Desempenho germinativo de sementes de soja revestidas com polímeros hidrofílicos / Germinative performance of soybean seeds coated with hidrophyl polymers

O uso de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis no revestimento de sementes tem se tornado importante devido às suas propriedades biológicas desejáveis e renováveis. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de polímeros hidrofílicos sobre a embebição e atributos fisiológicos de sementes de soja, cultivar NK 7059 RR. As sementes foram submetidas ao revestimento com os polímeros amido de mandioca, alginato de sódio e álcool polivinílico em quatro concentrações, sendo 0, 2, 4 e 6%. A embebição foi avaliada em intervalos de três horas durante 24 horas, totalizando oito avaliações. Para a qualidade fisiológica as sementes foram submetidas aos testes de primeira contagem de germinação, germinação, índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, emergência em casa de vegetação, índice de velocidade de emergência e condutividade elétrica. Os polímeros utilizados no presente estudo aumentam o percentual de embebição das sementes, principalmente o alginato de sódio na concentração de 4%. O revestimento com alginato de sódio afeta a qualidade fisiológica das sementes. De maneira geral, quanto maior a concentração dos polímeros, maior a interferência negativa no desempenho fisiológico das sementes.(AU)

The use of biodegradable and biocompatible polymers in seeds coated has become important due to their desirable and renewable biological properties. The present study aimed to evaluate the effect of biopolymers on the imbibition and physiological attributes of soybean seeds, NK 7059 RR cultivar. The seeds were coated with cassava starch, sodium alginate and polyvinyl alcohol biopolymers at four different concentrations 0, 2, 4 and 6%. The imbibition was evaluated at three hour intervals for 24 hours, totaling eight evaluations. For physiological quality the seeds were submitted to the tests of first germination count, germination, germination speed index, accelerated aging, greenhouse emergence, emergence speed index and electrical conductivity. The polymers used in the present study increase the percentage of seed soaking, especially sodium alginate at a concentration of 4%. The increase in the concentration of polymers negatively affects seedling emergence, and in the case of sodium alginate it reduces germination and seeds vigor.(AU)

Desempenho germinativo de sementes de soja revestidas com polímeros hidrofílicos / Germinative performance of soybean seeds coated with hidrophyl polymers

O uso de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis no revestimento de sementes tem se tornado importante devido às suas propriedades biológicas desejáveis e renováveis. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de polímeros hidrofílicos sobre a embebição e atributos fisiológicos de sementes de soja, cultivar NK 7059 RR. As sementes foram submetidas ao revestimento com os polímeros amido de mandioca, alginato de sódio e álcool polivinílico em quatro concentrações, sendo 0, 2, 4 e 6%. A embebição foi avaliada em intervalos de três horas durante 24 horas, totalizando oito avaliações. Para a qualidade fisiológica as sementes foram submetidas aos testes de primeira contagem de germinação, germinação, índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, emergência em casa de vegetação, índice de velocidade de emergência e condutividade elétrica. Os polímeros utilizados no presente estudo aumentam o percentual de embebição das sementes, principalmente o alginato de sódio na concentração de 4%. O revestimento com alginato de sódio afeta a qualidade fisiológica das sementes. De maneira geral, quanto maior a concentração dos polímeros, maior a interferência negativa no desempenho fisiológico das sementes.

The use of biodegradable and biocompatible polymers in seeds coated has become important due to their desirable and renewable biological properties. The present study aimed to evaluate the effect of biopolymers on the imbibition and physiological attributes of soybean seeds, NK 7059 RR cultivar. The seeds were coated with cassava starch, sodium alginate and polyvinyl alcohol biopolymers at four different concentrations 0, 2, 4 and 6%. The imbibition was evaluated at three hour intervals for 24 hours, totaling eight evaluations. For physiological quality the seeds were submitted to the tests of first germination count, germination, germination speed index, accelerated aging, greenhouse emergence, emergence speed index and electrical conductivity. The polymers used in the present study increase the percentage of seed soaking, especially sodium alginate at a concentration of 4%. The increase in the concentration of polymers negatively affects seedling emergence, and in the case of sodium alginate it reduces germination and seeds vigor.

Hidrogeis de polivinil-álcool (PVA) contendo o bacteriófago UFV-AREG1 para aplicação como curativo adesivo para a indústria de alimentos / Polyvinyl-alcohol (PVA) hydrogel containing the UFV-AREG1 bacteriophagus for application as a curative adhesive for the food industry

Infecções cutâneas obtidas por cortes nas mãos de manipuladores podem gerar contaminação nos alimentos. O objetivo deste trabalho foi incorporar o bacteriófago UFV-AREG1 em hidrogel de álcool poli(vinílico) PVA, aplicando-o futuramente como curativo adesivo. Foi adicionado 1,0 mL de solução do fago no PVA e seco em estufa por 48 h. Após, os hidrogeis foram submetidos a testes de Intumescimento, Espectroscopia no infravermelho (FTIR) e efeito antimicrobiano sobre E. coli O157:H7. O intumescimento do PVA-fago foi maior que o PVA-controle (p<0,05). A área de inibição do PVA-fago foi de 3,715 cm2 contra 2,916 cm2 do controle. As análises do FTIR mostraram um pico para o PVA-fago não encontrado no PVA-controle. Foi possível incorporar o bacteriófago em hidrogel de PVA e avaliar sua liberação para posterior aplicação como curativo adesivo.(AU)

Hidrogeis de polivinil-álcool (PVA) contendo o bacteriófago UFV-AREG1 para aplicação como curativo adesivo para a indústria de alimentos / Polyvinyl-alcohol (PVA) hydrogel containing the UFV-AREG1 bacteriophagus for application as a curative adhesive for the food industry

Infecções cutâneas obtidas por cortes nas mãos de manipuladores podem gerar contaminação nos alimentos. O objetivo deste trabalho foi incorporar o bacteriófago UFV-AREG1 em hidrogel de álcool poli(vinílico) – PVA, aplicando-o futuramente como curativo adesivo. Foi adicionado 1,0 mL de solução do fago no PVA e seco em estufa por 48 h. Após, os hidrogeis foram submetidos a testes de Intumescimento, Espectroscopia no infravermelho (FTIR) e efeito antimicrobiano sobre E. coli O157:H7. O intumescimento do PVA-fago foi maior que o PVA-controle (p<0,05). A área de inibição do PVA-fago foi de 3,715 cm2 contra 2,916 cm2 do controle. As análises do FTIR mostraram um pico para o PVA-fago não encontrado no PVA-controle. Foi possível incorporar o bacteriófago em hidrogel de PVA e avaliar sua liberação para posterior aplicação como curativo adesivo.

Immobilization of ammonia-oxidizing bacteria by polyvinyl alcohol and sodium alginate

Ammonia-oxidizing bacteria were immobilized by polyvinyl alcohol (PVA) and sodium alginate. The immobilization conditions and ammonia oxidation ability of the immobilized bacteria were investigated. The following immobilization conditions were observed to be optimal: PVA, 12%; sodium alginate, 1.1%; calcium chloride, 1.0%; inoculum concentration, 1.3 immobilized balls/mL of immobilized medium; pH, 10; and temperature, 30 °C. The immobilized ammonia-oxidizing bacteria exhibited strong ammonia oxidation ability even after being recycled four times. The ammonia nitrogen removal rate of the immobilized ammonia-oxidizing bacteria reached 90.30% under the optimal immobilization conditions. When compared with ammonia-oxidizing bacteria immobilized by sodium alginate alone, the bacteria immobilized by PVA and sodium alginate were superior with respect to pH resistance, the number of reuses, material cost, heat resistance, and ammonia oxidation ability.(AU)

Estudo de biocompatibilidade da membrana à base de polissacarídeo de Anacardium occidentale L. e álcool polivinílico após implante subcutâneo em ratos

A busca por novos biomateriais que auxiliem a cicatrização é desejável para potencializar o tratamento. Membranas poliméricas são uma opção viável e sustentável para a indústria biotecnológica, sob o ponto de vista econômico e ambiental. Neste trabalho, avaliamos a resposta e tolerância do tecido à implantação de membrana polimérica, preparada com o polissacarídeo extraído da goma do Anacardium occidentale L. (CGP) associado a poli (álcool vinílico), PVA. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar in vivo a biocompatibilidade da membrana CGP/PVA. Para tal, foram utilizados 36 ratos, machos, adultos, da linhagem wistar distribuídos em três tempos experimentais: 15, 30 e 60 dias. Foi realizado implante dos materiais teste na região dorsal, sendo grupo membrana (GM) animais submetidos ao procedimento cirúrgico seguido da implantação da membrana de CGP/PVA, grupo SHAM (GSHAM), procedimento falso cirúrgico usado para avaliar o impacto do procedimento no tecido envolvido, não sofrendo, contudo, implantação de membranas, onde GM e GSHAM realizados no mesmo animal. No grupo látex (GL) os animais foram submetidos a implantação da membrana de látex, utilizada como controle por promover resposta adequadamente positiva no sistema de teste de incompatibilidade do biomaterial. Necropsias excisionais foram coletadas ao final de cada período experimental e processadas histologicamente para análise da interação material-tecido hospedeiro, seguindo critérios de avaliação da norma ISO 10993-6. Os dados obtidos do grupo GM foram comparados aos grupos GL (controle positivo) e GSHAM (controle negativo). Após 15, 30 e 60 dias a membrana CGP/PVA apresentou moderada reação tecidual, com padrão de irritação não irritante, capsula fibrosa mais fina e menor quantidade de colágeno em relação ao GL, aos 30 e 60 dias apresentou quantidade semelhante de mastócitos a observada no grupo GSHAM. Os dados obtidos demonstram que a membrana CGP/PVA apresentou biocompatibilidade de acordo com a norma ISO10993-6.

The search for new biomaterials that aid healing is desirable to enhance treatment. Polymer membranes are a viable and sustainable option for the biotechnological industry, from an economic and environmental point of view. In this work, we evaluated the tissue response and tolerance to polymer membrane implantation, prepared with polysaccharide extracted from anacardium occidentale L. (CGP) gum associated with poly (vinyl alcohol), PVA. The objective of this research was to characterize in vivo the biocompatibility and biodegradability of CGP/PVA membrane. For this, 36 male, adult wistar rats were used, distributed in three experimental times: 15, 30 and 60 days. The test materials were implanted in the dorsal region, being membrane group (GM) animals submitted to the surgical procedure followed by the implantation of the CGP/PVA membrane, SHAM group (GSHAM), false surgical procedure used to evaluate the impact of the procedure on the tissue involved, not suffering, however, membrane implantation, where GM and GSHAM performed in the same animal. In the latex (GL) group the animals were submitted to latex membrane implantation, used as control for promoting adequately positive response in the biomaterial incompatibility test system. Excisional necropsies were collected at the end of each experimental period and histologically processed for analysis of the host material-tissue interaction, following criteria for evaluation of ISO 10993-6. The data obtained from the GM group were compared to the GL (positive control) and GSHAM (negative control) groups. After 15, 30 and 60 days the CGP/PVA membrane presented moderate tissue reaction, with non-irritating irritation pattern, thinner fibrous capsule and lower amount of collagen in relation to GL, at 30 and 60 days presented similar amount of mast cells to that observed in the GSHAM group. The data obtained show that the CGP/PVA membrane presented biocompatibility according to ISO10993-6.

PVA-Glutaraldehyde as support for lectin immobilization and affinity chromatography / PVA-Glutaraldeído como suporte para imobilização de lectina e cromatografia de afinidade

Immobilized lectins are a powerful biotechnological tool for separation and isolation of glycoconjugates. In the present study, polyvinyl alcohol (PVA) and glutaraldehyde (GA) were used as a support for Concanavalin A (Con A) covalent immobilization and for entrapment of Parkia pendula seed gum (PpeG). Con A immobilization yielded approximately 30% and 0.6 M glucose solution was the minimum concentration able to elute fetuin from column. PVA-GA-PpeG column was efficiently recognized by pure P. pendula lectin (PpeL). These findings indicate that PVA-GA interpenetrated network showed to be an efficient support for lectin covalent immobilization and as affinity chromatography matrix after trapping of PpeG.(AU)

Lectinas imobilizadas são uma poderosa ferramenta biotecnológica para a separação e isolamento de glicoconjugados. No presente trabalho álcool polivinílico (PVA) e glutaraldeído (GA) foram utilizados como um suporte para a imobilização covalente da Concanavalina A (Con A) e para aprisionamento da goma de semente de Parkia pendula (PpeG). A eficiência da imobilização da Con A foi aproximadamente 30 % e a concentração mínima de glucose capaz de eluir a fetuína da coluna foi 0,6 M. Coluna de PVA - GA - PpeG foi eficientemente reconhecida pela lectina de P. pendula (PpeL) pura. Estes resultados indicam que a rede interpenetrada de PVA-GA mostrou-se um suporte eficiente para a imobilização covalente de lectina e como matriz de cromatografia de afinidade após aprisionamento de PpeG.(AU)

Produção de curativos de nanofibras a base PVA e colágeno extraído da pele de rã touro (Lithobates catesbeianus)

O presente trabalho objetivou produzir nanofibras para a finalidade de uso em regeneração tecidual, utilizando álcool polivinílico (PVA) e colágeno, extraído da pele de rã touro (Lithobates catesbeianus), a partir da técnica de eletrofiação. O colágeno extraído da pele de rã touro foi purificado, e uma porção desse colágeno foi hidrolisado utilizando a enzima Alcalase®, nas seguintes condições: temperatura de 55º C, tempo de 3 horas, concentração enzima:substrato de 1% e pH 6,92. Foram produzidos 4 nanofibras de PVA/Colágeno com diferentes concentrações de colágeno hidrolisado (CH) (0%, 10%, 20% e 30% respectivamente) (m/m) de PVA. O processo de extração e purificação do colágeno foi eficiente e favorável para a produção das nanofibras, apresentando 0,07 ± 0,78 % de matéria mineral e 0,06 ± 0,01 % de material lipídico. O rendimento em base seca observado na extração do colágeno bruto foi de 16,58%. O hidrolisado produzido a partir do colágeno purificado apresentou grau de hidrólise e proteína solúvel de 5,70% e de 53,97 mg mL-1 , respectivamente. A atividade antioxidante do colágeno hidrolisado foi de IC50 6,82 ± 0,09 mg mL-1 , as nanofibras PVA/Colágeno+CH não apresentaram atividade antioxidante. O colágeno hidrolisado e as nanofibras demonstraram atividade antimicrobiana contra a cepa de Staphylococcus aureus. Os curativos produzidos de PVA/COL+CH 0%, 10%, 20% e 30%, demonstraram características físicoquímicas que estão de acordo com a literatura em relação as análises termogravimétricas e Espectroscopia (FTIR). Em relação a microscopia eletrônica de varredura, o filme PVA/COL+CH 10% destacou-se, pois apresentou maior uniformidades nas nanofibras, esse resultado corrobora com os resultados da avaliação mecânica, onde obteve maior porcentagem de elongação. Por fim, os filmes produzidos nessa pesquisa apresentam grande potencial para a sua utilização como curativos epiteliais, sendo um produto de alto valor agregado que poderá ser empregado para auxiliar a regeneração epitelial.

The present research aimed to produce nanofibers for use in tissue regeneration, using polyvinyl alcohol (PVA) and collagen, extracted from the skin of bullfrogs (Lithobates catesbeianus), using the electrospinning technique. The collagen extracted from the bullfrog skin was purified, and a portion of this collagen was hydrolyzed using the Alcalase® enzyme, under the following conditions: temperature of 55º C, time of 3 hours, enzyme:substrate concentration of 1% and pH 6.92. Four PVA/Collagen nanofibers were produced with different concentrations of hydrolyzed collagen (CH) (0%, 10%, 20% and 30% respectively) (m/m) of PVA. The collagen extraction and purification process were efficient and favorable to produce nanofibers, presenting 0.07 ± 0.78 % of ash and 0.06 ± 0.01 % of lipid material. The dry basis yield observed in the extraction of crude collagen was 16.58%. The hydrolysate produced from purified collagen showed a degree of hydrolysis and soluble protein of 5.70% and 53.97 mg mL-1 , respectively. The antioxidant activity of the hydrolyzed collagen was IC50 6.82 ± 0.09 mg mL-1 , the PVA/Collagen+CH nanofibers showed no antioxidant activity. Hydrolyzed collagen and nanofibers demonstrated antimicrobial activity against the Staphylococcus aureus strain. The nanofibers produced from PVA/COL+CH 0%, 10%, 20% and 30% showed physicochemical characteristics that agree with the literature regarding thermogravimetric analysis and Spectroscopy (FTIR). In relation to scanning electron microscopy, the PVA/COL+CH 10% nanofiber stood out, as it presented greater uniformity in the nanofibers, this result corroborates the results of the mechanical evaluation, where it obtained a higher percentage of elongation. Finally, the films produced in this research have great potential for use as epithelial dressings, being a product of high added value that can be used to assist epithelial regeneration.

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES DE NANOFIBRAS ASSOCIADOS A PLANTAS MEDICINAIS E SUAS ATIVIDADES SOBRE O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUT NEAS

Plantas medicinais são uma vasta fonte em potencial de medicamentos cicatrizantes. Nativa do sudeste da Ásia, Terminalia catappa L. (Combretaceae) foi naturalizada em áreas de clima subtropical e tropical como no Brasil. Seu uso etnofarmacológico, é melhor documentado em sistemas tradicionais de medicina Indianos como Siddha e Ayurveda e na Medicina Tradicional Chinesa onde é utilizada para o tratamento de hepatopatias, neoplasias, malária, febre amarela e diarreia, além de serem atribuídos efeitos antiviral, antibacteriano, antifúngico, antioxidante, expectorante, afrodisíaco, analgésico e anti-hipertensivo. Características morfoestruturais dos filmes eletrofiados os tornam apropriados para o desenvolvimento de curativos funcionais por mimetizar a matriz extracelular e atuarem em tecidos alvo como dispositivos de entrega de substancias. Neste contexto, objetivou-se com este estudo desenvolver um filme de nanofibras eletrofiadas de álcool polivinílico, associando-o ao extrato bruto liofilizado de T. catappa. Na análise fitoquímica, indentificou-se a presença majoritária de taninos hidrolisáveis, além de flavonoides e triperpenóides. Determinou-se para o extrato bruto de T. catappa a concentração inibitória mínima de 1000µg/ml frente Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853 e Sthapylococcus aureus - ATCC 29213, 500µg/ml para Sthapylococcus spp. coagulase negativo, e 250µg/ml para um isolado de bacilo Gram positivo. O extrato conferiu efeito antimicrobiano aos filmes quando incorporado nas diferentes proporções, evidenciado pelo fato que, exceto para o filme de PVA puro, não houve crescimento bacteriano após incubação de fragmentos em meio BHI e semeadura em ágar sangue. Os filmes de nanofibras de PVA obtidos apresentaram fibras uniformes e sem descontinuidades ou grânulos, e diâmetros inferiores a 1000nm. Ficou evidente a incorporação do extrato à matriz das nanofibras pela análise de FTIR e TGA, bem como maior estabilidade térmica conferida aos filmes associados ao extrato, indicando uma interação entre as moléculas orgânicas do extrato e as moléculas de PVA, tornando o material mais amorfo, conforme demonstrado pela análise por difração de raios-x. A cinética de liberação mostrou que os filmes produzidos foram capazes de liberar o extrato incorporado em meio aquoso de pH 5,8. Em seguida, avaliou-se o processo cicatricial de feridas cutâneas de expessura total induzidas em ratos Wistar (n=75), divididos em 5 tratamentos: controle negativo, filme de nanofibras de PVA e PVA acrescido de 3%, 6% e 10% com extrato de T. catappa. Os resultados mostraram que, além permanecer sobre a superfície das feridas por um período aceitável, a membrana de nanofibras foi capaz entregar o extrato de T. catappa no leito das feridas tratadas e, apesar de não produzir alterações histológicas estatisticamente relevantes, observou-se significativo efeito antioxidante pela redução de LPO e aumento de GSH de modo dose dependente. Conclui-se que a incorporação do extrato bruto de T. catappa ao PVA produz filmes de nanofibras com características desejáveis que podem potencialmente favorecer o processo de reparo tecidual por segunda intenção de feridas cutâneas.

Medicinal plants are a vast potential source of healing medicines. Native to Southeast Asia, Terminalia catappa L. (Combretaceae) was naturalized in areas of subtropical and tropical climate, such as Brazil. Its ethnopharmacological use is best documented in traditional Indian medicine systems such as Siddha and Ayurveda and in Traditional Chinese Medicine where it is used for the treatment of liver diseases, neoplasms, malaria, yellow fever and diarrhea, in addition to being attributed antiviral, antibacterial, antifungal effects, antioxidant, expectorant, aphrodisiac, analgesic and antihypertensive. Morphostructural characteristics of electrophilized films make them suitable for the development of functional dressings as they mimic the extracellular matrix and act on target tissues as substance delivery devices. In this context, the aim of this study was to develop a film of electrophilized nanofibers of polyvinyl alcohol, associating it with the lyophilized crude extract of T. catappa. In phytochemical analysis, the majority of hydrolyzable tannins was identified, in addition to flavonoids and triperpenoids. The minimum inhibitory concentration of 1000µg /ml for Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853 and Sthapylococcus aureus - ATCC 29213, 500µg / ml for Sthapylococcus spp was determined for the crude extract of T. catappa negative coagulase, and 250 µg / ml for a Gram positive bacillus isolate. The extract conferred antimicrobial effect to the films when incorporated in the different proportions, evidenced by the fact that, except for the pure PVA film, there was no bacterial growth after incubation of fragments in BHI medium and sowing on blood agar. The PVA nanofiber films obtained showed uniform fibers and without discontinuities or granules, and diameters less than 1000nm. It became evident the incorporation of the extract into the nanofiber matrix by FTIR and TGA analysis, as well as greater thermal stability conferred to the films associated with the extract, indicating an interaction between the organic molecules of the extract and the PVA molecules, making the material more amorphous, as demonstrated by X-ray diffraction analysis. The release kinetics showed that the produced films were able to release the incorporated extract in an aqueous medium of pH 5.8. Then, was evaluated the healing process of full-thickness skin wounds induced in Wistar rats (n = 75) divided into 5 treatments: negative control, PVA and PVA nanofiber film plus 3%, 6% and 10% with T. catappa extract. The results showed that, in addition to remaining on the surface of the wounds for an acceptable period, the nanofiber membrane was able to deliver the extract of T. catappa to the bed of the treated wounds and, despite not producing statistically relevant histological changes, it was observed significant antioxidant effect by reducing LPO and increasing GSH in a dose dependent manner. It is concluded that the incorporation of the crude extract of T. catappa to the PVA produces nanofiber films with desirable characteristics that can potentially favor the process of tissue repair by second intention of skin wounds.

Comparação entre dois protocolos de tratamento de ceratoconjuntivite seca experimentalmente induzida em coelhos / Comparison of two treatment protocols of experimentally induced keratoconjunctivitis sicca in rabbits

O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a eficácia de dois protocolos de tratamento de ceratoconjuntivite seca (CCS) experimentalmente induzida em coelhos: uma formulação oftálmica tópica composta por álcool polivinílico 1,4%, adicionado com acetilcisteína 10% e pilocarpina 1% (AAP), e outro protocolo com o uso do óleo de semente de linhaça (OL) tópico em forma de colírio, durante 12 semanas. Foram utilizados 15 coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia, alocados aleatoriamente em três grupos: grupo C (controle), grupo AAP (formulação oftálmica) e grupo L (OL tópica). Os animais foram avaliados semanalmente pelo teste lacrimal de Schirmer, teste de fluoresceína e teste de Rosa Bengala; uma vez por mês, pelo exame de citologia esfoliativa ocular; ao final do experimento, pela análise histopatológica da córnea e conjuntiva. Os resultados demonstraram que houve um aumento maior na produção lacrimal quando utilizada a formulação oftálmica, e uma resolução mais rápida das úlceras de córnea, bem como diminuição no número de células desvitalizadas quando utilizado o óleo de semente de linhaça, além de aumento no número de células caliciformes em ambos os grupos de tratamento. A associação desses dois protocolos pode ser no futuro uma alternativa no tratamento da CCS.(AU)

The objective of this study was to evaluate and compare the effectiveness of two treatment protocol of experimentally induced keratoconjunctivitis sicca (KCS) in rabbits, a topical ophthalmic formulation composed by 1.4% povinilic alcohol added with 10% acetylcysteine and 1% pilocarpine (AAP) and another protocol with the topical use of the linseed seed oil (LO) in eye drop form f or 12 weeks. Fifteen male New Zealand white rabbits were aleatory allocated in 3 groups: Group C (Control), Group AAP (ophthalmic formulation) and Group L (LO topical). The animals were evaluated weekly using the Schirmer's tear test, fluorescein test and Rose Bengal test monthly for ocular cytology, and at the end of the experiment for histopathological analysis of cornea and conjunctive. The results demonstrated that there was a larger increase in the tear production when the ophthalmic formulation was us ed and a faster rapid resolution of corneal ulcers and decrease in the number of devitalized cells when linseed seed oil was used, besides an increase in the number of caliciform cells in both treatment groups. The association of those two protocols can be a future alternative in the treatment of KCS.(AU)

Toxicity of cryoprotectants on Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1837) (curimba) embryos in an experimental incubator (Characiformes: Prochilodontidae)

This paper investigated the effect of cryoprotectant substances on Prochilodus lineatus embryos in an experimental incubator. The prospective study applied combinations of polyvinyl alcohol, hydroxyethyl cellulose, gelatin and fetal bovine serum with dimethyl sulfoxide and ethylene glycol in a new experimental incubator. The morphology of embryos, larval viability and the efficiency of experimental incubators in maintaining the quality of embryos were evaluated. This study demonstrates the efficient association between hydroxyethylcellulose and dimethyl sulfoxide as greater viability (p<0.05) was found for embryos (72.9 ± 23.9%). It should also be noted the permeation of cryoprotectants in embryos through the changes found in chorion diameter, embryo diameter and embryo volume comparing the treatments versus control group (water) (p<0.05), this results can help in future cryopreservation protocols. Although the temperature and oxygenation differed between the usual and experimental incubators (p<0.05), the results showed a high fertilization rate (79.6 ± 13.2%) for experimental incubators (p<0.05) which is sufficient for the maintenance of embryos in a cryoprotective environment and effectively allows experimentation for long periods with cryoprotectant substances. Cryopreservation of fish embryos has not been accomplished yet and new approaches are required for understanding the permeability of teleost embryos, especially in Brazilian native species.(AU)

Este trabalho avaliou o efeito de substâncias crioprotetoras sobre embriões de Prochilodus lineatus em uma incubadora experimental. O estudo aplicou combinações de álcool polivinílico, hidroxietilcelulose, gelatina e soro fetal bovino com dimetilosulfóxido e etilenoglicol em uma nova incubadora experimental. Foram avaliadas a morfologia dos embriões, a viabilidade larval e a eficiência das incubadoras experimentais na manutenção da qualidade dos embriões. Este estudo demonstra a associação eficiente entre hidroxietilcelulose e dimetilsulfóxido pela maior viabilidade (p<0,05) encontrada para os embriões (72,9 ± 23,9%). Deve-se notar também a permeação dos crioprotetores nos embriões através das alterações encontradas no diâmetro córion, diâmetro do embrião e no volume do embrião comparando os tratamentos ao grupo controle (água) (p<0,05), estes resultados podem ajudar em futuros protocolos de criopreservação. Embora a temperatura e a oxigenação diferiram entre as incubadoras comuns e as experimentais (p<0,05), os resultados mostraram elevada taxa de fertilização (79,6 ± 13,2%) para incubadoras experimentais (p<0,05), o que é suficiente para a manutenção de embriões em ambiente crioprotetor e permite efetivamente a experimentação por longos períodos com substâncias crioprotetoras. A criopreservação de embriões de peixes ainda não foi realizada e novas abordagens são necessárias para a compreensão da permeabilidade dos embriões de teleósteos, especialmente em espécies nativas brasileiras.(AU)

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES FORMULAÇÕES NA ABSORÇÃO DE OCITOCINA PELA VIA VAGINAL DE NOVILHAS GIROLANDO

O objetivo deste trabalho foi testar a viabilidade da utilização da via vaginal em fêmeas bovinas visando aplicação de ocitocina a partir de formulações específicas. A ocitocina foi utilizada associada a facilitadores de absorção e na forma injetável (como parâmetro de comparação). Foram produzidas sete formulações: ocitocina em água; ocitocina em álcool polivinílico 4% P/V; ocitocina em carboxi metil c elulose 2% P/V; ocitocina em glicerina 2% V/V; ocitocina em dimetilsulfóxido10% V/V; ocitocina em propilenoglicol 25% V/Ve ocitocina em tween 80 10% V/V, todas com concentração de 5 UI/mL de ocitocina. O delineamento experimental foi em quadrado latino 8x8 (oito dias, oito tratamentos e oito novilhas púberes ciclando). As administrações de ocitocina foram pela via vaginal e a ocitocina injetável comercial pela via endovenosa, todas aplicações contendo 10 UI. Amostras de sangue (n=7) foram coletadas de cada animal, no tempo 0, anterior à administração dos tratamentos, e de três em três minutos até 18 minutos. A ocitocina foi extraída do plasma e dosada utilizando o kit comercial Oxytocin EIA. Os resultados obtidos foram avaliados por análise estatística não paramétrica utilizando o teste Kruskal Wallis. Foi observada diferença estatística entre o tempo 0 e o tempo 12 minutos (p<0,05) para a formulação ocitocina em glicerina, indicando que houve absorção. Concluiu-se que houve absorção através da via vaginal para esta formulação, mas ressalva-se a necessidade de mais estudos para seu emprego no manejo com as fêmeas bovinas de forma efetiva.

The aim of this study was to test the feasibility of vaginal route in order to apply oxytocin in female bovines using specific formulations. The oxytocin was used in both its injectable form (as a comparison standard) and associated with absorption enhancers. Seven formulations were produced: oxytocin plus water; oxytocin plus polyvinyl alcohol 4% W/V; oxytocin plus carboxy methyl cellulose 2% W/V; oxytocin plus glycerin 2% V/V; oxytocin plus dimethyl sulfoxide 10% V/V; oxytocin plus propylene glycol 25% V/V and oxytocin plus tween80 10% V/V, containing all 5 IU/ml of oxytocin. The experimental design was made in an 8x8 latin square (eight days, eight treatments and eight cycling heifers). The formulations were delivered in vaginal route and the injectable oxytocin was applied intravenously, all of them having 10 IU of oxytocin. Blood samples (n=7) were collected from each animal, the first at time 0, prior to the administration of the treatment, and the following every three minutes until 18 minutes. Oxytocin was extracted from plasma and measured using the commercial kit Oxytocin EIA. The responses were evaluated using the non-parametric statistic test method by Kruskal Wallis. A statistical difference was observed between times 0 and 12 (p<0,05) for the oxytocin plus glycerin formulation, showing that absorption did occur. Therefore, the outcomes revealed that this formulation had been absorbed, even though it does not suppress the need for further research before it can be effectively used in female bovine management

EFEITOS DA ADIÇÃO DO IGF-1 OU IGF-LongR3 SOBRE ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES DE COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITO DURANTE A MATURAÇÃO OOCITÁRIA IN VITRO EM BOVINOS

O fator de crescimento semelhante à insulina-1 recombinante-3 (IGF-LongR3), um análogo sintético do IGF-1 de maior biodisponibilidade, ainda não foi utilizado no meio de maturação in vitro (MIV) de complexos cumulus-oócito (CCOs). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar e comparar os efeitos da adição de IGF-LongR3 e do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) na MIV de CCOs bovinos, sobre a progressão meiótica, apoptose e expressão de genes nos oócitos (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) e respectivas células do cumulus (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Ovários bovinos foram coletados em abatedouro, sendo selecionados 739 CCOs após aspiração de folículos de 2-8mm de diâmetro. A MIV foi realizada em meio base de maturação contendo IGF-1 (100ng/mL), IGF-LongR3 (100ng/mL), e dois grupos controles: 0,1% de álcool polivinílico (PVA) ou 10% de soro fetal bovino (SFB), durante 22-24 horas em estufa a 38,5ºC e 5% de CO2. Posteriormente os oócitos foram desnudados e preparados para a técnica de TUNEL, coloração Hoechst 33342 e RT-qPCR, intencionando-se avaliar a apoptose, maturação nuclear e a expressão gênica, respectivamente. A análise estatística foi realizada por um modelo linear de efeitos mistos, o qual relacionou a mudança de estádio de metáfase 1 para metáfase 2 e a ausência de apoptose entre os grupos experimentais, pelo programa lmer4. Os testes ANOVA e Tukey foram utilizados para análise dos resultados obtidos pelo RT-qPCR. Ao final de dez réplicas de MIV foram avaliados 339 (n= 5 réplicas) oócitos quanto à progressão meiótica e apoptose e 400 (n= 5 réplicas) quanto à expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P<0,05) entre os grupos experimentais com relação à progressão meiótica e apoptose. Foi possível detectar a expressão de mRNA para todos os genes avaliados nos oócitos e respectivas células do cumulus em todos os grupos experimentais. Houve diferença estatística (P¿0,05) entre o grupo 10% de SFB e os grupos IGF-1 e IGF-LongR3 para a expressão do gene IGFBP4 nas células do cumulus. A expressão do gene COX2 também foi estatisticamente diferente entre o grupo 0,1% de PVA e os grupos IGF-1 e IGF-LongR3. Houve diferença estatística para a expressão do gene BCL2 nos oócitos entre os grupos IGF-1, 10% de SFB e 0,1% de PVA e para a expressão do gene IGFBP4 entre os grupos IGF-LongR3, 0,1% de PVA e 10% de SFB. Não foi observada diferença estatística entre os grupos experimentais para os demais genes avaliados nos oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que é possível realizar a MIV de oócitos bovinos na presença do IGF-LongR3, possibilitando sua utilização em substituição ao IGF-1 e ao SFB.

The insuline like growth factor-1 recombinant-3 (LongR3-IGF-1) a synthetic analogue of IGF-1 with greater bioavailability has not yet been used in in vitro maturation medium of cumulus-oocyte complexes (COCs). Therefore the aim of this study was to evaluate and compare the effects of LongR3-IGF-1 and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) addition in the IVM of bovine oocytes on meiotic progression, apoptosis, and genic expression COCs (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) and their respectively cumulus cells (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Bovine ovaries were collected in slaughterhouse being selected 739 oocytes after aspiration of follicles from 2-8mm diameter. In vitro maturation (IVM) was performed on basic maturation medium containing IGF-1 (100 ng/ml), LongR3-IGF-1 (100ng/ml), and two control groups: 0.1% polyvinyl alcohol (PVA) or 10% fetal bovine serum (FBS), for 22-24 hours in an incubator at 38.5°C and 5% CO2. Subsequently oocytes were denuded and prepared for TUNEL technique, staining Hoechst 33342 and RT-qPCR, intending to evaluate apoptosis, nuclear maturation and gene expression, respectively. Statistical analysis was performed using a linear mixed effects model, which correlated the change in metaphase stage 1 to 2 and the absence of apoptosis among the experimental groups. ANOVA and Tukey tests were used to analyze the results obtained by RTqPCR. After ten replicas of IVM, 339 oocytes (n=5 pools) were evaluated for meiotic progression and apoptosis and 400 (n=5 pools) for gene expression. There was no statistical difference (P>0,05) between the experimental groups with respect to meiotic progression and apoptosis. It was possible to detect mRNA expression of all evaluated genes in the oocyte and its cumulus cells in all experimental groups. There was statistical difference between the group 10% FBS and IGF-1 and LongR3-IGF-1 groups for the expression of gene IGFBP4 in cumulus cells. The expression of COX2 gene was also statistically different (P¿0,05) between 0.1% PVA group and IGF-1 and LongR3-IGF-1 groups. Statistical difference was found for the expression of BCL2 gene in oocytes between IGF-1 groups, 10% FBS and 0.1% PVA and for the expression of IGFBP4 gene between LongR3-IGF-1, 0.1% PVA and 10% FBS groups. There was no statistical difference between the experimental groups for other genes evaluated in oocytes and cumulus cells. The results obtained of this study show that is possible to perform IVM of bovine oocytes in the presence of LongR3-IGF-1, allowing its use in replacement of IGF-1 and FBS.

Efeito da tensão de oxigênio e do meio na maturação oocitária in vitro e sua influência no desenvolvimento embrionário em suínos / Effect of oxygen tension and media on in vitro oocyte maturation and its influence in the porcine embryonic development

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da baixa tensão de oxigênio (5% de CO2; 5% de O2 e 90% de N2) na maturação oocitária in vitro em meio quimicamente definido (0,1% de PVA) ou suplementado com 10 % de PFF. Foram avaliados a migração dos grânulos corticais, a quantificação e distribuição da proteína HSP70, a maturação nuclear, as concentrações intracelulares da glutationa reduzida, a avaliação dos índices de penetração espermática e o desenvolvimento e qualidade de embriões fecundados in vitro em oócitos antes da maturação (0 hora) e após a maturação in vitro nos diferentes tratamentos (atmosfera = 5 ou 20% de O2 e suplementação do meio de maturação = 0,1% de PVA ou 10% de PFF). Para verificar a influência da atmosfera e da suplementação do meio no sistema de maturação foram avaliados o ciclo celular das células do cumulus, o número de células do cumulus por oócitos, as concentrações intracelulares de glutationa reduzida (GSH) das células do cumulus, as concentrações de TBARS no meio de maturação e a resistência das células do cumulus ao estresse oxidativo. Avaliações quanto às concentrações de GSH e HSP70 foram realizadas em oócitos in vivo, visando comparar a eficiência do sistema in vitro. Para a maioria dos parâmetros avaliados não houve interação entre a atmosfera e a suplementação do meio de maturação, indicando que o efeito da atmosfera independe do meio utilizado. Foi observado que em atmosfera com baixa tensão de O2 houve diminuição da concentração de glutationa nas células do cumulus, do índice de clivagem e do número total de blastômeros dos embriões e houve aumento do número de células por oócito após o período de maturação in vitro. A suplementação do meio de maturação com 0,1% de PVA diminuiu os índices de migração dos grânulos corticais, contudo não alterou os índices de penetração espermática. Os oócitos do grupo 0 hora apresentaram índices maiores de HSP70 do que cada um dos demais grupos, indicando provável diminuição dos estoques de HSP70 durante o período de maturação em todos os grupos de maturação in vitro. As células do cumulus provenientes de oócitos maturados em meio suplementado com 0,1% de PVA apresentaram maior número de células na fase S e G2/M do que o grupo 0 hora, entretanto isso não refletiu em aumento no número de células por oócito após a maturação. Este trabalho permite concluir que o uso de baixa tensão de oxigênio não melhora as condições do sistema de maturação oocitária in vitro em suínos, sendo que o efeito do uso desta atmosfera é, na maioria das variáveis avaliadas, independente do tipo de suplementação que se utiliza no meio de maturação in vitro

The aim of this study was to evaluate the efficiency of low oxygen tension (5% CO2, 5% O2 and 90% N2) on in vitro oocyte maturation using defined media (0.1% PVA) or supplemented with 10% PFF. To achieve this goal, oocytes were evaluated prior to in vitro maturation (0 hour) and after in vitro maturation on different treatments (atmosphere = 5 or 20% O2 and media supplementation = 0.1% PVA or 10% PFF) for cortical granules migration, quantification and distribution of HSP70 protein, nuclear maturation, intracellular concentrations of reduced glutathione, evaluation of sperm penetration and development and quality of in vitro-produced embryos. Furthermore, to evaluate the effects on maturation system, several factors were analyzed, such as: the cell cycle phase of cumulus cells, the number of cumulus cells per oocyte, the intracellular concentrations of reduced glutathione in cumulus cells, the concentrations of TBARS in maturation media and the resistance of cumulus cells to the oxidative stress. Some of these evaluations were performed on in vivo oocytes, aiming to analyze oocyte competence after in vitro maturation. Concerning the majority of the parameters analyzed, there were no interaction between atmosphere and the supplementation of maturation media, indicating that the effect of atmosphere is independent of the media used. It was possible to observe that low tension atmosphere of O2 decreased glutathione concentrations in cumulus cells, cleavage rate and total number of embryo blastomeres and increased the number of cells per oocyte after the period of in vitro maturation. The maturation media supplementation with 0.1% PVA decreased the migration of cortical granules; however this fact did not have effect on in vitro sperm penetration levels. The 0 hour oocytes showed higher levels of HSP70 than each one of the in vitro maturated groups, indicating decrease of this protein stock during the maturation period in all of the in vitro maturated groups. The cumulus cells originated from maturated oocytes in supplemented media with 0.1% PVA showed higher number of cells in S and G2/M phase than 0 hour group; however this fact did not reflect in increased cell numbers per oocyte after maturation. Therefore, the use of low oxygen tension does not improve the conditions of the in vitro porcine oocyte maturation system and their effect in most of the factors analyzed is not dependent on the supplementation of maturation media

Use of PVA-gel immobilized cells: a new strategy for biotechnological production of Xylitol from sugarcane bagasse hidrolysate / Uso de células imobilizadas em gel de PVA: uma nova estratégia para produção biotecnológica de Xilitol a partir de bagaço de cana-de-açúcar

Sugarcane bagasse is one of the most abundant residues in Brazil due to the large number of sugaralcohol industries. This biomass contains a high concentration of carbohydrates, which can be converted into products of high economic value, such as xylitol. Xylitol, a polyol with anticariogenic properties, is similar in sweetening power to sucrose, and has high potential for use in the food and pharmaceutical industries. Several studies have been carried out to produce xylitol by biotechnological processes. However, there is little information on the use of immobilized cells in these bioprocesses. The objective of this review was to present a new possibility to produce xylitol by biotechnological processes, using sugarcane bagasse hydrolysate and immobilized cells in PVA-gel.

O bagaço de cana-de-açúcar é um dos resíduos mais abundantes no Brasil devido ao grande número de indústrias sucroalcooleiras. Esta biomassa contém elevado teor de carboidratos, podendo ser utilizada na produção de compostos de interesse econômico como o xilitol. O xilitol é um poliol de cinco carbonos que apresenta poder adoçante semelhante ao da sacarose e propriedades anti-cariogênicas, tendo elevado potencial de uso nas indústrias alimentícias e farmacêuticas. Diversos estudos buscando o desenvolvimento de processos de produção de xilitol por via biotecnológica têm sido realizados, entretanto pouco tem sido escrito sobre a utilização de células imobilizadas no bioprocesso. A presente revisão tem como objetivo apresentar uma possibilidade de produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar, em sistema com células imobilizadas em gel de álcool polivinílico.

Use of PVA-gel immobilized cells: a new strategy for biotechnological production of Xylitol from sugarcane bagasse hidrolysate / Uso de células imobilizadas em gel de PVA: uma nova estratégia para produção biotecnológica de Xilitol a partir de bagaço de cana-de-açúcar

Sugarcane bagasse is one of the most abundant residues in Brazil due to the large number of sugaralcohol industries. This biomass contains a high concentration of carbohydrates, which can be converted into products of high economic value, such as xylitol. Xylitol, a polyol with anticariogenic properties, is similar in sweetening power to sucrose, and has high potential for use in the food and pharmaceutical industries. Several studies have been carried out to produce xylitol by biotechnological processes. However, there is little information on the use of immobilized cells in these bioprocesses. The objective of this review was to present a new possibility to produce xylitol by biotechnological processes, using sugarcane bagasse hydrolysate and immobilized cells in PVA-gel.

O bagaço de cana-de-açúcar é um dos resíduos mais abundantes no Brasil devido ao grande número de indústrias sucroalcooleiras. Esta biomassa contém elevado teor de carboidratos, podendo ser utilizada na produção de compostos de interesse econômico como o xilitol. O xilitol é um poliol de cinco carbonos que apresenta poder adoçante semelhante ao da sacarose e propriedades anti-cariogênicas, tendo elevado potencial de uso nas indústrias alimentícias e farmacêuticas. Diversos estudos buscando o desenvolvimento de processos de produção de xilitol por via biotecnológica têm sido realizados, entretanto pouco tem sido escrito sobre a utilização de células imobilizadas no bioprocesso. A presente revisão tem como objetivo apresentar uma possibilidade de produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar, em sistema com células imobilizadas em gel de álcool polivinílico.

DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS IN VITRO EM MONOCAMADA DE CÉLULAS OVARIANAS

The aim of the present work was to determine the influence of ovarian cells in the in vitro development of preantral follicles (PF). The viability of monolayer ovarian cells and the effect of the serum in the survive of in vitro PF was also investigated. Ovarian cells and PF were isolated from ovaries of bovine fetus between 6 and 8 months of pregnancy, obtained in a slaughterhouse. Monolayer of ovarian cells were cultured in a modified TCM-199 in the presence and absence of FSH and its viability after incubation was determined with Trypan Blue. PFs were divided in four different treatments, cultured in modified TCM-199, containing serum of castrated steer (SCS), SCS in monolayer of ovarian cells (MOC), MOC with FSH or a defined medium with polyvinyl alcohol (PVA) as macromolecule. The cellular viability was not affected by the presence or absence of FSH. However, PFs had a significant development (P 0.05) when cultivated in the presence of SNC, MCO and FSH, which was not observed in the other treatments. With these results, it was possible to conclude that FSH does not influence the viability of the ovarian cells when cultured in a monolayer for 20 days. Preantral follicles, measuring between 4000 and 8000mum² but not with size greater than 8000mum², grow on ovarian cells in vitro, independently of FSH.

O presente trabalho teve como objetivos determinar a influência de células ovarianas no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais, avaliar a viabilidade das células ovarianas em monocamada e a influência do soro na manutenção de folículos pré-antrais in vitro. Folículos pré-antrais (FPs) e células ovarianas foram isolados de ovários de fetos bovinos, com idade entre 6 e 8 meses de gestação, oriundos de matadouro. Células ovarianas em monocamada foram cultivadas em meio TCM-199, e a viabilidade celular, após o cultivo na presença ou ausência de FSH, foi determinada com o corante vital azul de tripan. FPs foram distribuidos em quatro tratamentos e cultivados em TCM-199 modificado, contendo soro de novilho castrado (SNC), SNC em monocamada de células ovarianas (MCO), MCO com FSH ou meio definido com álcool polivinílico (PVA) como macromolécula. A viabilidade celular não foi afetada em conseqüência da presença ou ausência de FSH. No entanto, houve um incremento significativo no tamanho dos FPs cultivados na presença de SNC, MCO e FSH (P 0,05), o que não foi observado nos demais tratamentos. A adição de FSH ao meio de cultivo não influencia a viabilidade de células ovarianas ao longo de 20 dias. Folículos pré-antrais, com área superficial entre 4000 e 8000mim², mas não folículos com área superficial superiores a 8000mim², crescem in vitro na presença de células ovarianas, independentemente da presença de FSH.

Fecundação e clivagem após a ativação da proteína quinase C durante a maturação de oócitos bovinos

In the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4alpha-PDD (100nM de 4alpha-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4alpha-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage.

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQ-C) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4alfa-PDD (100nM de 4alfa-phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de pró-núcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4alfa-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos.

Fecundação e clivagem após a ativação da proteína quinase C durante a maturação de oócitos bovinos

In the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4alpha-PDD (100nM de 4alpha-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4alpha-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage.

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQ-C) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4alfa-PDD (100nM de 4alfa-phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de pró-núcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4alfa-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos.

Desenvolvimento de folículos pré-antrais bovinos in vitro em monocamada de células ovarianas

The aim of the present work was to determine the influence of ovarian cells in the in vitro development of preantral follicles (PF). The viability of monolayer ovarian cells and the effect of the serum in the survive of in vitro PF was also investigated. Ovarian cells and PF were isolated from ovaries of bovine fetus between 6 and 8 months of pregnancy, obtained in a slaughterhouse. Monolayer of ovarian cells were cultured in a modified TCM-199 in the presence and absence of FSH and its viability after incubation was determined with Trypan Blue. PFs were divided in four different treatments, cultured in modified TCM-199, containing serum of castrated steer (SCS), SCS in monolayer of ovarian cells (MOC), MOC with FSH or a defined medium with polyvinyl alcohol (PVA) as macromolecule. The cellular viability was not affected by the presence or absence of FSH. However, PFs had a significant development (P 0.05) when cultivated in the presence of SNC, MCO and FSH, which was not observed in the other treatments. With these results, it was possible to conclude that FSH does not influence the viability of the ovarian cells when cultured in a monolayer for 20 days. Preantral follicles, measuring between 4000 and 8000mum² but not with size greater than 8000mum², grow on ovarian cells in vitro, independently of FSH.

O presente trabalho teve como objetivos determinar a influência de células ovarianas no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais, avaliar a viabilidade das células ovarianas em monocamada e a influência do soro na manutenção de folículos pré-antrais in vitro. Folículos pré-antrais (FPs) e células ovarianas foram isolados de ovários de fetos bovinos, com idade entre 6 e 8 meses de gestação, oriundos de matadouro. Células ovarianas em monocamada foram cultivadas em meio TCM-199, e a viabilidade celular, após o cultivo na presença ou ausência de FSH, foi determinada com o corante vital azul de tripan. FPs foram distribuidos em quatro tratamentos e cultivados em TCM-199 modificado, contendo soro de novilho castrado (SNC), SNC em monocamada de células ovarianas (MCO), MCO com FSH ou meio definido com álcool polivinílico (PVA) como macromolécula. A viabilidade celular não foi afetada em conseqüência da presença ou ausência de FSH. No entanto, houve um incremento significativo no tamanho dos FPs cultivados na presença de SNC, MCO e FSH (P 0,05), o que não foi observado nos demais tratamentos. A adição de FSH ao meio de cultivo não influencia a viabilidade de células ovarianas ao longo de 20 dias. Folículos pré-antrais, com área superficial entre 4000 e 8000mim², mas não folículos com área superficial superiores a 8000mim², crescem in vitro na presença de células ovarianas, independentemente da presença de FSH.