Equine papillomavirus detection in aural plaques by qPCR

Papillomatosis occupy a prominent position both in human and veterinary medicine, since it is a viral skin disease with potential to develop malignancy. Equus caballus papillomavirus (EcPV) are associated with several diseases in horses, i.e. classical papillomatosis associated with EcPV 1; squamous cell carcinoma associated with EcPV 2; tumors in mucous membranes on the genital area (EcPV 2 and EcPV 7); aural plaque associated with EcPV 1, 3, 4, 5 and 6; and equine sarcoid, associated with bovine papillomavirus (BPV 1 and 2). The aural plaque is characterized by small papules (1-2 cm), hypochromic and keratinized on the internal surface of the pinnae and can evolve and coalesce into larger lesions. To obtain a specific diagnostic test, both sensitive and fast to identify these viruses, a quantitative real time PCR (qPCR) was standardized for EcPV 3, 4, 5 and 6. Applying the qPCR technique in the 103 equine aural plaque samples resulted in 90.29% of at least one viral type prevalence, which was distributed as following: EcPV3, 36.89%; EcPV4, 82.52%; EcPV5, 0.97%; and EcPV6, 10.68%. This study represents an evolution in the area related to aural plaque and equine papillomatosis and raises new questions for future research.

Equine papillomavirus detection in aural plaques by qPCR

Papillomatosis occupy a prominent position both in human and veterinary medicine, since it is a viral skin disease with potential to develop malignancy. Equus caballus papillomavirus (EcPV) are associated with several diseases in horses, i.e. classical papillomatosis associated with EcPV 1; squamous cell carcinoma associated with EcPV 2; tumors in mucous membranes on the genital area (EcPV 2 and EcPV 7); aural plaque associated with EcPV 1, 3, 4, 5 and 6; and equine sarcoid, associated with bovine papillomavirus (BPV 1 and 2). The aural plaque is characterized by small papules (1-2 cm), hypochromic and keratinized on the internal surface of the pinnae and can evolve and coalesce into larger lesions. To obtain a specific diagnostic test, both sensitive and fast to identify these viruses, a quantitative real time PCR (qPCR) was standardized for EcPV 3, 4, 5 and 6. Applying the qPCR technique in the 103 equine aural plaque samples resulted in 90.29% of at least one viral type prevalence, which was distributed as following: EcPV3, 36.89%; EcPV4, 82.52%; EcPV5, 0.97%; and EcPV6, 10.68%. This study represents an evolution in the area related to aural plaque and equine papillomatosis and raises new questions for future research.(AU)

Caracterização molecular de DNA de Delta papillomavirus bovino (BPV1, 2 e 13) em sarcoides equinos / Molecular characterization of bovine Deltapapillomavirus (BPV1, 2, and 13) DNA in equine sarcoids

Sarcoides são tumores fibroblásticos, considerados os tumores de pele mais comuns em pele de equinos e que raramente apresentam regressão espontânea. Papilomavírus bovino (BPV) tipos 1 e 2 são relacionados com a patogenia do sarcoide e, provavelmente, o BPV tipo 13 (BPV13), recentemente descrito, também pode estar associado com a formação dessa lesão. Neste estudo, 20 amostras de lesões cutâneas, sendo 12 constituídas por tecidos frescos e 8 amostras de tecido fixado em formalina e embebido em parafina, provenientes de 15 cavalos foram utilizadas para a identificação do DNA de BPV. A análise histopatológica (HE) confirmou todas as lesões como sarcoide. Para a amplificação do DNA de papilomavírus (PV) foram realizadas três reações de PCR. Como triagem, os primers IFNR2/IDNT2 foram utilizados para amplificar um fragmento da ORF L1 do PV. O segundo par de primersutilizado é complementar a sequência dos genes E5 e L2 de BPVs 1, 2 e 13. O terceiro par de primers(FAP59/FAP64) utilizado tem o gene L1 como alvo. A primeira e a segunda PCRs permitiram amplificar produtos em todas as amostras avaliadas. Entretanto, na terceira reação, na qual foram utilizados os primers FAP, foi possível amplificar produtos com tamanho molecular esperado somente nas amostras constituídas por tecidos frescos. O sequenciamento de nucleotídeos e as análises filogenéticas realizadas nos fragmentos E5L2 resultaram na identificação de BPV1, 2 e 13 em 14 (70%), 2 (10%) e em 4 (20%) amostras de sarcoides, respectivamente. As amostras de sarcoides de um dos animais continha somente o DNA de BPV1. Entretanto, nas amostras provenientes do segundo cavalo foi possível identificar o DNA de três tipos de Deltapapillomavirus bovino (BPV1, 2 e 13) em lesões distintas. Este estudo ratifica a presença do DNA de BPV1, 2 e 13 em lesões de sarcoides em equinos, além de identificar três tipos de BPVs em um mesmo animal e descrever pela primeira vez no Brasil a presença de BPV1 e 2 nesse tipo de lesão.(AU)

Sarcoids are fibroblastic lesions, which are considered as the most common skin tumors of horses; spontaneous regression rarely occurs. The bovine papillomavirus (BPV) types 1 and 2 may be involved in the pathogenesis of sarcoids, and probably the recently described BPV type (BPV13) might be associated with the pathogenesis of this lesion. This study characterized the DNA of BPVs in sarcoids from 15 horses from Brazil by analyzing 20 cutaneous lesions (12 recently collected; 8 from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues). Histopathology confirmed the proliferative lesions as sarcoids. Three PCRs were performed to amplify papillomavirus (PV) DNA. For screening, the primers IFNR2/IDNT2 were used to amplify a fragment of the PV L1 ORF. The second primer set was complementary to a common sequence of the E5L2 genomic region of BPV1, 2, and 13. The third primer pair (FAP59/FAP64) targeted a fragment of the PVs L1 ORF. The screening and E5L2 PCRs yielded amplicons in all samples evaluated. The FAP amplicons identified BPV1, 2, and 13 only from fresh tissue samples. The phylogenetic analyses of E5L2 resulted in the identification of BPV1, 2, and 13 in 14 (70%), 2 (10%), and 4 (20%) sarcoids, respectively. Two horses demonstrated multiple lesions: the sarcoids of one of these contained only BPV1 DNA and those of the other contained three types of bovine Deltapapillomavirus (BPV1, 2, and 13). This study confirmed the presence of BPV1, 2, and 13 DNA in equine sarcoids. Moreover, these findings represent the first description of three types of BPV diagnosed in the same horse, as well as the first confirmation of BPV1 and 2 in horses from Brazil.(AU)

Carcinomas de células escamosas do trato alimentar superior de bovinos associados à intoxicação crônica por samambaia (Pteridium arachnoideum)

Os neoplasmas do trato alimentar superior (TAS) são raros em bovinos, porém em algumas regiões, como no Sul do Brasil, os carcinomas de células escamosas (CCEs) do TAS são relativamente comuns e estão associados à ocorrência concomitante de papilomas e ao consumo de samambaia. Embora haja uma teoria de patogênese que considera o papilomavírus bovino tipo 4 (BPV-4) como um co-fator no desenvolvimento desses CCEs, ainda há aspectos da etiopatogênese dessa condição a serem investigados, pois a detecção do BPV-4 em outras regiões geográficas, além das poucas previamente publicadas, é escassa. Além disso, no Brasil, os CCEs esofágicos são observados com uma apresentação macroscópica incomum, como um espessamento anelar estenosante da parede esofágica, que é diferente das formas comuns de apresentação deste tumor que são massas exofíticas ou endofíticas ulceradas ou infiltrativas. Portanto, os objetivos desta tese foram (1) analisar os aspectos epidemiológicos, clínicos e patológicos de 100 casos de CCEs do TAS em bovinos que pastejavam em áreas contaminadas por samambaia (Pteridium arachnoideum), bem como investigar as associações entre esses parâmetros; (2) investigar a presença de papilomavírus nos papilomas do TAS por reação em cadeia da polimerase (PCR) e por imuno-histoquímica; (3) e detalhar os aspectos clínicos e patológicos de 13 casos de CCEs esofágicos anelares estenosantes. No primeiro estudo, sobre os 100 casos de CCEs no TAS, associações estatisticamente significativas entre os sinais clínicos e a localização do tumor no TAS, entre o grau de diferenciação histológica e a localização do tumor e uma tendência a associação significativa entre o grau de diferenciação histológica e a presença de metástases foram observadas. A média de idade dos bovinos com CCEs orofaríngeos foi 7,39 anos, com diferença significativa quando comparado com bovinos com neoplasmas esofágicos (8,6 anos). DNA ou antígeno de papilomavírus não foram detectados nos papilomas por PCR e imuno-histoquímica, respectivamente. Desta forma, os resultados mantem aberta a possibilidade de que papilomas de TAS podem não estar associados ao papilomavírus. Assim, a infecção por BPV-4 pode não ser um co-fator no desenvolvimento dos CCEs em bovinos da região estudada. No segundo estudo, sobre os CCEs esofágicos anelares estenosantes, massas endofíticas, circunferenciais (anelares) no esôfago, com estreitamento luminal (estenose) foram observadas. Os ceratinócitos neoplásicos eram circundados por tecido conjuntivo fibroso moderado a abundante (reação desmoplástica). A coloração de Picrosírius sob luz polarizada demonstrou fibras de colágeno tipo I abundantes, que contribuiram para as características estenosantes deste tumor. Esses CCEs esofágicos devem ser incluídos no diagnóstico diferencial de estenose esofágica.

Upper digestive tract (UDT) neoplasms are rare in cattle, but in some regions, such as Southern Brazil, UDT squamous cell carcinomas (SCCs) are relatively common and have been associated with the concomitant occurrence of papillomas and the consumption of bracken fern. Although there is a theory of pathogenesis that considers bovine papillomavirus type 4 (BPV-4) as a co-factor in the development of these SCCs, some aspects of the etiopathogenesis of this condition need to be investigated, since the detection of BPV-4 in other geographic regions, in addition to the few ones previously published, is scarce. Additionally, esophageal SCCs in Brazil are observed with an uncommon gross presentation, such as an annular stenotic thickening of the esophageal wall, which is different from the usual forms of presentation of this tumor, which are exophytic or ulcerative or infiltrative endophytic neoplasms. Therefore, the aims of this thesis were (1) to analyze the epidemiological, clinical and pathological aspects of 100 cases of SCCs in the UDT of cattle grazing on bracken fern (Pteridium arachnoideum) highly contaminated areas, as well as to investigate associations between these parameters; (2) to investigate the presence of papillomavirus in the UDT papillomas by polymerase chain reaction (PCR) and by immunohistochemistry; (3) and to elucidate the clinical and pathological aspects of annular stenotic esophageal SCCs. In the first paper, about 100 cases of SCCs of the UDT, there were statistically significant associations between clinical signs and tumor localization in the UDT, between histological grade of differentiation and tumor localization, and a trend towards significant association between histological grade of differentiation and presence of metastases. The average age of cattle with oropharyngeal SCCs was 7.39 years old, with significant difference compared to cattle with esophageal SCCs (8.6 years). No papillomaviral DNA or antigen were detected in papillomas by PCR and immunohistochemistry, respectively. Therefore, these results keep open the possibility that papillomas of the UDT may not be associated with papillomavirus. Thus, the BPV-4 infection may not be a co-factor to the development the SCCs in cattle from the region studied. In the second paper, about annular stenotic esophageal SCCs, endophytic masses, circumferential (annular) within the esophageal with luminal narrowing (stenosis) were observed. The neoplastic keratinocytes were surrounded by moderate to abundant fibrous connective tissue (desmoplastic reaction). Picrosirius red-stained sections under polarized light showed abundant collagen type I fibers, which contributed to the stenosing characteristics of this tumor. These esophageal SCCs should be included in the differential diagnosis of esophageal stenosis.

OTIMIZAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO ONCOGENE E6 DE PAPILOMAVÍRUS BOVINO EM SARCOIDES EQUINOS E NEOPLASIAS EM BEXIGAS DE BOVINOS

Os papilomavírus bovino (BPV) tipos 2 e 13 estão envolvidos na etiologia do sarcoide equinos e também da hematúria enzoótica bovina. O objetivo do presente estudo foi desenvolver a técnica PCR em tempo real (qPCR), utilizando SYBR Green, para quantificar o oncogene E6 do BPV2 e 13 em quatro amostras de sarcoides de um equino e 12 amostras de lesões proliferativas de bexiga de bovinos. Avaliações histopatológicas das amostras confirmaram a presença de tumores fibroblásticos tipo sarcoide e dos carcinomas de bexiga. Com o objetivo de otimizar a qPCR, dois pares de primers foram desenvolvidos para amplificar um fragmento de 120 pb do oncogene E6, sendo um par específico para o BVP2 e outro para o BPV13, os controles positivos foram obtidos do acervo de papilomas do laboratório de virologia animal da Universidade Estadual de Londrina. O produto da amplificação deste fragmento foi clonado utilizando kit comercial e quantificado para o desenvolvimento da curva padrão. A reprodutibilidade foi analisada por meio de diluições seriadas (6x) dos produtos da clonagem do BPV2 e do BPV13. O sequenciamento dos amplicons foi realizado para confirmar a especificidade das reações. Nenhuma reação inespecífica com relação a outros tipos de BPVs foi identificada. O limite de detecção (LOD) da PCR convencional e qPCR foi avaliado testando o produto da amplificação de seis diluições seriadas dos controles positivos padrões. Os LOD para a PCR convencional para o BPV2 e 13 foram de aproximadamente 114 e 154 cópias de DNA, respectivamente, enquanto para qPCR, foram de 11,4 e 15,4 cópias de DNA viral de BPV2 e 13, respectivamente. Quatro amostras de sarcoide de um equino macho e doze fragmentos de carcinoma de bexigas bovinas foram coletadas e testadas pela nova qPCR. Amostras de swab de pele equina e mucosa de bexiga bovina sem lesão também foram testadas. O fragmento do oncogene E6 foi amplificado em 8/12 amostras de tumores de bexiga, sendo seis positivas para o BPV2, duas para o BPV13 e uma para ambos os tipos. O valor de Cq variou de 23,84 a 26,32 (1,05 x 104 até 9,53 x 103 cópias/µL) para o BPV2, e 23,41 e 24,96 (1,30 x 104 e 1,23 x 104 cópias/µL) para o BPV13. Nas amostras de sarcoide, em duas foi amplificado o oncogene E6 do BPV2, com Cq 21,16 e 21,43 (1.18 x 104 e 1.17 x 104 cópias/µL), e nas outras duas o E6 de BPV13 com Cq 18,9 e 19,1 (1.62 x 104 e 1.60 x 104 cópias/µL). O presente estudo confirmou o envolvimento do BPV2 e 13 na etiologia do sarcoide equino e na formação de lesões proliferativas em bexiga de bovinos e reforça a importância da participação do oncogene E6 de BPV2 e 13 na etiopatogenia destes tipos tumores podendo abrir novas perspectivas para o tratamento e profilaxia dessas importantes neoplasias em saúde animal.

The bovine papillomavirus (BPV) types 2 and 13 are involved in the etiology of equine sarcoids as well as bovine enzootic hematuria. The aim of this study was to standardize a realtime PCR (qPCR), using SYBR Green, to quantify the E6 oncogene of BPV2 and 13 in four equine sarcoid samples and 12 samples of urinary bladder tumors in cattle. Histopathological evaluations confirmed the presence of fibroblastic proliferation in sarcoid tumors and bladder tumors. In order to standardize qPCR, two primer pairs were designed to amplify a 120 bp fragment of the E6 oncogene, a specific pair for BPV2 and another for BPV13, positives controls were obtained from the collection of laboratory of virology animal of State University of Londrina. The amplification product of this fragment was cloned using commercial kit, and quantified for development of the standard curve. Reproducibility was analyzed using six-fold serial dilutions of the cloning products of BPV2 and 13. Sequencing was performed to confirm the specificities of the reactions. No cross-reaction was detected with other BPVs. The limit of detection (LOD) of the standard PCR and qPCR was evaluated by testing the amplification product of six serial dilutions of the standard positive controls. The LODs for conventional PCR for BPV2 and 13 were approximately 114 and 154 copies of DNA, respectively, whereas for qPCR, LODs were 11.4 and 15.4 copies of BPV2 and 13 viral DNA, respectively. Four sarcoid samples from one male equine and twelve bovine bladder carcinoma fragments were collected and tested by the new qPCR. Equine skin swab samples and lesionless bovine bladder mucosa were also tested. The E6 oncogene fragment was amplified in 9/12 samples of urinary bladder tumors, six of which were positive for BPV2, two were positive for BPV13 and one for both BPVs types, the Cq ranged from 23.84 to 26.32 (1.05 x 104 to 9.53 x 103 copies/µL) for BPV2 and 23.41 to 24.96 (1.30 x 104 to 1.23 x 104 copies/µL) for BPV13. In the sarcoid samples, the oncogene E6 of BPV2 were amplified in two samples, the Cq were 21.16 and 21.43 (1.18 x 104 to 1.17 x 104 copies/µL), and the other two samples were obtained BPV13 amplified with Cq 18.9 and 19.1 (1.62 x 104 and 1.60 x 104 copies/µL). The present study confirmed the involvement of BPV2 and 13 in the etiology of equine sarcoid and in the formation of urinary bladder lesions in cattle and reinforces the importance of the participation of BPV2 and BPV13 E6 oncogene in the etiopathogenesis of these two types of tumors and may open new perspectives for the treatment and prophylaxis of these important neoplasia in animal health.

Relação entre a linfopenia e a persistência da papilomatose alimentar em bovinos intoxicados crônica e espontaneamente por samambaia (Pteridium aquilinum) / Relationship between lymphopenia and the persistence of alimentary papillomatosis in cattle chronically and spontaneously poisoned by bracken fern (Pteridium aquilinum)

Papilomavírus bovino tipo 4 (BPV-4) é responsável pelo desenvolvimento de papilomas no trato alimentar superior (TAS) de bovinos. Os passos necessários para o crescimento, o desenvolvimento e a regressão dos papilomas estão intimamente relacionados com o estado imunológico do animal. A ingestão de samambaia (Pteridium aquilinum) tem sido relacionada como o principal fator envolvido na persistência da infecção pelo BPV-4 no TAS. A teoria que estabelece a relação entre papilomatose alimentar e a formação de CCEs sugere a produção de um estado imunossupressivo crônico pela planta, permitindo a persistência dos papilomas no TAS. Os papilomas serviriam então como sítios de desenvolvimento dos CCEs através da interação entre as proteínas do BPV-4 e os carcinógenos da samambaia. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a quantidade de linfócitos circulantes e a papilomatose alimentar em casos de intoxicação espontânea crônica por P. aquilinum em bovinos com CCE no TAS. Quarenta bovinos com CCEs no TAS foram avaliados quanto à idade, à intensidade da papilomatose alimentar no TAS e ao leucograma. Três bovinos tinham leucopenia e um apresentava neutrofilia. A média de linfócitos foi de 5.395 (±1.696) na papilomatose leve, 4.560 (±1.561) na moderada e 5.007 (±1.786) na acentuada. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o grau de papilomatose, a idade e a quantidade de linfócitos circulantes. Imunossupressão por linfopenia foi um achado esporádico (três casos) neste estudo. Os resultados indicam que a persistência da papilomatose alimentar em casos espontâneos de intoxicação crônica por samambaia em bovinos não tem relação com a quantidade de linfócitos circulantes e que talvez esteja relacionada a outros fatores imunológicos.(AU)

Bovine papillomavirus type-4 (BPV-4) is responsible for the development of papillomas in the upper digestive tract (UDT) of cattle. The necessary steps for the development, growth and regression of papillomas are intimately related with the immunological status of the animal. The consumption of bracken fern (Pteridium aquilinum) has been pointed out as the major factor involved in the persistence of BPV-4 infection of the UDT. The theory involving the relationship between alimentary papillomas and the formation of squamous cell carcinomas (SCCs) suggests the persistence of alimentary papillomatosis through a chronic immunosupressive lymphopenic state induced by bracken fern. The papillomas would serve then as a development site of SCCs through the interaction of BPV-4 oncoproteins and bracken carcinogens. The objective of this study was to evaluate the relationship between lymphopenia and alimentary papillomatosis in spontaneous cases of chronic bracken fern poisoning of cattle. The age, intensity of papillomatosis and the leukon were evaluated of 40 cattle with SCCs of the UDT. Three animals had leukopenia and one had neutrophilia. The mean lymphocyte count (and standart deviation) of mild, moderate and severe papillomatosis was 5,395(±1,696)/mm³, 4,560(±1,561)/mm³ and 5,007(±1,786)/mm³, respectively. There were no statistically significant differences between the intensity of alimentary papillomasis, age and the lymphocyte count. Immunosupression by lymphopenia was a sporadic finding (three cases) in the present study. The results demonstrate that the persistence of alimentary papilomatosis in spontaneous cases of bracken fern-related SCCs of the UDT is not related to lymphopenia and it may be related to other immunological factors.(AU)

Sarcoide equino associado ao papilomavírus bovino BR-UEL-4

A 3-year-old, mixed breed, male horse showed multiple nodules in different areas of the skin. Lesions occurred predominantly on the lips, cheeks, and submandibular and right inguinal regions. The nodules were characterized as mixed, fibroblastic, verrucous and occult types of sarcoid. Histologically there was proliferation of dermal fibroblasts, with or without pseudoepitheliomatous hyperplasia of the epidermis (frequently ulcerated), and formation of small isolated groups of neoplastic fibroblasts in the superficial dermis. Three tissue samples were submitted to DNA extraction and PCR amplification with generic primers for the internal region of the papillomavirus L1 gene. The amplified products from two samples were sequenced and showed 99% identity with the bovine papillomavirus (BPV) BR-UEL-4. This is the first description of BPV BR-UEL-4 infecting a horse and causing sarcoid in this species. BPV BR-UEL-4 is a putative new BPV type recently identified in skin papillomas in a Brazilian cattle herd.

Um equino, sem raça definida, macho com três anos de idade apresentou múltiplos nódulos na pele, em diversas regiões do corpo. As lesões localizavam-se predominantemente nos lábios, nas bochechas, na região submandibular e na região inguinal direita. Os tumores caracterizavam-se como sarcoides dos tipos misto, fibroblástico, verrucoso e oculto. Histologicamente apresentaram proliferação de fibroblastos dérmicos, muitas vezes ulcerado, com ou sem hiperplasia pseudoepiteliomatosa da epiderme e formação de pequenos grupos isolados de fibroblastos neoplásicos na derme superficial. Três amostras de tecido foram submetidas à extração de DNA e amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores genéricos direcionados para uma região interna do gene L1 dos papilomavírus. Os produtos resultantes da amplificação de duas amostras foram sequenciados e demonstraram identidade de 99% com o papilomavírus bovino (BPV) BR-UEL-4. Essa é a primeira descrição da infecção de equinos, bem como de sua associação com sarcoide pelo BPV BR-UEL-4, um suposto novo tipo de BPV identificado recentemente no Brasil a partir de papilomas cutâneos em bovinos.

Sarcoide equino associado ao papilomavírus bovino BR-UEL-4

A 3-year-old, mixed breed, male horse showed multiple nodules in different areas of the skin. Lesions occurred predominantly on the lips, cheeks, and submandibular and right inguinal regions. The nodules were characterized as mixed, fibroblastic, verrucous and occult types of sarcoid. Histologically there was proliferation of dermal fibroblasts, with or without pseudoepitheliomatous hyperplasia of the epidermis (frequently ulcerated), and formation of small isolated groups of neoplastic fibroblasts in the superficial dermis. Three tissue samples were submitted to DNA extraction and PCR amplification with generic primers for the internal region of the papillomavirus L1 gene. The amplified products from two samples were sequenced and showed 99% identity with the bovine papillomavirus (BPV) BR-UEL-4. This is the first description of BPV BR-UEL-4 infecting a horse and causing sarcoid in this species. BPV BR-UEL-4 is a putative new BPV type recently identified in skin papillomas in a Brazilian cattle herd.

Um equino, sem raça definida, macho com três anos de idade apresentou múltiplos nódulos na pele, em diversas regiões do corpo. As lesões localizavam-se predominantemente nos lábios, nas bochechas, na região submandibular e na região inguinal direita. Os tumores caracterizavam-se como sarcoides dos tipos misto, fibroblástico, verrucoso e oculto. Histologicamente apresentaram proliferação de fibroblastos dérmicos, muitas vezes ulcerado, com ou sem hiperplasia pseudoepiteliomatosa da epiderme e formação de pequenos grupos isolados de fibroblastos neoplásicos na derme superficial. Três amostras de tecido foram submetidas à extração de DNA e amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores genéricos direcionados para uma região interna do gene L1 dos papilomavírus. Os produtos resultantes da amplificação de duas amostras foram sequenciados e demonstraram identidade de 99% com o papilomavírus bovino (BPV) BR-UEL-4. Essa é a primeira descrição da infecção de equinos, bem como de sua associação com sarcoide pelo BPV BR-UEL-4, um suposto novo tipo de BPV identificado recentemente no Brasil a partir de papilomas cutâneos em bovinos.

Bovine papillomavirus type 4 L1 gene transfection in a Drosophila S2 cell expression system: absence of L1 protein expression

The development of a bovine papillomavirus (BPV) vaccine is an outstanding challenge. BPV protein L1 gene transfection in the Drosophila melanogaster S2 cell expression system failed to produce L1 protein notwithstanding correct L1 gene insertion. Severe genetic inbalance in the host cell line, including cytogenetic alterations, may account for the lack of protein expression.

O desenvolvimento de uma vacina para papilomavirus bovino (BPV) consiste em grande desafio. A transfecção do gene codificante da proteína L1 de BPV em sistema de células S2 de Drosophila melanogaster não logrou sucesso, apesar da correta inserção da seqüência gênica em vetor apropriado.Graves alterações genéticas na linhagem celular S2, que incluem aberrações cromossômicas, provavelmente estão relacionadas à ausência da expressão da proteína desejada.

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ

Os papilomavírus (PVs) pertencem a um grupo heterogêneo de vírus DNA epitéliotrópicos, que infectam as células basais induzindo-as à formação de lesões neoplásicas, conhecidas como papilomas ou verrugas, nos epitélios cutâneo e mucoso. A família Papillomaviridae é constituída por 16 gêneros e mais de uma centena de tipos virais. Até o momento foram caracterizados apenas seis tipos de papilomavírus bovino (BPV-1 a BPV-6), que estão incluídos nos gêneros Delta-papillomavirus (BPV-1 e 2), Episilon-papillomavirus (BPV-5) e Xi-papillomavírus (BPV-3, 4 e 6). Considerando o tropismo celular e as lesões ocasionadas, os seis tipos de BPV podem ser classificados em dois subgrupos. O subgrupo A (BPV-1, 2 e 5) compreende os fibropapilomavírus e o subgrupo B (BPV-3, 4 e 6) os papilomavírus epiteliotrópicos. A ORF L1 é o gene mais conservado no genoma do papilomavírus e tem sido utilizada para a identificação dos tipos de BPV mais freqüentes em uma região e também de novos tipos virais. Os primers genéricos FAP59 e FAP64 foram utilizados para a amplificação de um fragmento com 478 pb do gene L1 do papilomavirus em nove amostras de papilomas cutâneos obtidos de seis animais provenientes de quatro rebanhos bovinos da região norte do Estado do Paraná. Em todas as amostras foi possível a amplificação de um produto de tamanho molecular esperado. Por meio da análise filogenética das seqüências foi possível identificar o BPV-2 em três amostras, o BPV-1 em uma e o BPV-6 em cinco amostras. O BPV-6 foi encontrado, tanto em papilomas cutâneos presentes no teto, quanto em outras partes do corpo. Em um dos animais, onde foram colhidas mais de uma amostra, foi encontrada infecção mista com o BPV-1 e BPV-2. As cinco amostras positivas para o BPV-6 apresentaram 100% de similaridade na matriz de identidade com a amostra padrão, porém foram identificadas divergências entre as amostras do BPV-2 e BPV-1 e aquelas depositadas em bases públicas de dados. As amostras do BPV-2, quando comparadas entre si, mostraram-se diferentes demonstrando o envolvimento de duas variantes virais