Clinical safety of treatment with Zileuton, 5-Lox inhibitor, during acute inflammatory reaction in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) / Segurança clínica do tratamento com Zileuton, inibidor 5-Lox, durante reação inflamatória aguda em Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)

Zileuton is an inhibitor of the 5-lipoxygenase enzyme that transforms essential fatty acid (EFA) substrates into leukotrienes (LTB4, LTC4, LTD4 and LTE4), but little is known about the use of this drug in teleost fish. Therefore, the objective of this study was to evaluate the clinical safety of treatments with 2,25 mg and 4,50 mg of zileuton/Kg-1 (bodyweight), administered orally in the diet, through biochemical and hematological analysis during the acute inflammatory reaction in Nile tilapia (Oreochromis niloticus), induced by Aeromonas hydrophila bacterins. The study used eighty tilapias, conditioned in 20 tanks (n=4), constituting the following treatments: T0 (control), T1 (2,25 mg zileuton) and T2 (4,50 mg zileuton), being sampled eight animals per treatment in three periods: 6, 24 and 48 hours post-inoculation, and a 10th group consisting of fish without any type of stimulus to obtain the reference values. In order to evaluate and determine the blood count and serum biochemical, it was necessary to collect blood samples. The hematology results of the tilapia treated with zileuton did not reveal alterations between tilapia subjected to different treatments and control fish (T0). The liver cytotoxicity analysis of tilapias treated with zileuton did not reveal significant (p≥0,05) alterations in AST and ALT serum enzymatic activity. The study of tilapia blood total protein showed decrease in the T1 group at 48 HPI. As the treatment time progressed, the results indicated decrease in the serum albumin levels for T2 group at 24 HPI. The determination of serum biochemichal of creatinine, cholesterol, triglycerides, and glucose did not differ statistically between treatments. The results observed in the hematological and biochemical analyzes allows to conclude that zileuton administered orally, at doses of 2,25 and 4,50 mg/Kg-1 (body weight) demonstrated to be clinically safe.(AU)

Clinical safety of zafirlukast treatment during acute inflammatory reaction in nile tilapia (Oreochromis niloticus) / Segurança clínica do tratamento com zafirlucaste durante a reação inflamatória aguda em tilápia do nilo (Oreochromis niloticus)

Little is known about the toxicity of immune modulators in fish. Zafirlukast is an anti-inflammatory that antagonizes cysteine leukotriene receptors (CysLTR1). Aiming to study immunomodulatory treatments on fish health, this study evaluated the clinical safety of oral zafirlukast treatment, through biochemical and hematological analyzes during acute inflammatory reaction in Nile tilapia (Oreochromis niloticus), induced by Aeromonas hydrophila bacterins. 72 young tilapias were randomly divided in 9 aquariums (100 L each, n=8) to compose the following treatments: T0 (control), T1 (Treatment with 250 µg zafirlukast) and T2 (Treatment with 500 µg zafirlukast). Eight animals were evaluated per treatment in three periods: six, 24 and 48 hours post-inoculation (HPI), blood collection was performed for hematological and serum biochemical evaluation. The study of hepatic and renal functionality revealed that treatment with both doses of zafirlukast did not result in changes in the circulating values of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase, creatinine, triglycerides, cholesterol, and total protein, suggesting that the drug has not presented hepatotoxicity, as well as compromised liver and kidney functions. Tilapia submitted to treatment with 500 µg showed adverse hematological effects characterized by polycythemia associated with microcytosis. Therefore, oral treatment with zafirlukast has demonstrated clinical safety at a therapeutic dose of 250 µg in tilapia during acute aerocystitis, although hematological changes were observed in tilapia treated with overdose of this leukotriene blocker

Pouco se sabe sobre a toxicidade de imunomoduladores em peixes. Zafirlukast é um anti-inflamatório que antagoniza os receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLTR1). Com o objetivo de estudar o efeito de tratamentos imunomoduladores sobre a saúde dos peixes, este estudo avaliou a segurança clínica do tratamento com zafirlucaste oral, por meio de análises bioquímicas e hematológicas durante reação inflamatória aguda em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), induzida por bacterinas de Aeromonas hydrophila. Para tal, 72 tilápias jovens foram divididas aleatoriamente em 9 aquários (100 L cada, n=8) para compor os seguintes tratamentos: T0 (controle), T1 (Tratamento com 250 µg de zafirlucaste) e T2 (Tratamento com 500 µg de zafirlucaste). Oito animais foram avaliados por tratamento em três períodos: seis, 24 e 48 horas pós-inoculação (HPI), foi realizada coleta de sangue para avaliação hematológica e bioquímica sérica. O estudo da funcionalidade hepática e renal revelou que o tratamento com ambas as doses de zafirlucaste não resultou em alterações nos valores circulantes de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, creatinina, triglicerídeos, colesterol e proteína total, sugerindo que a droga não comprometeu as funções hepáticas e renais. As tilápias tratadas com 500 µg apresentaram efeitos hematológicos adversos caracterizados por policitemia associada a microcitose. Portanto, o tratamento oral com zafirlucaste demonstrou segurança clínica na dose de 250 µg em tilápias durante aerocistite aguda, embora alterações hematológicas tenham sido observadas em tilápias tratadas com sobredosagem deste bloqueador de leucotrieno.

Clinical safety of zafirlukast treatment during acute inflammatory reaction in nile tilapia (Oreochromis niloticus) / Segurança clínica do tratamento com zafirlucaste durante a reação inflamatória aguda em tilápia do nilo (Oreochromis niloticus)

Little is known about the toxicity of immune modulators in fish. Zafirlukast is an anti-inflammatory that antagonizes cysteine leukotriene receptors (CysLTR1). Aiming to study immunomodulatory treatments on fish health, this study evaluated the clinical safety of oral zafirlukast treatment, through biochemical and hematological analyzes during acute inflammatory reaction in Nile tilapia (Oreochromis niloticus), induced by Aeromonas hydrophila bacterins. 72 young tilapias were randomly divided in 9 aquariums (100 L each, n=8) to compose the following treatments: T0 (control), T1 (Treatment with 250 µg zafirlukast) and T2 (Treatment with 500 µg zafirlukast). Eight animals were evaluated per treatment in three periods: six, 24 and 48 hours post-inoculation (HPI), blood collection was performed for hematological and serum biochemical evaluation. The study of hepatic and renal functionality revealed that treatment with both doses of zafirlukast did not result in changes in the circulating values of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase, creatinine, triglycerides, cholesterol, and total protein, suggesting that the drug has not presented hepatotoxicity, as well as compromised liver and kidney functions. Tilapia submitted to treatment with 500 µg showed adverse hematological effects characterized by polycythemia associated with microcytosis. Therefore, oral treatment with zafirlukast has demonstrated clinical safety at a therapeutic dose of 250 µg in tilapia during acute aerocystitis, although hematological changes were observed in tilapia treated with overdose of this leukotriene blocker(AU)

Pouco se sabe sobre a toxicidade de imunomoduladores em peixes. Zafirlukast é um anti-inflamatório que antagoniza os receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLTR1). Com o objetivo de estudar o efeito de tratamentos imunomoduladores sobre a saúde dos peixes, este estudo avaliou a segurança clínica do tratamento com zafirlucaste oral, por meio de análises bioquímicas e hematológicas durante reação inflamatória aguda em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), induzida por bacterinas de Aeromonas hydrophila. Para tal, 72 tilápias jovens foram divididas aleatoriamente em 9 aquários (100 L cada, n=8) para compor os seguintes tratamentos: T0 (controle), T1 (Tratamento com 250 µg de zafirlucaste) e T2 (Tratamento com 500 µg de zafirlucaste). Oito animais foram avaliados por tratamento em três períodos: seis, 24 e 48 horas pós-inoculação (HPI), foi realizada coleta de sangue para avaliação hematológica e bioquímica sérica. O estudo da funcionalidade hepática e renal revelou que o tratamento com ambas as doses de zafirlucaste não resultou em alterações nos valores circulantes de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, creatinina, triglicerídeos, colesterol e proteína total, sugerindo que a droga não comprometeu as funções hepáticas e renais. As tilápias tratadas com 500 µg apresentaram efeitos hematológicos adversos caracterizados por policitemia associada a microcitose. Portanto, o tratamento oral com zafirlucaste demonstrou segurança clínica na dose de 250 µg em tilápias durante aerocistite aguda, embora alterações hematológicas tenham sido observadas em tilápias tratadas com sobredosagem deste bloqueador de leucotrieno.(AU)

Bovine genital campylobacteriosis: main features and perspectives for diagnosis and control / Campilobacteriose genital bovina: principais características e perspectivas para o diagnóstico e controle

Bovine genital campylobacteriosis (BGC) is a venereal disease caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis. In countries with large cattle herds, such as Brazil, where the use of natural breeding as a reproductive strategy is a common practice, BGC is considered an important cause of reproductive failure and economic losses. In these cases, the bull is the asymptomatic carrier of the bacterium and the infected females can have infertility and even abortions. The techniques for the diagnosis of C. fetus are isolation in culture medium and identification by biochemical tests, immunofluorescence, immunoenzymatic assays and molecular techniques. Disease control is based on vaccination with bacterins. This review described the epidemiology, etiology, pathogenesis, and advances in the diagnosis and control of BGC.(AU)

A campilobacteriose genital bovina (CGB) é uma importante enfermidade de caráter venéreo causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis. Em países com grandes rebanhos bovinos, como o Brasil, onde o uso da monta natural como estratégia reprodutiva é uma prática corrente, a CGB é considerada uma importante causa de falhas reprodutivas e perdas econômicas. Nestes casos, o touro é o portador assintomático da bactéria e as fêmeas infectadas podem apresentar infertilidade e até mesmo abortos. As técnicas para o diagnóstico de C. fetus são o isolamento em meio de cultura e identificação por testes bioquímicos; imunofluorescência; ensaios imunoenzimáticos e técnicas moleculares. O controle da doença é baseado em vacinação. Neste sentido, esta revisão consiste em uma abordagem sobre a epidemiologia, a etiologia, a patogenia, os avanços no diagnóstico e controle da CGB.(AU)

Protection efficacy of the rLTB-R1 chimera against experimental swine mycoplasmal pneumonia

Background: Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of the Swine Mycoplasmal Pneumonia (SMP), one ofthe most economically significant diseases in the swine industry worldwide. Commonly used vaccines for SMP controlconsist of inactivated whole cells (bacterins). These vaccines are efficacious against M. hyopneumoniae challenge, but donot prevent colonization by the pathogen or completely eliminate pneumonia. P97 adhesin is conserved in the M. pneumoniae virulent strains, therefore it is an attractive target to be used in recombinant vaccines against M. hyopneumoniae.The aim of the present study was to evaluate protection afforded by rLTB-R1, a recombinant chimera composed by LTBfused with the R1 repeat region of P97 adhesin of M. hyopneumoniae, in specific-pathogen-free (SPF) piglets vaccinatedby intranasal or intramuscular route and challenged with a pathogenic strain of M. hyopneumoniae.Materials, Methods & Results: PCR products of the LTB and R1 coding sequences were fused, then cloned into pETDEST42™ expression vector. The rLTB-R1 was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) Salt induction (SI). The pigletswere divided into three groups: four piglets were intranasally vaccinated with 1 mg of rLTB-R1 solubilized in 1 mL of PBSat 0 and 14 days (IN rLTB-R1 group); four piglets were intramuscularly vaccinated with 1 mg of rLTB-R1 solubilized in 1mL of PBS at 0 and 14 days (IM rLTB-R1 group); three piglets were intranasally and intramuscularly inoculated with 1 mLof PBS (control group). Two weeks after the last immunization (28 day), piglets were intratracheally challenged with 10 mLof a suspension containing 109 color-changing unit (CCU) of pathogenic M. hyopneumoniae 7448 strain on three consecutivedays. Until the challenge (28 days), intranasal and intramuscular vaccination with rLTB-R1 induced seroconversions of antiR1 systemic antibodies of 1.6 and 4.6 ×, respectively. The IN rLTB-R1...(AU)

Protection efficacy of the rLTB-R1 chimera against experimental swine mycoplasmal pneumonia

Background: Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of the Swine Mycoplasmal Pneumonia (SMP), one ofthe most economically significant diseases in the swine industry worldwide. Commonly used vaccines for SMP controlconsist of inactivated whole cells (bacterins). These vaccines are efficacious against M. hyopneumoniae challenge, but donot prevent colonization by the pathogen or completely eliminate pneumonia. P97 adhesin is conserved in the M. pneumoniae virulent strains, therefore it is an attractive target to be used in recombinant vaccines against M. hyopneumoniae.The aim of the present study was to evaluate protection afforded by rLTB-R1, a recombinant chimera composed by LTBfused with the R1 repeat region of P97 adhesin of M. hyopneumoniae, in specific-pathogen-free (SPF) piglets vaccinatedby intranasal or intramuscular route and challenged with a pathogenic strain of M. hyopneumoniae.Materials, Methods & Results: PCR products of the LTB and R1 coding sequences were fused, then cloned into pETDEST42™ expression vector. The rLTB-R1 was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) Salt induction (SI). The pigletswere divided into three groups: four piglets were intranasally vaccinated with 1 mg of rLTB-R1 solubilized in 1 mL of PBSat 0 and 14 days (IN rLTB-R1 group); four piglets were intramuscularly vaccinated with 1 mg of rLTB-R1 solubilized in 1mL of PBS at 0 and 14 days (IM rLTB-R1 group); three piglets were intranasally and intramuscularly inoculated with 1 mLof PBS (control group). Two weeks after the last immunization (28 day), piglets were intratracheally challenged with 10 mLof a suspension containing 109 color-changing unit (CCU) of pathogenic M. hyopneumoniae 7448 strain on three consecutivedays. Until the challenge (28 days), intranasal and intramuscular vaccination with rLTB-R1 induced seroconversions of antiR1 systemic antibodies of 1.6 and 4.6 ×, respectively. The IN rLTB-R1...

Protective efficacy of commercial vaccines against a virulent field strain of Clostridium chauvoei / Eficácia protetiva de vacinas comerciais contra uma cepa de campo virulenta de Clostridium chauvoei

Blackleg is an acute and frequently fatal infection that mainly affects cattle and is caused by Clostridium chauvoei. Formalin-killed, whole-cell vaccines are commonly used to control blackleg. The aim of this study was to verify the protective efficacy of two commercial vaccines against the infection of guinea pigs with two strains of C. chauvoei, a virulent field strain (SBP 07/09) and the reference strain used in official tests (Manguinhos-Teixeira or MT). The strains used in the challenge were characterized by whole genome sequencing, and the minimal inhibitory concentrations of 15 antimicrobials were determined. To assess the protective efficacy, guinea pigs were vaccinated and subsequently challenged with C. chauvoei. All four vaccinated and challenged groups seroconverted after vaccination, while the control group remained seronegative, as determined by indirect ELISA. The identical performance of the two C. chauvoei strains in terms of virulence after challenge and their inability to infect vaccinated animals was correlated with their high genetic homology. Both commercial vaccines showed good protective efficacy against both the reference and field strains. Although C. chauvoei vaccination failures have been reported, the results from our study and others reported high similarity among C. chauvoei strains from all over the world, which suggests that the vaccine failures are not due to antigenic variability but inadequate vaccine management.(AU)

O carbúnculo sintomático é uma infecção aguda e frequentemente fatal que afeta principalmente os bovinos, causada pelo Clostridium chauvoei. A administração de vacinas formolizadas compostas pelas células bacterianas inteiras é comumente utilizada no controle desta doença. O objetivo deste estudo foi verificar, em cobaios, a eficácia protetiva de duas vacinas comerciais contra duas cepas de Clostridium chauvoei, uma cepa de campo virulenta (SBP 07/09) e a cepa de referência utilizada nos testes oficiais (MT, Manguinhos-Teixeira). Adicionalmente, realizar a caracterização das cepas utilizadas no desafio pelo sequenciamento completo do genoma e pela determinação da concentração inibitória mínima frente a 15 antimicrobianos. Para tanto, os cobaios foram vacinados e subsequentemente desafiados com. Os quatro grupos vacinados e desafiados soroconverteram, enquanto que o grupo controle permaneceu soronegativo pelo teste de ELISA indireto. O desempenho idêntico das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados está correlacionado com a homologia genética das cepas. Além disso, ambas as vacinas comerciais demonstraram uma adequada eficácia protetiva contra as cepas de campo e de referência. Embora o insucesso das vacinações contra C. chauvoei tenha sido previamente relatado, os resultados deste estudo, juntamente com a alta similaridade genética reportada previamente em cepas provenientes de diferentes continentes sugerem que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica, mas sim ao manejo vacinal inadequado.(AU)

Protective efficacy of commercial vaccines against a virulent field strain of Clostridium chauvoei / Eficácia protetiva de vacinas comerciais contra uma cepa de campo virulenta de Clostridium chauvoei

Blackleg is an acute and frequently fatal infection that mainly affects cattle and is caused by Clostridium chauvoei. Formalin-killed, whole-cell vaccines are commonly used to control blackleg. The aim of this study was to verify the protective efficacy of two commercial vaccines against the infection of guinea pigs with two strains of C. chauvoei, a virulent field strain (SBP 07/09) and the reference strain used in official tests (Manguinhos-Teixeira or MT). The strains used in the challenge were characterized by whole genome sequencing, and the minimal inhibitory concentrations of 15 antimicrobials were determined. To assess the protective efficacy, guinea pigs were vaccinated and subsequently challenged with C. chauvoei. All four vaccinated and challenged groups seroconverted after vaccination, while the control group remained seronegative, as determined by indirect ELISA. The identical performance of the two C. chauvoei strains in terms of virulence after challenge and their inability to infect vaccinated animals was correlated with their high genetic homology. Both commercial vaccines showed good protective efficacy against both the reference and field strains. Although C. chauvoei vaccination failures have been reported, the results from our study and others reported high similarity among C. chauvoei strains from all over the world, which suggests that the vaccine failures are not due to antigenic variability but inadequate vaccine management.

O carbúnculo sintomático é uma infecção aguda e frequentemente fatal que afeta principalmente os bovinos, causada pelo Clostridium chauvoei. A administração de vacinas formolizadas compostas pelas células bacterianas inteiras é comumente utilizada no controle desta doença. O objetivo deste estudo foi verificar, em cobaios, a eficácia protetiva de duas vacinas comerciais contra duas cepas de Clostridium chauvoei, uma cepa de campo virulenta (SBP 07/09) e a cepa de referência utilizada nos testes oficiais (MT, Manguinhos-Teixeira). Adicionalmente, realizar a caracterização das cepas utilizadas no desafio pelo sequenciamento completo do genoma e pela determinação da concentração inibitória mínima frente a 15 antimicrobianos. Para tanto, os cobaios foram vacinados e subsequentemente desafiados com. Os quatro grupos vacinados e desafiados soroconverteram, enquanto que o grupo controle permaneceu soronegativo pelo teste de ELISA indireto. O desempenho idêntico das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados está correlacionado com a homologia genética das cepas. Além disso, ambas as vacinas comerciais demonstraram uma adequada eficácia protetiva contra as cepas de campo e de referência. Embora o insucesso das vacinações contra C. chauvoei tenha sido previamente relatado, os resultados deste estudo, juntamente com a alta similaridade genética reportada previamente em cepas provenientes de diferentes continentes sugerem que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica, mas sim ao manejo vacinal inadequado.

Efficacy of leptospiral commercial vaccines on the protection against an autochtonous strain recovered in Brazil

Abstract In swine and bovines, leptospirosis prevention and control is carried out via vaccination of susceptible animals using bacterins. However, the efficiency of leptospirosis vaccines has been questioned. This work aimed to investigate the potency of five leptospirosis vaccines sold commercially in Brazil, challenging the animals with one autochthonous strain of Leptospira, Canicola serovar, denoted LO4, isolated from swine. The standard protocol was followed, and renal carriers of Leptospira were identified among the surviving animals by culture and PCR. Of the five vaccines tested, only two proved effective. None of the surviving animals was positive by culture; however, one animal was positive by PCR. Three of the five vaccines sold commercially in Brazil for the immunization of swine or bovines failed the test of the efficacy to protect the vaccinated animals following challenge with an autochthonous Leptospira strain, Canicola serovar. The two vaccines provided protection against the renal carrier state in the surviving animals. The criteria used to produce leptospirosis bacterins sold commercially in Brazil must be reviewed. The industry should support researches on leptospiral vaccinology to improve the quality of the present vaccines and discover new immunogenic strains, because it is known that vaccination is one of the most important tools to increase the reproduction rates in livestock.

Efficacy of leptospiral commercial vaccines on the protection against an autochtonous strain recovered in Brazil

In swine and bovines, leptospirosis prevention and control is carried out via vaccination of susceptible animals using bacterins. However, the efficiency of leptospirosis vaccines has been questioned. This work aimed to investigate the potency of five leptospirosis vaccines sold commercially in Brazil, challenging the animals with one autochthonous strain of Leptospira, Canicola serovar, denoted LO4, isolated from swine. The standard protocol was followed, and renal carriers of Leptospira were identified among the surviving animals by culture and PCR. Of the five vaccines tested, only two proved effective. None of the surviving animals was positive by culture; however, one animal was positive by PCR. Three of the five vaccines sold commercially in Brazil for the immunization of swine or bovines failed the test of the efficacy to protect the vaccinated animals following challenge with an autochthonous Leptospira strain, Canicola serovar. The two vaccines provided protection against the renal carrier state in the surviving animals. The criteria used to produce leptospirosis bacterins sold commercially in Brazil must be reviewed. The industry should support researches on leptospiral vaccinology to improve the quality of the present vaccines and discover new immunogenic strains, because it is known that vaccination is one of the most important tools to increase the reproduction rates in livestock.(AU)

Desenvolvimento de uma vacina de subunidade contra a leptospirose

A leptospirose é uma zoonose reemergente de grande impacto na saúde animal e pública, que tem como agente etiológico às espécies patogênicas do gênero Leptospira. As vacinas comerciais contra esta doença são preparações de culturas de leptospiras de sorovares patogênicos, inativadas pela ação do calor ou formol (bacterinas). Estas vacinas são sorovar específicas e estimulam predominantemente a resposta imune humoral, reforçando a necessidade de revacinação anual para manter os níveis de anticorpos protetores. Além disso, há controvérsias sobre este tipo de vacina em relação à inibição da colonização renal. Por isso, novos antígenos têm sido avaliados para compor uma vacina mais eficaz contra a leptospirose, que confira proteção contra as diversas espécies patogênicas, previna a colonização bacteriana, gere resposta imune duradoura e apresente mínimos efeitos adversos. Os candidatos vacinais mais promissores são as proteínas de superfície LigA e LigB (Leptospiral immunoglobulin-like proteins), que são expressas durante a infecção e participam dos mecanismos de adesão às células do hospedeiro. Outra proteína promissora é a LcpA (Leptospiral complement regulator-acquiring protein A), cuja função é a interação com o fator regulador C4BP, sugerindo uma estratégia das leptospiras de evasão do sistema complemento. LcpA é conservada entre as espécies patogênicas e expressa durante o curso da infecção, sugerindo um papel potencial como antígeno vacinal. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi desenvolver uma vacina de subunidade contra a leptospirose utilizando as proteínas recombinantes LigAC (porção C-terminal da proteína LigA) e a proteína LcpA como antígenos. Com o intuito de aumentar a imunogenicidade destas proteínas, através do melhoramento da eficiência dos mecanismos de captura, processamento e apresentação do antígeno ao sistema imune, foram utilizadas duas estratégias vacinais. A primeira consistiu na fusão das proteínas ao domínio ZZ da proteína A de Staphylococcus aureus, capaz de se ligar à região Fc das imunoglobulinas; e ao domínio R da toxina diftérica (DTR), um ligante à heparam sulfato. A segunda estratégia consistiu na utilização de três adjuvantes: hidróxido de alumínio (Alum), CpG-ODN (agonista de TLR-9) e o anticorpo monoclonal anti-MHC II (clone 14.4.4S). Os resultados obtidos mostraram que a formulação vacinal contendo a proteína LcpA fusionada aos domínios ZZ e DTR mais Alum foi capaz de induzir 100% e 60% de proteção contra a morte nos desafios homólogo e heterólogo, respectivamente. A proteína LcpA não fusionada induziu proteção parcial (60%) na presença de Alum. Estes resultados sugerem que os domínios ZZ e DTR são capazes de apresentar o antígeno de maneira mais eficiente. As formulações vacinais contendo LigAC e LcpA fusionadas aos domínios, independente do adjuvante utilizado, foram capazes de induzir proteção contra a morte, mas não foram capazes de inibir a colonização renal, apesar dos altos títulos de anticorpos, direcionados principalmente à proteína LigAC. Assim, conclui-se que as proteínas LigAC e LcpA fusionadas aos domínios ZZ e DTR são candidatos vacinais promissores; e que outras estratégias vacinais utilizando essas proteínas precisam ser testadas para melhorar a imunogenicidade das mesmas e conseguir imunidade esterilizante contra a leptospirose.

Leptospirosis is a reemerging zoonosis of great impact in animal and public health, which has the pathogenic species of genus Leptospira as its etiological agent. Commercial vaccines against this disease consist of leptospiral culture preparations from pathogenic serovars, inactivated by heat or formaldehyde (bacterins). These vaccines are serovar specific and stimulate predominantly humoral immune response, reinforcing the need for annual revaccination to maintain the protective antibody levels. Moreover, there is controversy about these type of vaccines regarding inhibition of renal colonization and bacterial dissemination. Thus, new antigens have been evaluated to compose an effective vaccine against leptospirosis that confers protection against different pathogenic species, prevents bacterial colonization, generates long-lasting immune responses, and exhibits minimum adverse effects. The most promising vaccine candidates are surface proteins LigA and LigB (Leptospiral immunoglobulin-like), which are expressed during infection and play a role in the mechanisms of adhesion to the host cells. Another promising protein is LcpA (Leptospira complement regulator-acquiring protein), which interacts with the regulator factor C4BP, suggesting leptospires´ strategy for evading the complement system. LcpA is conserved among pathogenic species and expressed during infection, suggesting a potential role as a vaccine antigen. Therefore, this work aimed to develop a subunit vaccine against leptospirosis, using recombinant leptospiral proteins LigAC (C-terminal region of protein LigA) and LcpA, as antigens. Two strategies were used for increasing the immunogenicity of these proteins, through improvement of the efficiency of antigen capture, processing, and presentation to the immune systems mechanisms. The first consisted of fusion of proteins to domain ZZ of protein A of Staphylococcus aureus, capable of binding to the Fc region of immunoglobulins; and to R domain of diphtheria toxin (DTR), which is a ligand of heparan sulfate. The second strategy consisted of testing three adjuvants: aluminium hydroxide (Alum), CpG-ODN and monoclonal antibody anti- MHC II (14.4.4S). Results obtained showed that the vaccine formulation containing LcpA protein fused to domains ZZ and DTR plus Alum was capable of inducing 100% and 60% of protection against death in both homologous and heterologous challenge, respectively. Protein LcpA not fused induced partial protection (60%) in presence of Alum. These results suggest that domains ZZ and DTR are capable of presenting antigens in a much efficient manner. Vaccine formulations consisting of LigAC and LcpA fused to domains, independently of the adjuvant used, were able to induce protection against death caused by leptospirosis in hamsters, but they were not capable of inhibiting renal colonization, despite the high antibody titers directed to the LigAC protein. Thus, it can be concluded that proteins LigAC and LcpA fused to domains ZZ and DTR are promising vaccine candidates; and that other vaccines strategies, using these proteins need to be tested to enhance their immunogenicity and achieve sterilizing immunity agains leptospirosis.

Cross-protection between experimental anti-leptospirosis bacterins

We investigated the existence of cross-protection between two anti-leptospirosis monovalent experimental bacterins produced with two strains of Leptospira serogroup Pomona: Fromm strain of serovar Kennewicky, isolated from pigs in the United States, and strain GR6 of serovar Pomona isolated from pigs in Brazil. Both were added of aluminum hydroxide as an adjuvant. Experimental bacterins were tested with the hamster potency test in order to assess protection provided against the disease and against the establishment of kidney infection. Controls were polyvalent commercial vaccine produced with Leptospira strains isolated outside Brazil, which included a representative of Pomona serovar, or Sorensen solution added of aluminum hydroxide adjuvant. The challenge was performed with cross-strains of serogroup Pomona tested in accordance with international standards established for the potency test. After 21 days of the challenge, survivors were killed to evaluate the condition of Leptospira renal carrier. Experimental bacterins protected hamsters against homologous and heterologous strains, demonstrating the existence of cross-protection. The commercial vaccine protected the hamsters challenged with both strains, but there was a high proportion of animals diagnosed as renal carriers when the challenge was performed with strain GR6, isolated from pigs in Brazil.

Controle da eficácia de bacterinas antileptospirose: relação entre os resultados dos testes de inibição de crescimento de leptospiras in vitro com os do desafio in vivo em hamsters / Efficacy of anti-leptospirosis bacterines. Relation between the results of the in vitro growth inhibition test and the potency test, in vivo, with challenge in hamsters

Foi efetuada a comparação em hamsters da proteção conferida e dos níveis de anticorpos induzidos por duas bacterinas comerciais antileptospirose. Os ensaios empregados foram o teste oficial de potência com desafio (TP), o ensaio proposto, teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICLIV) e a soroaglutinação microscópica (SAM). O protocolo de imunização foi representado por duas aplicações individuais de 0,25 mL das bacterinas, puras ou de suas diluições geométricas de razão dois variando de 200 a 51.200 para a bacterina A e de 200 a 3.200 para a bacterina B, por via subcutânea com o intervalo de 15 dias. Decorridos 15 dias da segunda aplicação de vacina, um grupo de animais foi desafiado com 0,2 mL de cultivos de leptospiras, por indivíduo, respectivamente dos sorovares Canicola (bacterinas A e B) ou Kennewicki (bacterina A). Os números de doses infectantes empregados nos desafios foram de 100 e 631 respectivamente, para os sorovares Canicola e Kennewicki. Decorridos 21 dias do desafio, os grupos de animais utilizados nos testes de ICLIV e SAM foram sangrados e os seus soros foram reunidos em pools (n = 5). No TP, adotando-se os critérios internacionais, as bacterinas foram aprovadas. A comparação do desempenho das bacterinas para os sorovares adotados, segundo sua concentração, por meio das proporções de animais sobreviventes ao TP e a média dos títulos de anticorpos identificados no teste de ICLIV, indicou que um título igual ou superior a 0,77 log corresponde ao nível de aprovação da bacterina no TP(AU)

It was performed a comparison between the protection afforded in hamsters and the antibody levels induced by two commercial vaccines against leptospirosis. The assays used were the official challenge test (TP), the in vitro leptospires growth inhibition test (ICLIV) and microscopic agglutination test (MAT). The immunization protocol consisted of two single applications, 15 days from each other, of 0.25 mL of the bacterins, pure or its two-fold serial dilutions: 200 to 51,200 for bacterin A and 200 to 3.200 bacterin B, both of them administered subcutaneously. A group of animals was challenged, after 15 days from the second vaccine application, with 0.2 mL/animal of live leptospire cultures, with Canicola (bacterin A and B) or Kennewicki (bacterin A) serovars. The numbers of infective doses employed in the challenges were 100 and 631 for Canicola and Kennewicki serovars, respectively. After 15 days from the second vaccine dose the groups of animals used in ICLIV and SAM tests were bled and their sera were collected in pools (n = 5). In TP, adopting the criteria established by the Code Federal Regulation, both bacterins were approved. The comparison of the performance of the tested bacterins with the adopted serovars, according to its concentration, by the proportions of surviving animals to the challenge assay and the average of the neutralizing antibodies titers, established a neutralizing antibodies titer equal or higher than 0.77 log corresponding with the bacterin level of approval in the potency assay(AU)

Anticorpos revelados pelo teste de inibição do crescimento de leptospiras in vitro (TICL) contra os sorovares Canicola, Icterohaemorrhagiae e Copenhageni em cães adultos revacinados anualmente com vacina comercial contendo bacterinas dos sorovares Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa e Pomona / Antibody revealed by growth inhibition test the of leptospires in vitro (GIT) against serovars Canicola, Icterohaemorrhagiae and Copenhageni in adult dogs revaccinated annually with commercial vaccine containing serovars Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa and Pomona bacterins

Na atualidade, o sorovar Copenhageni é o representante do sorogrupo Icterohaemorrhagiae, mantido por roedores sinantrópicos, que tem prevalecido nos cães e seres humanos das grandes metrópoles brasileiras. A despeito de alguns autores sugerirem a existência de proteção cruzada entre sorovares incluídos em um mesmo sorogrupo esta condição ainda não foi suficientemente esclarecida para os sorovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni. No presente trabalho cães adultos com dois a seis anos de idade primo-vacinados com três doses intervaladas de 30 dias a partir dos 60 dias de idade e revacinados anualmente com vacina anti-leptospirose polivalente contendo os sorovares Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa e Pomona foram revacinados com a mesma vacina e aos 30 dias da revacinação foram submetidos aos testes de soroaglutinação microscópica (SAM) e de inibição do crescimento de leptospiras in vitro (TICL), para avaliação comparativa dos níveis de anticorpos produzidos para os sorovares Canicola, Icterohaemorrhagiae e Copenhageni. Os resultados obtidos indicaram que a imunidade conferida pela vacina para o sorovar Icterohaemorrhagiae é mais duradoura que a observada para o sorovar Canicola, já que títulos de anticorpos neutralizantes >1,0 log10 foram observados antes do reforço vacinal não havendo substancial aumento após a revacinação. Quanto ao sorovar Canicola, a revacinação resultou em considerável aumento do título de anticorpos neutralizantes quando comparado ao momento anterior a revacinação (p=0,001). A análise dos valores encontrados após a revacinação demonstrou claramente que cães revacinados com bacterina produzida com o sorovar Icterohaermorrhagiae não apresentam aumento do título de anticorpos inibidores do crescimento contra o sorovar Copenhageni, em nível suficiente para inibir o crescimento de leptospiras. Apesar disso, os títulos de anticorpos inibidores de crescimento anti-Copenhageni encontrados antes e após a revacinação demonstraram que, pelo menos certo grau de proteção contra a infecção por esse sorovar pode ser esperado para os cães vacinados com bacterinas do sorovar Icterohaemorrhagiae, não sendo, no entanto, uma proteção cruzada completa.(AU)

Currently, the serovar Copenhageni is the representative of serogroup Icterohaemorrhagiae maintained in synanthropic rodents found most frequently in dogs and humans in metropolitan areas of Brazil. Despite some authors have suggested the existence of cross-protection between serovars included in the same serogroup, this condition has not yet been sufficiently clarified for serovars Icterohaemorrhagiae and Copenhageni. In the present work, 2 to 6-year-old dogs, vaccinated at 60, 90 and 120 days of age and thereafter, revaccinated annually with commercial vaccine containing Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa and Pomona bacterins were evaluated as to the immune status against leptospirosis before and 30 days after revaccination. Mycroscopic agglutination test (MAT) and in vitro growth inhibition test (GIT) were performed to search for agglutinating anti-Leptospira antibodies and neutralizing anti-Leptospira antibodies, respectively for serovars Canicola and Icterohaemorrhagiae, and additionally, for serovar Copenhageni, not included in the vaccine. The results showed that the immunity conferred by the vaccine to serovar Icterohaemorrhagiae is more lasting than that observed for serovar Canicola, since neutralizing antibody titers >1.0 log10 were observed before the booster vaccination with no substantial increase after revaccination. As for the serovar Canicola, revaccination resulted in a considerable increase in neutralizing antibody titer when compared to the one observed previously to the revaccination (p=0.001). The analysis of the data obtained by GIT allowed us to conclude that dogs given vaccine containing Icterohaemorrhagiae bacterin did not produce neutralizing antibodies against serovar Copenhageni enough to inhibit leptopiral growth at the same level as occurred for the homologous serovar. Despite this, the GIT titer found for serovar Copenhageni before and after revaccination showed that at least, some level of protection could be expected for dogs vaccinated with serovar Icterohaemorrhagiae bacterin, not a complete cross protection.(AU)

AVALIAÇÃO DE ANTÍGENOS BASEADOS NOS RECEPTORES DE TRANSFERRINA PARA A PREVENÇÃO DA DOENÇA DE GLÄSSER EM SUÍNOS

Haemophilus parasuis é o agente causador da Doença de Glässer (GD), uma das mais importantes doenças bacterianas que acomete suínos mundialmente. A DG é observada principalmente na fase de creche, produzindo importantes perdas econômicas na cadeia produtiva de suínos em razão da mortalidade e do alto custo do tratamento dos animais acometidos. Atualmente o principal método de prevenção da GD é a vacinação. No entanto, o uso de vacinas comerciais tem sido intensamente questionado devido aos inúmeros surtos de GD, convertendo a investigação de novas formulações vacinais uma prioridade para esta doença. Nesta dissertação aportamos novos conhecimentos sobre as propriedades imunológicas de antígenos recombinantes derivados das Proteínas de União à Transferrina A e B (TbpA e TbpB) de Haemophilus parasuis. A capacidade de proteção de quatro antígenos recombinantes e de duas bacterinas foi avaliada utilizando um modelo suíno altamente susceptível e infectado com H. parasuis, SV7, cepa 174. Entre os antígenos recombinantes, avaliamos duas versões da proteína TbpB com mutagênese dirigida e defectivas na união à transferrina e dois antígenos híbridos, os quais apresentavam na superfície da TbpB loops da proteína TbpA. As proteínas TbpBs mutantes possuem uma substituição de um aminoácido aromático na superfície do lóbulo N [lisina (Y) e triptofano (W)] por uma alanina (A). A versão Y167A TbpB e W176A TbpB tiveram um resíduo de tirosina e triptofano, substituído por uma alanina nas posições indicadas, respectivamente. A perda da capacidade de união, a qual pode ser se confirmada através de um ensaio do tipo Dot Assay utilizando transferrina suína conjugada com peroxidase, é atrativa porque previne que a transferrina seja capturada pela TbpB durante o processo de imunização, expondo ao sistema imune importantes epítopos presentes na região de união à transferrina da TbpB. Os antígenos híbridos foram desenhados mediante a inserção do loop 10 exposto na superfície da TbpA na estrutura da proteína TbpB. O antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10 é constituído pelo loop 10 da TbpA de H. parasuis inserida no lóbulo C - LCL da TbpB de Neisseria meningitides, strain M982. O lóbulo C - LCL foi molecularmente alterado, tendo seus longos loops superficiais removidos e servindo como local para a inserção de antígenos exógenos. A proteína Y167A + Nm TbpA loop 10 consta da proteína Y167A TbpB intacta contendo o loop 10 da TbpA de N. meningitides na superfície da estrutura do lóbulo C. A construção dos antígenos híbridos, nos permitiu determinar se as imunizações baseadas em um único loop da TbpA poderiam prevenir a DG e se a inserção de um loop na superfície da proteína TbpB intacta poderia impactar na resposta imune gerada contra as versões híbridas em comparação com as versões da TbpB intacta. Finalmente, duas bacterinas (células inteiras inativadas quimicamente) baseadas na cepa clínica de H. parasuis 41.2015 (SV5) foram também preparadas. As vacinas de subunidades foram formuladas com 200µg de antígeno/dose e as bacterinas com 1×109 and 5×109 células/dose, todas contendo 15% (v/v) de adjuvante Montanide Gel 01. Trinta e três suínos privados de colostro foram divididos em 7 grupos: Y167A TbpB (n=5), W176A (n=5), Nm LCL + Hps TbpA loop 10 (n=5), Y167A + Nm TbpA loop 10 (n=5), bacterinas (n=4/cada) e grupo controle imunizado com PBS acrescido de adjuvante (n=5). Com o objetivo de avaliar a capacidade protetora destes antígenos, suínos foram vacinados 2 vezes (dia 0 e 21) e 14 dias após a segunda imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com 1×107 células de H. parasuis, cepa 174. A cinética da resposta imune humoral foi avaliada com amostras de sangue coletadas nos dias 0, 14, 21, 28 e 35, e a titulação de IgGs totais foi realizada com as amostras coletadas no dia 35. Nossos resultados demonstraram que os antígenos W176A e Y167A + Nm TbpA loop 10 induzem uma baixa resposta de IgG após a primeira vacinação (dia 21), no entanto, todas as vacinas estimulam níveis altos de IgG nos dias 28 e 35. Curiosamente o título de IgG induzido pelo antígeno Y167A TbpB foi significativamente superior ao induzido pela versão W176A TbpB. A capacidade das IgGs específicas de reconhecerem a cepa utilizada no desafio foi avaliada por citometria de fluxo. Com exceção do antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10, todos os demais demonstraram alta capacidade de reconhecimento da cepa 174 de Hps, sendo este reconhecimento maior inclusive que a resposta advertida nas bacterinas. Também, observamos que IgGs induzidas por todas as formulações vacinais eram capazes de ativar a via clássica do sistema do complemento contra a cepa de desafio e contra os antígenos vacinais, exceto as IgGs derivadas do antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10, as quais não eram capazes de ativar contra a cepa de desafio. Após cada uma das duas doses vacinais todas as formulações estimularam o aumento do número de linfócitos T CD4+ e B-IgM+ circulantes. E, com relação a capacidade de proteção das vacinas após o desafio experimental, observamos 80% (4/5) de sobrevivência no grupo imunizados com a proteína Y167A TbpB e 60% de sobrevivência no grupo imunizados com a versão Y167A + Nm TbpA loop 10. Todos os demais animais morreram após o desafiado ou foram humanamente eutanasiados. Em síntese, neste estudo demonstramos: 1) Y167A TbpB induz proteção heteróloga frente ao desafio com a cepa 174 de H. parasuis; 2) A cepa 174 (SV7) deve ser reclassificada como altamente virulenta; 3) Bacterinas baseadas no SV5 de H. parasuis não previnem contra a doença causada pelo SV7; e por fim, a utilização da tecnologia de engenharia estrutural de proteínas propiciou o desenvolvimento de um antígeno promissor (Y167A) e com características imunológicas melhoradas, sendo um bom presságio do desenvolvimento de uma vacina de amplo espectro contra todos os sorovares de H. parasuis.

Haemophilus parasuis (Hps) is the causative agent of the Glässers disease (GD), one of the most important bacterial diseases of swine worldwide. The disease is observed mainly in the nursery phase of production, leading to important economic losses for the pig industry due to mortality and the expensive treatment of sick animals. Currently, the primary method for GD prevention is vaccination. However, the use of commercial vaccines has been unable to prevent many global outbreaks of GD prompting us to investigate better vaccine design strategies. In this thesis, we provide new insights about immunological properties of engineered antigens based on transferring binding protein A and B (TbpA and TbpB) of Haemophilus parasuis. The protection capacity of four recombinant antigens and two bacterins were evaluated in a highly susceptible pig model experimentally infected by H. parasuis, SV7, 174 strain. The recombinant antigens were composed of two site directed non transferrin binding TbpB mutant proteins and two hybrid antigens where surface exposed loops of TbpA were displayed on a TbpB based scaffold. The non-binding TbpB mutants were designed by substituting an aromatic residue on the binding surface of the TbpB N-lobe to an alanine residue. Y167A TbpB and W176A TbpB had a tyrosine and tryptophan residue, respectively, substituted to an alanine residue at the indicated position. The loss of binding, which can be confirmed using a simple dot assay with HRP conjugated to porcine transferrin, is attractive because it prevents the antigen binding to transferrin upon immunization and exposes the binding region of the TbpB to the immune system as important epitopes. Two hybrid antigens were designed by selecting the surface exposed loop 10 of TbpA and inserting the loop into TbpB based scaffold. The Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 has the TbpA Loop 10 of H. parasuis inserted on the loopless C-lobe (LCL) of the TbpB of Neisseria meningitides, strain M982.The loopless C lobe was designed by removing large loops that did not resolve in the crystal structure of the C lobe, suggesting that large flexible loops can be accommodated in that region. The Y167A + Nm TbpA Loop 10 is composed of the intact TbpB Y167A with a Loop 10 of the N. meningitides TbpA inserted into its C-lobe structure. This strategy enabled us to determine whether immunizations with a single loop of TbpA can prevent disease and whether insertion of a loop into the intact TbpB protein impacted the immune response generated against the hybrid compared to the TbpB alone. Finally, two bacterins (whole cells chemically inactivated) based on Hps (SV5) field strain 41.2015 were also prepared. All subunit vaccines were formulated with 200 µg of antigen/dose and the bacterins with 1×109 and 5×109 whole cell/dose, mixing with 15% (v/v) of Montanide Gel 01 adjuvant. Thirty-three colostrum deprived pigs were divided into 7 groups, 4 groups of 5 animals for the recombinant antigens, 2 groups of 4 animals for two bacterins, and 5 animals as control, which were inoculated with sterile PBS plus adjuvant. In order to evaluate the protective capacity of the antigens, pigs were vaccinated 2 times (days 0 and 21), and 14 days after the second immunization the animals were challenged intratracheally with 107 cells of the H. parasuis 174 strain. The kinetics of the immune response were evaluated with blood samples collected on days 0, 14, 21, 28 and 35, and titration of antibodies was performed on day 35. Although the antigens W176A and Y167A + Nm TbpA Loop 10 antigens induced a low IgG response after first immunization (at day 21) compared to the other antigens, all vaccines stimulated maximum response on days 28 and 35. Curiously, the titre of IgGs induced by Y167A TbpB was significantly higher than those observed in the animals immunized with W176A TbpB. The ability of induced IgGs to recognize the challenge strain was conducted by flow cytometry. Apart from Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 antigen, all another 3 recombinant antigens induced IgGs with high capacity to detect live Hps 174 strain, even higher than those induced by bacterins. In addition, all IgG induced were able to activate the classical pathway of the complement system against the immunizing antigens and challenge strain, except for Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 antigen against the latter. All vaccines stimulated an increase in the percentage of T CD4+ and B -IgM+ lymphocytes after the first and second immunizations. Regarding to the protection capacity conferred by vaccines after challenge, we observed 80% (4/5) survival in the group immunized with the Y167A TbpB protein and 60% survival in the group immunized with the hybrid antigen Y167A + Nm TbpA loop 10. All other animals died or were humanely euthanized after the challenge. In this study, we demonstrated: 1) Y167A TbpB can induce heterologous protection against Hps SV7; 2) The Hps174 reference strain (SV7) needs to be reclassified as a high virulent strain; 3) Bacterin based on Hps SV5 cannot to prevent the disease caused by SV7; and finally, the structure-based protein engineering approach has produced a promising antigen (Y167A) with improved immunological properties that bodes well for developing a cross-protective vaccine against all serovars of H. parasuis.

DETERMINAÇÃO DOS SOROVARES DE HAEMOPHILUS PARASUIS RELACIONADOS COM A DOENÇA DE GLÄSSER NO BRASIL

A Doença de Glässer (DG) é uma doença infecciosa, emergente, e de grande importância para a suinocultura mundial. Seu agente etiológico é o Haemophilus parasuis (H. parasuis), uma bactéria Gram negativa, fastidiosa, fenotipicamente heterogênea e que pode desencadear uma importante patologia sistêmica em suínos, caracterizada por poliserosite fibrinosa, poliartrite e meningite. H. parasuis é classificado em 15 sorovares (SV), no entanto, um número crescente de cepas não-tipificáveis (NS) e relacionadas à surtos de DG tem emergido, demonstrando a variabilidade genética deste microrganismo. O Brasil destaca-se como um dos principais países nessa cadeia de produção, sendo globalmente, o quarto maior em produção e exportação de carne suína. Apesar desta importância, os estudos relacionados à tipificação de cepas clínicas de H. parasuis circulantes no Brasil são escassos e não abordam a distribuição nacional dos sorovares nas principais regiões produtoras de suínos. Em nosso país, a imunoprevenção das infeções produzidas por H. parasuis é realizada através de vacinas comerciais baseadas em bacterinas mono e bivalentes, inativadas com formol e potencializadas com adjuvantes aquosos ou oleosos. Devido aos problemas relacionados com a capacidade protetora dessas vacinas, principalmente em razão da grande variabilidade fenotípica dos diferentes sorovares e da escassa ou ausente proteção cruzada conferida por um único sorovar, o isolamento e tipificação de cepas envolvidas em um surto de DG são determinantes para o desenvolvimento de um programa preventivo baseado em vacinação. Em resposta ao cenário nacional exposto acima, apresentamos neste trabalho: os sorovares de H. parasuis envolvidos em surtos de DG no Brasil; sua distribuição geográfica; o efeito temporal sobre a prevalência de sorovares; e, o impacto destas informações sobre as atuais estratégias preventivas vacinais utilizadas para prevenção da DG. Para alcançar estes objetivos, 460 cepas clínicas de H. parasuis provenientes de dez estados do Brasil, abrangendo as principais regiões produtoras de suínos, foram analisadas. As cepas foram tipificadas através da técnica de PCR multiplex desenvolvida por Howell et al. (2015) e a diferenciação dos sorovares 5 e 12 foi realizada mediante a técnica de hemaglutinação indireta modificada desenvolvida por Lorenson et al. (2017). Nossos resultados demonstram que a nível nacional os sorovares mais prevalente são SV 4 (26.6%), NS (17.6%), SV 1 (13.1%), SV 14 (12.6%) e SV 5 (10.7%). Considerando-se a virulência dos sorovares, de acordo com a classificação proposta por Kielstein e Rapp-Gabrielson (1992), mais da metade do total dos isolados pertencem ao grupo dos sorovares altamente virulentos (51.0%) e 31.4% ao grupo dos sorovares moderadamente virulentos. Observamos que as cepas NS foram isoladas fundamentalmente do sistema respiratório, envolvendo pulmões (64.9%), área nasal (13.0%) e traqueia (10.4%). Por outro lado, os sorovares 5 e 14 foram basicamente isolados de cérebro, coração, articulações e líquidos cavitários. Quando relacionados à virulência, 62.5% dos sorovares altamente virulentos foram isolados a partir de locais sistêmicos e os demais procedentes do sistema respiratório. Em relação à distribuição geográfica, observamos a presença dos sorovares 1, 4, 5, 512, 14, 15 e NS em praticamente todos os estados analisados. Por outro lado, os sorovares 2 e 13 somente foram detectados em SC, MT e MG, além disso o sorovar 12 ficou basicamente restrito ao RS . Os estados com maior número de amostras analisadas foram MG e SC, fato que pode estar relacionado com as altas densidades de suínos produzidos nestas regiões. Também, verificamos que ao longo da linha temporal dos isolamentos ocorreu entre os anos de 2013 a 2016, um aumento no número de isolados clínicos e entre estes, de cepas altamente virulentas. Em síntese, apresentamos neste estudo, uma atualização dos sorovares de H. parasuis associados com a DG no Brasil e, destacamos que as vacinas comerciais disponíveis em nosso pais não incluem 76.3% dos sorovares presentes em nossas granjas produtoras de suínos. Desta maneira, o sucesso da prevenção da DG em nosso país em curto prazo está condicionado ao uso de vacinas autógenas e, em longo prazo, a uma atualização da composição antigênica das atuais vacinas comerciais.

Glässer's disease (GD) is an emerging bacterial disease of great importance to the world's pig farming. Its etiologic agent is Haemophilus parasuis (H. parasuis), a fastidious, phenotypically heterogeneous Gram negative bacterium that can trigger an important systemic pathology in pigs characterized by fibrinous polyserositis, polyarthritis and meningitis. H. parasuis is classified in 15 serovars (SV), however, a growing number of non-typeable (NT) strains and related to outbreaks of GD have emerged, demonstrating the genetic variability of this microorganism. Brazil stands out as one of the main countries in this production chain, being the fourth largest in swine production and exportation. Studies related to typing clinical strains of H. parasuis that are circulating in Brazil are scarce, even with its importance, and there are no studies that demonstrate the national screening of distribution of the serovars in the main producing regions of swine. In our country, the immunoprevention of the H. parasuis infections relays in commercial vaccines based on monovalent and bivalent bacterins inactivated with formalin and potentiated with aqueous or oily adjuvants. Due to the problems related to the protective capacity of these vaccines, mainly due to the high phenotypic variability of the different serovars of this pathogen and the little or absent cross-protection conferred by a single serovar, isolation and characterization of strains involved in a GD outbreak are determinant for the development of more racional vaccine-based preventive program. In response to the national scenario related to H. parasuis and GD, we present here the H. parasuis serovars involved in outbreaks of DG in Brazil, their geographic distribution, the temporal effect on the prevalence of serovars, and the impact of these work in the vaccines actually used. To reach these objectives, 460 clinical isolates of H. parasuis from ten Brazilian states, covering the main swine producing regions, were analyzed. The strains were typed by multiplex PCR technique developed by Howell et al. (2015), and the differentiation of serovars 5 and 12 was performed using the modified indirect hemagglutination technique developed by Lorenson et al. (2017). Our results show that the most prevalent serovars are SV 4 (26.6%), NT (17.6%), SV 1 (13.1%), SV 14 (12.6%) and SV 5 (10.7%). Taking into account the virulence of serovars, according to the classification proposed by Kielstein and Rapp-Gabrielson (1992), more than half of all isolates belong to the highly virulent serovars group (51.0%) and 31.4% to the serovars moderately virulent group. We observed that NT strains were fundamentally isolated from the respiratory system, involving lungs (64.9%), nasal area (13.0%) and trachea (10.4%). On the other hand, serovars 5 and 14 were basically isolated from brain, heart, joints and cavitary fluids. When related to virulence, 62.5% of the highly virulent serovars were isolated from systemic sites and the others from the respiratory system. Regarding the geographic distribution, we observed the presence of serovars 1, 4, 5,5/12, 14, 15 and NS in almost all analyzed states. On the other hand, serovars 2 and 13 were only detected in SC, MT and MG, respectively; in addition, serovar 12 was basically restricted to RS. The states with the highest number of analyzed samples were MG and SC, a fact that may be related to the high densities of pigs produced in these regions. In addition, we observed that the number of field isolates and amongst them of highly virulent strains have increased between 2013 to 2016. In summary, we present an update of H. parasuis serovars associated with GD in Brazil, and we highlight that the commercial vaccines available in our country do not include 76.3% of the serovars present on our pig production farms. Thus, the short-term success of GD prevention in our country is conditioned by the use of autogenous vaccines and, in the long term, an update of the antigenic composition of current commercial vaccines.

Comparação entre a imunidade induzida em bovinos vacinados com bacterinas polivalentes comerciais e uma monovalente experimental / Comparison between immunity induced in cattle vaccinated with commercial polyvalent bacterins and one experimental monovalent

O presente estudo avaliou a indução da produção de anticorpos contra Leptospira spp.por dez bacterinas, sendo nove polivalentes e uma monovalente experimental para a sorovariedade Hardjo amostra Norma. A concentração celular foi controlada e utilizou-se adjuvante de emulsão óleo em água. Um ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto foi desenvolvido utilizando-se conjugado anti-IgG total para mensurar os níveis de anticorpos da classe IgG conferido pelas bacterinas utilizando três amostras diferentes: Hardjoprajitino, Norma e Hardjo-bovis. Paralelamente foi utilizado também o Teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM) para mensurar os níveis de anticorpos contra as mesmas amostras. Encontraram-se títulos variáveis entre as bacterinas de acordo com o teste ELISA. Ostítulos no SAM foram de pouca intensidade e de curta duração indicando a necessidade de controle celular para uma posterior padronização destes produtos. Com base nos resultados encontrados no presente estudo, a bacterina monovalente foi a que apresentou melhor desempenho.(AU)

The study evaluated the induction of antibody production against ten bacterins, nine polyvalent and one experimental monovalent to serovar Hardjo strain Norma. An indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was developed using anti-IgG conjugate to measure total levels of IgG class antibodies conferred by bacterins using three different strains: Hardjoprajiitino, Norma and Hardjo-bovis. Microscopic Agglutination Test (MAT) was also used to measure immunoglobulin levels of the same strains. Variable ELISA titers were induced by the tested bacterins. The MAT titers found showed lower intensity and shorter duration, indicating the need to cellular control in further standardization of these vaccines. Based on results of this study, the monovalent bacterin showed best performance.(AU)

Vacina contendo isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis para avaliação da resposta imunológica em fêmeas ovinas

A ovino-caprinocultura é uma área que vem apresentando um forte crescimento no Brasil nas últimas décadas, com um rebanho constituído por 17.668.063 e 9.386.316 cabeças, respectivamente. Com o crescimento dos rebanhos, vem aumentando também a incidência das doenças bacterianas. Para o combate a essas enfermidades, tem-se estudado a utilização de vacinas. A constituição destas vacinas podem variar entre DNA, células bacterianas mortas, as bacterinas, e células bacterianas vivas, pela toxina inativada, os toxóides, do Corynebacterium pseudotuberculosis, ou pela associação destes componentes, utilizando ou não algum tipo de adjuvante. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi elaborar uma vacina à base de células bacterianas de C. pseudotuberculosis, avaliar a resposta imunológica com base na técnica da atividade bactericida do soro de fêmeas ovinas vacinadas, avaliando ainda a atividade hemaglutinante no extrato de C. pseudotuberculosis. Para o alcance desses objetivos foram utilizadas as seguintes metodologias: os isolados utilizados para elaboração da vacina foram isolados de caprinos pertencentes as cidades de Petrolândia e Jatobá, PE, isolados e cultivados na bacterioteca do laboratório de microbiologia e imunologia animal da Univasf. Os animais após vacinados, passaram por coletas de sangue semanais e com o soro obtido através destas coletas foi realizada a atividade bactericida. O extrato obtido dos três isolados, foi colocado em contato com hemácias de coelho para avaliar a atividade hemaglutinante no extrato, a qual foi avaliada visualmente. Foi possível observar que após a vacinação, o sistema imunológico dos animais respondeu de forma positiva, sendo possível observar do aumento da atividade bactericida do soro desses animais, diminuindo a contagem de UFC/mL com o passar das coletas, fato este que está relacionado com a ativação do sistema de defesa dos animais, conhecido como sistema complemento. O ensaio de hemaglutinação utilizando hemácias de coelho foi positivo para função biológica da proteína com o extrato proteico, indicando presença de lectinas no conjunto de proteínas do C. pseudotuberculosis.

The sheep-goat is an area that has shown strong growth in Brazil in recent decades, with a herd consisting of 17,668,063 and 9,386,316 heads, respectively. With the growth of herds, it has also increased the incidence of bacterial diseases. To combat these diseases, we have studied the use of vaccines. The constitution of these vaccines may vary between DNA killed bacterial cells, bacterins, and live bacterial cells, the inactivated toxin toxoids of Corynebacterium pseudotuberculosis, or the combination of these components, with or without some type of adjuvant. Thus, the objective of this study was to develop a vaccine based on bacterial cells of C. pseudotuberculosis, evaluate the immune response based on the technique of bactericidal activity of serum from vaccinated sheep females still evaluating the hemagglutination activity in extract C. pseudotuberculosis. To achieve these objectives, the following methodologies were used: the isolates used for the preparation of the vaccine were isolated from goats belonging to the towns of Petrolândia and Jatoba, PE, isolated and cultured in bacterioteca microbiology laboratory animal and Immunology UNIVASF. The animals vaccinated after, underwent weekly blood samples and serum obtained through these collections was held bactericidal activity. The extract obtained from three isolated, was put in contact with rabbit red blood cells to evaluate the hemagglutination activity in the extract, which was assessed visually. It was observed that after vaccination, the immune system of animals responded positively and are recording increased bactericidal activity of the serum of these animals, reducing the CFU / mL count over the collections, a fact that is related to activation of the animal defense system known as the complement system. The hemagglutination assay using rabbit erythrocytes was positive for biological function of the protein with the protein extract, indicating the presence of lectins on the set proteins of C. pseudotuberculosis.

ESTRATÉGIAS A CAMPO DE CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM VACAS E ÉGUAS NATURALMENTE INFECTADAS

A leptospirose é uma doença infectocontagiosa determinada por bactérias do gênero Leptospira sp. Em ruminantes, a infecção determina principalmente falhas reprodutivas, causando importantes prejuízos econômicos. O controle da leptospirose é complexo, sendo baseado principalmente no tripé vacinação, antibioticoterapia e medidas de manejo/ambientais. No entanto, ainda não há consenso sobre as melhores estratégias a serem empregadas, principalmente em ambiente tropical. O presente estudo objetivou contribuir para o aprimoramento das estratégias de controle e profilaxia da leptospirose em vacas e éguas naturalmente infectadas, por meio de vacinação e análises ambientais. O estudo foi dividido em dois experimentos, sendo um realizado em vacas e outro em éguas naturalmente infectadas, provenientes de rebanhos endêmicos. Cada espécie foi dividida em dois grupos: vacinados e nãovacinados. Além disso, nas duas espécies foram empregadas vacinas comerciais (bacterinas) contra leptospirose. Foram testadas duas marcas distintas de vacinas nas vacas, e estes animais foram acompanhados por 90 dias. Já as éguas foram imunizadas apenas com uma marca e acompanhadas por 120 dias. Amostras de sangue e urina foram colhidas para realização de sorologia e PCR, respectivamente. Além disso, dados sobre condições ambientais foram colhidos durante os meses de experimento. Foi confirmada a infecção por Leptospira nas duas espécies estudadas. Além disso, a distribuição de animais carreadores (PCR+) ou sororeativos (MAT+) foi homogênea entre os grupos. Foi possível observar que, a vacinação interferiu significativamente na produção de anticorpos nas duas espécies estudadas. Esta apresentou uma rápida ascensão e com pico em D60. Ao final do experimento em equinos vacinados foi observada a produção de anticorpos neutralizantes. Recomenda-se a utilização de diferentes ferramentas concomitantes para a avaliação da resposta humoral. Adicionalmente, as duas marcas de vacinas testadas em bovinos apresentaram resultados similares entre si, e também similares à vacina testada em equinos. As condições ambientais encontradas por Leptospira no presente estudo foram favoráveis para sua sobrevivência por longos período. Desta forma, a ação do ambiente não pode ser negligenciada na elaboração de programas de controle para esta enfermidade, principalmente em ambientes tropicais.

Leptospirosis is an infectious disease determined by bacteria of the genus Leptospira sp. In ruminants, that infection determines reproductive failures, causing significant economic losses. Control of leptospirosis is complex, being aimed on tripod vaccination, antibiotic therapy and environmental/management changes. Nevertheless, there is no consensus on the most effective strategies to be employed on control, mainly in tropical scenarios. This study aimed to contribute to the improvement of the control and prevention strategies against leptospirosis in naturally infected cows and mares after vaccination and environmental analysis. The study was divided in two experiments: the first one conducted in cows and the second in mares, both naturally infected, from endemic regions. Each species was divided into two groups, vaccinated and non-vaccinated. In both species were employed commercial vaccines (bacterins) against leptospirosis. Additionally, two different brands of vaccine were tested in cows, and these animals were studied during 90 days. While in mares was used only on brand of vaccine, and these animals studied during 120 days. Blood and urine were collected to perform serology and PCR, respectively. In addition, data on environmental conditions were collected during the experiments. Leptospiral infection was confirmed in both species. Moreover, the distribution of urinary carriers (PCR +) or seroreactive animals (MAT +) was homogeneous between groups. It was observed that the vaccination interfered significantly in antibodies production in both species. Additionally, at the end of the experiment in horses neutralizing antibodies were detected in vaccinated animals. It is recommended the usage of concurrent different serological tools for evaluation of the humoral response. Additionally, the two vaccine brands tested in cattle showed similar results among themselves, and also similar to the vaccine tested in horses. Environmental conditions faced by Leptospira in this study were favorable for their survival for a long periods. Thus, environment cannot be neglected for the development of control programs for this disease, mainly in tropical scenarios.

Desenvolvimento de bacterinas de Escherichia coli recombinante contendo as toxinas alfa, beta e épsilon de Clostridium perfringens

Clostridium perfringens é um bacilo Gram-positivo, formador de esporo e produtor de ao menos 17 toxinas, das quais, quatro são consideradas principais, a toxina alfa (CPA), beta (CPB), épsilon (ETX) e iota (CPI) utilizadas para classificar a espécie em cinco toxinotipos (A, B, C, D e E). A toxinfecção nos animais ocorre por via iatrogênica/traumática ou gastrointestinal. As principais enfermidades causadas por C. perfringens são gangrena gasosa, enterotoxemias, enterite necrótica/hemorrágica e enterocolite. As vacinas contra as toxinas de C. perfringens são extensivamente utilizadas em medicina veterinária, tornando-se a principal medida de controle e profilaxia nos rebanhos. Tem crescido o número de estudos visando à utilização de vacinas recombinantes contra as principais toxinas de C. perfringens (CPA, CPB e ETX). Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar os títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB e ETX em coelhos vacinados com células inteiras inativadas de Escherichia coli (bacterinas recombinantes), assim como, a fração celular solúvel ou insolúvel, contendo tais antígenos. Após a expressão das proteínas, as células foram inativadas com formaldeído na concentração final 0,2% (v/v). Em seguida, a eficiência da inativação foi avaliada por plaqueamento de uma alíquota do cultivo em placas de LB ágar. Confirmada a inativação, as bactérias foram centrifugadas e lavadas com PBS estéril para remoção de formaldeído residual. Nas vacinas compostas por frações celulares solúveis e insolúveis, a presença dos antígenos rCPA, rCPB e rETX foi confirmada através de SDS-PAGE e western blot. As proteínas, nas duas formulações, foram quantificadas por SDSPAGE juntamente com uma curva com diferentes concentrações de albumina sérica bovina (BSA) e analisadas no software TotalLab quant®. As características de solubilidade dos antígenos recombinantes foram idênticas em ambos os vetores utilizados, pAE e pET28a, onde rCPA e rCPB foram expressas em corpos de inclusão e rETX na forma solúvel. Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB ou ETX no soro dos animais vacinados com ambas as formulações vacinais contendo 50 µg de cada antígeno expresso no vetor pAE. Entretanto, no segundo experimento com 200 µg de cada antígeno expresso em vetor pET28a, em ambas as formulações, geraram títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina ETX de 10 UI/mL-1 , cinco vezes superior ao valor mínimo preconizado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina CPB. A titulação de anticorpos neutralizantes antitoxina CPA não foi realizada. Os resultados do presente estudo, não apenas sustentam a potencial utilização de antígenos recombinantes, mas também fornecem dados adicionais quanto à vacinação com células inteiras inativadas de E. coli ou fração celular solúvel e insolúvel contendo proteínas recombinantes. Essa forma alternativa de produção de vacinas recombinantes visa à disponibilização de antígenos de alta qualidade e baixo custo para utilização pela indústria veterinária

Clostridium perfringens is a spore-forming, Gram-positive bacillus that produces at least 17 alpha (CPA), beta (CPB), epsilon (ETX), and iota (CPI) toxins are used to classify this bacterium into five toxinotypes (A, B, C, D, and E). Animal toxinfection occurs via either the iatrogenic/traumatic or the gastrointestinal route. The main illnesses caused by C. perfringens are gas gangrene, enterotoxemias, haemorrhagic/necrotic enteritis and enterocolitis. Vaccines against C. perfringens toxins are largely used in veterinary medicine, rendering them the main prophylactic control measure in farm animals. The number of studies aiming to develop recombinant vaccines against C. perfringens alpha, beta, and epsilon toxins is on the rise. Studies looking for alternatives to diminish time and production costs are also gaining ground. Therefore, the present study aims to evaluate neutralizing antibody titers against CPA, CPB, and ETX in rabbits immunized with whole, inactivated de E. coli cells (recombinant bacterins) and with post-lysis cell fractions containing such antigens. After protein expression, E. coli cells were inactivated with formaldehyde 0,2% (v/v). Inactivation efficiency was assessed by plating sterile LB agar plates. Once inactivation was confirmed, bacteria were washed with sterile PBS to remove residual formaldehyde. The presence of rCPA, rCPB and rETX in vaccines comprised by both soluble and insoluble cell fractions was confirmed by means of SDS-PAGE and western blot. Proteins in both formulations were quantified by SDSPAGE using different BSA concentrations using TotalLab quant® software. Solubility characteristic were identical in both pAE and pET28a expression vectors: rCPA and rCPB were expressed in inclusion bodies and rETX was soluble. No neutralizing antibody titers against CPA, CPB or ETX were detected in the sera of animals immunized with either formulation containing 50 µg of each antigen when pAE was used. However, when pET28a was used, 200 µg of each antigen in either formulation were able to generate up to 10 UI/mL-1 of anti ETX neutralizing antibodies, which is five-fold the minimum required by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply. Neutralizing antibodies against CPB were not detected. A toxoid-based commercial vaccine induced 10-20 UI/mL-1of neutralizing antibodies against CPB. Anti-CPA neutralizing antibodies titration was not performed. These results, not only support the use of recombinant antigens, but also provide data about immunization using whole, inactivated E. coli cells or both their soluble and not soluble fractions containing recombinant antigens as vaccines. This alternative recombinant vaccine production method yields high quality antigens with low production costs to be used in veterinary medicine.