In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time / A fertilização in vitro de ovócitos suínos é afetada pelo tempo de coincubação espermático

The aim was to study the effects of different gamete coincubation times on porcine in vitro fertilization (IVF), and to verify whether efficiency could be improved by reducing oocyte exposure time to spermatozoa during IVF. In groups of 50, a total of 508 immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in NCSU-37 medium. The COCs were cultured for 44 hours and then inseminated with in natura semen (2,000 spermatozoa/oocyte). The sperm and oocytes were coincubated according to the following treatments (T): T1 = oocytes exposed to spermatozoa for one hour (173 oocytes), T2 = oocytes exposed to spermatozoa for two hours (170 oocytes), and T3 = oocytes exposed to spermatozoa for three hours (165 oocytes). After these coincubation periods, the oocytes were washed in fertilization medium (TALP medium) to remove spermatozoa not bound to the zona pellucida and cultured in another similar medium (containing no sperm). Eighteen to twenty hours after fertilization, the putative zygotes were stained in Hoechst-33342 to evaluate the IVF results. The penetration rate was higher (P<0.05) after two hours of coincubation time than it was for one or three hours. Furthermore, 68.60% of the ova coincubated with the spermatozoa for two hours were monospermic. The oocytes exposed to spermatozoa for one hour (T1) presented a higher (P<0.01) rate of polyspermy than those in T2 and T3. Fertilization performance (%) did not differ (P>0.05) between oocytes exposed to spermatozoa for one (T1) and three hours (T3). However, optimum (P=0.048) results were obtained after two hours of coincubation, when the rate of fertilization performance was 50.16±8.52%. The number of penetrated sperm per oocyte, as well as male pronucleus formation, did not differ (P>0.05) between the treatments evaluated. Under these assay conditions, especially in relation to the sperm concentration used, gamete coincubation for a period of two hours appears to be optimal for monospermy and fertilization performance. Thus, it is the optimal time period for obtaining a large number of pig embryos capable of normal development.(AU)

Esse estudo foi realizado para avaliar os efeitos de diferentes tempos de coincubação dos gametas sobre a fertilização in vitro (FIV) de suínos e se a eficiência dessa técnica poderia ser melhorada pela redução no período que os ovócitos são expostos aos espermatozoides durante a FIV. Um total de 508 (em grupos de 50) complexos cumulus-ovócito (COCs) imaturos foram maturados no meio NCSU-37. Os COCs foram cultivados por 40-44 horas e então inseminados com sêmen in natura (2.000 espermatozoides/ovócito). Os espermatozoides e ovócitos foram coincubados de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1 = ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (173 ovócitos); T2 = ovócitos expostos aos espermatozoides por duas horas (170 ovócitos) e T3 = ovócitos expostos aos espermatozoides por três horas (165 ovócitos). Após esses períodos de coincubação, os ovócitos foram lavados em meio de fertilização (meio TALP) para remoção dos espermazoides não ligados a zona pelúcida e cultivados em outro mesmo meio (não contendo espermatozoides). Após 18-20 horas de fertilização, os prováveis zigotos foram corados com Hoechst-33342 para avaliação dos resultados da FIV. A taxa de penetração foi maior (P<0,05) após o tempo de coincubação de duas horas em comparação a uma e três horas. Além disso, 68,60% dos ovócitos coincubados com os espermatozoides por duas horas foram monospérmicos. Os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (T1) apresentaram elevada (P<0,01) taxa de polispermia em comparação com o T2 e T3. A eficiência da fertilização (%) não diferiu (P>0,05) entre os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma (T1) e três horas (T3). Entretanto, ótimos (P=0,048) resultados foram obtidos após duas horas de coincubação, quando a taxa da eficiência da fertilização foi 50,16 ± 8,52%. O número de espermatozoides penetrados por ovócito e a formação de pro-núcleo masculino não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos avaliados. Sob as condições de ensaio realizadas, especialmente em relação à concentração espermática utilizada, a coincubação dos gametas por um período de duas horas parece ser ótima para as taxas de monospermia e eficiência da fertilização. Portanto, um tempo provavelmente ótimo para obter um elevado número de embriões suínos capazes de ter um desenvolvimento normal.(AU)

In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time / A fertilização in vitro de ovócitos suínos é afetada pelo tempo de coincubação espermático

The aim was to study the effects of different gamete coincubation times on porcine in vitro fertilization (IVF), and to verify whether efficiency could be improved by reducing oocyte exposure time to spermatozoa during IVF. In groups of 50, a total of 508 immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in NCSU-37 medium. The COCs were cultured for 44 hours and then inseminated with in natura semen (2,000 spermatozoa/oocyte). The sperm and oocytes were coincubated according to the following treatments (T): T1 = oocytes exposed to spermatozoa for one hour (173 oocytes), T2 = oocytes exposed to spermatozoa for two hours (170 oocytes), and T3 = oocytes exposed to spermatozoa for three hours (165 oocytes). After these coincubation periods, the oocytes were washed in fertilization medium (TALP medium) to remove spermatozoa not bound to the zona pellucida and cultured in another similar medium (containing no sperm). Eighteen to twenty hours after fertilization, the putative zygotes were stained in Hoechst-33342 to evaluate the IVF results. The penetration rate was higher (P<0.05) after two hours of coincubation time than it was for one or three hours. Furthermore, 68.60% of the ova coincubated with the spermatozoa for two hours were monospermic. The oocytes exposed to spermatozoa for one hour (T1) presented a higher (P<0.01) rate of polyspermy than those in T2 and T3. Fertilization performance (%) did not differ (P>0.05) between oocytes exposed to spermatozoa for one (T1) and three hours (T3). However, optimum (P=0.048) results were obtained after two hours of coincubation, when the rate of fertilization performance was 50.16±8.52%. The number of penetrated sperm per oocyte, as well as male pronucleus formation, did not differ (P>0.05) between the treatments evaluated. [...] (AU)

Esse estudo foi realizado para avaliar os efeitos de diferentes tempos de coincubação dos gametas sobre a fertilização in vitro (FIV) de suínos e se a eficiência dessa técnica poderia ser melhorada pela redução no período que os ovócitos são expostos aos espermatozoides durante a FIV. Um total de 508 (em grupos de 50) complexos cumulus-ovócito (COCs) imaturos foram maturados no meio NCSU-37. Os COCs foram cultivados por 40-44 horas e então inseminados com sêmen in natura (2.000 espermatozoides/ovócito). Os espermatozoides e ovócitos foram coincubados de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1 = ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (173 ovócitos); T2 = ovócitos expostos aos espermatozoides por duas horas (170 ovócitos) e T3 = ovócitos expostos aos espermatozoides por três horas (165 ovócitos). Após esses períodos de coincubação, os ovócitos foram lavados em meio de fertilização (meio TALP) para remoção dos espermazoides não ligados a zona pelúcida e cultivados em outro mesmo meio (não contendo espermatozoides). Após 18-20 horas de fertilização, os prováveis zigotos foram corados com Hoechst-33342 para avaliação dos resultados da FIV. A taxa de penetração foi maior (P<0,05) após o tempo de coincubação de duas horas em comparação a uma e três horas. Além disso, 68,60% dos ovócitos coincubados com os espermatozoides por duas horas foram monospérmicos. Os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (T1) apresentaram elevada (P<0,01) taxa de polispermia em comparação com o T2 e T3. A eficiência da fertilização (%) não diferiu (P>0,05) entre os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma (T1) e três horas (T3). Entretanto, ótimos (P=0,048) resultados foram obtidos após duas horas de coincubação, quando a taxa da eficiência da fertilização foi 50,16 ± 8,52%. O número de espermatozoides penetrados por ovócito e a formação de pro-núcleo masculino não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos avaliados. [...] (AU)

Strategies to predict and minimize differences in field fertility in bulls

Foram realizados dois estudos objetivando ajustar protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) para incrementar a prenhez por IA (P/IA) de touros Nelore de menor fertilidade e predizer a fertilidade a campo de touros Holandês. No primeiro estudo, vacas Nelore (n = 1133) foram submetidas a um protocolo de IATF, iniciando no Dia -10, com a inserção de um dispositivo intravaginal de progesterona (P4, 1,0 g) e aplicação de benzoato de estradiol (BE, 2,0 mg). No Dia -2, o dispositivo de P4 foi removido e as vacas receberam cloprostenol sódico (PGF, 0,5 mg), eCG (300 UI) e cipionato de estradiol (CE, 1,0 mg). No Dia -0,5 ou 0 as vacas foram submetidas aos tratamentos com GnRH (G- 16 = GnRH 16 h antes da IA ou G0 = GnRH na AI). No Dia 0 as vacas foram inseminadas e distribuídas no tratamento de categoria de fertilidade de touros [A = uma dose de sêmen de touro de fertilidade mais alta (n = 3); B1 = uma dose de sêmen de touro de fertilidade mais baixa (n = 3); B2 = duas doses de sêmen de touro B (n = 3)]. Além disso, foi realizado o teste de ligação espermática em agregados de células do oviduto. Foi utilizado sêmen de touros A (n = 3) e B (n = 3) da raça Nelore. Para isso, foram coletados tratos reprodutivos de vacas em abatedouro e utilizou-se a região do istmo do oviduto para coletar as células no laboratório. As células foram cultivadas por 24 h para a formação de agregados celulares, seguindo por coincubação com espermatozoides por 36 h. A motilidade espermática foi avaliada pelo sistema CASA e a integridade das membranas foi avaliada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. A fertilidade dos touros A e B foi semelhante (P > 0,10), independente do ajuste do momento da ovulação com GnRH e do número de doses de sêmen. Entretanto, apesar de a P/IA das vacas inseminadas com touros A ter sido similar independente do ECC das vacas, vacas de ECC < 3,0 tiveram menor P/IA quando inseminadas com touros B [ECC < 3,0: 50,5% (166/329); ECC 3,0: 60,6% (254/419); P < 0,05]. O número de espermatozoides ligados por mm de agregado celular não diferiu em 0,5 h (P = 0,10), mas em 12 h, 24 h e 36 h houve maior número de espermatozoides/mm de touros A (P > 0,05). Espermatozoides A tiveram maior motilidade total e progressiva do que espermatozoides B. As características de membranas analisadas não diferiram entre os touros. No segundo estudo, foi utilizado sêmen de touros A (n = 3) e B (n = 4) da raça Holandês. Avaliou-se o número de espermatozoides/mm de agregado celular. Além disso, a motilidade espermática foi avaliada pelo CASA e a integridade das membranas espermáticas por citometria de fluxo. Com 0,5 h de coincubação houve tendência para maior número de espermatozoides A ligados por mm de agregado, e a partir de 12 h de coincubação a ligação de espermatozoides nos agregados foi maior para A. Com 24 h e 36 h o número de espermatozoides ligados por agregado foi mantido, sendo maior para espermatozoides de touros A, e com 36 h houve uma alta correlação entre a fertilidade de campo e o número de espermatozoides ligados por mm de agregado (r = 0,89). Dos padrões de motilidade avaliados pelo CASA, apenas a velocidade retilínea foi maior para touros A. Das características de membranas espermáticas analisadas, touros B tiveram maior porcentagem de células com membranas plasmática e acrossomal íntegras (80,3% vs. 74,5%; P = 0,01) e maior potencial mitocondrial de células com membrana plasmática íntegra (P = 0,004). Sendo assim, o ECC das vacas, tempo de ovulação e características espermáticas influenciaram a fertilidade a campo de touros. Associadas às análises convencionais de motilidade e integridade de membranas espermáticas, a menor capacidade de se ligar às células do oviduto pode ser a causa da menor fertilidade de touros B, possibilitando o uso da técnica pela indústria como uma nova estratégia de predição da fertilidade a campo de touros.

Two studies were carried out aiming to adjust timed-artificial insemination (TAI) protocols to increase pregnancy per AI (P/AI) of Nelore bulls of lower fertility and to predict the field fertility of Holstein bulls. In the first study, Nelore cows (n = 1133) underwent a TAI protocol, starting on Day -10, with insertion of an intravaginal progesterone device (P4, 1.0 g) and treatment with estradiol benzoate (EB, 2.0 mg). On Day -2, the P4 device was removed, and cows received cloprostenol sodium (PGF, 0.5 mg), eCG (300 IU) and estradiol cypionate (EC, 1.0 mg). On Day -0.5 or 0 cows were subjected to GnRH treatments (G-16 = GnRH 16 h before AI or G0 = GnRH at AI). On Day 0 cows were inseminated and assigned to the fertility category bull treatment (H = one dose of higher fertility bull semen [n = 3]; L1 = one dose of lower fertility bull semen [n = 3]); L2 = two doses of semen from bull L [n = 3]). In addition, the sperm binding test was performed on oviduct cell aggregates. Semen from H (n = 3) and L (n = 3) Nelore bulls was used. For this, reproductive tracts of cows in slaughterhouse were collected and the region of the isthmus of the oviduct was used to collect the cells in the laboratory. Cells were cultured for 24 h to form cell explants, followed by co-incubation with sperm for 36 h. In addition, sperm motility was assessed by the CASA system and the integrity of membranes was assessed by fluorescence microscopy and flow cytometry. The fertility of bulls H and L was similar (P > 0.10), regardless of the adjustment of time of ovulation with GnRH and number of semen doses. However, despite P/AI of cows inseminated with H bulls was similar regardless of the BCS, cows with BCS < 3.0 had lower P/AI when inseminated with L bulls (BCS < 3.0: 50.5% [166/329]; BCS 3.0: 60.6% [254/419]; P < 0.05). The number of sperm bound per mm of cell explant did not differ at 0.5 h (P = 0.10), but at 12 h, 24 h and 36 h there was a greater number of sperm/mm of H bulls (P > 0.05). H sperm had greater total and progressive motility than L sperm. The membrane characteristics analyzed did not differ between H and L groups. In the second study, semen from H (n = 3) and L (n = 4) Holstein bulls was used. The number of sperm/mm of cell aggregate was evaluated. In addition, sperm motility was assessed by CASA and the integrity of sperm membranes by flow cytometry. With 0.5 h of co-incubation there was a tendency for a greater number of H sperm bound per mm of aggregate, and from 12 h of co-incubation on the binding of sperm in aggregates was greater for H. With 24 h and 36 h the number of spermatozoa bound per aggregate was maintained, being greater for sperm from bulls H, and at 36 h there was a high correlation between field fertility and the number of sperm bound per mm of explant (r = 0.89). Out of the motility patterns evaluated by CASA, only the straight velocity was higher for bulls H. Out of the sperm membrane characteristics analyzed, L bulls had the greatest percentage of cells with intact plasma and acrosomal membranes (80.3% vs. 74.5%; P = 0.01) and greater mitochondrial potential of cells with an intact plasma membrane (P = 0.004). Thus, the BCS of cows, timing of ovulation and sperm characteristics influenced field fertility of bulls. Combined with conventional analyzes of sperm motility and membrane integrity, the lower ability to bind to oviduct cells may be the cause of lower fertility in L bulls, allowing the industry to use this technique as a new strategy for predicting field fertility of bulls.

AVALIAÇÃO IN VITRO DO EFEITO DOS ESPERMATOZOIDES SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA EM AGREGADOS DE CÉLULAS EPITELIAIS DA TUBA UTERINA BOVINA

A interação entre espermatozoides e as células da tuba uterina garante a disponibilidade de espermatozoides viáveis e com maior potencial de fecundação. Estudos relacionados a ligação dos espermatozoides à tuba uterina, têm demonstrado que essa ligação influencia a transcrição e tradução de genes, promovendo a formação de um ambiente propício para a manutenção da viabilidade espermática. Objetivou-se, avaliar o efeito da concentração de espermatozoides e tempo de incubação com as células epiteliais da tuba uterina (BOEC) sobre a expressão relativa dos genes FUT 6, NQ01, CST6, B3GNT3, CKB, RARRES2, MIF e FOS. Para cada coleta das amostras, um pool de espermatozoides de seis touros foi incubado com agregados de BOEC nas concentrações de 1x103 e 1x106 spermatozoides/mL por 18h em estufa de cultivo celular, além dos grupos controle, sendo apenas com agregados celulares coletados no momento 0h e 18h. Posteriormente com base no resultado deste experimento, foi avaliado se a co-incubação por 3, 6 e 12h apresentava variação no nível de transcritos das BOEC. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) e as diferenças entre as médias foram comparados pelo teste de Tukey (p<0,05). Em relação à concentração espermática, não houve efeito sobre o nível relativo de transcritos dos genes RARRES2, MIF, CKB, CST6, B3GNT3 e NQO1 em relação ao controle 0h sem incubação. Para o gene FOS houve um aumento de sua expressão mediante o tratamento de 1x106 espermatozoides/mL em 18h de coincubação com as BOEC. Em relação ao tempo de incubação, apenas o gene MIF apresentou menor expressão após 12 h de co-incubação em relação ao momento 0 e 6 h. Baseado nesses resultados, conclui-se que a interação de espermatozoides e BOEC modula a expressão do gene MIF e FOS in vitro. Para os demais genes avaliados, não foi identificado efeito dos espermatozoides sobre o nível de transcritos.

The interaction between spermatozoa and uterine tubal cells ensures the availability of viable spermatozoids with a higher fertilization potential. Studies related to sperm binding to the uterine tube have shown that this influence influences the transcription and translation of genes, promoting the formation of an environment conducive to the maintenance of sperm viability. The objective of this study was to evaluate the effect of sperm concentration and incubation time on the relative expression of the FUT 6, NQ01, CST6, B3GNT3, CKB, RARRES2, MIF and FOS genes. For each collection of samples, a sperm pool of six bulls was incubated with BOEC aggregates at concentrations of 1x103 and 1x106 spermatozoids / mL for 18h in a cell culture oven, in addition to the control groups, with only cell aggregates collected at time 0h and 6:00 p.m. Subsequently based on the result of this experiment, it was evaluated whether the co-incubation for 3, 6 and 12h presented variation in the level of BOEC transcripts. Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA) and the differences between means were compared by the Tukey test (p <0.05). In relation to the sperm concentration, there was no effect on the relative level of transcripts of genes RARRES2, MIF, CKB, CST6, B3GNT3 and NQO1 in relation to the 0h control without incubation. For the FOS gene there was an increase of its expression by the treatment of 1x106 spermatozoa / mL in 18h of co-incubation with the BOEC. In relation to the incubation time, only the MIF gene presented lower expression after 12 h of coincubation in relation to the moment 0 and 6 h. Based on these results, we conclude that the interaction of spermatozoa and BOEC modulates the expression of the MIF and FOS gene in vitro. For the other evaluated genes, no effect of spermatozoa on the level of transcripts was identified.

Recent advances in micromanipulation and transgenesis in domestic mammals

Background: Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) involves mechanical transfer of a single sperm cell into ooplasm. A new application has been recently found for ICSI, the production of transgenic animals. Since the birth of ''Dolly'', the first adult somatic cloned mammal, viable offspring has been produced by nuclear transfer in many species including cattle. The present review briefly summarizes our experience with ICSI and somatic cell nuclear transfer mainly to produce transgenic embryos, as well as for the generation of new micromanipulation technique. Review: We have evaluated different factors that affect SCNT and transgenesis including the chemical activator, the transfection event and the effect of recloning. Also, we included a brief description of the ICSI technique, which we used in five different species, examining its potential to produce transgenic embryos. Finally different strategies to produce transgenic animals were analyzed: ICSI- mediated gen transfer (ICSI-MGT), Injection of cumulus cell and ooplasmic vesicle incubated for 5 min with the transgene or injection of the plasmid alone. All of them were very efficient in exogenous DNA expression at embryo stages but resulted in mosaic embryos. We demonstrated that "ICSI-MGT" assisted by chemical activation is the only treatment of sperm mediated gen transfer capable to generated transgenic embryos in ovine. Besides, after ICSI-MGT, it is possible to obtain enhanced green fluorescent protein (EGFP)-expressing embryos in five diferent species: ovine, porcine, feline, bovine and equine. Our studies also established for the first time that short term transgene co-incubation with somatic cells can produce transgene-expressing mammalian SCNT embryos, and also that parthenogenic, eDNA- expressing embryos can be obtained by injection of vesicles or eDNA alone. Moreover, eDNA- -expressing embryos can be also obtained by cytoplasmic injection of vesicles in IVF zygotes, simplifying the traditional IVF pronuclear injection technique. We tried a further simplification of the technique in bovine oocytes and zygotes, by intracytoplasmically injecting them with eDNA-liposomes complexes. Approximately 70% of the cleaved embryos and 50% of the blastocysts expressed EGFP, when egfp­liposome was injected 16 h post-fertilization. Different approaches were assayed to reverse the mosaicism including a novel technique of gamete cloning. Our first approach consisted of the production of transgenic IVF embryos by vesicle microinjection to generate transgenic blastomeres to be used as donor cells for cloning. A high efficiency in mosaicism reversal and multiplication of transgenic embryos was attaineded. Other technique assayed was the separation of transgenic blastomeres followed by the aggregation of two-cell fused embryos or by the asynchronous younger blastomere successfully multiplied transgenic embryos, and theoretically reduces mosaicism rates in future offspring [15]. This technology can also be used to multiply embryos from animals with high genetic value. We demonstrated that a sperm and oocyte can be efficiently cloned. Green haploid androgenic blastomeres produced with the injection of a single sperm by egfp ICSI-MGT could be used to fertilized oocytes resulting in several homogeneous expressing embryos. This approach shows great potential because it allows for determination of the sex of the sperm nucleus prior to fertilization. It is also possible to clone previously transfected oocytes followed by the reconstruction of biparental bovine embryos to generate homogeneous transgene-expressing embryos. This review summarizes recent experiments in micromanipulation and gene transfer in domestic animals. The objective is not to exhaustedly describe the research done in this field but to present the promising methods recently developed or evaluated in our lab. Conclusion: Significant advancements have been made in the course of the recent years in micromanipulation and transgenesis techniques. In our lab we have been evaluating ICSI and Nuclear transfer mainly to produce transgenic embryos. We used also transgensis to apply or developed new micromanipulation technique in domestic animals linke sperm and oocyte cloning.