Mecanismos epigenéticos nos espermatozoides e o impacto sobre a fertilidade masculina / Epigenetic mechanisms on sperm cells and the impact on male fertility

Por ser uma célula altamente especializada, o espermatozoide apresenta diferentes mecanismos epigenéticos, sendo os principais as metilações do DNA, o código de histonas, os ncRNAs (RNAs não codificadores), e a alta condensação da cromatina pela presença das protaminas. Estes mecanismos interagem entre si, contribuindo para a formação do epigenoma espermático, que modela a carga molecular espermática, que, por sua vez, pode impactar sobre as características do desenvolvimento embrionário e da progênie. Dessa forma, atualmente é consenso que o papel do espermatozoide ultrapassa a entrega de DNA de qualidade para o oócito no momento da fecundação. Pesquisas recentes de diversos grupos, incluindo o nosso, mostram que além da contribuição com DNA de qualidade, o espermatozoide entrega moléculas ao oócito no momento da fecundação que influenciam o desenvolvimento do embrião. Recentemente, essas moléculas de origem espermática (Em inglês: sperm-borne) também são associadas com alterações metabólicas e cognitivas da progênie. Embora ainda pouco se entenda como esses mecanismos podem persistir mesmo com o ciclo de reprogramação celular que ocorre logo após a fecundação, é evidente que estes podem impactar as características da progênie. Nesta revisão abordaremos sobre a modulação do epigenoma espermático e seus efeitos no desenvolvimento embrionário.(AU)

Since it is a highly specialized cell, the spermatozoa display different epigenetic mechanisms; the main ones are DNA methylation, histone code, ncRNAs (non-coding RNAs), and high chromatin condensation by the presence of protamines. These mechanisms act in synergy contributing to forming the sperm epigenome, which modulates the spermatic molecular cargo, and, may impact embryo and offspring development features. Thus, it is currently a consensus that the role of spermatozoa goes beyond delivering quality DNA to the oocyte at fertilization. Relevant findings from several research groups, including ours, have shown that sperm delivers several molecules to the oocyte at fertilization, beyond the contribution to DNA, which influences the development of the embryo. Recently, these sperm-borne molecules have also been associated with metabolic and cognitive changes in the offspring. Although the mechanism by which these changes can persist even after embryo reprogramming is not completely understood, evidence shows that sperm cell molecular content impacts embryo and offspring development. This review will mainly focus on the modulation of the sperm epigenome and its effects on embryo development.(AU)

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes) / Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.(AU)

Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.(AU)

Investigação metagenômica em queijos tipo coloniais, produzidos com leite pasteurizado e comercializados no estado do Rio Grande do Sul, Brasil / Metagenomic investigation in colonial cheese produced with pasteurized milk and sold in the state of Rio Grande do Sul, Brazil / Investigación metagenómica en quesos de tipo colonial, producidos con leche pasteurizada y comercialziados en el estado de Río Grande do Sul, Brasil

Leite e derivados são alimentos muito susceptíveis a ataques de micro-organismos. Sua fiscalização no Brasil está a cargo das Inspeções Municipais, Estaduais ou Federais, sendo a verificação da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos uma atividade de extrema importância. Este estudo utilizou a análise metagenômica para investigar sequencias genéticas microbianas em 12 marcas de queijo tipo colonial produzidos sob diferentes regimes de fiscalização pública, e comercializados no estado do Rio Grande do Sul em dois municípios distintos. Foi identificado DNA de micro-organismos pertencentes a quatro filos microbianos: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. Dentre os resultados mais relevantes, sequências genéticas de micro-organismos patogênicos ou prejudiciais à tecnologia do leite foram evidenciados, com os gêneros Acinetobacter, Bacillus e Pseudomonas ocorrrendo em 100% das amostras avaliadas. Outras bactérias de importância em saúde pública, como as pertencentes à Família Enterobacteriaceae e o gênero Staphylococcus foram detectados e são discutidos. À comparação das medianas de detecção nos 3 níveis de fiscalização, quando da avaliação por pares, evidenciou-se diferença estatística entre as esferas municipal e federal (PT= 0,03), com maior mediana registrada em nível municipal. À avaliação entre os municípios, não foi evidenciada diferença significativa (PMW= 0,81). Sugere-se melhor qualidade microbiológica do queijo, e/ou leite utilizado como matéria-prima, pertencentes à produção submetida à Inspeção Federal em relação à Municipal.

Milk and dairy products are very susceptible foods to microorganism attacks. Its control in Brazil is submitted to Municipal, State or Federal Inspections, and verification of the hygienic-sanitary quality of food is an extremely important activity. This study used metagenomic analysis to investigate microbial genetic sequences in 12 brands of colonial cheese produced under different Public Inspection regimes and selled in two different municipalities in the state of Rio Grande do Sul. DNA from microorganisms belonging to four microbial Phyla have been identified: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria. Among the most relevant results, genetic sequences of pathogenic microorganisms or harmful to milk technology were evidenced, with Acinetobacter, Bacillus and Pseudomona sbacterias occurring in 100% of the evaluated samples. Other public health important bacterias, such as those belonging to the Enterobacteriaceae and Staphylococcus spp. were detected and discussed. Comparing the detection medians in the 3 levels of inspection by peer evaluation, a statistical difference was highlighted between the Municipal and Federal levels (PT= 0,03), with the highest median recorded at Municipal level. It is suggested better microbiological quality of cheese, and / or milk used as raw material, when they belong to the production submitted to the Federal Inspection in relation to Municipal one.

La leche y los derivados son alimentos muy susceptibles a los ataques de microorganismos. Su fiscalización en Brasil es responsabilidad de las inspecciones municipales, estatales o federales, y la verificación de la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos es una actividad extremadamente importante. Este estudio utilizó el análisis metagenómico para investigar secuencias genéticas microbianas en 12 marcas de queso colonial com produción sometida a diferentes regímenes de inspección pública, y comercializadas en el estado de Rio Grande do Sul en dos municipios diferentes. Se han identificado ADN de microorganismos pertenecientes a cuatro filamentos microbianos: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Entre los resultados más relevantes, se evidenciaron secuencias genéticas de microorganismos patógenos o nocivos para la tecnología de la leche,com detección de los géneros Acinetobacter, Bacillus y Pseudomonas en el 100% de las muestras evaluadas. Se detectaron y discutieron otras bacterias de importancia para la salud pública, como las que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y el género Staphylococcus. La comparación de las medianas de detección en los 3 niveles de inspección, cuando la evaluación por pares, mostró una diferencia estadística entre los niveles municipales y federales (PT= 0,03), con la mediana más alta registrada a nivel municipal. En la evaluación entre los municipios, no se evidenciaron diferencias significativas (PMW= 0.81). Se sugiere una mejor calidad microbiológica del queso, y / o leche utilizada como materia prima, perteneciente a la producción sometida a la Inspección Federal en relación con el Municipal.

Investigação metagenômica em queijos tipo coloniais, produzidos com leite pasteurizado e comercializados no estado do Rio Grande do Sul, Brasil / Metagenomic investigation in colonial cheese produced with pasteurized milk and sold in the state of Rio Grande do Sul, Brazil / Investigación metagenómica en quesos de tipo colonial, producidos con leche pasteurizada y comercialziados en el estado de Río Grande do Sul, Brasil

Leite e derivados são alimentos muito susceptíveis a ataques de micro-organismos. Sua fiscalização no Brasil está a cargo das Inspeções Municipais, Estaduais ou Federais, sendo a verificação da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos uma atividade de extrema importância. Este estudo utilizou a análise metagenômica para investigar sequencias genéticas microbianas em 12 marcas de queijo tipo colonial produzidos sob diferentes regimes de fiscalização pública, e comercializados no estado do Rio Grande do Sul em dois municípios distintos. Foi identificado DNA de micro-organismos pertencentes a quatro filos microbianos: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. Dentre os resultados mais relevantes, sequências genéticas de micro-organismos patogênicos ou prejudiciais à tecnologia do leite foram evidenciados, com os gêneros Acinetobacter, Bacillus e Pseudomonas ocorrrendo em 100% das amostras avaliadas. Outras bactérias de importância em saúde pública, como as pertencentes à Família Enterobacteriaceae e o gênero Staphylococcus foram detectados e são discutidos. À comparação das medianas de detecção nos 3 níveis de fiscalização, quando da avaliação por pares, evidenciou-se diferença estatística entre as esferas municipal e federal (PT= 0,03), com maior mediana registrada em nível municipal. À avaliação entre os municípios, não foi evidenciada diferença significativa (PMW= 0,81). Sugere-se melhor qualidade microbiológica do queijo, e/ou leite utilizado como matéria-prima, pertencentes à produção submetida à Inspeção Federal em relação à Municipal.(AU)

Milk and dairy products are very susceptible foods to microorganism attacks. Its control in Brazil is submitted to Municipal, State or Federal Inspections, and verification of the hygienic-sanitary quality of food is an extremely important activity. This study used metagenomic analysis to investigate microbial genetic sequences in 12 brands of colonial cheese produced under different Public Inspection regimes and selled in two different municipalities in the state of Rio Grande do Sul. DNA from microorganisms belonging to four microbial Phyla have been identified: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria. Among the most relevant results, genetic sequences of pathogenic microorganisms or harmful to milk technology were evidenced, with Acinetobacter, Bacillus and Pseudomona sbacterias occurring in 100% of the evaluated samples. Other public health important bacterias, such as those belonging to the Enterobacteriaceae and Staphylococcus spp. were detected and discussed. Comparing the detection medians in the 3 levels of inspection by peer evaluation, a statistical difference was highlighted between the Municipal and Federal levels (PT= 0,03), with the highest median recorded at Municipal level. It is suggested better microbiological quality of cheese, and / or milk used as raw material, when they belong to the production submitted to the Federal Inspection in relation to Municipal one.(AU)

La leche y los derivados son alimentos muy susceptibles a los ataques de microorganismos. Su fiscalización en Brasil es responsabilidad de las inspecciones municipales, estatales o federales, y la verificación de la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos es una actividad extremadamente importante. Este estudio utilizó el análisis metagenómico para investigar secuencias genéticas microbianas en 12 marcas de queso colonial com produción sometida a diferentes regímenes de inspección pública, y comercializadas en el estado de Rio Grande do Sul en dos municipios diferentes. Se han identificado ADN de microorganismos pertenecientes a cuatro filamentos microbianos: Acinetobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Entre los resultados más relevantes, se evidenciaron secuencias genéticas de microorganismos patógenos o nocivos para la tecnología de la leche,com detección de los géneros Acinetobacter, Bacillus y Pseudomonas en el 100% de las muestras evaluadas. Se detectaron y discutieron otras bacterias de importancia para la salud pública, como las que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y el género Staphylococcus. La comparación de las medianas de detección en los 3 niveles de inspección, cuando la evaluación por pares, mostró una diferencia estadística entre los niveles municipales y federales (PT= 0,03), con la mediana más alta registrada a nivel municipal. En la evaluación entre los municipios, no se evidenciaron diferencias significativas (PMW= 0.81). Se sugiere una mejor calidad microbiológica del queso, y / o leche utilizada como materia prima, perteneciente a la producción sometida a la Inspección Federal en relación con el Municipal.(AU)

Allele and genotype frequency for milk beta-casein in dairy cattle in the northern region of Tocantins State, Brazil / Frequências alélicas e genotípicas para beta-caseína do leite em bovinos leiteiros da microrregião de Araguaína, Tocantins

At present, there is a concern about the quality of milk and diseases related to its consumption, as it can generate discomfort and allergic reactions in some individuals due to its protein components. Thus, the present study was developed to identify the allele and genotype frequencies of genes for ß-casein, A1 and A2, in dairy herds in the region of Araguaína-TO, Brazil. Genetic material from 421 animals (crossbred dairy cattle in lactation) was used. All animals were numbered for identification, and DNA samples were extracted from hair bulbs. Samples for two markers from the polymorphic regions were characterized and confirmed by real-time PCR using the ABI Prism® 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Allele and genotype frequencies were determined using the TaqMan™ detection system, where the primer and probe release different fluorescence signals for each allele of the polymorphism. The sampled herd showed frequencies of 28.27% for the A1 allele and 71.73% for the A2 allele. Genotype frequencies were 52.96% (223/421) for A2A2; 37.53% (158/421) for the A1A2 genotype; and 9.50% (40/421) for the A1A1 genotype. The frequency of the A1 allele for ß-casein in dairy herds from the northern region of Tocantins was low and is per the results of previous studies. Although the A2A2 genotype of ß-casein had a high relative frequency, the A1A2 genotype is still rather frequent, warranting greater selection pressure.(AU)

Atualmente existe uma preocupação em relação à qualidade e doenças que estão relacionadas ao consumo de leite, pois o mesmo pode gerar desconfortos e reações alergicas em alguns indivíduos devido aos seus constituintes protéicos. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar a frequência alélica e genotípica de genes para beta caseína, A1 e A2, em rebanhos leiteiros da região de Araguaína-TO. Foram utilizados material genético de 421 animais (bovinos leiteiros mestiços em lactação), e todos os animais foram numerados para identificação e amostras de DNA foram extraídas de bulbo de folículos pilosos. As amostras para dois marcadores das regiões polimórficas foram caracterizadas e confirmadas por PCR em tempo real, usando um sistema de detecção de sequências ABI Prism® 7500 (Applied Biosystems). As frequências alélicas e genotípicas foram determinadas utilizando o sistema de detecção TaqMan ™, no qual o primer e a sonda emitem diferentes sinais de fluorescência para cada alelo do polimorfismo. Observou-se frequência do alelo A1 de 28,27%, e do alelo A2 de 71,73% no rebanho amostral. A frequência genotípica de A2A2 foi de 52,96% (223/421), com genótipo A1A2 de 37,53% (158/421), e de 9,50% (40/421) animais com genótipo A1A1. A frequência do alelo A1 para beta-caseína em rebanhos leiteiros da região norte do Tocantins foi baixa e seguiu a mesma tendência já observada em estudos anteriores. Os genótipos A2A2 da beta-caseína apresentaram frequência relativa alta, entretanto o genótipo A1A2 ainda é bastante frequente, necessitando de maior pressão de seleção.(AU)

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

SSR and ISSR markers in assessing genetic diversity in Gallus gallus domesticus: a quantitative analysis of scientific production / Marcadores SSR e ISSR na avaliação da diversidade genética em Gallus gallus domesticus: uma análise quantitativa da produção científica

Poultry meat is a major source of animal protein in the world. Research indicates a high inbreeding rate derived from a relative absence of heterozygous subpopulations of chicken from different suppliers. Molecular markers can provide information for the genetic basis of chicken consumed in rural areas and help establishing a chicken database for product quality and warranty. The bibliometric research, comprises between 1994 and 2018, from five previously selected databases: Google Scholar, PubMed, ScienceDirect, Scopus and Web of Science, using the following descriptors: microsatellites, SSR, ISSR, genetic variability and genetic diversity, all of them coupled to chicken and/or birds results in 66 scientific publications. The publications were then categorized according to their titles to the use of ISSR or SSR markers. They were also addressed by countries according first author cited. The publications data appointed that countries with the height production of poultry meat and hens are the most interested in the genetic diversity study of these species. The SSR markers, due to its more specific characteristic, are more frequently applied to genetic diversity assignment, compared to ISSR.(AU)

A carne de frango é uma das principais fontes de proteína animal do mundo. Pesquisas indicam uma alta taxa de endogamia derivada de uma relativa ausência de subpopulações heterozigotas de frango de diferentes fornecedores. Marcadores moleculares podem fornecer informações para a base genética de frango consumido em áreas rurais, e ajudar a estabelecer um banco de dados de frango para qualidade e garantia do produto. A pesquisa bibliométrica compreende entre 1994 e 2018, a partir de cinco bancos de dados selecionados anteriormente: Google Scholar, PubMed, ScienceDirect, Scopus e Web of Science, usando os seguintes descritores: microssatélites, SSR, ISSR, variabilidade genética e diversidade genética, todos eles associados a resultados de galinha e / ou aves o que resultou em 66 publicações científicas. As publicações foram então categorizadas de acordo com seus títulos para o uso de marcadores ISSR ou SSR. Eles também foram abordados pelos países, segundo o primeiro autor citado. Os dados das publicações obtidas apontam que os países com grande produção de carnes de frangos são os mais interessados no estudo da diversidade genética dessas espécies. Os marcadores SSR, devido à sua característica mais específica, são frequentemente aplicados à atribuição de diversidade genética, em comparação com o ISSR.(AU)

Efeito da adição de plasma seminal oriundo de animais de alta e baixa fertilidade na criopreservação de espermatozoides da cauda do epidídimo e do ejaculado de garanhões subférteis / Effect of seminal plasma addition from high and low fertility animals on the cryopreservation of epididymal tail and ejaculated sperm from subfertile stallions

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de plasma seminal de garanhões de alta e baixa fertilidade sobre a congelabilidade e a viabilidade de espermatozoides do ejaculado (EJ) e do epidídimo (EP) de garanhões subférteis. Foram utilizados seis garanhões com histórico de subfertilidade. Após coleta, espermatozoides do ejaculado foram divididos em três alíquotas: BotuSêmen® (EJ-CT); plasma seminal de alta qualidade espermática (EJ-PS1); e plasma seminal de baixa qualidade espermática (EJ-PS2). O mesmo protocolo foi realizado com espermatozoides da cauda do epidídimo após orquiectomia (EP-CT; EP-PS1; EP-PS2). Foram realizadas avaliações da cinética espermática pelo CASA e análises de integridade de membrana, acrossoma, fragmentação de DNA, capacitação espermática e peroxidação espermática por citometria de fluxo. Não foram observadas diferenças na cinética espermática entre EJ e EP, logo após a descongelação. Porém, foi observada maior (P<0,05) porcentagem de células com membranas plasmática e acrossomal íntegras nos grupos EP (EP-CT:31,7±7,5b; EP-PS1:35,2±7,0b; EP-PS2:33,9±7,2b) em comparação aos grupos EJ (EJ-CT:15,1±4,9a; EJ-PS1:11,7±4,5a; EJ-PS2:13,1±5,2a). Adicionalmente, foram observadas diferenças no índice de fragmentação de DNA (EJ-CT:2,6±0,6a; EJ-PS1:2,4±0,8a; EJ-PS2:3,0±0,8a; EP-CT:1,4±0,4b; EP-PS1:1,2±0,3b; EP-PS2:1,3±0,2b). Concluiu-se que a adição de 20% de plasma seminal, oriundo de animais férteis ou subférteis, previamente à congelação de espermatozoides epidídimários de animais subférteis não interfere na qualidade espermática.(AU)

The aim of this study was to compare the effect of the addition of seminal plasma from high and low fertility stallions on sperm viability of frozen-thawed sperm cells from ejaculate and from epididymal tail of subfertile stallions. Six stallions with a history of subfertility were used. After collection, ejaculate spermatozoa were divided into three aliquots: Botu-Semen® (EJ-CT); High-quality seminal plasma (EJ-PS1); Low-quality seminal plasma (EJ-PS2). The same was done with sperm cells from epididymis tail after orchiectomy (EP-CT; EP-PS1; EP-PS2). Evaluations of sperm kinetics were assessed by CASA and membrane and acrosome integrity, DNA fragmentation, sperm capacitation and sperm peroxidation were assessed by flow cytometry. After thawing, no differences were observed between ejaculated sperm (EJ) and epididymal sperm (EP) in any CASA evaluations. However, higher (P< 0.05) percentage of cells with intact plasma and acrossomal membranes was observed in EP groups (EP-CT:31.7±7.5b; EP-PS1:35.2±7.0b; EP-PS2:33.9±7.2b) compared to EJ groups (EJ-CT:15.1±4.9a, EJ-PS1:11.7±4.5a, EJ-PS2:13.1±5,2a). In addition, differences in DNA fragmentation index were observed (EJ-CT:2.6±0.6a; EJ-PS1:2.4±0.8a; EJ-PS2:3.0±0.8a; CT:1.4±0.4b; EP-PS1:1.2±0.3b; EP-PS2:1.3±0.2b). It was concluded that the addition of 20% seminal plasma from fertile or subfertile animals prior to the freezing of epididymal spermatozoa from subfertile animals does not interfere in sperm quality.(AU)

Efeito da adição de plasma seminal oriundo de animais de alta e baixa fertilidade na criopreservação de espermatozoides da cauda do epidídimo e do ejaculado de garanhões subférteis / Effect of seminal plasma addition from high and low fertility animals on the cryopreservation of epididymal tail and ejaculated sperm from subfertile stallions

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de plasma seminal de garanhões de alta e baixa fertilidade sobre a congelabilidade e a viabilidade de espermatozoides do ejaculado (EJ) e do epidídimo (EP) de garanhões subférteis. Foram utilizados seis garanhões com histórico de subfertilidade. Após coleta, espermatozoides do ejaculado foram divididos em três alíquotas: BotuSêmen® (EJ-CT); plasma seminal de alta qualidade espermática (EJ-PS1); e plasma seminal de baixa qualidade espermática (EJ-PS2). O mesmo protocolo foi realizado com espermatozoides da cauda do epidídimo após orquiectomia (EP-CT; EP-PS1; EP-PS2). Foram realizadas avaliações da cinética espermática pelo CASA e análises de integridade de membrana, acrossoma, fragmentação de DNA, capacitação espermática e peroxidação espermática por citometria de fluxo. Não foram observadas diferenças na cinética espermática entre EJ e EP, logo após a descongelação. Porém, foi observada maior (P<0,05) porcentagem de células com membranas plasmática e acrossomal íntegras nos grupos EP (EP-CT:31,7±7,5b; EP-PS1:35,2±7,0b; EP-PS2:33,9±7,2b) em comparação aos grupos EJ (EJ-CT:15,1±4,9a; EJ-PS1:11,7±4,5a; EJ-PS2:13,1±5,2a). Adicionalmente, foram observadas diferenças no índice de fragmentação de DNA (EJ-CT:2,6±0,6a; EJ-PS1:2,4±0,8a; EJ-PS2:3,0±0,8a; EP-CT:1,4±0,4b; EP-PS1:1,2±0,3b; EP-PS2:1,3±0,2b). Concluiu-se que a adição de 20% de plasma seminal, oriundo de animais férteis ou subférteis, previamente à congelação de espermatozoides epidídimários de animais subférteis não interfere na qualidade espermática.(AU)

The aim of this study was to compare the effect of the addition of seminal plasma from high and low fertility stallions on sperm viability of frozen-thawed sperm cells from ejaculate and from epididymal tail of subfertile stallions. Six stallions with a history of subfertility were used. After collection, ejaculate spermatozoa were divided into three aliquots: Botu-Semen® (EJ-CT); High-quality seminal plasma (EJ-PS1); Low-quality seminal plasma (EJ-PS2). The same was done with sperm cells from epididymis tail after orchiectomy (EP-CT; EP-PS1; EP-PS2). Evaluations of sperm kinetics were assessed by CASA and membrane and acrosome integrity, DNA fragmentation, sperm capacitation and sperm peroxidation were assessed by flow cytometry. After thawing, no differences were observed between ejaculated sperm (EJ) and epididymal sperm (EP) in any CASA evaluations. However, higher (P< 0.05) percentage of cells with intact plasma and acrossomal membranes was observed in EP groups (EP-CT:31.7±7.5b; EP-PS1:35.2±7.0b; EP-PS2:33.9±7.2b) compared to EJ groups (EJ-CT:15.1±4.9a, EJ-PS1:11.7±4.5a, EJ-PS2:13.1±5,2a). In addition, differences in DNA fragmentation index were observed (EJ-CT:2.6±0.6a; EJ-PS1:2.4±0.8a; EJ-PS2:3.0±0.8a; CT:1.4±0.4b; EP-PS1:1.2±0.3b; EP-PS2:1.3±0.2b). It was concluded that the addition of 20% seminal plasma from fertile or subfertile animals prior to the freezing of epididymal spermatozoa from subfertile animals does not interfere in sperm quality.(AU)

Identification of subclinical mastitis caused by Mycoplasma spp. from screenings of bulk tanks / Identificação de mastite subclínica causada por Mycoplasma spp. de triagem de tanques de expansão

Mastitis caused by Mycoplasma spp., regardless of species, are considered highly contagious pathogens and, usually was not responsive to antimicrobial therapy. Five dairy herds, comprising 489 animals and 1,956 mammary glands, were used in this study. Milk samples were obtained from bulk tanks and subjected to polymerase chain reaction (PCR) for the identification of Mollicutes, Mycoplasma spp., and Mycoplasma bovis. Moreover, individual samples from cases of clinical and subclinical mastitis in quarters of the dairy herds' animals that yielded a positive PCR upon bulk tank analysis were subjected to molecular analysis. Only one bulk tank was positive for class Mollicutes by PCR. All positive samples classified as mastitis teats had their DNA extracted and tested by PCR for both class Mollicutes and M. bovis. Of these, two (2.08%) were positive for Mycoplasma genus, although none was positive for M. bovis. This result suggests that the PCR of bulk tanks is a viable tool in monitoring and preventing mastitis infections caused by Mycoplasma spp.(AU)

Mastites bovinas causadas por Mycoplasma spp., independentemente da espécie causadora, são consideradas de alta contagiosidade e geralmente não responsivas à terapia antimicrobiana. Cinco propriedades leiteiras foram utilizadas neste estudo, totalizando 489 animais e 1956 quartos mamários. As amostras de leite foram obtidas de tanques de expansão e submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa de Mollicutes, Mycoplasma spp. e Mycoplasma bovis. Apenas um tanque de uma propriedade foi positivo na PCR para a classe Mollicutes. Amostras individuais de casos de mastite subclínica provenientes de propriedade com tanque positivo também foram submetidas à análise molecular; dessas, duas delas (2,08%) foram positivas para a classe Mollicutes e para o gênero Mycoplasma, entretanto nenhuma foi positiva para a espécie Mycoplasma bovis. Isso sugere que a PCR de tanques de expansão de propriedades leiteiras demonstra ser uma ferramenta viável no monitoramento e na prevenção de infecções por Mycoplasma spp.(AU)

Identification of subclinical mastitis caused by Mycoplasma spp. from screenings of bulk tanks / Identificação de mastite subclínica causada por Mycoplasma spp. de triagem de tanques de expansão

Mastitis caused by Mycoplasma spp., regardless of species, are considered highly contagious pathogens and, usually was not responsive to antimicrobial therapy. Five dairy herds, comprising 489 animals and 1,956 mammary glands, were used in this study. Milk samples were obtained from bulk tanks and subjected to polymerase chain reaction (PCR) for the identification of Mollicutes, Mycoplasma spp., and Mycoplasma bovis. Moreover, individual samples from cases of clinical and subclinical mastitis in quarters of the dairy herds' animals that yielded a positive PCR upon bulk tank analysis were subjected to molecular analysis. Only one bulk tank was positive for class Mollicutes by PCR. All positive samples classified as mastitis teats had their DNA extracted and tested by PCR for both class Mollicutes and M. bovis. Of these, two (2.08%) were positive for Mycoplasma genus, although none was positive for M. bovis. This result suggests that the PCR of bulk tanks is a viable tool in monitoring and preventing mastitis infections caused by Mycoplasma spp.(AU)

Mastites bovinas causadas por Mycoplasma spp., independentemente da espécie causadora, são consideradas de alta contagiosidade e geralmente não responsivas à terapia antimicrobiana. Cinco propriedades leiteiras foram utilizadas neste estudo, totalizando 489 animais e 1956 quartos mamários. As amostras de leite foram obtidas de tanques de expansão e submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa de Mollicutes, Mycoplasma spp. e Mycoplasma bovis. Apenas um tanque de uma propriedade foi positivo na PCR para a classe Mollicutes. Amostras individuais de casos de mastite subclínica provenientes de propriedade com tanque positivo também foram submetidas à análise molecular; dessas, duas delas (2,08%) foram positivas para a classe Mollicutes e para o gênero Mycoplasma, entretanto nenhuma foi positiva para a espécie Mycoplasma bovis. Isso sugere que a PCR de tanques de expansão de propriedades leiteiras demonstra ser uma ferramenta viável no monitoramento e na prevenção de infecções por Mycoplasma spp.(AU)

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

Acción de oxígeno en especies reactivas en los espermatozoides / Action of reactive oxygen species on spermatozoa / Ação das espécies reativas de oxigênio nos espermatozoides

Para que el esperma puede desempeñar sus funciones y lograr el objetivo final, que es la fertilización, requieren energía que proviene de trifosfato de adenosina (ATP). Durante el metabolismo de la energía se almacena en forma de electrones de alta energía que se dirige a la cadena de transporte de electrones, compuesto de cinco proteínas supramolecular. En este proceso, se produce la formación de una, el anión intermedio radical semiquinona (Q- ) que es finalmente capaz de transferir este electrón desapareado a O2 y formar especies reactivas del oxígeno, la superóxido principal, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. Estas moléculas son procesos de activación altamente reactivos y espermatozoides que llevan a la degradación y la disminución de la calidad celular. Sin embargo, estas mismas moléculas que a menudo se consideran grandes villanos, también participan en los mecanismos que culminan en la fertilización y la formación de cigoto, adquiriendo así una gran importancia. Con el advenimiento de la criopreservación del semen y el estrés oxidativo asociado con el procesamiento, especies reactivas de oxígeno entraron en evidencia en la investigación, por lo que es necesario estudiar su acción y formas de reducir el estrés oxidativo.(AU)

So that spermatozoa can perform functions and achieve the goal that is fertilization, require energy from adenosine triphosphate (ATP). During the energy metabolism is stored in the form of high-energy electrons that are directed to the electron transport chain, comprised of five supramolecular protein. In this process, there is the formation of a semiquinone anion (Q¯) an intermediate radical that is eventually able to transfer this unpaired electron to O2 and form reactive oxygen species, as the main superoxide, hydrogen peroxide and hydroxyl radical. These molecules are highly reactive and sperm trigger processes that lead to degradation and decrease in cell quality. However these same molecules that are often considered great villains, also participate in mechanisms that culminate in fertilization and zygote formation, thus acquiring great importance. With the advent of semen cryopreservation and oxidative stress associated with the processing, reactive oxygen species entered into evidence in the research, making it necessary to study its action and ways to reduce oxidative stress.(AU)

Para que os espermatozoides possam executar suas funções e alcançarem o objetivo final, que é a fecundação, necessitam de energia que advém da adenosina trifosfato (ATP). Durante o metabolismo, a energia é armazenada na forma de elétrons de alta energia que são direcionados a cadeia de transporte de elétrons, composta de cinco proteínas supramoleculares. Neste processo, há a formação de um radical intermediário, o ânion semiquinona (Q) que eventualmente é capaz de transferir este elétron desemparelhado ao O2 e formar as espécies reativas de oxigênio, sendo as principais o superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila. Essas moléculas são altamente reativas e nos espermatozoides desencadeiam processos que levam à degradação e decréscimo na qualidade celular. Porém, essas mesmas moléculas que muitas vezes são consideradas grandes vilãs, também participam de mecanismos que culminam na fertilização e formação do zigoto, adquirindo assim uma grande importância. Com o advento da criopreservação de sêmen e o estresse oxidativo associado ao processamento, as espécies reativas de oxigênio entraram em evidência nas pesquisas, tornando-se necessário o estudo de sua ação e maneiras de reduzir o estresse oxidativo.(AU)

Acción de oxígeno en especies reactivas en los espermatozoides / Action of reactive oxygen species on spermatozoa / Ação das espécies reativas de oxigênio nos espermatozoides

Para que el esperma puede desempeñar sus funciones y lograr el objetivo final, que es la fertilización, requieren energía que proviene de trifosfato de adenosina (ATP). Durante el metabolismo de la energía se almacena en forma de electrones de alta energía que se dirige a la cadena de transporte de electrones, compuesto de cinco proteínas supramolecular. En este proceso, se produce la formación de una, el anión intermedio radical semiquinona (Q- ) que es finalmente capaz de transferir este electrón desapareado a O2 y formar especies reactivas del oxígeno, la superóxido principal, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. Estas moléculas son procesos de activación altamente reactivos y espermatozoides que llevan a la degradación y la disminución de la calidad celular. Sin embargo, estas mismas moléculas que a menudo se consideran grandes villanos, también participan en los mecanismos que culminan en la fertilización y la formación de cigoto, adquiriendo así una gran importancia. Con el advenimiento de la criopreservación del semen y el estrés oxidativo asociado con el procesamiento, especies reactivas de oxígeno entraron en evidencia en la investigación, por lo que es necesario estudiar su acción y formas de reducir el estrés oxidativo.

So that spermatozoa can perform functions and achieve the goal that is fertilization, require energy from adenosine triphosphate (ATP). During the energy metabolism is stored in the form of high-energy electrons that are directed to the electron transport chain, comprised of five supramolecular protein. In this process, there is the formation of a semiquinone anion (Q¯) an intermediate radical that is eventually able to transfer this unpaired electron to O2 and form reactive oxygen species, as the main superoxide, hydrogen peroxide and hydroxyl radical. These molecules are highly reactive and sperm trigger processes that lead to degradation and decrease in cell quality. However these same molecules that are often considered great villains, also participate in mechanisms that culminate in fertilization and zygote formation, thus acquiring great importance. With the advent of semen cryopreservation and oxidative stress associated with the processing, reactive oxygen species entered into evidence in the research, making it necessary to study its action and ways to reduce oxidative stress.

Para que os espermatozoides possam executar suas funções e alcançarem o objetivo final, que é a fecundação, necessitam de energia que advém da adenosina trifosfato (ATP). Durante o metabolismo, a energia é armazenada na forma de elétrons de alta energia que são direcionados a cadeia de transporte de elétrons, composta de cinco proteínas supramoleculares. Neste processo, há a formação de um radical intermediário, o ânion semiquinona (Q) que eventualmente é capaz de transferir este elétron desemparelhado ao O2 e formar as espécies reativas de oxigênio, sendo as principais o superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila. Essas moléculas são altamente reativas e nos espermatozoides desencadeiam processos que levam à degradação e decréscimo na qualidade celular. Porém, essas mesmas moléculas que muitas vezes são consideradas grandes vilãs, também participam de mecanismos que culminam na fertilização e formação do zigoto, adquirindo assim uma grande importância. Com o advento da criopreservação de sêmen e o estresse oxidativo associado ao processamento, as espécies reativas de oxigênio entraram em evidência nas pesquisas, tornando-se necessário o estudo de sua ação e maneiras de reduzir o estresse oxidativo.

Efeito das mudanças climáticas sobre a qualidade espermática do peixe amazônico Colossoma macropomum

O conhecimento da qualidade dos espermatozoides de peixes produzidos ou ativados em diferentes cenários de estresse é fundamental para compreender o sucesso da fertilização dos ovócitos. Neste sentido, o objetivo da tese foi avaliar o efeito de diferentes estressores ambientais sobre os espermatozoides do tambaqui, Colossoma macropomum. No primeiro capítulo apresentamos uma série de respostas dos espermatozoides de C. macropomum ativados in vitro em diferentes temperaturas (29, 31, 33 e 35 °C), pHs (4 e 8) e concentração reduzida de oxigênio (1 mg/O2 L-1); a maior duração da motilidade dos espermatozoides ocorreu em 29 °C (50,1±2,70 s), diminuindo em 35 °C (31,2±1,31 s) e na hipóxia em ambos pH 4 (27,4±1,42 s) e pH 8 (30,44±1,66 s)(p<0,05); houve aumento da atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST) e superóxido dismutase (SOD), bem como dos níveis de lipoperoxidação (LPO) e danos no DNA nos espermatozoides expostos a temperaturas mais elevadas e a hipóxia. No segundo capítulo, verificamos o efeito da exposição in vivo dos reprodutores de C. macropomum às temperaturas de 29 e 35 °C durante 10 dias; a exposição do peixe a alta temperatura gerou células espermáticas com menor motilidade (51,91±11,60 s) em relação ao controle (61,38±5,52 s)(p<0,05); o consumo de oxigênio dos espermatozoides diminuiu em alta temperatura (32,82±3,49 pmol.(s.ml)-1) quando comparado ao controle (46,64±3,50 pmol.(s.ml)-1); a atividade da catalase (CAT) e GST não foram suficientes para impedir danos oxidativos em espermatozoides gerados em alta temperatura, indicados pelo aumento de células inviáveis com membranas danificadas e estruturas morfológicas alteradas. No terceiro capítulo, apresentamos uma short comunication, onde observamos respostas dos espermatozoides de C. macropomum incubados em pH 4 e 8 e em sinergia com metais cobre (Cu) e cádmio (Cd) ao longo do tempo; as tendências analisadas indicam que a presença dos metais em ambos pHs podem prejudicar a qualidade das células espermáticas ao longo do tempo; e que o pH ácido ao longo do tempo, tende a afetar a integridade do DNA. Em conjunto, esses resultados nos fornecem informações que irão contribuir para a compreensão e previsão de possíveis mudanças na produção de peixes, considerando os cenários de mudanças climáticas.

The knowledge of the quality of sperm from fish produced or activated in different stress scenarios is essential to understand the success of oocyte fertilization. In this sense, the aim of this thesis was to evaluate the effect of different environmental stressors on the sperm of tambaqui, Colossoma macropomum. In the first chapter we present a series of responses of C. macropomum sperm activated in vitro at different temperatures (29, 31, 33 and 35 °C), pH (4 and 8) and reduced oxygen concentration (1 mg/O2 L- 1); the longest duration of sperm motility occurred at 29 °C (50.1±2.70 s), decreasing at 35 °C (31.2±1.31 s) and in hypoxia at both pH 4 (27.4±1.42 s) and pH 8 (30.44±1.66 s) (p<0.05); there was an increase in the activity of the enzymes glutathione S-transferase (GST) and superoxide dismutase (SOD), as well as in the levels of lipoperoxidation (LPO) and DNA damage in sperm exposed to higher temperatures and hypoxia. In the second chapter, we verified the effect of in vivo exposure of C. macropomum broodstock to temperatures of 29 and 35 °C for 10 days; the exposure of the fish to high temperature generated sperm cells with lower motility (51.91±11.60 s) compared to the control (61.38±5.52 s) (p<0.05); sperm oxygen consumption decreased at high temperature (32.82±3.49 pmol.(s.ml)-1) when compared to the control (46.64±3.50 pmol.(s.ml)-1); the catalase activity (CAT) and GST were not enough to prevent oxidative damage in sperm generated at high temperature, indicated by the increase of non-viable cells with damaged membranes and altered morphological structures. In the third chapter, we present a short communication, reporting the responses of C. macropomum sperm incubated at pH 4 and 8 and in synergy with copper (Cu) and cadmium (Cd) metals over time; the trends analyzed indicate that the presence of metals at both pHs can affect the quality of sperm cells over time; and that acidic pH over time tends to affect DNA integrity. Together, these results provide us with information that will contribute to the understanding and prediction of possible changes in fish production, considering climate change scenarios.

PROSPECÇÃO DE REGIÕES INFORMATIVAS DO GENOMA MITOCONDRIAL DE CERVIDAE

A tribo Odocoileini é o grupo mais heterogêneo, com maiores problemas e controvérsias taxonômicas dos cervídeos. Ela é dividida em duas subtribos bem suportadas: Odocoileina e Blastocerina. Todos os cervídeos da região Neotropical são da tribo Odocoileini e suas espécies representantes destacam-se pela ampla variedade morfológica e de habitats. Dentre as espécies tem Mazama gouazoubira (veado-catingueiro) a qual possui uma grande amplitude em sua distribuição geográfica e na diversidade de habitats que ocupa. No Brasil pode ocupar quase todos os biomas, exceto a Amazônia. O veado-catingueiro apresenta ainda variações regionais, ecológicas e individuais de coloração, além de uma alta diversidade haplotípica. Por essa razão análises genéticas são importantes, já que, fornecem informações valiosas para taxonomia e para determinação da existência de estruturação populacional e, consequentemente, unidades evolutivamente significativas distintas. Para tanto, primers foram confeccionados a partir das sequências existentes (Genbank) e das produzidas no presente projeto em uma análise in silico das sequências das regiões Citocromo B, ND5, ND2 e D-loop (região controle) do DNA mitocondrial, visto que já se conhece o mitogenoma da espécie. As sequências foram alinhadas com as várias existentes para a mesma espécie e de espécies distintas, buscando-se áreas polimórficas flanqueadas por regiões conservadas. Prospectamos primers que permitam amplificação de pequenos fragmentos (150-250pb) informativos das diferentes regiões. Os primers foram utilizados para amplificação do mtDNA em amostras de fezes de veado-catingueiro, sendo testada a eficiência de amplificação para os diferentes marcadores. Também foram realizadas duas análises Máxima Verossimilhança e a Inferência Bayesiana para confirmação dos sinais filogenéticos e uma rede de haplotipos para analises intrapopulacionais das matrizes dos fragmentos separados e concatenadas. Nossos resultados mostraram que os marcadores testados possuem sinal filogenético relevante para estudos filogenéticos preliminares, identificação de gêneros e populações, principalmente quando a amostra contém pouco DNA de qualidade. Os fragmentos das regiões podem apresentar resultados de diversidade genética similares ao da região completa, a diversidade depende do local da região onde fragmento se encontra. Os amplicons menores tem maior facilidade de amplificação no material fecal e que sua concatenação pode gerar um marcador de importância para análises filogenéticas em cervídeos.

The Odocoileini tribe is the most heterogeneous group, with the greatest taxonomic problems and controversies among deer. It is divided into two well-supported subtribes: Odocoilein and Blastocerin. All deer in the Neotropical region are from the Odocoileini tribe and their representative species stand out for their wide morphological and habitat variety. Among the species there is Mazama gouazoubira (brocket deer) which has a wide range of geographic distribution and the diversity of habitats it occupies. In Brazil it can occupy almost all biomes, except for the Amazon. The brocket deer also presents regional, ecological and individual color variations, in addition to a high haplotype diversity. For this reason genetic analyzes are important, as they provide valuable information for taxonomy and for determining the existence of population structure and, consequently, distinct evolutionarily significant units. For this purpose, primers were made from existing sequences (Genbank) and those produced in this project in an in silico analysis of sequences from the Cytochrome B, ND5, ND2 and D-loop (control region) regions of the mitochondrial DNA, since the mitogenome of the species is known. The sequences were aligned with the several existing ones for the same species and from different species, looking for polymorphic areas flanked by conserved regions. We are looking for primers that allow the amplification of small fragments (150-250bp) that are informative from different regions. The primers were used for mtDNA amplification in brocket deer feces samples, and the amplification efficiency for the different markers was tested. Two Maximum Likelihood analyzes and Bayesian Inference were also performed to confirm the phylogenetic signals and a haplotype network for intrapopulation analyzes of the matrices of the separated and concatenated fragments. Our results showed that the tested markers have a relevant phylogenetic signal for preliminary phylogenetic studies, identification of genera and populations, especially when the sample contains little quality DNA. The fragments of the regions can show similar genetic diversity results to the complete region, the diversity depends on the location of the region where the fragment is found. Smaller amplicons are easier to amplify in fecal material and their concatenation can generate an important marker for phylogenetic analysis in deer.

IDENTIFICAÇÃO DE VARIAÇÕES ESTRUTURAIS DO GENOMA DE BOVINOS GIR LEITEIRO

O Gir Leiteiro resulta da seleção fenotípica de animais da raça zebuína Gir com maior aptidão para produção de leite. Esses animais possuem tolerância ao calor, às doenças e aos parasitas tropicais. Essas características adaptativas tornam o Gir Leiteiro um recurso genético importante para a produção de leite nos trópicos. O estudo e caracterização de variantes estruturais (SV) do DNA desses indivíduos relacionadas a características adaptativas, de sanidade e produtivas são de interesse para o melhoramento genético da raça. Um exemplo de variações estruturais estudadas é a variação no número de cópias (CNV), que compreende deleção ou duplicação de um segmento de DNA em relação ao genoma referência. Esse tipo de SV envolve muitos pares de bases, sendo capaz de alterar a expressão gênica e de ocasionar alterações fenotípicas. Os objetivos deste trabalho foram: (1) detectar CNV no genoma de bovinos Gir Leiteiro; (2) identificar regiões de CNV (CNVR) de alta confiabilidade; (3) determinar as regiões genômicas em que ocorrem as CNV que coincidem com regiões de interesse, tais como genes e Quantitative trait loci (QTL) previamente relacionados às características de sanidade, reprodução e produção de leite; (4) categorizar funcionalmente os genes sobrepostos às CNV e identificar as vias biológicas enriquecidas. Após o controle de qualidade, dados de intensidade de sinal de genotipagem de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) provenientes do ensaio Bovine HD SNPChip de 545 indivíduos e dados oriundos de sequenciamento de genoma completo de 38 touros foram utilizados para a detecção de CNV. Ao total, 547 animais foram utilizados, dos quais 36 possuíam informação de painel de SNP e sequenciamento. Para a identificação das CNV nos dados de genotipagem foi utilizado o modelo oculto de Markov por meio do programa PennCNV e, nos dados de sequenciamento, foram utilizadas as metodologias de Read Depth, por meio do programa CNVnator e, Split-Read e Read Pair, pelo programa DELLY. O genoma referência ARS_UCD1.2 foi utilizado para o alinhamento das amostras de sequenciamento e para o mapa de SNP. Dois conjuntos de regiões de CNV (CNVR) de alta confiança foram definidos, contendo variantes encontradas nos dados de painéis de SNP e de sequenciamento. Esses conjuntos foram relativos às CNVR presentes em, no mínimo, 5% da população estudada (CNVR_POP) e aos indivíduos representativos da população Gir Leiteiro (CNVR_ANI). No conjunto CNVR_POP, foram encontradas dez CNVR, que representam 1,04 Mb do genoma bovino. No conjunto CNVR_ANI, foram encontradas 45 CNVR, que somadas representam mais de 4,4 Mb do genoma bovino. Os dois conjuntos de CNVR de alta confiança foram unidos para análise funcional resultando em 48 CNVR únicas e de alta confiança. Essas se sobrepuseram a 69 genes, incluindo FILIP1, SENP6, CA5A, BANP, HERC2, RHOU, GBP2, GBP4, GBP6, BLA-DQB, ENSBTAG00000037605 e genes de receptores olfativos. Na análise de enriquecimento, dois termos de Gene Ontology (GO) (FDR<0,05) e 17 termos da plataforma Medical Subject Headings (MeSH) (pajustado< 0,05) foram enriquecidos significativamente. Nas CNVR únicas e de alta confiança foram encontrados 44 Quantitative trait loci (QTL) significativamente associados (p<0,05) a produção (29,54%), reprodução (22,73%), conformação (18,18%), sanidade (13,64%), leite (13,63%), e carne e carcaça (2,27%). As CNVR iv presentes no conjunto CNVR_POP podem ser consideradas como regiões de polimorfismos no número de cópia, pois estão presentes em mais de 1% da população estudada. Em adição, esse conjunto pode ser utilizado como critério de escolha de CNV a serem validadas, como por exemplo, por PCR. Este estudo poderá auxiliar na escolha de SNP que estejam sobrepostos às CNV para o desenvolvimento de painéis de genotipagem para o Gir leiteiro. Ainda, a inclusão de CNVR na avaliação genômica poderá trazer benefícios para o processo de seleção e deve ser verificada. Nossos resultados abrangem a identificação e caracterização de 48 CNVR de alta confiança no genoma de bovinos Gir Leiteiro, o que contribui para a elaboração de um mapa de SV na raça Gir e para o melhor entendimento do genoma dos zebuínos. As CNVR identificadas neste estudo podem afetar potencialmente genes que estão envolvidos no processo evolutivo e no controle fenotípico de característica de interesse para a cadeia produtiva leiteira, como imunidade, lactação, reprodução, reconhecimento de estímulos e sanidade.

The Dairy Gir cattle results from the selection of animals from the Zebu Gir breed with greater aptitude for milk production. These animals are tolerant of heat, disease, and tropical parasites. These adaptive traits make the Dairy Gir an important genetic resource for milk production in the tropics. The study and characterization of structural variants (SV) of the DNA of these animals related to adaptive, healthy, and productive traits are interesting to the animal breeding of the breed. An example of structural variants is copy number variation (CNV), which comprises deletion or duplication of a DNA segment compared to the reference genome. The CNV can alter the gene expression and consequently change phenotypes because it encompasses many base pairs. The objectives of the work were: (1) detect CNV in the genome of Dairy Gir cattle; (2) identify high-confidence CNVR; (3) determine the genomic regions overlapping CNVR that coincide with the interest regions, such as genes and Quantitative Trait Loci (QTL) previously related to health, reproduction, and milk production traits; (4) functionally categorize genes overlapped with CNVR and identify the enriched biological pathways. After the quality control, luminosity data from 545 individuals genotyped with Illumina BovineHD BeadChip and whole-genome sequencing data from 38 bulls were used to detect CNV. In total, 547 Dairy Gir animals were used, and 36 animals had both types of information. To identify the CNV in the SNP (single nucleotide polymorphism) array data, the hidden Markov model methodology was used by the PennCNV software and, in the sequencing data, the Read Depth methodology was used by the CNVnator software, and Split-Read and Read Pair methodologies by the DELLY software. The reference genome ARS_UCD1.2 was used for the alignment and the SNP map. Two sets of high confidence CNV regions (CNVR) were defined, containing variants found in the SNP array and sequencing data. These sets are related to the CNVR present in at least 5% of the studied population (CNVR_POP) and the representative animals of the Dairy Gir population (CNVR_ANI). In the CNVR_POP set, ten CNVR were found, covering 1.04 Mb of the bovine genome. In the CNVR_ANI set, 45 CNVR were found, which together cover more than 4.4 Mb of the bovine genome. The two high confidence CNVR sets were merged for functional analysis, resulting in 48 unique and high-confidence CNVR. These overlapped 69 genes, including FILIP1, SENP6, CA5A, BANP, HERC2, RHOU, GBP2, GBP4, GBP6, BLA-DQB, ENSBTAG00000037605, and odorant receptors genes. In the enrichment analysis, two Gene Ontology (GO) terms (FDR<0.05), and 17 terms (padjusted< 0.05) from the Medical Subject Headings (MeSH) platform were significant. In the unique and high confidence CNVR, 44 Quantitative trait loci (QTL) were significantly associated (p<0,05) with production (29.54%), reproduction (22.73%), conformation (18.18%), health (13.64%), milk (13, 63%), and meat and carcass (2.27%). The CNVR in the CNVR_POP set may be considered regions of copy number polymorphism since they are present in more than 1% of the studied population. In addition, this set can be used to choose the CNV to be validated, such as by PCR. This study may support the selection of markers that flanks CNV to the development of SNP arrays for the Dairy Gir. Also, the inclusion of CNVR in the genomic evaluation could benefit the selection process and must be verified. Our results include the identification and characterization of 48 high-confidence CNVR in the genome of Dairy Gir cattle. These data contribute to elaborate an SV map in the vi Gir breed and a better understanding of the genome of the zebu cattle. The CNVR identified in this study may potentially affect genes involved in the evolutionary process and the phenotypic control of traits of interest to the dairy products market, such as immunity, lactation, reproduction, stimulus recognition, and health.

DOENÇAS DE SUÍNOS NO NORDESTE DO BRASIL

O Brasil é o quarto maior produtor mundial e exportador de carne suína, esta possui uma importância econômica pelo fato de que de ser a segunda fonte de proteína animal mais consumida no mundo. Porém, tanto a criação de suínos quanto o consumo da carne é pouco expressiva no Nordeste, cenário diferente da região Sul, onde os três estados lideram os primeiros lugares do ranking de maiores produtores do país. Estes apresentam criação intensiva com bons padrões de sanidade, alimentação adequada, alta tecnologia e utilização de raças melhoradas geneticamente, proporcionando uma carne de melhor qualidade para o consumidor. Enquanto que na suinocultura nordestina, predomina pequenos e médios produtores, criação extensiva e semiextensiva, muitas vezes voltada para subsistência familiar, com baixo nível tecnológico e pouca instrução técnica. Devido a precariedade na sanidade várias doenças surgem e a maioria delas podem ser evitadas a partir da implementação de boas práticas de manejo. Esta dissertação de mestrado é dividida em duas partes, a primeira tem por objetivo revisar as doenças de suínos já descritas em publicações científicas referentes a região Nordeste, onde as enfermidades foram separadas de acordo com a etiologia em intoxicações, nutricionais, infecciosas (viroses e bacterioses) e parasitárias. Destaca-se que poucas enfermidades têm sido relatadas na região Nordeste e supõe-se que outras doenças importantes ocorram, porém, não foram diagnosticadas ou não reportadas. A segunda parte é um artigo científico formatado segundo as normas de publicação da revista Pesquisa Veterinária Brasileira, que descreve os aspectos epidemiológicos, clínicos e patológicos de três surtos de Doença de Glässer no Estado de Pernambuco, onde fragmentos de pulmão e cérebro foram utilizados para extração de DNA e realização de teste molecular por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real, que amplificou o gene infB de H. parasuis em todas as amostras analisadas, confirmando a presença deste agente etiológico.

Brazil is the fourth largest world producer and exporter of swine, this has an economic importance due to the fact that it is the second most consumed animal protein source in the world. However, both the creation of pigs and the consumption of meat is not very significant in the Northeastern, a different scenario from the South region, where the three states lead the first places in the ranking of the largest producers in the country. These have intensive breeding with good standards of health, adequate food, high technology and the use of genetically improved breeds, providing better quality meat for the consumer. While in northeastern swine farming, small and medium producers predominate, extensive and semi-extensive breeding, often geared to family subsistence, with low technological level and little technical education. Due to the precariousness in health, several diseases arise and most of them can be avoided by implementing good management practices. This master's dissertation is divided into two parts, the first of which aims to review the swine diseases already described in scientific publications referring to the Northeastern region, where the diseases were be separated according to the etiology into intoxications, nutritional, infectious (viruses and bacteriosis) and parasitic. It is noteworthy that few diseases have been reported in the Northeastern region and it is assumed that other important diseases occur, however, they have not been diagnosed or not reported. The second part is a scientific article formatted according to the publication rules of the Pesquisa Veterinária Brasileira magazine, which describes the epidemiological, clinical and pathological aspects of three outbreaks of Glässer disease in the state of Pernambuco, where lung and brain fragments were used for DNA extraction and molecular testing using real-time Polymerase Chain Reaction (PCR), which amplified the H. parasuis infB gene in all analyzed samples, confirming the presence of this etiological agent.