Intertubular morphometric and ultrastructural testes analyses in mdx mice

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) reproductive alterations and the influence of antioxidant treatments may aid in understanding morphometry testicular quantification. In this context, the aim of the present study was to characterize the intertubular compartment (ITC) morphometry of animal testes in mdx mice supplemented with ascorbic acid (AA). Sixteen mice were used, namely the C57BL/10 (non-dystrophic) and C57BL/10Mdx (dystrophic) lineages, distributed into the following groups: Control (C60), Dystrophic (D60), Control supplemented with AA (CS60), Dystrophic supplemented with AA (DS60). A total of 200 mg/kg of AA were administered to mice for 30 days. Subsequently, the testicles were collected, weighed, and fragmented. The obtained fragments were fixed in Karnovsky's solution (pH 7.2) and embedded in historesin for morphometric and transmission electron microscopy assessments. Leydig cells were hypertrophic in the D60 group, but was reverted by AA supplementation in the DS60 group. The DS60 group also exhibited increased intertubular volume compared to the CS60 group. The ultrastructural images identified multilamellar bodies in dystrophic animals (lipid storage) and telocyte cells (transport substances) in both control and dystrophic animals. Morphometric alterations were, therefore, noted in the intertubular compartment due to Duchenne muscular dystrophy (DMD), with AA administration capable of altering Leydig cells in this condition.(AU)

Mast cells in the pathophysiology of Duchenne muscular dystrophy in Golden Retriever dogs / O papel dos mastócitos na patogênese da distrofia muscular de Duchenne em cães Golden Retriever

The Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is one of the best models of Duchenne muscular dystrophy (DMD), with similar genotypic and phenotypic manifestations. Progressive proliferation of connective tissue in the endomysium of the muscle fibers occurs in parallel with the clinical course of the disease in GRMD animals. Previous studies suggest a relationship between mast cells and the deposition of fibrous tissue due to the release of mediators that recruit fibroblasts. The aim of this study was to evaluate the presence of mast cells and their relationship with muscle injury and fibrosis in GRMD dogs of different ages. Samples of muscle groups from six GRMD and four control dogs, aged 2 to 8 months, were collected and analyzed. The samples were processed and stained with HE, toluidine blue, and Azan trichrome. Our results showed that there was a significant increase in infiltration of mast cells in all muscle groups of GRMD dogs compared to the control group. The average number of mast cells, as well as the deposition of fibrous tissue, decreased with age in GRMD dogs. In the control group, all muscle types showed a significant increase in the amount of collagenous tissue. This suggests increased mast cell degranulation occurred in younger GRMD dogs, resulting in increased interstitial space and fibrous tissue in muscle, which then gradually decreased over time as the dogs aged. However, further studies are needed to clarify the role of mast cells in the pathogenesis of fibrosis.(AU)

O cão Golden Retriever distrófico (Golden Retriever muscular dystrophy - GRMD) é um dos melhores modelos da distrofia muscular de Duchenne (DMD), com manifestações genotípicas e fenotípicas similares. A proliferação progressiva de tecido conjuntivo no endomísio das fibras musculares ocorre paralelamente ao curso clínico da doença em animais GRMD. Estudos anteriores sugerem uma relação entre os mastócitos e a deposição de tecido fibroso devido à liberação de mediadores que recrutam fibroblastos. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de mastócitos e sua relação com a lesão muscular e fibrose em cães GRMD de diferentes idades. Amostras de grupos musculares de seis GRMD e quatro controles, com idade entre 2 a 8 meses, foram coletadas e analisadas. As amostras foram processadas e coradas com HE, azul de toluidina e tricrômico de Azan. Nossos resultados mostraram que houve um aumento significativo na infiltração de mastócitos em todos os grupos musculares de cães GRMD em comparação com o grupo controle. O número médio de mastócitos, assim como a deposição de tecido fibroso, diminuiu com a idade em cães GRMD. No grupo controle, todos os tipos musculares mostraram um aumento significativo na quantidade de tecido colágeno. Isto sugere o aumento da degranulação de mastócitos em cães GRMD mais jovens, resultando em aumento do espaço intersticial e tecido fibroso no músculo, que então gradualmente diminuiu com o tempo à medida que os cães envelheceram. No entanto, mais estudos são necessários para esclarecer o papel dos mastócitos na patogênese da fibrose.(AU)

Mast cells in the pathophysiology of Duchenne muscular dystrophy in Golden Retriever dogs / O papel dos mastócitos na patogênese da distrofia muscular de Duchenne em cães Golden Retriever

The Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is one of the best models of Duchenne muscular dystrophy (DMD), with similar genotypic and phenotypic manifestations. Progressive proliferation of connective tissue in the endomysium of the muscle fibers occurs in parallel with the clinical course of the disease in GRMD animals. Previous studies suggest a relationship between mast cells and the deposition of fibrous tissue due to the release of mediators that recruit fibroblasts. The aim of this study was to evaluate the presence of mast cells and their relationship with muscle injury and fibrosis in GRMD dogs of different ages. Samples of muscle groups from six GRMD and four control dogs, aged 2 to 8 months, were collected and analyzed. The samples were processed and stained with HE, toluidine blue, and Azan trichrome. Our results showed that there was a significant increase in infiltration of mast cells in all muscle groups of GRMD dogs compared to the control group. The average number of mast cells, as well as the deposition of fibrous tissue, decreased with age in GRMD dogs. In the control group, all muscle types showed a significant increase in the amount of collagenous tissue. This suggests increased mast cell degranulation occurred in younger GRMD dogs, resulting in increased interstitial space and fibrous tissue in muscle, which then gradually decreased over time as the dogs aged. However, further studies are needed to clarify the role of mast cells in the pathogenesis of fibrosis.(AU)

O cão Golden Retriever distrófico (Golden Retriever muscular dystrophy - GRMD) é um dos melhores modelos da distrofia muscular de Duchenne (DMD), com manifestações genotípicas e fenotípicas similares. A proliferação progressiva de tecido conjuntivo no endomísio das fibras musculares ocorre paralelamente ao curso clínico da doença em animais GRMD. Estudos anteriores sugerem uma relação entre os mastócitos e a deposição de tecido fibroso devido à liberação de mediadores que recrutam fibroblastos. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de mastócitos e sua relação com a lesão muscular e fibrose em cães GRMD de diferentes idades. Amostras de grupos musculares de seis GRMD e quatro controles, com idade entre 2 a 8 meses, foram coletadas e analisadas. As amostras foram processadas e coradas com HE, azul de toluidina e tricrômico de Azan. Nossos resultados mostraram que houve um aumento significativo na infiltração de mastócitos em todos os grupos musculares de cães GRMD em comparação com o grupo controle. O número médio de mastócitos, assim como a deposição de tecido fibroso, diminuiu com a idade em cães GRMD. No grupo controle, todos os tipos musculares mostraram um aumento significativo na quantidade de tecido colágeno. Isto sugere o aumento da degranulação de mastócitos em cães GRMD mais jovens, resultando em aumento do espaço intersticial e tecido fibroso no músculo, que então gradualmente diminuiu com o tempo à medida que os cães envelheceram. No entanto, mais estudos são necessários para esclarecer o papel dos mastócitos na patogênese da fibrose.(AU)

Relevant aspects of golden retriever muscular dystrophy for the study of Duchenne muscular dystrophy in humans / Aspectos relevantes da distrofia muscular do Golden Retriever para o estudo da distrofia muscular de Duchenne em humanos

Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is the most representative model for studying Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans, owing its phenotypic expression. DMD is a recessive disorder linked to the X chromosome in which the loss of dystrophin induces progressive weakness and degeneration of the skeletal and cardiac muscles, which lead to replacement by connective and adipose tissues. Onset of clinical signs occurs between 2 and 5 years of age, and many patients die from heart or respiratory failure. The main studies concerning dystrophic Golden Retrievers (DGR) sought to elucidate the pathophysiology of the disease and its clinical implications to develop therapies and alternative treatments to improve the quality of life and increase longevity of DMD patients. This review presents an overview of relevant contributions of the DGR model for elucidating DMD in humans.

A distrofia muscular do Golden Retriever (DMGR) é o modelo mais representativo para o estudo da distrofia muscular de Duchenne (DMD) em humanos devido a sua expressão fenotípica. A DMD é uma desordem genética recessiva ligada ao cromossomo X onde a perda da distrofina induz fraqueza progressiva e degeneração do músculo esquelético e cardíaco conduzindo a substituição do músculo por tecido conjuntivo e adiposo. O início da doença ocorre entre 2 e 5 anos de idade e muitos pacientes morrem por insuficiência cardíaca ou respiratória. Os principais estudos realizados no Golden Retriever distrófico (GRD) buscam elucidar a fisiopatogenia da doença e suas implicações clínicas na tentativa de testar terapias e tratamentos alternativos para melhoria da qualidade de vida do paciente distrófico e aumentar sua longevidade. Esta revisão apresenta uma visão geral sobre relevante contribuição do modelo GRD para elucidar a DMD em humanos.

Relevant aspects of golden retriever muscular dystrophy for the study of Duchenne muscular dystrophy in humans / Aspectos relevantes da distrofia muscular do Golden Retriever para o estudo da distrofia muscular de Duchenne em humanos

Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is the most representative model for studying Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans, owing its phenotypic expression. DMD is a recessive disorder linked to the X chromosome in which the loss of dystrophin induces progressive weakness and degeneration of the skeletal and cardiac muscles, which lead to replacement by connective and adipose tissues. Onset of clinical signs occurs between 2 and 5 years of age, and many patients die from heart or respiratory failure. The main studies concerning dystrophic Golden Retrievers (DGR) sought to elucidate the pathophysiology of the disease and its clinical implications to develop therapies and alternative treatments to improve the quality of life and increase longevity of DMD patients. This review presents an overview of relevant contributions of the DGR model for elucidating DMD in humans.(AU)

A distrofia muscular do Golden Retriever (DMGR) é o modelo mais representativo para o estudo da distrofia muscular de Duchenne (DMD) em humanos devido a sua expressão fenotípica. A DMD é uma desordem genética recessiva ligada ao cromossomo X onde a perda da distrofina induz fraqueza progressiva e degeneração do músculo esquelético e cardíaco conduzindo a substituição do músculo por tecido conjuntivo e adiposo. O início da doença ocorre entre 2 e 5 anos de idade e muitos pacientes morrem por insuficiência cardíaca ou respiratória. Os principais estudos realizados no Golden Retriever distrófico (GRD) buscam elucidar a fisiopatogenia da doença e suas implicações clínicas na tentativa de testar terapias e tratamentos alternativos para melhoria da qualidade de vida do paciente distrófico e aumentar sua longevidade. Esta revisão apresenta uma visão geral sobre relevante contribuição do modelo GRD para elucidar a DMD em humanos.(AU)

Noninvasive evaluation of respiratory muscles in pre-clinical model of Duchenne Muscular Dystrophy / Avaliação não invasiva dos músculos respiratórios no modelo pré-clinico da Distrofia Muscular de Duchenne

Since respiratory insufficiency is the main cause of death in patients affected by Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), the present study aims at establishing a new non-invasive method to evaluate the clinical parameters of respiratory conditions of experimental models affected by DMD. With this purpose in mind, we evaluated the cardiorespiratory clinical conditions, the changes in the intercostal muscles, the diaphragmatic mobility, and the respiratory cycles in Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) employing ultrasonography (US). A control group consisting of dogs of the same race, but not affected by muscular dystrophy, were used in this study. The results showed that inspiration, expiration and plateau movements (diaphragm mobility) were lower in the affected group. Plateau phase in the affected group was practically non-existent and showed that the diaphragm remained in constant motion. Respiratory rate reached 15.5 per minute for affected group and 26.93 per minute for the control group. Expiration and inspiration movements of intercostal muscles reached 8.99mm and 8.79mm, respectively, for control group and 7.42mm and 7.40mm, respectively, for affected group. Methodology used in the present analysis proved to be viable for the follow-up and evaluation of the respiratory model in GRMD and may be adapted to other muscular dystrophy experimental models.(AU)

Uma vez que, a insuficiência respiratória é a principal causa de morte em pacientes afetados pela Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), o presente estudo avaliou as condições clínicas cardiorrespiratórias, o movimento dos músculos intercostais, a mobilidade diafragmática, os ciclos respiratórios e a expansão da cavidade torácica em cães Golden Retriever com Distrofia Muscular (GRMD) por ultrassonografia (US) a fim de estabelecer um novo método não invasivo para avaliar os parâmetros de avaliação clínica de doenças respiratórias de modelos experimentais afetados por DMD. Um grupo controle constituído por cães da mesma raça e espécie, mas não afetados pela distrofia muscular também foram utilizados neste estudo. Os resultados mostraram que os movimentos de inspiração, expiração e platô (mobilidade do diafragma) foram menores no grupo afetado. A fase de platô no grupo afetado foi praticamente inexistente e mostrou que o diafragma destes animais permaneceu em constante movimento. A frequência respiratória atingiu 15,5 por minuto para o grupo afetado e 26,93 para o controle. Movimento de expiração e inspiração dos músculos intercostais atingiu 8,99 milímetros e 8,79 milímetros, respectivamente para o grupo controle e 7,42 milímetros e 7,40 milímetros, respectivamente para o grupo afetado. A metodologia utilizada nesta análise foi viável para o acompanhamento e avaliação do modelo respiratória em modelo GRMD e pode ser adaptado para outros modelos experimentais de distrofia muscular.(AU)

Multidrug therapy for muscular dystrophy in a GRMD (Golden Retriever muscular dystrophy) model

Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is a degenerative, progressive and lethal genetic disease, homologous to human Duchenne muscular dystrophy (DMD). For both there is no cure and clinical interventions are limited to treating clinical signs. As potential treatment, we did a pilot study in GRMD and administered a cocktail of frequently used drugs that might work synergistically. Biochemical blood values were investigated and histology and real-time PCR of muscle biopsies were performed. Significant improvements occurred in experimental Golden Retrievers dogs in regard to the levels of alanine aminotransferase, neutrophils, lymphocytes and CK, which began to show values closer to normal ones when compared to control animals, as well as moderate inflammatory infiltrates in the musculature, according to histology. The drug cocktail seemed to work systemically, but did not interfere with the gene defect, thus having potential value for maintaining the health status and preventing the progression of muscular dystrophy in GRMD model.

Multidrug therapy for muscular dystrophy in a GRMD (Golden Retriever muscular dystrophy) model

Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) is a degenerative, progressive and lethal genetic disease, homologous to human Duchenne muscular dystrophy (DMD). For both there is no cure and clinical interventions are limited to treating clinical signs. As potential treatment, we did a pilot study in GRMD and administered a cocktail of frequently used drugs that might work synergistically. Biochemical blood values were investigated and histology and real-time PCR of muscle biopsies were performed. Significant improvements occurred in experimental Golden Retrievers dogs in regard to the levels of alanine aminotransferase, neutrophils, lymphocytes and CK, which began to show values closer to normal ones when compared to control animals, as well as moderate inflammatory infiltrates in the musculature, according to histology. The drug cocktail seemed to work systemically, but did not interfere with the gene defect, thus having potential value for maintaining the health status and preventing the progression of muscular dystrophy in GRMD model.(AU)

Recelularização da matriz extracelular de músculo de cães saudáveis e distróficos

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária de caráter progressivo causada por mutação no gene produtor da proteína distrofina, responsável por ligar o citoesqueleto da célula muscular a matriz extracelular (MEC). Além de humanos, outros animais podem apresentar distrofias musculares, podendo ser utilizados como modelos para o estudo de distrofias musculares em humanos. O modelo animal mais utilizado é o modelo de Distrofia Muscular do Golden Retriever (GRMD). Os estudos de distrofias musculares podem ser associados a diversas áreas, como a Bioengenharia de tecidos, área que visa a utilização de MEC descelularizadas (scaffolds) para reparação/substituição de órgãos e tecidos, porém estes scaffolds também podem servir como ferramenta para estudo de MEC em doenças. Portando, o objetivo deste trabalho foi a caracterização de alguns componentes da MEC distrófica, sugerir se uma MEC distrófica pode ser um possível biomaterial para medicina regenerativa e a recelularização de MEC distróficas para observação da relação célula- matriz. Para realização deste trabalho, músculos bíceps femorais distróficos e não distróficos foram descelularizados com protocolo de utilização de SDS a 1% e passaram por análises de quantificação de DNA e fluorescência por DAPI para validação da descelularização e análises histológicas (colorações), imunohistoquímica e de Microscopia Eletrônica de Varredura para avaliação da composição, ultraestrutura e preservação das MEC distróficas e não distróficas. Como resultados, obtivemos as quantificações de DNA que alcançaram quantidade inferior a 50ng de DNA por mg de tecido e na fluorescência por DAPI não foram visualizados núcleos celulares nos tecidos descelularizados. Pelas análises histológicas foi possível observar a ausência de células nos tecidos descelularizados e a preservação de fibras colágenas da MEC. Pela imunohistoquímica, não foram observadas grandes diferenças nos componentes da MEC de músculos distróficos quando comparados com músculos não distróficos. Quando observadas, as células utilizadas para recelularização dos scaffolds apresentaram maior taxa de proliferação quando em contato com o scaffold muscular e o protocolo de esterilização do scaffold foi eficiente, já que os testes para detecção de micoplasma foram negativos. Foi observado o aumento da quantidade de DNAg após a recelularização dos scaffolds e pela MEV são visíveis camadas de células sobre a matriz extracelular. Concluímos que a MEC de músculo distrófico não interfere na diferenciação e adesão celular quando comparadas às MEC de músculo não distrófico. Embora o aumento de distrofina tenha sido observado em alguns processos de recelularização, mais estudos precisam ser realizados para comprovação deste dado.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive hereditary disease caused by a mutation in the gene producing the dystrophin protein, responsible for linking the cytoskeleton of the muscle cell to the extracellular matrix (ECM). In addition to humans, other animals may have muscular dystrophies and can be used as models for the study of muscular dystrophies in humans. The most used animal model is the Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) model. Muscular dystrophy studies can be associated with several areas, such as tissue bioengineering, an area that aims to use decellularized ECM (scaffolds) for repairing / replacing organs and tissues, but these scaffolds can also serve as a tool for studying the ECM in diseases. Therefore, the objective of this work was to characterize some components of the dystrophic ECM, to suggest whether a dystrophic ECM may be a possible biomaterial for regenerative medicine and the recellularization of dystrophic ECM to observe the cell-matrix relationship. To perform this work, dystrophic and non-dystrophic femoral biceps muscles were decellularized using a 1% SDS protocol and underwent DNA quantification and fluorescence analyzes by DAPI to validate decellularization and histological (staining), immunohistochemistry and Scanning Electron microscopy analyzes to evaluate the composition, ultrastructure and preservation of dystrophic and non-dystrophic ECM. As a result, we obtained the DNA quantifications that reached a quantity of less than 50ng of DNA per mg of tissue and in the fluorescence by DAPI, cell nuclei were not seen in the decellularized tissues. Through histological analyzes it was possible to observe the absence of cells in the decellularized tissues and the preservation of collagen fibers of the ECM. Due to immunohistochemistry, no major differences were observed in the ECM components of dystrophic muscles when compared with non-dystrophic muscles. When observed, the cells used to recellularize the scaffolds showed a higher proliferation rate when in contact with the muscle scaffold and the scaffold sterilization protocol was efficient, since the tests for mycoplasma detection were negative. An increase in the amount of DNAg was observed after the scaffolds were recellularized and by SEM, layers of cells are visible on the extracellular matrix. We conclude that the ECM of dystrophic muscle does not interfere with cell differentiation and adhesion when compared to the ECM of non-dystrophic muscle. Although the increase in dystrophin has been observed in some recellularization processes, more studies need to be carried out to prove this data.

Arquitetura comparativa dos pulmões de camundongos normais e afetados pela Distrofia Muscular de Duchenne / Comparative lung architecture of normal and by Duchenne Muscular Dystrophy affected mice

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética de caráter recessivo que caracterizada por fraqueza muscular progressiva de cintura pélvica e escapular evoluindo para insuficiência respiratória e, ou cardíaca. O camundongo mdx é um modelo amplamente utilizado para estudos da DMD. Apesar do fenótipo destes animais serem mais suave, estes apresentam o principal músculo respiratório, o diafragma com morfologia e bioquímica semelhante à DMD humana, fato este que pode comprometer a função respiratória e consequentemente os pulmões. Foi realizado um estudo anatômico descritivo do parênquima pulmonar dos pulmões de 5 animais modelo mdx comparando estes com os pulmões de 5 camundongos BALB/C57 (Mus musculus). Os pulmões foram analisados macroscopicamente e através de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Os achados sugerem que o modelo mdx apresenta morfologia pulmonar semelhante aos camundongos BALB/C57 e que seu uso deve ser cauteloso e criterioso em ensaios clínicos que aborde este órgão.(AU)

The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a recessive genetic disease characterized by progressive muscle weakness of the pelvic and scapular girdle and progressing to respiratory or heart failure. The mdx mouse is a model widely used for studies. Although they possess a milder phenotype, the morphology and biochemistry of the diaphragm are similar to human DMD. We performed a descriptive anatomical study of the pulmonary parenchyma of five mdx animal models and compared these with the lungs of 5 mice BALB/C57 (Mus musculus). The findings suggest that the mdx model has morphological features similar to BALB/C57 mice and it must be used with caution in clinical trials which involve the lung.(AU)

Arquitetura comparativa dos pulmões de camundongos normais e afetados pela Distrofia Muscular de Duchenne

Abstract: The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a recessive genetic disease characterized by progressive muscle weakness of the pelvic and scapular girdle and progressing to respiratory or heart failure. The mdx mouse is a model widely used for studies. Although they possess a milder phenotype, the morphology and biochemistry of the diaphragm are similar to human DMD. We performed a descriptive anatomical study of the pulmonary parenchyma of five mdx animal models and compared these with the lungs of 5 mice BALB/C57 (Mus musculus). The findings suggest that the mdx model has morphological features similar to BALB/C57 mice and it must be used with caution in clinical trials which involve the lung.

Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética de caráter recessivo que caracterizada por fraqueza muscular progressiva de cintura pélvica e escapular evoluindo para insuficiência respiratória e, ou cardíaca. O camundongo mdx é um modelo amplamente utilizado para estudos da DMD. Apesar do fenótipo destes animais serem mais suave, estes apresentam o principal músculo respiratório, o diafragma com morfologia e bioquímica semelhante à DMD humana, fato este que pode comprometer a função respiratória e consequentemente os pulmões. Foi realizado um estudo anatômico descritivo do parênquima pulmonar dos pulmões de 5 animais modelo mdx comparando estes com os pulmões de 5 camundongos BALB/C57 (Mus musculus). Os pulmões foram analisados macroscopicamente e através de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Os achados sugerem que o modelo mdx apresenta morfologia pulmonar semelhante aos camundongos BALB/C57 e que seu uso deve ser cauteloso e criterioso em ensaios clínicos que aborde este órgão.

Arquitetura comparativa dos pulmões de camundongos normais e afetados pela Distrofia Muscular de Duchenne

Abstract: The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a recessive genetic disease characterized by progressive muscle weakness of the pelvic and scapular girdle and progressing to respiratory or heart failure. The mdx mouse is a model widely used for studies. Although they possess a milder phenotype, the morphology and biochemistry of the diaphragm are similar to human DMD. We performed a descriptive anatomical study of the pulmonary parenchyma of five mdx animal models and compared these with the lungs of 5 mice BALB/C57 (Mus musculus). The findings suggest that the mdx model has morphological features similar to BALB/C57 mice and it must be used with caution in clinical trials which involve the lung.

Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética de caráter recessivo que caracterizada por fraqueza muscular progressiva de cintura pélvica e escapular evoluindo para insuficiência respiratória e, ou cardíaca. O camundongo mdx é um modelo amplamente utilizado para estudos da DMD. Apesar do fenótipo destes animais serem mais suave, estes apresentam o principal músculo respiratório, o diafragma com morfologia e bioquímica semelhante à DMD humana, fato este que pode comprometer a função respiratória e consequentemente os pulmões. Foi realizado um estudo anatômico descritivo do parênquima pulmonar dos pulmões de 5 animais modelo mdx comparando estes com os pulmões de 5 camundongos BALB/C57 (Mus musculus). Os pulmões foram analisados macroscopicamente e através de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Os achados sugerem que o modelo mdx apresenta morfologia pulmonar semelhante aos camundongos BALB/C57 e que seu uso deve ser cauteloso e criterioso em ensaios clínicos que aborde este órgão.

Avaliação da composição da matriz extracelular do músculo estriado esquelético de cães com distrofia muscular comparados com cães não distróficos SÃO PAULO 2020

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença que causa degeneração progressiva dos músculos estriados esqueléticos e cardíacos, causada pela perda da função do gene da distrofina, devido a uma mutação genética. É caracterizada por uma perda progressiva da função muscular. Músculos com deficiência de distrofina são vulneráveis à danos induzidos pela contração, o que leva a ciclos repetidos de necrose e regeneração, resultando em falha de regeneração, aumento da fibrose e perda progressiva da função muscular. Dentro do músculo esquelético, a matriz extracelular é duplamente importante para fornecer um suporte celular e transmitir forças contráteis musculares. No entanto, o acúmulo patológico de certos componentes na matriz extracelular muscular, que ocorre na fibrose especificamente, prejudica a função celular normal e a transmissão de força, bem como inibe o reparo e a regeneração, compondo desse modo o defeito celular primário. A DMD vem recebendo atenção especial das comunidades médicas por ser uma doença comum em homens (devido à mutação que ocorre no cromossomo X), além de ser um distúrbio grave e atualmente uma doença sem cura. Devido à necessidade de se descobrir o real impacto da DMD na estrutura molecular dos músculos estriados esqueléticos e cardíacos a partir dos componentes proteicos da matriz extracelular dos músculos , avaliamos o grau de alterações de distrofia muscular de cães usados como modelo da DMD comparados com cães não distróficos. Assim, utilizando modelos caninos com distrofia muscular, devido à proximidade de sinais fenotípicos humanos, a saber, atrofia muscular, perda de massa corporal, fadiga muscular e comprometimento cardíaco, buscamos verificar a influência da distrofia muscular na estrutura proteica do músculo estriado esquelético. A partir de amostras de músculos descelularizados de cães distróficos e não distróficos, realizamos análises histológicas e imunohistoquímicas visando avaliar alteração nos componentes da matriz extracelular em cães com deficiência de distrofina. Obtivemos uma satisfatória descelularização, com ausência de núcleos celulares na matriz, e também constatamos que houve alterações na estrutura da matriz extracelular, a saber, preservação de colágeno e proteínas adesivas como fibronectina e laminina, bem como uma diminuição dos glicosaminoglicanos após o processo de descelularização.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a disease that causes progressive degeneration of the skeletal and cardiac striated muscles, caused by the loss of dystrophin gene function due to a genetic mutation. It is characterized by a progressive loss of muscle function. Muscles with dystrophin deficiency are vulnerable to contraction-induced damage, which leads to repeated cycles of necrosis and regeneration, resulting in failed regeneration, increased fibrosis, and progressive loss of muscle function. Within the skeletal muscle, the extracellular matrix is doubly important for providing cellular support and transmitting contractile muscle forces. However, the pathological accumulation of certain components in the extracellular muscle matrix, which occurs in fibrosis specifically, normal cell function and force transmission impairs, as well as inhibits repair and regeneration, thus composing the primary cell defect. DMD has been receiving special attention from medical communities because it is a common disease in men (due to the mutation that occurs in the X chromosome), as well as being a serious disorder and currently a disease without cure. Due to the need to discover the real impact of DMD on the molecular structure of the skeletal and cardiac striated muscles - from the protein components of the extracellular muscle matrix -, I evaluated the degree of muscular dystrophy changes in dogs used as a model of DMD compared with non-dystrophic dogs. Thus, using canine models with muscular dystrophy, due to the proximity of human phenotypic signs, namely, muscle atrophy, loss of body mass, muscle fatigue and cardiac involvement, I sought to verify the influence of muscular dystrophy on the protein structure of skeletal striated muscle. From samples of decellularized muscles of dystrophic and non-dystrophic dogs, we performed histological and immunohistochemical analyzes to evaluate changes in extracellular matrix components in dogs with dystrophin deficiency.We obtained satisfactory decellularization, with absence of cell nuclei in the matrix, and we also found that there were changes in the structure of the extracellular matrix, namely, preservation of collagen and adhesive proteins such as fibronectin and laminin, well as a decrease in glycosaminoglycans after the process of decellularization.

utilizando modelagem neuronal""Correlação entre Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) e Distúrbio Muscular de Duchenne (DMD):estudo de casos

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) compreende um quadro complexo do neurodesenvolvimento acompanhado por prejuízos na interação social e na comunicação, com padrões restritos e estereotipados de comportamento, interesses ou atividades.A prevalência mundial é de cerca de 1-2%.A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença recessiva causada por uma mutação no gene da distrofina, responsável pela síntese da proteína que leva o mesmo nome e que fica localizado na região p21 do cromossomo X. Ao nascimento os pacientes portadores da DMD são aparentemente normais, com os primeiros sintomas aparecendo geralmente entre os 3 e 5 anos de idade, quando se observa fraqueza muscular e degeneração progressiva da musculatura esquelética. Há também relatos de que um terço dos pacientes apresenta algum déficit cognitivo. A prevalência é de 1em cada 3300 meninos, e por isso é considerada uma das doenças genéticas pediátricas de maior ocorrência.Nosso grupo tem modelado o TEA e a DMD in vitro, através da produção de células pluripotentes induzidas de pacientes diagnosticados com essas patologias, e a posterior diferenciação destas células em células do SNC. Assim como nos autistas, identificamos que os neurônios dos pacientes com DMD apresentavam conexões neurais alteradas. Além disso, existe na literatura descrição de que 3,1% dos pacientes com DMD também apresentam sinais clínicos de autismo. Neste trabalho buscamos investigar o perfil celular de pacientes comprometidos com as duas patologias, autismo e DMD. Para tanto, produzimos iPSC de meninos de uma mesma família, para modelar os fenótipos de células do SNC, comparando com um grupo neurotípico (controle). Foi possível observar que a reprogramação para produção das iPSC a partir da coleta de células-tronco de dente decíduo foi eficiente, vantajosa e pouco estressante aos pacientes, permitindo a diferenciação em NPC e neurônio. Não foi possível verificar diferenças morfológicas entre os portadores de TEA e DMD e os controles, entretanto, temos agora disponível materiais que nos permitirão realizar outras análises para verificar essas possíveis variações. Além disso, tivemos acesso a análises genéticas prévias realizadas pela família onde se observaram alterações em genes como SETD2 E AUTS2, porém não foi possível relacionar tais mutações genéticas ao quadro do TEA apresentado pelos trigêmeos, mas através do DNA coletado da família e essas análises genéticas prévias, poderemos realizar mais estudos acerca dessas mutações.

Autism Spectrum Disorder (ASD) comprises a complex neurodevelopmental disorder, with impairment in social interaction and communication, with restricted and stereotyped patterns of behavior, interests, or activities. The worldwide prevalence is about 1-2%. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a recessive disease caused by a mutation in the dystrophin gene located in the Xp21, responsible for the synthesis of the protein that bears the same name. The prevalence of DMD is 1: 3300 boys, which is why it is considered one of the most common pediatric genetic diseases. At birth, patients with DMD are apparently healthy, with the first symptoms generally appearing between 3 and 5 years of age, when muscle weakness and progressive skeletal muscle degeneration are observed. There are also reports that one-third of patients have some cognitive impairment. Besides, there is a description in the literature that 3.1% of DMD patients also have clinical signs of autism. Our group has modeled TEA and DMD in vitro, through the production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from patients diagnosed with these pathologies, and the subsequent differentiation of these cells into CNS cells. As with ASD, we found that the neurons of patients with DMD had altered neural connections. In this work, we seek to investigate the cell profile of patients compromised with both pathologies, ASD, and DMD, concomitantly. For this purpose, we produced iPSC from a family of triplet boys from stem cells from deciduous teeth, which were later efficiently differentiated into NPC and neuron. It was not possible to verify morphological differences in the cells of patients with ASD and DMD and the controls with the preliminary experiments presented in this thesis. However, the production of these cells allows other analyses to be carried out to verify these possible variations. Also, we had access to previous genetic analyzes carried out by the family, where changes in genes such as SETD2 and AUTS2, reported as related to ASD, were observed. However, using just these data, it was not possible to correlate these mutations with the ASD in the triplet. Still, through the collected DNA of the family and these previous genetic analyzes, we will be able to carry out more studies.

Laparoscopic guided local injection in the X-linked muscular dystrophy mouse (mdx) diaphragm. An advance in experimental therapies for Duchenne Muscular Dystrophy

PURPOSE:To investigate the development of a laparoscopy technique for local injection into the X-linked muscular dystrophy (mdx) diaphragm.METHODS:It was used 10 mice Balb/C57 and 5 mdx mice and three differents decubitus type were tested: the right lateral, supine, and supine decubitus with 20 degrees elevation of the forelimb. Abdominal caudal face and the 10 intercostal space were tested as spot to introduce the needle into the diaphragm.RESULTS:Supine position with elevation of 20 degrees forelimb and the 10th intercostal space are the beneficial position to apply a local injection.CONCLUSION:It was proved to be possible to perform the laparoscopy technique in the X-linked muscular dystrophy diaphragm and this requires a specific position and technique during the surgery.(AU)

Alterações morfofuncionais renais em cães Golden Retriever Distróficos (GRMD) / Kidneys morphological changes in Golden Retriever Muscular Dystrophy dogs (GRMD)

A Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é geneticamente homóloga à distrofia muscular de Duchenne (DMD) que acomete seres humanos. É uma doença genética que gera degeneração progressiva da musculatura esquelética. Considerando-se as intensas alterações musculares, é natural pensar em uma possível lesão renal decorrente da intensa lesão muscular. Foram avaliados seis cães machos da raça Golden Retriever afetados pela distrofia muscular (GRMD) e três cães machos clinicamente sadios. A concentração de creatinina foi determinada e as proteínas urinárias foram avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os resultados mostraram que a proteinúria patológica não está diretamente associada à Distrofia Muscular de Duchenne, porém diversos parâmetros apresentaram concentrações aumentadas para animais afetados, como a razão proteína/albumina, que foi maior em cães distróficos, podendo ser indício de microalbuminúria e conseqüente lesão renal precoce. Estes resultados visam embasar avaliações clínicas e futuros estudos considerando-se as patologias decorrentes ou associadas a esta doença genética.(AU)

The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is genetically homologous to Duchenne muscular dystrophy (DMD) that affects humans. It is a genetic disease that causes progressive degeneration of skeletal muscle. Considering the intense muscle changes, it is natural to think in possible kidney damage caused by intense muscle injury. We evaluated six male Golden Retriever dogs affected by Duchenne muscular dystrophy (GRMD) and three clinically healthy male dogs. The urinary proteins and creatinine concentration were determined. The proteins were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results showed that pathological proteinuria is not directly associated with Duchenne muscular dystrophy, but several parameters showed increased concentrations for affected animals, as the ratio protein/albumin, which was higher in dystrophic dogs, probably a consequence of microalbuminuria a sign of early kidney damage. These results aim to base future studies and clinical evaluations considering the pathologies arising from or associated with this genetic disease.(AU)

Avaliação de Pericitos no modelo GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy)

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética decorrente de uma mutação ou deleção da distrofina, uma proteína que se expressa através de um gene de caráter recessivo relacionado ao cromossomo X. Através do modelo animal canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD), pesquisas em busca de novas alternativas terapêuticas são objeto de estudo para uma melhor compreensão da doença, por apresentarem um fenótipo similar aos pacientes humanos com DMD. O estudo visa avaliar a morfologia macro e microscópica, quantificar a área de fibrose e identificar células perivasculares (pericitos) nos músculos gastrocnêmio, diafragma, miocárdio e língua de cães Golden Retriever afetados com Distrofia Muscular (n=4) comparados com cães normais (n=4). Foram realizadas análises da morfologia, pelas características anatômicas macroscópicas, microscopia eletrônica de varredura e histologia (colorações de Hematoxilina e Eosina e Picrossírius). Os principais achados macroscópicos foram contratura muscular e hipertrofia (diafragma); infiltrado de tecido adiposo (gastrocnêmio); e a macroglossia. Microscopicamente, as principais alterações foram necrose e degeneração, observada por áreas de hipertrofia e atrofia miofibrilar, acúmulo de gordura e presença de fibrose na musculatura estriada esquelética. Concluiu-se que a musculatura estriada esquelética dos cães GRMD sofreram significativa variação na morfologia, com maior deposição fibrose comparado ao músculo cardíaco. A identificação dos pericitos em animais GRMD, demonstrou uma imunomarcação menos intensa em relação aos cães controle.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a genetic disease caused by a mutation or deletion of the dystrophin, protein which is expressed through a recessive gene associated to X chromosome. The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) canine model serves to new alternatives of therapies and to test better understand the disease pathogenesis, as they present a phenotype similar to the patients with DMD. The aim of this study was to evaluate the macro and microscopic morphology, to quantify the fibrotic area and to identify perivascular cells in the gastrocnemius, diaphragm, myocardium and tongue muscles of Golden Retriever dogs affected with Muscular Dystrophy (n = 4) compared to normal dogs (n = 4). Morphology macroscopic anatomical characteristics and scanning electron microscopy, histological (Hematoxylin and Eosin staining and Picrossírius staining). The main macroscopic findings were muscle contracture and hypertrophy (diaphragm); adipose tissue infiltrate (gastrocnemius); and a macroglossia. Microscopically, the main stages were necrosis and degeneration, observed by areas of hypertrophy and myofibrillar atrophy, fat accumulation and presence of fibrosis in skeletal muscles. After the extended muscles of the GRMD parenchyma were more morphologically varied, with greater deposition of fibrosis to the cardiac muscle. The identity of pericitos in animals GRMD, demonstrated an immunostaining in relation to the remote control.

Análise Comportamental em Cães com Distrofia Muscular de Duchenne (GRMD) São Paulo

O comportamento social de cães pode ser definido como um conjunto de comportamentos realizados durante interações interespecíficas. Este comportamento pode ser dividido em quatro períodos: neonato, o período de transição; socialização e juvenil. O presente trabalho possui o objetivo de analisar a interação social dos cães afetados pela Distrofia Muscular com outros cães não afetados e verificar se há ou não diferença na interação social. O estudo foi dividido em dois experimentos. No primeiro foi analisado um cão macho de 9 anos afetado pela distrofia muscular, e quatro cadelas portadoras do gene da distrofia, porém não afetadas pela distrofia, de idades entre 6 e 7 anos. No segundo foram selecionados 8 filhotes, sendo eles 3 fêmeas não afetadas e 3 machos, onde 2 eram afetados pela distrofia muscular e 1 não, nascidos do cruzamento de uma fêmea portadora e um macho normal. O comportamento dos cães foi filmado e analisado, em três categorias: comportamento de matilha; interação social entre cães e ocupação de território. Os resultados do primeiro experimento foram descritos e comparados entre si. Os do segundo experimento foram analisados com o teste estatístico Mann-Whitney para fatores independentes. Os resultados obtidos, no primeiro experimento indicam que houve diferença entre o comportamento do macho afetado e das demais fêmeas não afetadas. Os resultados obtidos pelo experimento 2 indicam que o surgimento dessa diferença coincide com o aparecimento dos primeiros sintomas da doença e se agravam se os animais afetados ficarem separados dos animais não afetados. Baseados nestes resultados podemos concluir que existem diferenças entre cães afetados pela distrofia muscular e que essa diferença está relacionada com a própria distrofia muscular.

Dog social behavior can be defined as a set of behaviors performed during interspecific interactions. This behavior can be divided into four periods: neonatal, the transition period; socialization and juvenile. This work aims to analyze the social interaction between muscular dystrophy affected dogs with other unaffected dogs and to verify whether there is a difference in social interaction. The study was divided into two experiments. In the first one, a 9-year-old male dog affected by muscular dystrophy and four female dogs carrying the dystrophy gene, but not affected by dystrophy, aged between 6 and 7 years were analyzed. In the second were selected 8 puppies, being 3 unaffected females and 3 males, where 2 were affected by muscular dystrophy and 1 not, born from the crossing of a carrier female and a normal male. Dog behavior was filmed and analyzed in three categories: pack behavior; social interaction between dogs and occupation of territory. The results of the first experiment were described and compared with each other. Those in the second experiment were analyzed using the Mann-Whitney statistical test for independent factors. The results obtained in the first experiment indicate that there was a difference between the behavior of the affected male and the other unaffected females. The results obtained by experiment 2 indicate that the appearance of this difference coincides with the onset of the first symptoms of the disease and worsens if the affected animals are separated from the unaffected animals. Based on these results we can conclude that there are differences between dogs affected by muscular dystrophy and that this difference is related to the muscular dystrophy itself. Keywords: ; , Dog, GRMD, Ontogenesis, Social Behavior.

Immunohistochemical and Morphometric Evaluation of Gastrocnemius Muscle and Myotendinous Junction of Golden Retriever Dogs with Muscular Dystrophy

In this research we studied the alterations in the muscles and myotendinous junction of dogs with muscular dystrophy. Gastrocnemius muscle (GM) and myotendinous junction (MTJ) samples of 3 controls and 6 dystrophic dogs were subjected to histopathological and immunohistochemical assays. Histopathological/histomorphometric analysis showed that the lesions in the GM were more pronounced and showed the highest percentage of Fiber Type II (FTII) and low values for the minimum diameters and areas of Fiber Type I (FTI) and FTII than those in the MTJ. FTII in dystrophic MTJ was morphologically similar to the controls. There was a significant difference (p 0.07) in the MHCI antigen compared to the control. We conclude that the preservation of the morphological features of the MTJ can be directly related to a better stabilization of FTII, lower expression of the MHCI complex and less cytotoxic activity of CD8.

Immunohistochemical and Morphometric Evaluation of Gastrocnemius Muscle and Myotendinous Junction of Golden Retriever Dogs with Muscular Dystrophy

In this research we studied the alterations in the muscles and myotendinous junction of dogs with muscular dystrophy. Gastrocnemius muscle (GM) and myotendinous junction (MTJ) samples of 3 controls and 6 dystrophic dogs were subjected to histopathological and immunohistochemical assays. Histopathological/histomorphometric analysis showed that the lesions in the GM were more pronounced and showed the highest percentage of Fiber Type II (FTII) and low values for the minimum diameters and areas of Fiber Type I (FTI) and FTII than those in the MTJ. FTII in dystrophic MTJ was morphologically similar to the controls. There was a significant difference (p 0.07) in the MHCI antigen compared to the control. We conclude that the preservation of the morphological features of the MTJ can be directly related to a better stabilization of FTII, lower expression of the MHCI complex and less cytotoxic activity of CD8.(AU)