Impact of nitrogen and phosphorus fertilizers on Cry1Ac protein contents in transgenic cotton / Impacto de fertilizantes de nitrogênio e fósforo nos conteúdos de proteína Cry1Ac em algodão transgênico

Abstract Application of different fertilizers to check the efficiency of expression of Bt (Bacillus thuringiensis) gene in one of the leading commercialized crops (cotton) against Lepidopteran species is of great concern. The expression of Cry protein level can be controlled by the improvement of nutrients levels. Therefore, the myth of response of Cry toxin to different combinations of NP fertilizers was explored in three Bt cotton cultivars. Combinations include three levels of nitrogen and three levels of phosphorus fertilizers. Immunostrips and Cry gene(s) specific primer based PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis were used for the presence of Bt gene that unveiled the presence of Cry1Ac gene only. Further, the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit was used to quantify the expression of Cry1Ac protein. Under various NP fertilizers rates, the level of toxin protein exhibited highly significant differences. The highest toxin level mean was found to be 2.3740 and 2.1732 µg/g under the treatment of N150P75 kg ha-1 combination while the lowest toxin level mean was found to be 0.9158 and 0.7641 µg/g at the N50P25 kg ha-1 level at 80 and 120 DAS (Days After Sowing), respectively. It was concluded from the research that the usage of NP fertilizers has a positive relation with the expression of Cry1Ac toxin in Bt cotton. We recommend using the N150P50 kg ha-1 level as the most economical and practicable fertilizer instead of the standard dose N100P50 kg ha-1 to get the desired level of Cry1Ac level for long lasting plant resistance (<1.5). The revised dose of fertilizer may help farmers to avoid the cross-resistance development in contradiction of insect pests.

Resumo A aplicação de diferentes fertilizantes para verificar a eficiência da expressão do gene Bt (Bacillus thuringiensis) em uma das principais culturas comercializadas (algodão) contra espécies de lepidópteros é uma grande preocupação. A expressão do nível de proteína Cry pode ser controlada pela melhoria dos níveis de nutrientes. Portanto, o mito da resposta da toxina Cry a diferentes combinações de fertilizantes NP foi explorado em três cultivares de algodão Bt. As combinações incluem três níveis de nitrogênio e três níveis de fertilizantes de fósforo. A análise de PCR (reação em cadeia da polimerase) específica para o gene (s) Immunostrips e Cry (s) foi usada para a presença do gene Bt que revelou a presença do gene Cry1Ac apenas. Além disso, o kit ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) foi usado para quantificar a expressão da proteína Cry1Ac. Sob várias taxas de fertilizantes NP, o nível de proteína de toxina exibiu diferenças altamente significativas. A média do nível mais alto de toxina foi de 2,3740 e 2,1732 µg / g sob o tratamento da combinação N150P75 kg ha-1, enquanto a média do nível mais baixo de toxina foi de 0,9158 e 0,7641 µg / g no nível de N50P25 kg ha-1 em 80 e 120 DAS (dias após a semeadura), respectivamente. Concluiu-se com a pesquisa que o uso de fertilizantes NP tem relação positiva com a expressão da toxina Cry1Ac no algodão Bt. Recomendamos o uso do nível de N150P50 kg ha-1 como o fertilizante mais econômico e praticável em vez da dose padrão N100P50 kg ha-1 para obter o nível desejado de nível de Cry1Ac para resistência de planta de longa duração (<1,5). A dose revisada de fertilizante pode ajudar os agricultores a evitar o desenvolvimento de resistência cruzada em contradição com as pragas de insetos.

Effects of systemic inflammation due to hepatic ischemia-reperfusion injury upon lean or obese visceral adipose tissue

Purpose: To evaluate how the induction of liver damage by ischemia and reperfusion affects the adipose tissue of lean and obese mice. Methods: Lean and diet-induced obese mice were subjected to liver ischemia (30 min) followed by 6 h of reperfusion. The vascular stromal fraction of visceral adipose tissue was analyzed by cytometry, and gene expression was evaluated by an Array assay and by RT-qPCR. Intestinal permeability was assessed by oral administration of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran and endotoxemia by serum endotoxin measurements using a limulus amebocyte lysate assay. Results: It was found that, after liver ischemia and reperfusion, there is an infiltration of neutrophils, monocytes, and lymphocytes, as well as an increase in the gene expression that encode cytokines, chemokines and their receptors in the visceral adipose tissue of lean mice. This inflammatory response was associated with the presence of endotoxemia in lean mice. However, these changes were not observed in the visceral adipose tissue of obese mice. Conclusions: Liver ischemia and reperfusion induce an acute inflammatory response in adipose tissue of lean mice characterized by an intense chemokine induction and leukocyte infiltration; however, inflammatory alterations are already present at baseline in the obese adipose tissue and liver ischemia and reperfusion do not injure further.

Behavior and development of Tetranychus ludeni Zacher, 1913 (Acari: Tetranychidae) and physiological stress in genetically modified cotton expressing Cry1F and Cry1Ac proteins / Comportamento e desenvolvimento de Tetranychus ludeni Zacher, 1913 (Acari: Tetranychidae) e estresse fisiológico em algodoeiro geneticamente modificado expressando as proteínas Cry1F e Cry1Ac

Genetically modified plants are one of the tactics used in integrated pest management - IPM. There is great concern about the impact of these plants on non-target organisms. On the other hand, there is little information in the literature on the effects of transgenics (Bacillus thuringiensis) Bt on populations of phytophagous mites, and the physiological responses that this attack promotes on plants. The objective of this work was to evaluate the biology of the T. ludeni mite in Bt cotton, expressing the Cry1F and Cry1Ac proteins. To evaluate the behavior of food and oviposition preference of the T. ludeni with Bt cotton and isohybrid. Verify if the physiological stress caused by T. ludeni's attack is differentiated in Bt cotton. The mites were reared in Bt cotton and isohybrid, in a total of 40 replicates in the completely randomized design and the biological cycle was evaluated. The food preference and oviposition analysis were done with 10 replicates, with choice. The physiological stress was evaluated through chlorophyll fluorescence, under greenhouse conditions. The data of the T. ludeni biology were analyzed by Student's t-test, for food and oviposition preference the chi-square test was performed. Regression models were fitted for the fluorescence parameters. The model identity test was used to evaluate the differences between Bt and isohybrid treatments. Cry1F and Cry1Ac proteins have not affected the biology of T. ludeni. The photosynthetic parameters in Bt cotton plants were less influenced by T. ludeni infestation.

O uso de plantas geneticamente modificadas é uma das táticas utilizadas no manejo integrado de pragas - MIP. Observa-se grande preocupação com o impacto dessas plantas sobre organismos não alvos. Por outro lado, existe pouca informação na literatura sobre efeitos dos transgênicos (Bacillus thuringiensis) Bt em populações de ácaros fitófagos, e as respostas fisiológicas que esse ataque promove nas plantas. Objetivou-se com esse trabalho avaliar a biologia do ácaro T. ludeni em algodoeiro Bt, expressando as proteínas Cry1F e Cry1Ac. Avaliar se há comportamento de preferência alimentar e postura de T. ludeni em relação ao algodoeiro Bt e seu iso-híbrido. E verificar se o estresse fisiológico causado pelo ataque de T. ludeni é diferenciado em algodoeiro Bt. Os ácaros foram criados em algodoeiro Bt e iso-híbrido, em um total de 40 repetições no delineamento inteiramente casualizado, onde foi avaliado o ciclo biológico. A análise de preferência alimentar e de posturas foi feita com 10 repetições, com escolha. O estresse fisiológico foi avaliando através da fluorescência da clorofila, em casa de vegetação. Os dados da biologia de T. ludeni foram analisados pelo teste t Student, para preferência alimentar e postura foi realizado o teste qui-quadrado. Para os parâmetros da fluorescência, foram ajustados modelos de regressão. Para testar as diferenças entre Bt e iso-híbrido foi utilizado o teste de identidade de modelos. As proteínas Cry1F e Cry1Ac não afetaram a biologia de T. ludeni. Os parâmetros fotossintéticos em plantas de algodoeiro Bt foram menos influenciados pela infestação de T. ludeni.

Effect of bacterial endotoxin lipopolysaccharide treatment on duck Leydig cells

This study aimed to investigate the effects of bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) on hormone production and gene expression in duck Leydig cells and its underlying mechanisms. Leydig cells were collected from 200-day-old mallard ducks and divided into five treatment groups (0, 50, 100, 200, and 400 ng/mL LPS). After treatment with LPS for 6, 12, 24, and 48 h, testosterone, activin, and inhibin levels in the cell supernatants were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. The expression levels of testosterone synthesis-related genes, including steroidogenic acute regulatory protein (StAR), 3-beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD), and cytochrome P450 aromatase (P450arom), and reproductive-related genes, including gonadotropin-inhibitory hormone receptor (GnIHR), follicle stimulating hormone receptor (FSHR), and luteinizing hormone receptor (LHR) were detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). We successfully isolated and cultured duck Leydig cells with cell purity above 90%. Compared with the control group, the levels of testosterone, activin, and inhibin secreted in Leydig cells decreased gradually with increasing LPS concentration. After treatment with LPS, the expression of StAR and 3β-HSD genes in Leydig cells was upregulated at 12 h, and that of GnIHR was upregulated at 24 h; whereas the expression of FSHR and LHR was reduced at 24 h. This study indicates that LPS can inhibit the secretion of hormones and regulate the expression of related genes in duck Leydig cells.(AU)

Effect of bacterial endotoxin lipopolysaccharide treatment on duck Leydig cells

This study aimed to investigate the effects of bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) on hormone production and gene expression in duck Leydig cells and its underlying mechanisms. Leydig cells were collected from 200-day-old mallard ducks and divided into five treatment groups (0, 50, 100, 200, and 400 ng/mL LPS). After treatment with LPS for 6, 12, 24, and 48 h, testosterone, activin, and inhibin levels in the cell supernatants were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. The expression levels of testosterone synthesis-related genes, including steroidogenic acute regulatory protein (StAR), 3-beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD), and cytochrome P450 aromatase (P450arom), and reproductive-related genes, including gonadotropin-inhibitory hormone receptor (GnIHR), follicle stimulating hormone receptor (FSHR), and luteinizing hormone receptor (LHR) were detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). We successfully isolated and cultured duck Leydig cells with cell purity above 90%. Compared with the control group, the levels of testosterone, activin, and inhibin secreted in Leydig cells decreased gradually with increasing LPS concentration. After treatment with LPS, the expression of StAR and 3β-HSD genes in Leydig cells was upregulated at 12 h, and that of GnIHR was upregulated at 24 h; whereas the expression of FSHR and LHR was reduced at 24 h. This study indicates that LPS can inhibit the secretion of hormones and regulate the expression of related genes in duck Leydig cells.

Validação de metodologia analítica para determinação de endotoxina bacteriana em água para diálise por meio de método cromogênico cinético / Analytical methodology validation for determining the bacterial endotoxin in the dialysis water by means of kinetic chromogenic technique

O nível de endotoxina presente na água tratada para hemodiálise é um importante indicador de qualidade, uma vez que altas concentrações de endotoxina atuam como a principal fonte de inflamação crônica em pacientes submetidos à diálise. Este estudo visa validar o método analítico para determinar quantitativamente a endotoxina bacteriana em amostras de água de hemodiálise pelo método cromogênico cinético e de comparar com o método de coagulação em gel. Os ensaios pelo método de coagulação em gel foram realizados de acordo com a Farmacopeia Brasileira em três amostras de água de hemodiálise. A validação do método cromogênico cinético foi realizada utilizando-se as mesmas amostras por meio de sistema de teste portátil. As médias geométricas das concentrações dos pontos finais obtidos nos testes de confirmação de sensibilidade LAL e de interferência por método de coagulação em gel apresentaram resultado de 0,125 UE/mL. Os resultados obtidos pelo método cromogênico para a recuperação do controle positivo do produto variaram de 89 a 186% e o coeficiente de variação de 2,5 a 18,2%, demonstrando que as amostras não apresentaram interferência. Foram obtidos resultados equivalentes em ambos os métodos, o que permite a implementação do método em laboratórios de saúde pública.

The occurrence of endotoxin in the treated water for hemodialysis is an important indicator of quality, since high concentrations of endotoxin constitute the main source for causing chronic inflammation in patients undergoing dialysis. This study aims at validating the analytical method for determining quantitatively the bacterial endotoxin in hemodialysis water samples. The data from the kinetic chromogenic method were compared with the results obtained from the gel coagulation technique. The gel coagulation assays were performed in three samples of hemodialysis water, according to the Brazilian Pharmacopoeia. The validation of the kinetic chromogenic method was performed using the same samples through the portable test system. The geometric means of the concentrations of the endpoints obtained from the tests for confirming the LAL sensitivity and the interference by gel coagulation method showed a result of 0.125 EU/mL. The results obtained by the chromogenic method for recovering the product positive control varied from 89 to 186% and the coefficient of variation from 2.5 to 18.2%, demonstrating that the samples did not show interference. Equivalent results were obtained in both methods, therefore being viable the implementation of this methodology in the public health laboratories.

Validação de metodologia analítica para determinação de endotoxina bacteriana em água para diálise por meio de método cromogênico cinético / Analytical methodology validation for determining the bacterial endotoxin in the dialysis water by means of kinetic chromogenic technique

O nível de endotoxina presente na água tratada para hemodiálise é um importante indicador de qualidade, uma vez que altas concentrações de endotoxina atuam como a principal fonte de inflamação crônica em pacientes submetidos à diálise. Este estudo visa validar o método analítico para determinar quantitativamente a endotoxina bacteriana em amostras de água de hemodiálise pelo método cromogênico cinético e de comparar com o método de coagulação em gel. Os ensaios pelo método de coagulação em gel foram realizados de acordo com a Farmacopeia Brasileira em três amostras de água de hemodiálise. A validação do método cromogênico cinético foi realizada utilizando-se as mesmas amostras por meio de sistema de teste portátil. As médias geométricas das concentrações dos pontos finais obtidos nos testes de confirmação de sensibilidade LAL e de interferência por método de coagulação em gel apresentaram resultado de 0,125 UE/mL. Os resultados obtidos pelo método cromogênico para a recuperação do controle positivo do produto variaram de 89 a 186% e o coeficiente de variação de 2,5 a 18,2%, demonstrando que as amostras não apresentaram interferência. Foram obtidos resultados equivalentes em ambos os métodos, o que permite a implementação do método em laboratórios de saúde pública.(AU)

The occurrence of endotoxin in the treated water for hemodialysis is an important indicator of quality, since high concentrations of endotoxin constitute the main source for causing chronic inflammation in patients undergoing dialysis. This study aims at validating the analytical method for determining quantitatively the bacterial endotoxin in hemodialysis water samples. The data from the kinetic chromogenic method were compared with the results obtained from the gel coagulation technique. The gel coagulation assays were performed in three samples of hemodialysis water, according to the Brazilian Pharmacopoeia. The validation of the kinetic chromogenic method was performed using the same samples through the portable test system. The geometric means of the concentrations of the endpoints obtained from the tests for confirming the LAL sensitivity and the interference by gel coagulation method showed a result of 0.125 EU/mL. The results obtained by the chromogenic method for recovering the product positive control varied from 89 to 186% and the coefficient of variation from 2.5 to 18.2%, demonstrating that the samples did not show interference. Equivalent results were obtained in both methods, therefore being viable the implementation of this methodology in the public health laboratories.(AU)

Clinical and hematological changes in sheep induced by Escherichia coli lipopolysaccharide / alterações clínicas e hematológicas induzidas pela administração de lipopolisscarídeo de Escherichia coli em ovelhas / Alteraciones clínicas y hematológicas inducidas por la administración de lipopoliscárido de Escherichia coli en ovejas

Organic response to infection is characterized by a systemic reaction known as acute phase response (APR). In order to know the effect of the administration of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) on physiological, hematological and biochemical variables, 10 sheep weighing 45 ± 5 kg were divided in two groups: Experimental group treated with 3 doses of 1 µg.kg-1 LPS and control group treated with saline solution (SS) at the same frequency as experimental group. Body temperature (BT°), heart rate (HR) and respiratory rate (RR) were monitored. Blood samples for hemogram and enzyme activity for aspartate amino transferase (AST) and gamma glutamyl transferase (GGT) were collected between 1 and 24 h post-LPS. LPS-treated sheep presented mean values of BT (41.2 ± 0.4°C), HR (132 ± 12.3 beats/min) and RR (107.2 ± 25 cycles/min) higher than those observed in control sheep (39.8 ± 0.2°C, 88.8 ± 8.7 beats/min and 53.6 ± 17.1 cycles/min respectively). Between 4 and 8 hours post-injection (hpi) of LPS the leukocyte count was associated with lymphopenia, followed by leukocytosis at 24 hours. No changes were observed in the activity of AST and GGT enzymes. The results characterize APR induced by LPS in sheep, representing a useful model to study cardiovascular, hematological and biochemical responses to infection. (AU)

A resposta orgânica à infecção é caracterizada por uma reação sistêmica conhecida como resposta de fase aguda (RFA). Para conhecer o efeito da administração de lipopolissacárideo (LPS) de Escherichia coli sobre as variáveis fisiológicas, hematológicas e bioquímicas, 10 carneiros pesando 45 ± 5 kg foram divididos em dois grupos: o grupo experimental tratado com três doses de 1 µg.kg -1 de LPS e grupo controle tratado com solução salina (SS) na mesma frequência que o grupo experimental. Temperatura corporal (T°C), frequência cardíaca (FC) e frequência respiratória (FR) foram monitoradas. As amostras de sangue foram tomadas para hemograma e atividade da enzima aspartato aminotransferase (AST) e gama- -glutamiltransferase (GGT) entre uma e 24 h pós-LPS. Ovelhas tratadas com LPS apresentaram valores médios de T°C (41,2 ± 0,4°C), FC (132 ± 12,3 batimentos/min) e FR (107,2 ± 25 ciclos/min) acima dos observados em ovelhas do tratamento controle (39,8 ± 0,2°C, 88,8 ± 8,7 batimentos/min e 53,6 ± 17,1 ciclos/min, respectivamente). Entre 4 e 8 horas após a injeção de LPS, a contagem de leucocitos foi asociado com linfopenia, seguida de leucocitose as 24 horas. Nenhuma mudança na atividade das enzimas AST e GGT foi observada. Os resultados caracterizam uma resposta de fase aguda induzida por LPS em ovelhas, o que representa um modelo útil para estudar os sistemas cardiovascular, hematológico e bioquímico em resposta à infecção.(AU)

La respuesta orgánica a la infección se caracteriza por una reacción sistémica conocida como respuesta de fase aguda (RFA). Para conocer el efecto de la administración de lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli sobre las variables fisiológicas, hematológicas y bioquímicas, 10 ovejas con un peso de 45 ± 5 kg se dividieron en dos grupos: grupo experimental tratado con 3 dosis de 1 µg.kg-1de LPS y grupo control tratado con solución salina (SS) en la misma frecuencia que el grupo experimental. Temperatura corporal (T°C), frecuencia cardíaca (FC) y frecuencia respiratoria (FR) fueron monitoreadas. Se tomaron muestras de sangre para hemograma y actividad enzimática para el aspartato amino transferasa (AST) y gamma glutamil transferasa (GGT) entre 1 y 24 h post-LPS. Las ovejas tratadas con LPS presentaron valores medios de T°C (41.2 ± 0.4°C), FC (132 ± 12.3 latidos / min) y FR (107.2 ± 25 ciclos/min) por encima de los observados en ovinos controles (39.8 ± 0.2°C, 88.8 ± 8.7 latidos/min y 53.6 ± 17.1 ciclos/min respectivamente). Entre las 4 y 8 horas después de la inyección de LPS, el recuento de leucocitos se asoció a linfopenia, seguida de leucocitosis a las 24 horas. No se observaron cambios en la actividad de las enzimas AST y GGT. Los resultados caracterizan una respuesta de fase aguda inducida por LPS en ovinos, representando un modelo útil para estudiar los sistemas cardiovascular, hematológico y bioquímico en respuesta a la infección.(AU)

Clinical and hematological changes in sheep induced by Escherichia coli lipopolysaccharide / alterações clínicas e hematológicas induzidas pela administração de lipopolisscarídeo de Escherichia coli em ovelhas / Alteraciones clínicas y hematológicas inducidas por la administración de lipopoliscárido de Escherichia coli en ovejas

Organic response to infection is characterized by a systemic reaction known as acute phase response (APR). In order to know the effect of the administration of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) on physiological, hematological and biochemical variables, 10 sheep weighing 45 ± 5 kg were divided in two groups: Experimental group treated with 3 doses of 1 µg.kg-1 LPS and control group treated with saline solution (SS) at the same frequency as experimental group. Body temperature (BT°), heart rate (HR) and respiratory rate (RR) were monitored. Blood samples for hemogram and enzyme activity for aspartate amino transferase (AST) and gamma glutamyl transferase (GGT) were collected between 1 and 24 h post-LPS. LPS-treated sheep presented mean values of BT (41.2 ± 0.4°C), HR (132 ± 12.3 beats/min) and RR (107.2 ± 25 cycles/min) higher than those observed in control sheep (39.8 ± 0.2°C, 88.8 ± 8.7 beats/min and 53.6 ± 17.1 cycles/min respectively). Between 4 and 8 hours post-injection (hpi) of LPS the leukocyte count was associated with lymphopenia, followed by leukocytosis at 24 hours. No changes were observed in the activity of AST and GGT enzymes. The results characterize APR induced by LPS in sheep, representing a useful model to study cardiovascular, hematological and biochemical responses to infection. (AU)

A resposta orgânica à infecção é caracterizada por uma reação sistêmica conhecida como resposta de fase aguda (RFA). Para conhecer o efeito da administração de lipopolissacárideo (LPS) de Escherichia coli sobre as variáveis fisiológicas, hematológicas e bioquímicas, 10 carneiros pesando 45 ± 5 kg foram divididos em dois grupos: o grupo experimental tratado com três doses de 1 µg.kg -1 de LPS e grupo controle tratado com solução salina (SS) na mesma frequência que o grupo experimental. Temperatura corporal (T°C), frequência cardíaca (FC) e frequência respiratória (FR) foram monitoradas. As amostras de sangue foram tomadas para hemograma e atividade da enzima aspartato aminotransferase (AST) e gama- -glutamiltransferase (GGT) entre uma e 24 h pós-LPS. Ovelhas tratadas com LPS apresentaram valores médios de T°C (41,2 ± 0,4°C), FC (132 ± 12,3 batimentos/min) e FR (107,2 ± 25 ciclos/min) acima dos observados em ovelhas do tratamento controle (39,8 ± 0,2°C, 88,8 ± 8,7 batimentos/min e 53,6 ± 17,1 ciclos/min, respectivamente). Entre 4 e 8 horas após a injeção de LPS, a contagem de leucocitos foi asociado com linfopenia, seguida de leucocitose as 24 horas. Nenhuma mudança na atividade das enzimas AST e GGT foi observada. Os resultados caracterizam uma resposta de fase aguda induzida por LPS em ovelhas, o que representa um modelo útil para estudar os sistemas cardiovascular, hematológico e bioquímico em resposta à infecção.(AU)

La respuesta orgánica a la infección se caracteriza por una reacción sistémica conocida como respuesta de fase aguda (RFA). Para conocer el efecto de la administración de lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli sobre las variables fisiológicas, hematológicas y bioquímicas, 10 ovejas con un peso de 45 ± 5 kg se dividieron en dos grupos: grupo experimental tratado con 3 dosis de 1 µg.kg-1de LPS y grupo control tratado con solución salina (SS) en la misma frecuencia que el grupo experimental. Temperatura corporal (T°C), frecuencia cardíaca (FC) y frecuencia respiratoria (FR) fueron monitoreadas. Se tomaron muestras de sangre para hemograma y actividad enzimática para el aspartato amino transferasa (AST) y gamma glutamil transferasa (GGT) entre 1 y 24 h post-LPS. Las ovejas tratadas con LPS presentaron valores medios de T°C (41.2 ± 0.4°C), FC (132 ± 12.3 latidos / min) y FR (107.2 ± 25 ciclos/min) por encima de los observados en ovinos controles (39.8 ± 0.2°C, 88.8 ± 8.7 latidos/min y 53.6 ± 17.1 ciclos/min respectivamente). Entre las 4 y 8 horas después de la inyección de LPS, el recuento de leucocitos se asoció a linfopenia, seguida de leucocitosis a las 24 horas. No se observaron cambios en la actividad de las enzimas AST y GGT. Los resultados caracterizan una respuesta de fase aguda inducida por LPS en ovinos, representando un modelo útil para estudiar los sistemas cardiovascular, hematológico y bioquímico en respuesta a la infección.(AU)

Detection of microorganisms, endotoxins and aluminum in mobile dialysis services / Detecção de microrganismos, endotoxinas e alumínio em serviços de diálise móvel

Hemodialysis water and dialysates are fundamental in the treatment of kidney disease.During just one hemodialysis session, 120 liters of dialysate are consumed. Thus, it is essential that theparameters of chemical and microbiological quality of the fluids used in dialysis systems are carefullyobserved. In this study, water samples were collected at 12 hospitals in the state of Rio de Janeiro. Thesamples were obtained at three points of fluid reservoirs: pre-, post-osmosis and dialysis solution. Aftercollection, colony forming units (CFU), total coliforms and Escherichia coli 100 mL-1 were quantified. Later,isolated colonies and endotoxin content were identified by biochemical assays. Data about total aluminumlevels per sample (mg L-1) were also obtained. Samples of all mobile dialysis services and points ofcollection were contaminated above the levels set out by national laws, in particular by Pseudomonasaeruginosa. Endotoxin levels were also above the recommended by current legislation (> 0.25 EU mL-1).Only three samples contained detectable levels of aluminum, which were found to be above therecommended values for the corresponding resolution (0.01 mg L-1). Finally, there were no observableamounts of total coliforms and E. coli 100 mL-1 sample. The data from this study are an important step forward in the standardization and control of chemical/microbiological quality of mobile dialysis services.(AU)

Águas de hemodiálise e dialisatos são peças fundamentais na terapêutica da doença renal.Durante apenas uma sessão de hemodiálise, são consumidos aproximadamente 120 litros de dialisato. Destaforma, é essencial que os parâmetros de qualidade microbiológica e química dos fluidos utilizados emsistemas de diálise sejam cuidadosamente observados. Neste trabalho, foram coletadas amostras de água em12 hospitais do Estado do Rio de Janeiro. Amostras foram obtidas em pontos pré-osmose, pós-osmose esolução de diálise. Após coleção, quantificaram-se unidades formadoras de colônias (UFC), coliformestotais e Escherichia coli 100 mL-1. Posteriormente, colônias isoladas e teor de endotoxinas foram identificadospor ensaios bioquímicos. Dados acerca dos níveis totais de alumínio por amostra (mg L-1) também foramobtidos. Amostras de todos os serviços de diálise móvel e pontos de coleção apresentaram contaminaçãoacima dos níveis previstos em legislação nacional, em especial por Pseudomonas aeruginosa. Teores deendotoxinas também se mostraram acima da legislação vigente (> 0,25 EU mL-1). Apenas três amostrascontinham níveis detectáveis e acima dos valores preconizados por resolução correspondente (0,01 mg L-1).Por fim, não foram encontradas quantidades observáveis de coliformes totais e E. coli 100 mL-1 de amostra.Dados de nosso estudo são importante avanço na padronização e controle de qualidadequímica/microbiológica em serviços de diálise móvel.(AU)

Piometra com insuficiência renal aguda em cadela - relato de caso / Piometra with acute renal failure in female dog - case report

A hiperplasia endometrial cística ou piometra desenvolve-se durante ou logo após o estro quando a produção de progesterona é alta, nessa fase há dilatação da cérvix e assim as bactérias de origem vaginal podem ter acesso ao útero. A insuficiência renal aguda pode ocorrer concomitantemente devido à deposição de complexos antígeno-anticorpo nos glomérulos e da ação de endotoxinas bacterianas. O objetivo deste trabalho foi relatar o caso de uma fêmea canina, sem raça definida, não castrada, piometra e com sinais de insuficiência renal aguda. Após a realização de exames físicos e complementares, o diagnóstico foi de piometra e insuficiência renal aguda, sendo assim o animal foi encaminhado para procedimento cirúrgico de ovariohisterectomia terapêutica. Após a cirurgia, o paciente permaneceu internado, mantendo-se apático, anoréxico e com emagrecimento progressivo. Apesar das várias tentativas de reverter o quadro clínico, sem resposta, optou-se pela eutanásia. O presente relato ressalta a importância da avaliação da função renal nos pacientes com diagnóstico de piometra.

Cystic endometrial hyperplasia or pyometra develops during or shortly after estrus when progesterone production is high, at this stage there is dilation of the cervix and thus bacteria of vaginal origin can have access to the uterus. Acute renal failure may occur concomitantly due to the deposition of antigen antibody complexes in the glomeruli and the action of bacterial endotoxins. The objective of this study was to report the case of a canine female, undefined, uncastrated, pyometra with signs of acute renal failure. After physical and complementary examinations, the diagnosis was of pyometra and acute renal failure, so the animal was referred to a surgical procedure of therapeutic ovariohysterectomy. After surgery, the patient remained hospitalized, remaining apathetic, anorexic and with progressive weight loss. Despite several attempts to reverse the clinical picture, with no response, euthanasia was chosen. The present report emphasizes the importance of the evaluation of renal function in patients with pyometra.

Piometra com insuficiência renal aguda em cadela - relato de caso / Piometra with acute renal failure in female dog - case report

A hiperplasia endometrial cística ou piometra desenvolve-se durante ou logo após o estro quando a produção de progesterona é alta, nessa fase há dilatação da cérvix e assim as bactérias de origem vaginal podem ter acesso ao útero. A insuficiência renal aguda pode ocorrer concomitantemente devido à deposição de complexos antígeno-anticorpo nos glomérulos e da ação de endotoxinas bacterianas. O objetivo deste trabalho foi relatar o caso de uma fêmea canina, sem raça definida, não castrada, piometra e com sinais de insuficiência renal aguda. Após a realização de exames físicos e complementares, o diagnóstico foi de piometra e insuficiência renal aguda, sendo assim o animal foi encaminhado para procedimento cirúrgico de ovariohisterectomia terapêutica. Após a cirurgia, o paciente permaneceu internado, mantendo-se apático, anoréxico e com emagrecimento progressivo. Apesar das várias tentativas de reverter o quadro clínico, sem resposta, optou-se pela eutanásia. O presente relato ressalta a importância da avaliação da função renal nos pacientes com diagnóstico de piometra.(AU)

Cystic endometrial hyperplasia or pyometra develops during or shortly after estrus when progesterone production is high, at this stage there is dilation of the cervix and thus bacteria of vaginal origin can have access to the uterus. Acute renal failure may occur concomitantly due to the deposition of antigen antibody complexes in the glomeruli and the action of bacterial endotoxins. The objective of this study was to report the case of a canine female, undefined, uncastrated, pyometra with signs of acute renal failure. After physical and complementary examinations, the diagnosis was of pyometra and acute renal failure, so the animal was referred to a surgical procedure of therapeutic ovariohysterectomy. After surgery, the patient remained hospitalized, remaining apathetic, anorexic and with progressive weight loss. Despite several attempts to reverse the clinical picture, with no response, euthanasia was chosen. The present report emphasizes the importance of the evaluation of renal function in patients with pyometra.(AU)

Microbiological quality of water and dialysate from haemodialysis units in Southern Brazil / Qualidade microbiológica da água e dialisato em clínicas de hemodiálise do Sul do Brasil

Infectious diseases in renal patients may be associated with the dialysis water quality, which may be contaminated with microorganisms. In Brazil, the water quality is evaluated by analyzing total coliforms, heterotrophic bacteria, and bacterial endotoxin, but not Pseudomonas sp. and fungi. Water samples from haemodialysis units in Curitiba/PR were investigated on their conformity with the standard established by the Brazilian Health Ministry. Total coliforms, heterotrophic bacteria, P. aeruginosa and fungi counts were performed according to APHA, and LAL methodology for detecting bacterial endotoxin. All of the samples showed the total coliforms counts 1.1 MPN/100 mL,and 95 % of analyzed samples complied with the standards for heterotrophic bacteria counting. P. aeruginosa was recovered from 4 % of samples. In 15 % of samples, bacterial endotoxin was detected in values above the limit established by legislation. Yeasts were isolated from 26 % samples and filamentous fungi from 58 %, being 46 % characterized as melanized fungi. The fungi genera were Cladosporium spp., Penicillium spp., Beauveria spp., Exophiala spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Trichoderma spp, Acremonium spp. and Rinocladiella spp.. The study highlights the significance of P. aeruginosa and fungi detection in those systems, as these microorganisms are potentially pathogenic to immunocompromised patients(AU)

Doenças infecciosas em pacientes renais podem ser associadas à qualidade da água de diálise, que pode apresentar contaminação com microrganismos. Pelos padrões brasileiros, a qualidade da água é avaliada analisando-se coliformes totais, bactérias heterotróficas e endotoxinas bacterianas. Pseudomonas sp. e fungos não são investigados. Amostras de água de clínicas de hemodiálise em Curitiba/PR foram avaliadas quanto à conformidade com os padrões do Ministério da Saúde. Contagens de coliformes totais, bactérias heterotróficas, Pseudomonas aeruginosa e fungos foram realizadas seguindo-se APHA e detecção de endotoxina pela metodologia LAL. Todas as amostras tiveram contagens de coliformes totais abaixo de 1,1 MPN/100 mL e 95 % das amostras apresentaram padrões aceitáveis para bactérias heterotróficas. P. aeruginosa foi encontrada em quatro amostras. Em 15 % das amostras, endotoxinas bacterianas foram detectadas em valores acima dos permitidos pela legislação. Leveduras foram isoladas em 26 % das amostras e fungos filamentosos em 58 %, sendo 46 % melanizados e 27 % hialinos. Os gêneros fúngicos detectados foram Cladosporium spp., Penicillium spp., Beauveria spp., Exophiala spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Trichoderma spp, Acremonium spp. e Rinocladiella spp.. Foi evidenciada a importância da detecção de P. aeruginosa e fungos nestes sistemas, uma vez que estes podem ser potencialmente patogênicos para pacientes imunocomprometidos(AU)

Efeito do Lipopolissacarídeo (LPS) sobre o metabolismo, a reserva ovariana, modulação da expressão de genes do útero, ovário e oviduto em novilhas

A fim de avaliar os efeitos de exposições agudas ao LPS, sobre o metabolismo, útero, oviduto e ovário de bovinos, foram acompanhadas 16 novilhas de corte, europeias, distribuídas uniformemente em dois grupos, a partir do peso corporal: O grupo LPS (n=8) recebeu 2 aplicações contendo 0,5 g/kg de peso corporal de LPS diluídas em 2 mL de solução salina via intravenosa, com intervalo de 24 horas e o grupo controle (n=8) que recebeu 2 aplicações contendo 2 mL de solução salina via intravenosa, com o mesmo intervalo. Os resultados encontrados são apresentados através de 3 artigos. No artigo 1, o objetivo do estudo foi avaliar os parâmetros hematológicos, bem como alguns marcadores energéticos e inflamatórios e níveis de minerais e enzimas hepáticas. No artigo 2, o objetivo do estudo foi identificar os possíveis mecanismos moleculares no oviduto e útero pelos quais as endotoxinas podem influenciar a fertilidade em bovinos. No artigo 3 o objetivo foi verificar o efeito de duas aplicações de LPS sobre a reserva, ativação e apoptose de folículos primordiais. Como resultados, no artigo 1 os animais desafiados apresentaram aumento de temperatura acima dos valores fisiológicos (38,5-39,5°C) da 1 às 4,5 horas com pico na hora 1, no primeiro desafio. Em relação ao segundo desafio, foi observado uma elevação aguda na temperatura 2 horas após o segundo desafio com retorno as 3 horas. Ocorreu uma leucopenia por neutropenia no grupo LPS, sem alteração da série vermelha e das plaquetas. Em relação aos parâmetros bioquímicos ocorreu uma redução nos níveis de colesterol 8 horas após o primeiro desafio no grupo LPS. Os níveis de parâmetros energéticos, inflamatórios, de minerais de enzimas hepáticas não sofreram efeito do desafio. No artigo 2, ocorreu uma redução significativa na expressão dos genes PTGS2 e NANOG no útero, enquanto que os demais genes avaliados não apresentaram alteração. No estudo 3, não houve diferença na população folicular total, bem como nas diferentes categorias foliculares avaliadas. Além disso, o desafio com LPS não modulou a expressão de genes relacionados a reserva ovariana, sobrevivência oocitária, taxa de ativação e atresia folicular. Com isso concluímos que a exposição de animais ao LPS com intervalo de 24 horas, desencadeou uma resposta sistêmica com alteração na temperatura corporal, no leucograma e com um efeito a curto prazo no metabolismo lipídico. Além disso, promoveu a alteração na expressão de genes relacionados a produção de prostaglandinas e a renovação endometrial, sem alterar a população folicular total, taxa de atresia e ativação e a expressão de genes relacionados a reserva ovariana, a sobrevivência oocitária, e a ativação e atresia de folículos primordiais e antiapoptóticos.

In order to evaluate the effects of acute exposure to LPS, on the metabolism, uterus, oviduct and ovary of cattle, sixteen European heifers were uniformly distributed in two groups, based on body weight: The LPS group (n = 8) received 2 applications containing 0.5 g / kg of body weight of LPS diluted in 2 mL of saline intravenously, with an interval of 24 hours and the control group (n = 8) that received 2 applications containing 2 mL of solution saline via intravenously, with the same interval. The results found are presented through 3 articles. In article 1, the aim of the study was to assess hematological parameters, as well as some energy and inflammatory markers and levels of minerals and liver enzymes. In article 2, the objective of the study was to identify the possible molecular mechanisms in the oviduct and uterus by which endotoxemias can influence fertility in cattle. In article 3, the objective was to verify the effect of two applications of LPS on the reserve, activation and apoptosis of primordial follicles. The results of article 1 indicated that the challenged animals showed an increase in temperature above the physiological values (38.5-39.5 °C) from 1 to 4.5 hours with a peak at hour 1, in the first challenge. In relation to the second challenge, a sharp rise in temperature was observed 2 hours after the second challenge with a return at 3 hours. Leukopenia due to neutropenia occurred in the LPS group, with no change in the red series and platelets. Regarding the biochemical parameters, there was a reduction in cholesterol levels 8 hours after the first challenge in the LPS group. Levels of energy, inflammatory parameters, liver enzyme minerals were not affected by the challenge. In article 2, there was a significant reduction in the expression of the PTGS2 and NANOG genes in the uterus, while the other evaluated genes showed no change. In study 3, there was no difference in the total follicular population, as well as in the different follicular categories evaluated. Furthermore, the challenge with LPS did not modulate the expression of genes related to ovarian reserve, oocyte survival, activation rate and follicle atresia. Thus, we conclude that the exposure of animals to LPS with an interval of 24 hours, triggers a systemic response with changes in body temperature, leukogram and with a short-term effect on lipid metabolism. In addition, it promoted the alteration in the expression of genes related to the production of prostaglandins and endometrial renewal, without altering the total follicular population, rate of atresia and activation and the expression of genes related to ovarian reserve, oocyte survival, and primordial follicle activation and atresia and anti-apoptotics.

Marcadores inflamatórios, maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovinos

A resposta inflamatória surge como mecanismo do sistema imune para combater agentes infecciosos. Estudos sugerem uma associação entre a inflamação e a fertilidade, principalmente devido à modulação e síntese de mediadores inflamatórios. A lipoproteína de alta densidade (HDL) é a principal lipoproteína no fluido folicular, tem propriedades anti-inflamatória e antioxidante, que derivam principalmente de sua composição lipídica, porção de apolipoproteína AI (ApoAI) e paraoxonase-1 (PON1). Por outro lado, os lipopolissacarídeos (LPS) são endotoxinas bacterianas que agem como potente estimulador da resposta inflamatória. Neste sentido, objetivou-se avaliar o efeito do HDL durante a maturação in vitro (MIV) sobre a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário, e avaliar o efeito da exposição de oócitos bovinos ao LPS in vitro e in vivo, sobre a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovinos. No primeiro estudo, complexos cumulus oócito (COCs) foram suplementados com proteína HDL durante a MIV, após, foram fecundados (FIV) e cultivados in vitro (CIV). No segundo estudo, COCs foram desafiados com LPS durante a MIV e após, passaram pela FIV e CIV. Separadamente, COCs foram submetidos à MIV sem LPS, depois disso passaram pela FIV e, durante os 7 dias de CIV foram desafiados com LPS. Ainda no segundo estudo, novilhas foram desafiadas com LPS intravenoso durante a sincronização da onda folicular. Os animais foram abatidos, os ovários foram coletados e foi realizada a recuperação dos COCs. Os COCs selecionados passaram por MIV, FIV e CIV. Dessa forma, encontramos que, a adição do complexo HDL/ApoAI do plasma humano durante a MIV, na ausência de atividade da PON1, diminui o desenvolvimento embrionário inicial. Ainda, a exposição de oócitos bovinos ao LPS durante a MIV diminui a taxa de maturação nuclear, entretanto, não foi capaz de afetar o desenvolvimento embrionário inicial. Da mesma maneira, a exposição de zigotos ao LPS durante o CIV não afetou o desenvolvimento embrionário. No entanto, a infusão de LPS em novilhas diminuiu a taxa de clivagem, porém o desenvolvimento embrionário foi semelhante ao do grupo não desafiado com LPS. Conclui-se que a interação dos componentes do complexo HDL-ApoAI-PON1, pode afetar a fertilidade bovina, em nível de oócito e subsequente desenvolvimento embrionário. Da mesma, forma o LPS, pode afetar o oócito e desenvolvimento embrionário, entretanto, os mecanismos pelos quais isso acontecem parecem ser diferentes in vitro e in vivo.

The inflammatory response arises as a mechanism of the immune system to fight infectious agents. Studies suggest an association between inflammation and fertility, mainly due to the modulation and synthesis of inflammatory mediators. High-density lipoprotein (HDL) is the main lipoprotein in follicular fluid. It has anti-inflammatory and antioxidant properties, mainly derived from its lipid composition, apolipoprotein AI (ApoAI) and paraoxonase-1 (PON1). On the other hand, lipopolysaccharides (LPS) are bacterial endotoxins that act as potent stimulator of the inflammatory response. The objective of this study was to evaluate the effect of HDL during in vitro maturation (IVM) on oocyte maturation and early embryonic development and to evaluate the effect of bovine oocyte exposure to LPS in vitro and in vivo on oocyte maturation and embryonic development in cattle. In the first study, cumulus oocyte complex (COCs) were supplemented with HDL protein during IVM, after, were fertilized (IVF) and cultured in vitro (IVC). In the second study, COCs were challenged with LPS during IVM and after, underwent IVF and IVC. Separately, COCs were subjected to IVM without LPS, thereafter they underwent IVF and during the 7 days of IVC they were challenged with LPS. Still in the second study, heifers were challenged with intravenous LPS during follicular wave synchronization. The animals were slaughtered, the ovaries were collected and COC recovery was performed. All recovered COCs underwent IVM, IVF, and IVC. In this way, we found that the addition of the HDL/ApoAI complex of human plasma during IVM, in the absence of PON1 activity, decreases the initial embryonic development. Furthermore, the exposure of bovine oocytes to LPS during IVM decreases the nuclear maturation rate, however, it was not able to affect the initial embryonic development. Similarly, exposure of zygotes to LPS during IVC did not affect embryonic development. However, infusion of LPS into heifers decreased the rate of cleavage, but the embryonic development was similar to that of the non-LPS challenged group. It is concluded that the interaction of HDL-ApoAI-PON1 complex components may affect bovine fertility at oocyte level and subsequent embryonic development. In the same way, the LPS can affect the oocyte and embryonic development; however, the mechanisms by which this happens appear to be different in vitro and in vivo.

Mesenteric lymph reperfusion after superior mesenteric artery occlusion shock exacerbates endotoxin translocation in brain

To determine the role of mesenteric lymph reperfusion (MLR) on endotoxin translocation in brain to discuss the mechanism of brain injury subjected to superior mesenteric artery occlusion (SMAO) shock. Twenty-four rats were randomly assigned to MLR, SMAO, MLR+SMAO and sham groups. MLR was performed by clamping the mesenteric lymph duct (MLD) for 1 h and then allowing reperfusion for 2 h in the MLR group; SMAO involved clamping the superior mesenteric artery (SMA) for 1 h, followed by reperfusion for 2 h in the SMAO group; occlusion of both the SMA and MLD for 1 h was followed by reperfusion for 2 h in the MLR+SMAO group rats. SMAO shock induced severe increased levels of the endotoxin, lipopolysaccharide receptor, lipopolysaccharide-binding protein, intercellular adhesion molecule-1 and tumor necrosis factor-α. Concurrently, MLR after SMAO shock further aggravates these deleterious effects. Mesenteric lymph reperfusion exacerbated the endotoxin translocation in brain; thereby increased inflammatory response occurred, suggesting that the intestinal lymph pathway plays an important role in the brain injury after superior mesenteric artery occlusion shock.(AU)

Application of statistical experimental design for optimisation of bioinsecticides production by sporeless Bacillus thuringiensis strain on cheap medium

In order to overproduce bioinsecticides production by a sporeless Bacillus thuringiensis strain, an optimal composition of a cheap medium was defined using a response surface methodology. In a first step, a Plackett-Burman design used to evaluate the effects of eight medium components on delta-endotoxin production showed that starch, soya bean and sodium chloride exhibited significant effects on bioinsecticides production. In a second step, these parameters were selected for further optimisation by central composite design. The obtained results revealed that the optimum culture medium for delta-endotoxin production consists of 30 g L-1 starch, 30 g L-1 soya bean and 9g L-1 sodium chloride. When compared to the basal production medium, an improvement in delta-endotoxin production up to 50% was noted. Moreover, relative toxin yield of sporeless Bacillus thuringiensis S22 was improved markedly by using optimised cheap medium (148.5 mg delta-endotoxins per g starch) when compared to the yield obtained in the basal medium (94.46 mg delta-endotoxins per g starch). Therefore, the use of optimised culture cheap medium appeared to be a good alternative for a low cost production of sporeless Bacillus thuringiensis bioinsecticides at industrial scale which is of great importance in practical point of view.(AU)

Biochemical parameters of evaluation of renal and hepatic function of colic horses submitted to laparotomy that have survived or not / Parâmetros bioquímicos de avaliação da função renal e hepática de equinos com cólica submetidos a laparotomia, sobreviventes ou não

We examined 46 adult horses   - six healthy, as control, (group 1) and 40 horses with colic submitted to treatment by laparotomy. Twenty animals had no postoperative complication (group 2), and twenty died or were euthanized from seven to ten days after the surgery (group 3). There was an increase in serum urea and creatinine concentration and AST, FA and GGT activity of animals from group 1 and group 2, indicative of renal and hepatic injury. The changes were associated with dehydration and endotoxins. Depending on the severity of the colic, animals may develop kidney and liver failure. KEYWORDS: acute abdomen; clinical pathology; horse.

Foram examinados 46 equinos adultos, seis animais hígidos (G1) e 40 com cólica, submetidos à laparotomia. Desses, vinte recuperaram-se sem intercorrência pós-operatória (G2) e 20 foram a óbito ou foram sacrificados sete a dez dias após a cirurgia (G3). Houve aumento na concentração sérica de ureia e de creatinina e na atividade da aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina e gama glutamiltransferase nos animais do G2 e do G3, indicativo de lesão renal e hepática. As alterações foram associadas à desidratação e às endotoxinas. Animais que apresentam distúrbio gastrointestinal mais severo são mais propensos a desenvolverem insuficiência renal e hepática, as quais contribuem negativamente para o prognóstico. PALAVRAS-CHAVE: abdômen agudo; cavalo; patologia clínica.

Influência do erro de micropipetas na dosagem espectrofotométrica do ensaio de endotoxina bacteriana (LAL cromogênico) aplicável a produtos sujeitos à Vigilância Sanitária / Effect of micropipette inaccuracy on performance of spectrophotometric assay for bacteria endotoxin dosage (chromogenic LAL) employed in products subjected to sanitary surveillance

Segundo a norma ISO 17.025, os instrumentos usados em experimento devem ser calibrados. No caso de micropipetas não há limite máximo de erro definido, sendo difícil estipular até que ponto uma micropipeta pode continuar a ser usada. O objetivo do trabalho foi o de determinar a porcentagem de erro no volume da micropipeta que não interfira nos resultados das diferentes etapas do ensaio toxicológico Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL). Os percentuais de erro foram obtidos do levantamento de 44 certificados de micropipetas. Foram utilizados uma pipeta monocanal calibrada, de volume variável e kit LAL Cromogênio QCL-1000 (Lonza). A curva de endotoxina foi construída com as concentrações de 0,1; 0,25; 0,5 e 1 UE/mL. Os percentuais de erro de ±2%, ±4% e±10% foram comparados com a concentração de referência (0,5 UE/mL), e analisados pelo Student t-test (p<0,05). A análise estatística mostrou que, para a endotoxina padrão e para o substrato do LAL, erro acima de 2% interferenos resultados, cuja correção deve ser feita pelo ajuste do volume na pipeta. Nenhum erro testado causou interferência estatisticamente significativa na reação da cor do substrato. Micropipetas com erro superior a ±2% devem ser corrigidas. (AU)

Indução diferencial das vias MyD88 e TRIF-dependentes em leucócitos totais de equinos estimulados com LPS de E. coli

A resposta imune inata é a principal responsável pela defesa do hospedeiro contra endotoxinas de bactérias gram negativas. Tal resposta se dá através dos receptores Toll-like-4 e -2, seja pela via MyD88dependente, TRIF-dependente ou ambas. Entretanto, uma resposta exagerada pode resultar em muitos danos para o organismo e levar até mesmo ao choque séptico. Uma das formas de controle desta resposta se dá através da Tolerância à endotoxina (TE). Por isso o presentes estudo tem por objetivo investigar a indução diferencial dos receptores TLR-4 e 2, suas vias de sinalização MyD88 e TRIF-dependentes e avaliar outros possíveis genes relacionados a estas vias após indução da TE. Foi coletado sangue total de cavalos saudáveis (n=6), o qual foram estimulados com diferentes doses (0, 1 e 10ng de LSP/mL) LPS de E.coli no momento 0 e 4 horas após o primeiro estímulo e 4 horas após o segundo estímulo. O pool (n=6) de RNA das amostras, coletado 0, 2, 4 e 8 horas, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em uma lâmina 4x44 contendo sequências específicas da espécie equina. Foi identificado durante a TE, nas diferentes doses de LPS, um aumento de transcritos dos receptores TLR-4 e -2, TNFAIP3 e IL-10 e uma diminuição de outros transcritos de genes importantes, tais como: MyD88, IL1-, TNF-, TRAM2, o que caracteriza e esclarece, de certa forma, as alterações na sinalização do TLR nas condições de tolerância à endotoxina.

The innate immune response is the main responsible for the host's defense against endotoxins from Gram-negative bacteria. Such response occurs via Toll-like-4 and -2 receptors, MyD88dependent pathway, TRIF-dependent pathway or both. However, an exaggerated reponse can induce many damages to the organism, including septic shock. One way to control this exacerbated response is through endotoxin tolerance (ET). The goals of the present study were to investigate TLR-4 and 2 receptors, their signaling through MyD88 e TRIF-dependent pathways and evaluate other possible genes related to this ways after ET induction. Blood samples were collected from healthy horses (n=6) which were stimulated with different doses (0, 1 e 10ng of LSP/mL) of LPS from E.coli, for 0 and 4 hours after the first stimulus and 4 hours after second stimulus. The pool (n=6) of RNA, extracted from the samples collected at 0, 2, 4 e 8 hours, was used for the transcription of the cDNA. The hybridization of the cDNA marked with Cy-3 was done in one slide 4x44 containing specific sequences from the equine species. We identified during the ET, on the different doses of LPS, an increase of transcripts for the receptors TLR-4 and -2, TNFAIP3 and Il-10 and a reduction of transcripts of other important genes, such as: MyD88, IL1, TNF-, TRAM2, what characterizes and enlightens the changes in TLR signaling during endotoxin tolerance.