Burkholderia mallei isolation from milk of a mare and evidence of congenital transmission of glanders in equids: case reports / Isolamento de Burkholderia mallei de leite de égua e evidência de transmissão congênita de mormo em equinos: relatos de casos

This is the first report of Burkholderia mallei isolation in milk from a mare diagnosed with glanders and of transplacental transmission of the bacteria in a seropositive pregnant mare, both from São Paulo State, Brazil, 2016 and 2019. After necropsy, the horses were evaluated for macroscopic lesions, and organ samples were removed for histological, bacteriological, and molecular analysis. B.mallei was identified in milk samples by culture isolation and PCR, whereas in the fetus of the pregnant mare by PCR of the stomach fluid. These findings will contribute to the epidemiological knowledge of glanders life cycle in Brazil.

Este é o primeiro relato de isolamento de Burkholderia mallei no leite de uma égua com diagnóstico de mormo e de transmissão transplacentária da bactéria em uma égua prenhe soropositiva, ambas do Estado de São Paulo, Brasil, 2016 e 2019. Após a necropsia, os cavalos foi verificada a presença de lesões macroscópicas e amostras de órgãos foram coletadas para posterior análise histológica, bacteriológica e molecular. B.mallei foi identificada em amostras de leite por isolamento bacteriano e PCR, enquanto no feto de égua prenhe por PCR do fluido estomacal. Esses achados contribuirão para o conhecimento epidemiológico do ciclo de vida do mormo no Brasil.

Burkholderia mallei isolation from milk of a mare and evidence of congenital transmission of glanders in equids: case reports / Isolamento de Burkholderia mallei de leite de égua e evidência de transmissão congênita de mormo em equinos: relatos de casos

This is the first report of Burkholderia mallei isolation in milk from a mare diagnosed with glanders and of transplacental transmission of the bacteria in a seropositive pregnant mare, both from São Paulo State, Brazil, 2016 and 2019. After necropsy, the horses were evaluated for macroscopic lesions, and organ samples were removed for histological, bacteriological, and molecular analysis. B.mallei was identified in milk samples by culture isolation and PCR, whereas in the fetus of the pregnant mare by PCR of the stomach fluid. These findings will contribute to the epidemiological knowledge of glanders life cycle in Brazil.(AU)

Este é o primeiro relato de isolamento de Burkholderia mallei no leite de uma égua com diagnóstico de mormo e de transmissão transplacentária da bactéria em uma égua prenhe soropositiva, ambas do Estado de São Paulo, Brasil, 2016 e 2019. Após a necropsia, os cavalos foi verificada a presença de lesões macroscópicas e amostras de órgãos foram coletadas para posterior análise histológica, bacteriológica e molecular. B.mallei foi identificada em amostras de leite por isolamento bacteriano e PCR, enquanto no feto de égua prenhe por PCR do fluido estomacal. Esses achados contribuirão para o conhecimento epidemiológico do ciclo de vida do mormo no Brasil.(AU)

First serological detection of Borrelia spp. in dogs in western Cuba / Primeira detecção sorológica de Borrelia spp. em cães na região oeste de Cuba

This study aimed to verify the presence of IgG antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) in domestic dogs in western Cuba. Serum samples were analyzed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), using crude antigens of a B. burgdorferi strain of North American origin. To verify the presence of Borrelia spp., deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from individual blood samples was analyzed by nested-PCR, with markers targeted for amplification of portions of the flagellin B gene (flaB) present in Borrelia spirochetes. Ticks were also collected through inspection of the animals. Sera from 93 of 176 (52.84%) dogs were reactive to the indirect ELISA. Geographic prevalence varied from 54.35% (25/46) in Boyeros, 44.44% (20/45) in Cotorro, 66.67% (22/33) in Habana del Este, and 50% (26/52) in San José de las Lajas. There was no statistical difference between these tested variables. No blood samples analyzed were positive for the Borrelia flaB gene.(AU)

Este estudo teve como objetivo confirmar a presença de anticorpos IgG contra Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) em cães na região oeste de Cuba. As amostras de soro foram analisadas por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) indireto, usando-se antígenos brutos de uma cepa de B. burgdorferi de origem norte-americana. Para confirmar a presença de Borrelia spp., o ácido desoxirribonucleico (DNA), extraído de amostras individuais de sangue, foi analisado por PCR, utilizando-se marcadores direcionados para a amplificação de porções do gene da flagelina B (flaB) presente nas espiroquetas de Borrelia. Os carrapatos também foram coletados através da inspeção dos animais. Os soros de 93 de 176 (52,84%) cães foram reativos ao ELISA indireto. A prevalência geográfica variou de 54,35% (25/46) em Boyeros, 44,44% (20/45) em Cotorro, 66,67% (22/33) em Habana del Este e 50% (26/52) em San José de las Lajas. Não houve diferença estatística entre essas variáveis testadas. Nenhuma amostra de sangue analisada foi positiva para o gene Borrelia flaB.(AU)

Molecular characterization of virulence genes cctA, nanA, and fliC in Clostridium chauvoei from Rio Grande do Sul and São Paulo State, Brazil / Caracterização molecular dos genes de virulência cctA, nanA e fliC em Clostridium chauvoei isolados no Rio Grande do Sul e São Paulo, Brasil

Clostridium chauvoei toxin A (CctA), neuraminidase (NanA), and flagellin (FliC) proteins contribute to the pathogenicity of Clostridium chauvoei, the causative agent of blackleg in cattle. The aim of this study was to analyze the genetic variability of cctA, nanA, and fliC genes in C. chauvoei isolates from the Rio Grande do Sul and São Paulo state- Brazil, during different sampling periods. The presence of these genes was verified through PCR amplification and partial gene sequencing of 17 strains. Alignment of PCR amplicons combined with bioinformatics analysis was used in an attempt to study the variability across C. chauvoei solates. The similarity among the partial sequences of cctA and nanA genes was 100%. The sequencing of fliC revealed three different paralog alleles of flagellin, and two strains were seen to be polymorphic, with amino acid alterations in the predicted protein. Overall, this study indicates that strains of C. chauvoei isolated in Brazil are highly conserved with respect to the virulence factors evaluated.(AU)

Toxina A de Clostridium chauvoei (CctA), neuraminidase (NanA) e flagelina (FliC) são proteínas que contribuem para a patogenicidade de Clostridium chauvoei, o agente causador do carbúnculo sintomático em bovinos. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética dos genes cctA, nanA, e fliC em C. chauvoei isolados em diferentes períodos no Rio Grande do Sul e São Paulo. A presença destes genes foi verificada pela amplificação dos produtos da PCR e sequenciamento parcial dos genes de 17 cepas. Os alinhamentos da amplificação dos produtos da PCR combinados com a análise de bioinformática foram utilizados na tentativa de avaliar a variabilidade dos genes entre os isolados de C. chauvoei. A similaridade do sequenciamento parcial dos genes cctA e nanA foi 100%. O sequenciamento do fliC revelou três alelos paralogos diferentes de flagelina e duas cepas mostraram polimorfismos, causando alterações na sequência de aminoácidos. As cepas de C. chauvoei isoladas no Brasil mostraram-se altamente conservadas em relação aos fatores de virulência avaliados neste estudo.(AU)

Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR analysis as a reliable evidence for suspected Shigella spp. outbreaks

Background: Shigellosis remains a serious public health problem and an important cause of morbidity and mortality worldwide. The aim of this study was to characterize fliC and the genetic relatedness of Shigella spp. isolated during a one-year period from children in a suspected outbreak in Tehran, Iran. Methods and results: Fifty Shigella spp. were isolated from 3779 stool samples of children with diarrhea (prevalence rate: 1.32%). Among the isolates, 92% were characterized as Shigella sonnei, while 6% and 2% were identified as S. flexneri and S. boydii, respectively. S. dysenteriae was not recovered from the patients. All isolates were negative for fliC except for Shigella standard strains. The enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) profiles allowed differentiating the 50 isolates into 5 ERIC types, which were grouped into five clusters (ET1-ET5). Computer-assisted clustering of the strains showed a high degree of similarity among the isolates. Conclusion: In conclusion, given the clonal correlation of the Shigella strains isolated in this study and the lack of fliC among them, we propose that probably a single or limited fliC-defected Shigella clone spread and caused the outbreak.(AU)

Production of recombinant flagellin to develop ELISA-based detection of Salmonella Enteritidis

ABSTRACT Food-borne diseases, caused by the pathogenic bacteria, are highly prevalent in the world. Salmonella is one of the most important bacterial genera responsible for this. Salmonella Enteritidis (SE) is one of the non-typhoid Salmonellae that can be transmitted to human from poultry products, water, and contaminated food. In recent years, new and rapid detection methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) have been developed. In this study, recombinant FliC (rFliC) was produced to be used as an antigen. The immunization was conducted in mice with the purified recombinant FliC (rFliC). The mice were subcutaneously immunized with rFliC and elicited significant rFliC specific serum IgG antibodies. An indirect ELISA system was established for the detection of Salmonella Enteritidis. Our results confirmed that the recombinant flagellin can be one of the excellent indicators for the detection of Salmonella Enteritidis.(AU)

Aplicação da proteômica de Leptospira e ferramentas de imunoinformática para a identificação de candidatos ao desenvolvimento de uma vacina contra leptospirose

A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas do gênero Leptospira, que tem um impacto significativo em saúde pública com mais de um milhão de novas infecções e 59 mil mortes por ano, além de grandes perdas econômicas na agropecuária. A falta de uma vacina totalmente eficaz contra a doença é um dos principais fatores que comprometem o seu controle, por isso é emergencial o desenvolvimento de novas vacinas que seja capaz de superar as limitações das vacinais disponíveis no mercado atualmente, e que possa ser empregada em populações humanas globalmente. Por isso, o objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação completa do perfil proteico de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa M20, com caracterização in silico das proteínas desconhecidas e das proteínas com capacidade de gerar resposta imune para compor uma vacina multiepítopo. Para a realização da proteômica foi desenvolvido um protocolo simplificado de obtenção do extrato proteico seguido pela espectrometria de massas LTQ-Orbitrap Velos acoplado à cromatografia líquida EASY-nLC II. As proteínas encontradas passaram por uma avaliação ampla, como análise taxonômica para identificação das proteínas comuns à outras espécies e sorovares da bactéria, descrição dos grupos funcionais, design da estrutura tridimensional de proteínas importantes no estudo da Leptospira e caracterização in silico das proteínas não caracterizadas e das proteínas já identificadas como geradoras de resposta imune. A partir daí foram utilizados diversos servidores para realização das análises de imunoinformática, visando a identificação e de seleção das proteínas com maior potencial para alvo vacinal e subsequente seleção dos melhores epítopos, capazes de estimular resposta imune humoral e celular. As proteínas Loa 22, LipL32, Flagelina, Fator de elongação Tu e Fator de elongação Ts, tiveram sua estrutura tridimensional desenvolvida e validada. Dentre as proteínas selecionadas com maior potencial para alvo vacinal, a maioria correspondeu a proteínas não caracterizadas até então. Este estudo também identificou epítopos de células B, de Linfócito T Citotóxico, de Linfócito T Helper, de células TCD4 e indutores de IFN-, que foram reunidos através de um design racional para constituir em uma proteína quimérica multiepítopo a ser empregada como alvo vacinal com potencial para superar as limitações da bacterina utilizada atualmente. O estudo do perfil proteico de Leptospira associado a triagem de alvos vacinais, por meio da imunoinformática, resultou na construção de uma proteína quimérica, com características desejáveis para um imunógeno no processo de desenvolvimento da vacina.

Leptospirosis is a zoonosis caused by spirochetes of the Leptospira genus, which causes a significant impact on public health, with more than one million new infections and 59,000 deaths each year, moreover major economic losses in agriculture. Lack of an fully effective vaccine against the disease is one of the main factors that compromise its control, so it is urgent to develop new vaccines that is able to overcoming the limitations of vaccines currently available, that can be used in human populations globally. Therefore, the aim of this study was to fully evaluate the protein profile of Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain M20, with in silico characterization of uncharacterized proteins and proteins that is able to induce immune response and compose a subunit vaccine. To perform proteomics, a simplified protocol for obtaining protein extract was developed followed by mass spectrometry LTQ-Orbitrap Velos coupled to liquid chromatography EASY-nLC II. The proteins found undego a full evaluation, like a taxonomic analysis to identify common proteins to other species and serovars of the bacterium; description of functional categories; design of the three-dimensional structure of important proteins in the Leptospira study and in silico characterization of uncharacterized proteins and proteins already identified as induce an immune response. Then, many servers were used to perform immunoinformatics analysis, aiming to identify and select the proteins with the major potential for vaccine target and subsequent selection of the best epitopes able to stimulating humoral and cellular immunity. Proteins Loa 22, LipL32, Flagellin, Elongation fator Tu and Elongation fator Ts had their three-dimensional structure developed and validated. Among the selected proteins with the major vaccine target potential, most are uncharacterized proteins until then. This study also identified epitopes of B cell, of cytotoxic T lymphocyte, of helper T lymphocyte, of TCD4 cell and of IFN- inducers. This epitopes have been assembled through rational design to constitute a multi-epitope chimeric protein that can be used as a vaccine target with potential for overcome the bacterin limitations. The detailed study of Leptospira protein profile associated with the screening of vaccine targets by immunoinformatics resulted in the design of a chimeric protein, with desirable characteristics for an immunogen in the vaccine development process.

ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE, COLONIZAÇÃO E INVASÃO DE AVES (Gallus gallus domesticus) POR ESTIRPES DE Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium CONTENDO DELEÇÕES NOS GENES clpP E fliD

Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium causam infecções em seres humanos e animais que são frequentemente associadas à extensa colonização intestinal e excreção fecal. A presença de estrutura flagelar no patógeno está relacionada à indução de inflamação intestinal e atenuação de infecção sistêmica no hospedeiro. Por outro lado, a infecção por estirpes aflageladas resulta em pouca inflamação e consequente infecção sistêmica grave. No presente estudo, foi avaliada a hipótese de que a síntese de maior quantidade de flagelina em estirpes de Salmonella geneticamente modificadas poderia levar a infecção sistêmica menos intensa em aves. Para investigar as conseqüências da superprodução de flagelina, foram construídas estirpes de Salmonella Enteritidis e Typhimurium contendo deleções nos genes clpP e fliD (que levam à superexpressão de flagelina) e patogenicidade e imunogenicidade foram comparadas com as respectivas estirpes selvagens em aves infectadas. Os resultados indicaram que o aumento da síntese de flagelina por SE clpPfliD e STM clpPfliD culmina em déficit da taxa de multiplicação bacteriana. Porém, tais alterações não interferiram na capacidade de colonização cecal e excreção fecal das estirpes mutantes. O mesmo foi observado em fígado e baço, mas após 14 dpi as estirpes mutantes tendem a serem eliminadas destes órgãos. Mesmo com síntese mais elevada de flagelina, as estirpes mutantes recrutaram quantidades semelhantes de linfócitos e macrófagos em tonsila cecal, baço e fígado que as estirpes selvagens. Infecções por STM clpPfliD produziram sinais clínicos mais brandos em comparação à STM, e alta produção de IL22 em 7 dpi. Enquanto que SE clpPfliD desencadeou sinais clínicos semelhantes aos induzidos por SE, porém, com níveis mais elevados de IL22 e IL18, porém com repressçao de CCl4, CXCLi2 e IL17 em no intestino no início da infecção. Ao que tudo indica a maior produção de flagelina por ambas as estirpes mutantes alteraram a patogenicidade, possivelmente por alterarem a ativação e modulação do sistema imune da ave.

Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium cause infections in humans and animals that are often associated with extensive intestinal colonization and faecal shedding. The presence of flagellar structure in the pathogen is related to the induction of intestinal inflammation and attenuation of systemic infection in the host. On the other hand, the absence of flagellin results in severe systemic infection as a result of mild inflammatory intestinal responses provoked by aflagellated strains. The hypothesis that higher flagellin production by Salmonella strains could induce immunogenic response during infection in chickens was evaluated in the present study. To investigate the consequences of flagellin overproduction, strains of Salmonella Enteritidis and Typhimurium containing clpP and fliD deletions (which lead to flagellin overexpression) were constructed, and pathogenicity and immunogenicity were compared with their respective wild-type strains in infected chickens. The results suggested that the increase in flagellin synthesis by SE clpPfliD and STM clpPfliD culminates in a deficit in the bacterial multiplication rate. However, that changes did not interfere with the capacity for caecal colonization and faecal excretion of mutant strains. The same was observed in the liver and spleen, but after 14 dpi, mutant strains tend to be eliminated from these organs. Even with higher flagellin synthesis, the mutant strains recruited similar amounts of lymphocytes and macrophages in the caecal tonsil, spleen and liver than wild-type strains. and high IL22 production at 7 dpi. While SE clpPfliD triggered clinical signs similar to those induced by SE, but with higher levels of IL22 and IL18, but with repression of CCl4, CXCLi2 and IL17 in the intestine at the beginning of the infection. Apparently, the higher production of flagellin by both mutant strains altered the pathogenicity, possibly by altering the activation and modulation of the chicken's immune system.

Seleção, caracterização e clonagem dos genes fljB e groEL agonistas dos receptores de reconhecimento de padrão do sistema imune inato das aves / Selection, characterization and cloning of the fljB and groEL genes agonists of the innate immune system pattern recognition receptors of birds

The recombinant production of innate immune system pattern recognition receptor agonists has provided a new tool for the production of immunostimulants for animals. The molecular pattern associated with the pathogen (PAMP), flagellin, coded by the fljB gene from Salmonella Typhimirium, and the molecular pattern associated to the damage (DAMP), HSP60, coded by the groEL gene from S. Typhimurium and S. Enteritidis, are recognized by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system of birds. In the present study, we performed the cloning of genetic fragments of the genes fljB, from S. Typhimurium, and groEL from S. Typhimurium and S. Enteritidis inserted in expression vector pET100/D-TOPO and transformed in E. coli TO10 cells. The clones were evaluated by colony PCR, plasmidial DNA PCR and genome sequencing in order to confirm the presence of these genes. In the colony PCR, we identified the presence of genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) and fljB (S. Typhimurium) in 80%, 60% and 80% of the transformed colonies, respectively. The cloning system adopted allowed the production of HSP60 genetic fragment clones and flagellin of Salmonella strains, allowing the posterior use of these clones in gene expression trials, with the future potential of being used as non-specific immunostimulants for birds.(AU)

A produção recombinante de agonistas dos receptores do reconhecimento de padrão do sistema imune inato tem fornecido uma nova ferramenta para a produção de imunoestimulantes para animais. O padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), flagelina, codificado pelo gene fljB de Salmonella Typhimurium e o padrão molecular associado ao dano (DAMP) HSP60, codificado pelo gene groEL da S. Typhimurium e S. Enteritidis, são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (RRPs) do sistema imune inato das aves. No presente estudo, foi feita a clonagem de fragmentos genéticos dos genes fljB de S. Typhimurium e groEL de S. Typhimurium e S. Enteritidis inseridos no vetor de expressão pET100/D-TOPO e transformados em células de E. coli TOP10. Os clones foram avaliados pela PCR de colônia, PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para a confirmação da presença desses genes. Na PCR de colônia, foram identificadas em 80%, 60% e 80% das colônias transformadas, a presença dos genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) e fljB (S. Typhimurium) respectivamente. O sistema de clonagem adotado possibilitou a produção de clones dos fragmentos genéticos da HSP60 e flagelina das cepas de Salmonella, permitindo a utilização posterior desses clones em ensaios de expressão gênica, com potencial futuro de serem utilizados como imunoestimulante inespecífico das aves.(AU)

Identification of new flagellin-encoding fliC genes in Escherichia coli isolated from domestic animals using RFLP-PCR and sequencing methods / Identificação de novas flagelinas codificadas por fliC em Escherichia coli isoladas de animais domésticos utilizando RFLP-PCR e sequenciamento

Identification of Escherichia coli requires knowledge regarding the prevalent serotypes and virulence factors profiles allows the classification in pathogenic/non-pathogenic. However, some of these bacteria do not express flagellar antigen invitro. In this case the PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) and sequencing of the fliC may be suitable for the identification of antigens by replacing the traditional serology. We studied 17 samples of E. coli isolated from animals and presenting antigen H nontypeable (HNT). The H antigens were characterized by PCR-RFLP and sequencing of fliC gene. Three new flagellin genes were identified, for which specific antisera were obtained. The PCR-RFLP was shown to be faster than the serotyping H antigen in E. coli, provided information on some characteristics of these antigens and indicated the presence of new genes fliC.(AU)

A identificação da Escherichia coli requer conhecimento sobre os sorotipos e fatores de virulência prevalentes permitindo a classificação em patogênico/não patogênico. No entanto, algumas destas bactérias não expressam o antígeno flagelar in vitro. Neste caso, o PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) e o sequenciamento do gene fliC podem ser adequados para a identificação desses antígenos, substituindo a sorologia tradicional. Nesta pesquisa foram estudadas 17 amostras de E. coli isoladas de animais e que apresentavam antígeno H não tipável (HNT). Os antígenos H foram caracterizados por PCR-RFLP e sequenciamento do gene fliC. Três novos genes da flagelina foram identificados, para os quais anti-soros específicos foram obtidos. A técnica PCR-RFLP mostrou-se mais rápida que a sorotipagem do antígeno H em E. coli, fornecendo informações sobre algumas características desses antígenos e indicou a presença de novos genes fliC.(AU)

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ANTIGÊNICA DE Clostridium chauvoei ISOLADOS DE CASOS DE CARBÚNCULO SINTOMÁTICO EM BOVINOS

As clostridioses formam o grupo de infecções e intoxicações causadas por micro-organismos anaeróbios do gênero Clostridium. Dentre estas enfermidades, a principal doença que determina mionecrose é o carbúnculo sintomático, uma infecção endógena e aguda que acomete principalmente os bovinos, cujo agente etiológico é Clostridium chauvoei. O controle desta enfermidade se baseia em medidas adequadas de manejo e vacinações sistemáticas de todo o rebanho. As vacinas contra o carbúnculo sintomático comercializadas no Brasil são, no geral, compostas de múltiplos antígenos e seguem as normas para o controle da qualidade e eficiência definidas na legislação publicada pela Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). No entanto, são escassos os trabalhos com evidências científicas que comprovem a eficiência da vacina, assim como trabalhos que indiquem o grau de similaridade entre cepas de C. chauvoei utilizadas na produção destas vacinas, cepas de maior ocorrência no campo e a cepa padrão utilizada no teste de eficiência da vacina pelo MAPA. Da mesma forma os relatos acerca de falhas vacinais são informais e as circunstâncias destas falhas não são claramente elucidadas. Os principais fatores de virulência de C. chauvoei são a neuraminidase, citotoxina A (CctA) e a flagelina, sendo que a CctA parece ser o principal. Esta tese teve por objetivo avaliar a eficácia protetiva de vacinas comerciais frente ao desafio com C. chauvoei, bem como realizar a comparação genômica das cepas utilizadas no desafio vacinal (manuscrito 2). A diversidade molecular foi investigada, a partir do sequenciamento parcial dos genes da neuraminidase (nanA), CctA (cctA) e flagelina (fliC) de dezessete cepas de C. chauvoei isoladas de casos clínicos em bovinos (manuscrito 3). Também pretendeu à comparação genômica de seis cepas isoladas de casos de carbúnculo sintomático no Brasil com vistas a pesquisar diferenças moleculares na única cepa com apresentação clínica visceral (manuscrito 4). Dessa forma, discutir as implicações da caracterização molecular e antigênica no entendimento do carbúnculo sintomático, e subsidiar futuras pesquisas a fim de melhorar o controle da doença. Concluímos que o desempenho equivalente das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados estão correlacionados com a homologia genética das cepas, sugerindo que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica. O sequenciamento parcial dos genes nanA e cctA mostrou alta homologia entre as cepas. Por essa razão, estes antígenos solúveis são bons candidatos a antígenos vacinais. Além disso, três alelos foram detectados no gene fliC. Na comparação genômica as seis cepas brasileiras se mostraram altamente conservadas, tal como foi observado no sequenciamento parcial dos genes e na comparação das cepas utilizadas no desafio vacinal. Os resultados apresentados nesta tese podem ser um indicativo de que neste momento evolutivo C. chauvoei não está sendo desafiado a desenvolver mutações

Clostridioses are the group of infections and intoxications caused by anaerobic microorganisms of the genus Clostridium. Among these diseases, the main disease that causes myonecrosis is blackleg, an endogenous and acute infection that mainly affects cattle, whose etiological agent is Clostridium chauvoei. Control of this disease is based on adequate management measures and systematic vaccinations of herd. Vaccines against blackleg marketed in Brazil are, in general, composed of multiple antigens and follow the standards for quality and efficiency control defined in the legislation published by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA). However, there are few studies with scientific evidence to prove the effectiveness of the vaccine, as well as studies indicating the degree of similarity between strains of C. chauvoei used in the production of these vaccines, strains occurring in the field and the standard strain. Likewise reports of vaccine failures are informal and the circumstances of these failures are not clearly elucidated. The main virulence factors of C. chauvoei are neuraminidase, cytotoxin A (CctA) and flagellin, and CctA appears to be the main. This thesis aimed to evaluate the protective efficacy of commercial vaccines against the challenge with C. chauvoei, as well as to carry out the genomic comparison of the strains used in the vaccine challenge (manuscript 2). The molecular diversity, from the partial sequencing of the neuraminidase (nanA), CctA (cctA) and flagellin (fliC) genes of seventeen strains of C. chauvoei isolated from clinical cases in cattle was investigated (manuscript 3). It also aimed to the genomic comparison of six strains isolated from cases of blackleg in Brazil with a view to investigate molecular differences in the only strain with visceral clinical presentation (manuscript 4). Thus, to discuss the implications of molecular and antigenic characterization in the understanding of blackleg, and to support future research with the objective of improving disease control. We concluded that the similar performance observed between the strains in challenge in vivo and the inability to infect the vaccinated animals are correlated with the genetic homology of the strains, suggesting that vaccine failures are not related to antigenic variability. Partial sequencing of nanA and cctA genes showed high homology between strains. For this reason, these soluble antigens are good candidates for vaccine antigens. Moreover, three different fliC alleles were detected among the strains studied. In the genomic comparison, the six Brazilian strains were highly conserved, as observed in the partial sequencing of the genes and in the comparison of the strains used in the vaccine challenge. The results presented in this thesis may be indicative that at this evolutionary time C. chauvoei is not being challenged to develop mutations.

Induction of immune response in broiler chickens immunized with recombinant FliC and challenged by Salmonella Typhimurium / Indução de resposta imune em frangos de corte imunizados com FliC recombinante e desafiados por Salmonella Typhimurium

The study examined (1) the immune response in broiler chickens after oral immunization with recombinant flagellin (rFliC) from Salmonella Typhimurium conjugated with sodium alginate microparticles, and the immune response enhancement in association with recombinant cholera toxin B subunit protein (rCTB) and pool of Lactobacillus spp. (PL). The immune responses were evaluated by dosage of IgY serum and IgA from intestinal fluid and immunostaining of CD8+ T lymphocytes in the cecum. The immunized animals were challenged with Salmonella Typhimurium (ST) 21 days after treatment. In all immunized groups, a significant increase (p<0.05) was observed in IgA levels (μg/mL), especially three weeks after immunization. The serum IgY levels (μg/mL) were little affected by the treatments and differed significantly among groups only in the second post-immunization week (p<0.05). After the challenge, the number of CD8+ T cells differed significantly between the treatments and negative control. Retrieval of Salmonella Typhimurium was not detected at 48 hours after the challenge in T2 (rFliC+rCTb), T3 (rFliC+PL) and T4 (rFliC+rCTB PL). The rFliC administered orally with or without rCTB and Lactobacillus spp. produces significant induction of humoral immune response, and the immunized chickens were more effective in eliminating Salmonella after challenge. (AU)

Este estudo investigou a resposta imunitária de frangos de corte após a imunização oral com flagelina recombinante (rFliC) de Salmonella Typhimurium conjugada com micropartículas de alginato de sódio, e como intensificador de resposta imune foi associada a proteína subunidade B da toxina colérica (rCTB) e pool de Lactobacillus spp. (PL). As respostas imunes foram avaliadas por dosagem de IgY sérica e IgA do fluído intestinal e imunomarcação de linfócitos T CD8+ presentes no ceco. Os animais imunizados foram desafiados aos 21 dias após tratamento com Salmonella Typhimurium (ST). Foi observado em todos os grupos imunizados um aumento significativo (p<0,05) nos níveis de IgA (μg/mL) principalmente três semanas após as imunizações. Os níveis de IgY sérica (μg/mL) foram pouco influenciados pelos tratamentos, apenas na segunda semana após imunização observou-se diferenças significativas (p<0,05) entre os grupos. Observou-se que o número de linfócitos T CD8+ apresentou diferença significativa entre os tratamentos e o controle negativo após o desafio. Quanto a recuperação de Salmonella Typhimurium, observou-se que 48 horas após o desafio já não havia detecção do agente nos grupos T2 (rFliC+rCTb), T3 (rFliC+PL) e T4 (rFliC+rCTB+PL). Concluí-se que rFliC administrada, via oral, associada ou não a Lactobacillus spp e rCTB, demonstrou induzir significativamente a resposta imune humoral e que as aves imunizadas foram mais eficientes na eliminação de Salmonella após desafio. (AU)

Produção recombinante do padrão Molecular associado ao Patógeno Flagelina e do padrão Molecular associado ao Dano HSP70 Agonistas dos receptores de reconhecimento de padrões em Aves

A resposta imune aviária pode ser dividida em resposta imune inata e adquirida. A imunidade inata é a primeira linha de defesa contra patógenos microbianos e possui como um de seus componentes moleculares os receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Três famílias dos PRRs têm sido maior alvo de pesquisas nas aves: os receptores semelhantes ao Toll (TLR), receptores semelhantes ao NOD (NLR) e os receptores semelhante a RIG-1 (RLR). Estruturas denominadas Padrão Molecular Associado ao Patógeno (PAMP) e Padrão Molecular Associado ao Dano (DAMP) são reconhecidos por esses receptores, induzem respostas imunes inatas e podem modular a imunidade adquirida. O objetivo deste trabalho foi selecionar PAMPs e DAMPs agonistas de PRRS das aves,analisar in silico sequências genéticas do PAMP flagelina e DAMP HSP70 das aves, clonar e expressar de de forma recombinante esses agonistas. O modelo de clonagem e expressão utilizado para a geração do PAMP e DAMP alvos desta pesquisa, pET100-D/TOPO, clonados em E. coli TOP10 e expressos em E. coli C4 (DE3) e C43 (DE3) mostrou ser eficiente, e ambas as proteínas foram expressas e confirmadas por Western Blotting. Os resultados da caracterização in silico realizadas para as proteínas expressas justificaram a adoção do fragmento genético das sequências da flagelina e HSP70 devido a seleção de uma região de cada agonista que foi traduzida em uma proteína com características físico-químicas e imunológicas viáveis para sua adoção como imunobiógicos das aves. Os resultados obtidos nesta tese aumenta a possibilidade de obter novos ensaios in vitro e in vivo que visam analisar PAMPs e DAMPs recombinantes como estimulantes dos componentes do sistema imune inato das aves e desta forma atuarem como possíveis adjuvantes vacinais.

The immune responses of birds are carried out in coordination by the innate and acquired immune systems. The innate immunity is the first line of defense against microbial pathogens, and is structured with cells equipped with receptors for pattern recognition (PRR). Three families of PRR have been the subject of research in birds: Toll-like receptors (TLR), NOD-like receptors (NLR), and RIG-1-like receptors (RLR). Structures known as Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP), present in pathogens, and Damage Associated Molecular Standard (DAMP), present in the damaged tissue, are recognized by cells with these receptors, and induce innate immune responses which will modulate the acquired immunity. The objective of this work was to perform a review that addresses the intrinsic characteristics of the innate immune system of birds, pointing out the mechanisms of action of PRRs in avian species, and consider the perspective of studies aimed at improving the vaccine responses through the adoption of PAMPs and DAMPs as adjuvants. In addition, we aimed at selecting and analyzing in silico the genetic sequences of the flagellin (PAMP) and HSP70 (DAMP) from birds and to produce these PRR agonists through genetic engineering. The in silico expressed proteins characterization results justified the adoption of the genetic fragment of the fljB (flagellin encoding) and HSP70 gene sequences. The selected region was chosen considering the ideal physico-chemical and immunological characteristics of the translated segment and considering the immunogenicity to birds. The expression system pET100-D / TOPO was used for the generation of flagellin and HSP70 and subsequently cloned in E. coli TOP10. Using E. coli C4 (DE3) and C43 (DE3) for expression, the system showed to be efficient, enabling both proteins be correctly expressed and confirmed by western blotting. The results obtained indicate the possibility of using the recombinant proteins for the immunomodulation in birds. In vitro and In vivo studies are needed aiming at analyzing recombinant PAMPs and DAMPs as stimulants of the innate immune system of birds and their potential use as vaccine adjuvants

Avaliação do potencial imunogênico e vacinal das flagelinas de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni

A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por leptospiras patogênicas, que colonizam os túbulos renais de animais selvagens e domésticos. Vacinas comerciais estão sendo usadas, porém promovem proteção apenas contra os sorovares presentes na preparação e falham em induzir imunidade de longa duração. A porção carboxi-terminal da proteina immunoglobulin like A (LigAC) é capaz de induzir imunoproteção contra a leptospirose. No entanto, a imunização com a LigAC não confere imunidade esterilizante. Flagelinas têm sido consideradas adjuvante promissor para o desenvolvimento de vacinas. As leptospiras possuem dois flagelos periplasmáticos que são constituídos por duas classes de proteínas (FlaA e FlaB). Somente as proteínas FlaB apresentam homologia com as regiões importantes que ativam as respostas dependentes ao receptor Toll-like 5 (TLR-5). Neste estudo, avaliou-se a capacidade de indução da atividade do TLR5 das cinco flagelinas de L. interrogans sorovar Copenhageni (FlaB1, FlaB2, FlaB3, FlaB4 e FlaB5) e o potencial vacinal destas flagelinas na imunidade protetora de LigAC contra o desafio letal em hamsters. As flagelinas recombinantes foram expressas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade com níquel. Os hamsters foram imunizados por via subcutânea com as flagelinas purificadas e LigAC. Dados experimentais demonstram que todas as flagelinas foram capazes de ativar o receptor TLR5 e a secreção de citocinas em macrógafos estimulados de maneira similar. Nos ensaios de desafio, a maioria dos animais imunizados com as flagelinas e LigAC sobreviveram ao desafio letal entretanto, não foram protegidos contra a colonização renal. Os animais do grupo controle vacinados com PBS morreram com sintomas de leptospirose e hamsters imunizados com a vacina comercial sobreviveram após o desafio.

Leptospirosis is a zoonosis of global importance caused by pathogenic leptospires that colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Commercial vaccines are being used, but only to promote protection against the serovar in the preparation; they have failed to induce short-term immunity. The C-terminal portion of immunoglobulin-like protein A (LigAC) is able to induce immunoprotection against leptospirosis. However, immunization with LigAC did not confer sterilizing immunity. Flagellins have been considered a promising adjuvant for vaccine development. Leptospires have two periplasmic flagella that are formed by two classes of proteins (FlaA and FlaB); only FlaB proteins show homology with important regions that elicit TLR5-dependent responses. In the present study, we have evaluated their ability to induce the TLR5 activity and the protective activity of five L. interrogans sorovar Copenhageni flagellins (FlaB1, FlaB2, FlaB3, FlaB4 and FlaB5) in the protective immunity of LigAC against lethal challenge in hamsters. The recombinant flagellins expressed in E.coli were purified by nickel affinity chromatography. Hamsters were immunized subcutaneously with purified flagellins with LigAC. Experimental data showed that all flagellins activated both the TLR-5 receptor and the secretion of cytokines in stimulated macrofages, similarly. In challenge assays, the majority of hamsters immunized with the flagellins and LigAC survived the lethal challenge. However, they were not protected against kidney colonization. The control animals vaccinated with PBS died with symptoms of leptospirosis and hamsters vaccinated with commercial vaccine survived after challenge.

Investigação da microbiota gastroentérica e desenvolvimento de IgY para fins diagnósticos em ema (Rhea americana)

IgG anti-IgY de ema (Rhea americana) foi produzida em caprino e coelho para uso como imunoferramenta diagnóstica para a espécie. A IgY de ema se mostrou mais imunogênica para o caprino que para os coelhos. Foi observado por ELISA alta especificidade desses anticorpos para a espécie estudada, sendo o antiema produzido em coelhos mais específica para fins diagnósticos na espécie. IgY de gema de ovos de ema foi isolada por precipitação por sulfato de amônia a 29% e purificação em coluna de afinidade, pelo que foi possível observar as cadeias leves e pesada da imunoglublina com aproximadamente 30 kDa e 70 kDa, respectivamente. Proteína recombinante anti-flagelina de fase dois de Salmonella enterica sv. Enteritidis PT4 (recFljB) foi eficientemente obtida utilizando as construções plasmídeal pGEX-fljB em Escherichia coli DH5 e BL21(DE3) e utilizada para imunizar emas e galinhas. A IgY específica anti-recFljB foi obtida da gema de ovos dessas aves com alto rendimento (4,82 mg/mL para galinhas e 11,68 mg/mL para emas). IgY anti-recFljB obtidas de ovos de emas e galinhas diminuiu a capacidade de aderência e invasão das cepas S. Enteritidis PT4 e Salmonella entérica sv.Typhimurium em células CACO-2 e HT-29, respectivamente. IgY anti-recFljB de emas e galinhas também foi capaz de inibir o crescimento dessas bactéria em meio líquido (BHI 0,3M de NaCl). Foram isolados 203 microrganismos de 63 emas de cativeiro clinicamente saudáveis provenientes de três criatórios diferentes entre 2012 e 2014. Sendo 132 bactérias Gram-negativas, potencialmente patogênicas e resistentes fenotipicamente a antibióticos da microbiota oral e cloacal das emas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersínia spp., Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp.e Acinetobacter spp.). Por PCR identificou-se 11,6% de cepas de E. coli entropatogênicas (EPEC). Genes de resistência a antibióticos -lactâmicos foram identificados em E. coli (22,1% blaCTX-M, 26,7% de blaSHV e 14% blaTEM) e em Klebsiella spp. (100% de blaSHV e 14,3% blaTEM). Foram isoladas 71 bactérias Gram-positivas, potencialmente patogênicas, e com resistência a antimicrobianos, da microbiota oral e cloacal das emas: Staphylococcus spp. coagulase negativa (SCN), Enterococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., e Micrococcus spp. Por PCR identificou-se a presença do gene mecA em 44.4% dos SCN e das enterotoxinas SEA (66,7%) e SEB(8,3%) nas cepas SCN. A identificação da microbiota das emas pode auxiliar na prevenção de diferentes patologias, assim como fornecer dados para estudos da epidemiologia das bactérias. Os resultados deste estudo também podem ser utilizados para a criação de novas estratégias de profilaxia de doenças, como por exemplo, a utilização e imunoglobulinas aviárias específicas. Ainda foi discutido o fato das emas abrigarem bactérias resistentes a antibióticos e produtoras de enterotoxinas e, por isso, serem veículo de disseminação dessas linhagens de microrganismos. Nesse sentido, o presente estudo pode contribuir para o fornecimento de novas informações sobre a associação de microrganismos potencialmente patogênicos em Rhea americana, além de demonstrar a necessidade da realização de novas pesquisas focadas nas diferentes temáticas levantadas e no monitoramento de microrganismos em aves silvestres e de cativeiro.

IgG anti-IgY from greater rhea (Rhea americana) was produced in goat and rabbit, for use as a immunodiagnostic tool for the specie, and greater rhea's IgY was more immunogenic for the goat than for rabbits. ELISA assays show high specificity of these antibodies for this species, and the anti-greater rhea produced in rabbits were more specific for diagnostic purposes in the species. IgY greater rhea egg yolk was isolated by precipitation by ammonium sulfate at 29% and purification was performed by affinity column where it was possible to observe light and heavy chains of immunoglobulin approximately 30 kDa and 70 kDa, respectively. Recombinant Protein anti-flagellin of phase two of Salmonella enterica sv.Enteritidis PT4 (recFljB) was efficiently obtained using the constructions plasmideal pGEX-fljB in E. coli DH5 and BL21 (DE3) and used to immunize rheas and hens and a IgY specific anti-recFljB was obtained from egg yolk of these birds with high yield (4.82 mg/mL for hens and 11.68 mg/mL for rheas). IgYanti-recFljB obtained from eggs of rheas and hens decreased the adhesion and invasion of the strains S. enteritidis PT4 and Salmonella enterica sv.Typhimurium in CACO-2 and HT-29 cells, respectively. IgYanti-recFljB from rheas and hens was also able to inhibit the growth of these bacteria in liquid medium (BHI 0.3M NaCl). 203 microorganisms were isolated from 63 clinically healthy rheas kept in captivity from three different CEMAS, between 2012 and 2014. 132 bacteria were Gram-negative, potentially pathogenic and phenotypically resistant to antibiotics, from oral and cloacal microbiota of rheas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersinia spp. , Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp.). 11.6% of strains of enteropathogenic. E. coli (EPEC) was identified by PCR. Beta lactam antibiotic resistance genes were identified in E. coli (22.1% blaCTX-M, 26.7% of blaSHV and 14% blaTEM) and Klebsiella spp. (100% of blaSHV and 14.3% blaTEM). 71 Gram-positive bacteria were isolated from the oral and cloacal microbiota of rheas, all of them potentially pathogenic and with resistance to antimicrobials: coagulase negative Staphylococcus (CNS), Enterococcus spp. , Streptococcus spp. , Corynebacterium spp. , and Micrococcus spp. The presence of the mecA gene was confirmed by PCR in 44.4 % of CNS and enterotoxins SEA (66.7 %) and SEB (8.3 %) were confirmed in CNS strains. The identification of the microbiota of rheas can help in the prevention of various diseases, as well as provide data for epidemiological studies of bacteria. The results of this study may also be used for the creation of new strategies for prophylaxis diseases, such as the use and avian specific immunoglobulins. The fact that greater rheas may shelter antibiotic-resistant and enterotoxin producing bacteria has also been discussed and therefore they would act as a dissemination vehicle of these strains of microorganisms. In this sense, the present study may contribute to the provision of new information on the association of potentially pathogenic microorganisms in Rhea americana, as well as to demonstrate the need for further research focused on different themes raised and monitoring microrganisms in wild birds and in captivity.

Clonal study of avian Escherichia coli strains by fliC conserved-DNA-sequence regions analysis / Estudo clonal de Escherichia coli aviário por análise de seqüências de DNA conservadas do gene fliC

The clonal relationship among avian Escherichia coli strains and their genetic proximity with human pathogenic E. coli, Salmonela enterica, Yersinia enterocolitica and Proteus mirabilis, was determined by the DNA sequencing of the conserved 5' and 3'regions fliC gene (flagellin encoded gene). Among 30 commensal avian E. coli strains and 49 pathogenic avian E. coli strains (APEC), 24 commensal and 39 APEC strains harbored fliC gene with fragments size varying from 670bp to 1,900bp. The comparative analysis of these regions allowed the construction of a dendrogram of similarity possessing two main clusters: one compounded mainly by APEC strains and by H-antigens from human E. coli, and another one compounded by commensal avian E. coli strains, S. enterica, and by other H-antigens from human E. coli. Overall, this work demonstrated that fliC conserved regions may be associated with pathogenic clones of APEC strains, and also shows a great similarity among APEC and H-antigens of E. coli strains isolated from humans. These data, can add evidence that APEC strains can exhibit a zoonotic risk.(AU)

A relação clonal entre linhagens de Escherichia coli de origem aviária e sua proximidade genética com E. coli patogênica para humanos, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica e Proteus mirabilis foi determinada através da utilização das seqüências conservadas 5' e 3' do gene fliC (responsável pela codificação da flagelina). Entre as 30 linhagens comensais de E. coli aviária e as 49 linhagens patogênicas de E. coli para aves (APEC), 24 linhagens comensais e 39 APEC apresentaram o gene fliC, que foi encontrado em tamanhos que variam de 670pb a 1900pb. Um dendrograma representando similaridade genética foi obtido a partir do seqüenciamento das regiões 5' e 3' conservadas do gene fliC das linhagens de E. coli de origem aviária, das seqüências dos antígenos H de E. coli de origem humana, de S. enterica, Y. enterocolitica e de P. mirabilis. A análise do dendrograma demonstrou que este apresenta dois grupos principais: um composto principalmente por isolados APEC e por antígenos H de E. coli de origem humana e outro formado por isolados comensais de E. coli aviária, S. enterica e por antígenos H de E. coli. No geral, o presente trabalho demonstrou que as regiões conservadas do gene fliC podem estar associadas à diferenciação clonal de linhagens de E. coli aviária, e que existe uma grande similaridade genética entre estas linhagens e antígenos H de E. coli humana. Estes dados podem adicionar evidências de que linhagens APEC podem apresentar riscos zoonóticos.(AU)

Cytotoxic T cell adjuvant effects of three Salmonella enterica flagellins

Bacterial flagellins are important virulence-associated factors and strong inducers of inflammatory responses in mammalian hosts. Flagellins have also been investigated as potential vaccine adjuvants, either for induction of humoral or cellular immune responses, to different target antigens. In this study we investigated the adjuvant properties of three Salmonella enterica flagellins types (FliCd, FliCi and FljB) to an ovalbumin-derived CD8+ T cell-restricted epitope (OVA257264). Although mice immunized with the three tested flagellins elicited antigen-specific activated CD8+ T cells, only animals immunized with FliCi and FliCd flagellins admixed with ovalbumin mounted specific in vivo cytotoxic responses to peptide-pulsed target cells. The present results indicate that Salmonella flagellins are endowed with type-specific adjuvant effects toward murine CD8+ T cells, a feature that may impact their use as adjuvants for prophylatic or therapeutic vaccines.

As flagelinas bacterianas são importantes fatores associados à virulência e potentes indutores de resposta inflamatória em mamíferos. Estas moléculas são também investigadas como potencial adjuvante para uso em vacinas na indução de resposta imune humoral e celular para diferentes antígenos alvo. No presente estudo investigamos as propriedades adjuvantes de três tipos de flagelinas de Salmonella enterica (FliCd, FliCi e FljB) para um epítopo derivado da ovalbumina específico para células T CD8+. As três flagelinas testadas induziram respostas de células T CD8+ específicas em camundongos imunizados, porém, somente animais imunizados com as flagelinas FliCi e FliCd co-administradas com ovalbumina montaram resposta citotóxica específica in vivo para células-alvo pulsadas com peptídeo OVA. Os resultados apresentados indicam que flagelinas de Salmonella são dotadas de efeitos adjuvantes tipo-específico frente a células T CD8+ in vivo, uma característica que pode gerar impactos no uso dessas proteínas como adjuvantes em vacinas profiláticas ou terapêuticas.

PCR multiplex para identificação de isolados de Clostridium chauvoei e Clostridium septicum / Multiplex PCR for identification of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum

Padronizou-se uma técnica de reação em cadeia da polimerase múltipla (PCR multiplex) para detecção de Clostridium chauvoei e Clostridium septicum em culturas puras. Foram utilizados pares de iniciadores para segmentos específicos dos genes que codificam a flagelina de C. chauvoei e a toxina alfa de C. septicum. Para avaliaçã o da PCR multiplex, foram testados 16 isolados clínicos de C. chauvoei e 15 isolados de C. septicum provenientes de ruminantes, quatro sementes vacinais de cada um desses agentes. Amostras de referência de ambos os microrganismos foram usadas como controle. Para avaliar a especificidade, DNAs genômicos dos seguintes microrganismos foram usados: C. sordellii, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B, C. perfringens tipo A, C. haemolyticum, C. botulinum tipo D, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli e Salmonella typhimurium. Todos os isolados e sementes vacinais de C. chauvoei e C. septicum foram detectados pela técnica. Não foram observadas reações cruzadas com as outras espécies de clostrídios, outras espécies bacterianas ou entre C. Chauvoei e C. septicum. As menores concentrações de DNA de C. chauvoei e C. septicum detectadas foram 45pg/µl e 30pg/µl, respectivamente. A PCR multiplex pode ser utilizada para a identificação específica de C. chauvoei e C. septicum em culturas puras.(AU)

Multiplex PCR was optimized to detect Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in pure cultures. In each reaction, a pair of primers for a specific segment of the flagellin gene of C. chauvoei and a pair of primers for a specific segment of alpha toxin gene of C. septicum were employed. Reference strains of both microorganisms were used as control. The multiplex PCR was evaluated by testing 16 clinical isolates of C. chauvoei from ruminants, 15 clinical isolates of C. septicum from ruminants and, four vaccine strains of each one of these agents. Reference strains of both microorganisms were used as control. To evaluate the specificity, genomic DNA of the following microorganisms was used: C. sordellii, C. novyi type A, C. novyi type B, C. perfringens type A, C. haemolyticum, C. botulinum type D, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, and Salmonella typhimurium. All the isolates and vaccine strains of C. chauvoei and C. septicum were positive by PCR assay and cross reactions were not observed with the other species of clostridia, the other bacterial species or amongst both investigated agents. The smallest concentrations of DNA detected from C. chauvoei and C. septicum were 45pg/µl and 30pg/µl, respectively. The multiplex PCR was useful for the specific identification of C. chauvoei and C. septicum in pure cultures.(AU)

Clonal study of avian Escherichia coli strains by fliC conserved-DNA-sequence regions analysis / Estudo clonal de Escherichia coli aviário por análise de seqüências de DNA conservadas do gene fliC

The clonal relationship among avian Escherichia coli strains and their genetic proximity with human pathogenic E. coli, Salmonela enterica, Yersinia enterocolitica and Proteus mirabilis, was determined by the DNA sequencing of the conserved 5' and 3'regions fliC gene (flagellin encoded gene). Among 30 commensal avian E. coli strains and 49 pathogenic avian E. coli strains (APEC), 24 commensal and 39 APEC strains harbored fliC gene with fragments size varying from 670bp to 1,900bp. The comparative analysis of these regions allowed the construction of a dendrogram of similarity possessing two main clusters: one compounded mainly by APEC strains and by H-antigens from human E. coli, and another one compounded by commensal avian E. coli strains, S. enterica, and by other H-antigens from human E. coli. Overall, this work demonstrated that fliC conserved regions may be associated with pathogenic clones of APEC strains, and also shows a great similarity among APEC and H-antigens of E. coli strains isolated from humans. These data, can add evidence that APEC strains can exhibit a zoonotic risk.(AU)

A relação clonal entre linhagens de Escherichia coli de origem aviária e sua proximidade genética com E. coli patogênica para humanos, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica e Proteus mirabilis foi determinada através da utilização das seqüências conservadas 5' e 3' do gene fliC (responsável pela codificação da flagelina). Entre as 30 linhagens comensais de E. coli aviária e as 49 linhagens patogênicas de E. coli para aves (APEC), 24 linhagens comensais e 39 APEC apresentaram o gene fliC, que foi encontrado em tamanhos que variam de 670pb a 1900pb. Um dendrograma representando similaridade genética foi obtido a partir do seqüenciamento das regiões 5' e 3' conservadas do gene fliC das linhagens de E. coli de origem aviária, das seqüências dos antígenos H de E. coli de origem humana, de S. enterica, Y. enterocolitica e de P. mirabilis. A análise do dendrograma demonstrou que este apresenta dois grupos principais: um composto principalmente por isolados APEC e por antígenos H de E. coli de origem humana e outro formado por isolados comensais de E. coli aviária, S. enterica e por antígenos H de E. coli. No geral, o presente trabalho demonstrou que as regiões conservadas do gene fliC podem estar associadas à diferenciação clonal de linhagens de E. coli aviária, e que existe uma grande similaridade genética entre estas linhagens e antígenos H de E. coli humana. Estes dados podem adicionar evidências de que linhagens APEC podem apresentar riscos zoonóticos.(AU)

Molecular subtyping of Campylobacter jejuni subsp. jejuni strains isolated from different animal species in the state of São Paulo, Brazil

The objective of the present trial was to characterize genetically strains of Campylobacter jejuni subsp. jejuni isolated from humans and several animal sources (bovines, swine, dogs, primates, wild boars and poultry). A total of 828 different animal samples (feces, carcass, aborted fetus and hysterectomized uterus) were analysed by means of routine bacteriological methods, and 36 C. jejuni strains were isolated. Thirty strains of human fecal origin were obtained in clinical analysis laboratories in the city of São Paulo. The 66 C. jejuni strains isolated were submitted to genetic characterization. Primers based on fla A gene were used in a polymerase chain reaction (PCR) and amplified a fragment of the 702 bp. PCR products were evaluated by means of sequencing and genealogic analysis. Genetic variability analysis of 66 strains showed 44 different subtypes of C. jejuni. One subtype was identical to a C. jejuni strain of human origin with the sequence in the GenBank (GENBANK accession number AF050186). Subtyping analysis of C. jejuni strains based on sequencing of the fla A gene variable region and analysis of sequence alignment by the Maximum Parsimony method showed to be highly discriminatory, providing the best conditions to differentiate strains involved in outbreaks from those sporadically isolated. This is the first study of molecular subtyping analysis of human and animal C. jejuni strains using sequencing technique and genealogic analysis in the state of São Paulo, Brazil.

O objetivo do presente trabalho foi caracterizar geneticamente estirpes de Campylobacter jejuni subsp. jejuni isoladas de humanos e de diferentes origens animais (bovinas, suínas, cães, primatas, javalis, suínos e aves de corte). Um total de 828 amostras (fezes, carcaças, fetos abortados e útero histerectomizado) foram analisadas por métodos de rotina bacteriológica e 36 estirpes de C. jejuni foram isoladas. Trinta estirpes de origem fecal humana foram obtidas de laboratórios de análises clínicas da cidade de São Paulo. As 66 estirpes de C. jejuni isoladas foram submetidas à caracterização genética. Oligonucleotídeos baseados no gene fla A foram usados na reação de polimerase em cadeia (PCR) e amplificou um fragmento de 702 pb. Os produtos obtidos pela PCR foram avaliados pelas técnicas de seqüenciamento e análise genealógica. Análise da variabilidade genética das 66 estirpes revelou 44 diferentes subtipos de C. jejuni. Um subtipo de origem humana apresentou seqüência idêntica à de C. jejuni depositada no GenBank (GENBANK acesso número AF050186). A subtipagem das estirpes de C. jejuni baseadas no seqüenciamento da região variável do gene fla A e na análise do alinhamento das seqüências pelo método da Máxima Parcimônia, mostraram-se altamente discriminatórios fornecendo melhores condições para a correta diferenciação entre estirpes originárias de surto e as isoladas esporadicamente. Este foi o primeiro estudo de subtipagem molecular de estirpes de C. jejuni de origem humana e animal utilizando a técnica do seqüenciamento com análise genealógica realizado no Estado de São Paulo, Brasil.