Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.(AU)

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.(AU)

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.

Phospholipid composition and resistance to vitrification of in vivo blastocyst of a Brazilian naturalized porcine breed / Composição de fosfolipídios e resistência à vitrificação de blastocistos produzidos in vivo de uma raça de suíno naturalizada brasileira

Piau porcine blastocysts were submitted to MALDI-TOF to identify the main phospholipids (PL). After that, in vivo blastocysts (D6) were vitrified (n=52), non-vitrified were used as control (n=42). After warming, blastocysts were in vitro cultured to assess re-expansion and hatching at 24 and 48 hours. Finally, at 48 hours, hatched blastocysts were submitted to RT-qPCR searching for BCL2A1, BAK, BAX and CASP3 genes. For MALDI-TOF, the ion intensity was expressed in arbitrary units. Blastocyst development was compared by Qui-square (P< 0.05). Among the most representative PL was the phosphatidylcholine [PC (32:0) + H]+; [PC (34:1) + H]+ and [PC (36:4) + H]+. Beyond the PL, MALDI revealed some triglycerides (TG), including PPL (50:2) + Na+, PPO (50:1) + Na+, PLO (52:3) + Na+ and POO (52:2) + Na. Re-expansion did not differ (P> 0.05) between fresh or vitrified blastocysts at 24 (33.3%; 32.7%) or 48 hours (2.4%; 13.5%). Hatching rates were higher (P< 0.05) for fresh compared to vitrified at 24 (66.7%; 15.4%) and 48 hours (97.6%; 36.0%). BAX was overexpressed (P< 0.05) after vitrification. In conclusion, Piau blastocysts can be cryopreserved by Cryotop. This study also demonstrated that the apoptotic pathway may be responsible for the low efficiency of porcine embryo cryopreservation.(AU)

Blastocistos de suínos foram submetidos ao MALDI-TOF para se identificarem os principais fosfolipídios (PL). Depois, parte destes embriões (D6) foram vitrificados (n=52), ou permaneceram frescos (grupo controle, n=42). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados in vitro para se avaliar a reexpansão e a eclosão (BE) às 24 e 48 horas. Finalmente, às 48 horas, os BE foram submetidos ao RT-qPCR em busca dos genes BCL2A1, BAK, BAX e CASP3. No MALDI-TOF, a intensidade do íon foi expressa em unidades arbitrárias. O desenvolvimento embrionário foi comparado por qui-quadrado (P<0,05). Entre os PL mais representativos estavam as fosfatidilcolinas [PC (32: 0) + H] +; [PC (34: 1) + H] + e [PC (36: 4) + H] +. Além do PL, o MALDI revelou alguns triglicerídeos (TG), incluindo PPL (50: 2) + Na +, PPO (50: 1) + Na +, PLO (52: 3) + Na + e POO (52: 2) + Na. A reexpansão não diferiu (P>0,05) entre blastocistos frescos ou vitrificados às 24 (33,3%, 32,7%) e 48 horas (2,4%, 13,5%). As taxas de eclosão foram maiores (P<0,05) para o grupo fresco comparado ao vitrificado às 24 (66,7% x 15,4%) e 48 horas (97,6% x 36,0%). O BAX estava mais expresso (P<0,05) após a vitrificação. Concluindo, os blastocistos Piau podem ser criopreservados por Cryotop. Este estudo também demonstrou que a via apoptótica pode ser responsável pela baixa eficiência da criopreservação de embriões suínos.(AU)

Phospholipid composition and resistance to vitrification of in vivo blastocyst of a Brazilian naturalized porcine breed / Composição de fosfolipídios e resistência à vitrificação de blastocistos produzidos in vivo de uma raça de suíno naturalizada brasileira

Piau porcine blastocysts were submitted to MALDI-TOF to identify the main phospholipids (PL). After that, in vivo blastocysts (D6) were vitrified (n=52), non-vitrified were used as control (n=42). After warming, blastocysts were in vitro cultured to assess re-expansion and hatching at 24 and 48 hours. Finally, at 48 hours, hatched blastocysts were submitted to RT-qPCR searching for BCL2A1, BAK, BAX and CASP3 genes. For MALDI-TOF, the ion intensity was expressed in arbitrary units. Blastocyst development was compared by Qui-square (P< 0.05). Among the most representative PL was the phosphatidylcholine [PC (32:0) + H]+; [PC (34:1) + H]+ and [PC (36:4) + H]+. Beyond the PL, MALDI revealed some triglycerides (TG), including PPL (50:2) + Na+, PPO (50:1) + Na+, PLO (52:3) + Na+ and POO (52:2) + Na. Re-expansion did not differ (P> 0.05) between fresh or vitrified blastocysts at 24 (33.3%; 32.7%) or 48 hours (2.4%; 13.5%). Hatching rates were higher (P< 0.05) for fresh compared to vitrified at 24 (66.7%; 15.4%) and 48 hours (97.6%; 36.0%). BAX was overexpressed (P< 0.05) after vitrification. In conclusion, Piau blastocysts can be cryopreserved by Cryotop. This study also demonstrated that the apoptotic pathway may be responsible for the low efficiency of porcine embryo cryopreservation.(AU)

Blastocistos de suínos foram submetidos ao MALDI-TOF para se identificarem os principais fosfolipídios (PL). Depois, parte destes embriões (D6) foram vitrificados (n=52), ou permaneceram frescos (grupo controle, n=42). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados in vitro para se avaliar a reexpansão e a eclosão (BE) às 24 e 48 horas. Finalmente, às 48 horas, os BE foram submetidos ao RT-qPCR em busca dos genes BCL2A1, BAK, BAX e CASP3. No MALDI-TOF, a intensidade do íon foi expressa em unidades arbitrárias. O desenvolvimento embrionário foi comparado por qui-quadrado (P<0,05). Entre os PL mais representativos estavam as fosfatidilcolinas [PC (32: 0) + H] +; [PC (34: 1) + H] + e [PC (36: 4) + H] +. Além do PL, o MALDI revelou alguns triglicerídeos (TG), incluindo PPL (50: 2) + Na +, PPO (50: 1) + Na +, PLO (52: 3) + Na + e POO (52: 2) + Na. A reexpansão não diferiu (P>0,05) entre blastocistos frescos ou vitrificados às 24 (33,3%, 32,7%) e 48 horas (2,4%, 13,5%). As taxas de eclosão foram maiores (P<0,05) para o grupo fresco comparado ao vitrificado às 24 (66,7% x 15,4%) e 48 horas (97,6% x 36,0%). O BAX estava mais expresso (P<0,05) após a vitrificação. Concluindo, os blastocistos Piau podem ser criopreservados por Cryotop. Este estudo também demonstrou que a via apoptótica pode ser responsável pela baixa eficiência da criopreservação de embriões suínos.(AU)

Cooking ways on composition of intramuscular phospholipid fatty acids of inra rabbit / Influência do cozimento na composição de ácidos graxos fosfolipídos intramusculares do coelho inra

The effect of boiling, microwaving and aluminium (Al) foil-baking on composition of intramuscular phospholipid fatty acids of Inra rabbit was evaluated. Results showed that, the proportion of polyunsaturated fatty acids (PUFA)(e.g. C18:2n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:5n-3 and C22:6n-3) and monounsaturated fatty acids (MUFA)(e.g. C18:1n-7 and C18:1n-9) of treated longissimus dorsi muscle (LD) decreased, whilst the proportion of saturated (SFA)(e.g. C16:0 and C18:0) and n-6/n-3 value increased during cooking. Among the three treatments, microwaving can do better to stop the unsaturated fatty acids (UFA) being destroyed than boiling and Al foil-baking. However, boiling treatment did more serious damage to PUFA portion. Even so, the n-6/n-3 values of all of the cooked LD were within the recommended range. By analysis of partial least squares regression (PLSR), the microwaving treatment was more suitable in reserving UFA of intramuscular phospholipids from inra rabbit.(AU)

Avaliou-se o efeito do cozimento da fervura, emprego de microondas e de preparo da carne envolvida em alumínio (Al) de três formas de cocção na composição de ácidos graxos fosfolipídicos intramusculares de coelho Inra. Os resultados mostraram que, a proporção de ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) (por exemplo, C18: 2n-6, C20: 4n-6, C20: 5n-3, C22: 5n-3 e C22: 6n-3) e ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) (por exemplo, C18: 1n-7 e C18: 1n-9) de longissimus dorsimuscle (LD) tratado, diminuem, enquanto a proporção de saturado (SFA) (por exemplo, C16: 0 e C18: 0) e n-6 / n -3 valor aumentado durante o cozimento. Entre os três tratamentos, o micro-ondas parace ser o melhor por impedir a destruição dos ácidos graxos insaturados (UFA) do que a fervura e o cozimento em folha Al. No entanto, o tratamento de ebulição causou danos mais sérios à porção de PUFA. Mesmo assim, o valor n-6 / n-3 de todas as amostras de LD cozidas estava dentro da faixa recomendada. Por análise de regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR), o tratamento com microondas foi mais adequado para preservar UFA de fosfolipídios intramusculares de Inra coelho.(AU)

Change in energy metabolism of in vitro produced embryos: an alternative to make them more cryoresistant? / Alteração no metabolismo energético de embriões produzidos in vitro: uma alternativa para torná-los mais criotolerantes?

For the development of in vitro produced (IVP) as well as in vivo produced bovine embryos, it is extremely important that their energy metabolism works properly because the embryo must be able to metabolize energy substrates that are necessary for producing energy. Lipids play an important role in early embryonic development, acting as source of energy for oocytes and embryos. However, it is known that oocytes and embryos, mainly IVP, accumulate large amounts of lipids in the cytoplasm. Although they are extremely important in embryonic development, lipids have been associated with the reduced survival of bovine embryos following cryopreservation. There is evidence that at least four different categories of lipids affect embryo survival after cryopreservation, including triglycerides (TAG), free fatty acids, cholesterol and phospholipids. Thus, many studies are being conducted to improve the resistance of IVP embryos to the cryopreservation process by reducing the concentration or removing the source of serum from the medium or by reducing oocyte/embryo lipids using mechanical or chemical means. Regarding the use of delipidating agents that reduce the uptake and synthesis of fatty acids (FA) by cells, substances such as phenazine ethosulfate (PES), forskolin, L-carnitine and isomers of conjugated linoleic acid (CLA) have been utilized. This review aims to address important issues related to embryonic energy metabolism, the importance of lipid metabolism and its relation tothe cryopreservation of IVP bovine embryos by summarizing the latest research in this field.(AU)

Para o desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) e in vivo, é extremamente importante que o metabolismo energético funcione de maneira adequada, pois o embrião precisa ser capaz de metabolizar os substratos energéticos necessários para a produção de energia. Os lipídios desempenham papel importante no desenvolvimento embrionário inicial, atuando como fonte de energia para oócitos e embriões. Entretanto, sabe-se que oócitos e embriões bovinos, principalmente os PIV, acumulam grande quantidade de lipídios no citoplasma. Apesar de serem extremamente importantes no desenvolvimento embrionário, os lipídios têm sido associados com a reduzida sobrevivência após a criopreservação de embriões bovinos. Existem evidências de que pelo menos quatro classes de lipídios afetam a sobrevivência embrionária pós-criopreservação, sendo os triglicerídeos (TAG), ácidos graxos livres, colesterol e os fosfolipídios. Sendo assim, vários estudos estão sendo realizados com o intuito de melhorar a resistência dos embriões PIV ao processo de criopreservação, realizando a redução ou retirada do soro do meio ou a redução mecânica ou química de lipídios. Com relação ao uso de agentes delipidantes que diminuam a captação e síntese de ácidos graxos (AG) pelas células, substâncias como fenazina etossulfato (PES), forskolin, L-carnitina e isômeros do ácido linoleico conjugado (CLA) tem sido utilizadas. O objetivo desta revisão foi abordar aspectos importantes relacionados ao metabolismoenergético embrionário, a importância dos lipídios no metabolismo e sua relação com a criopreservaçãode embriões bovinos PIV sumarizando os estudos mais recentes nessa área.(AU)

ETOSSULFATO DE FENAZINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS DE BOVINOS

O objetivo foi avaliar diferentes doses do etossulfato de fenazina (PES) durante a maturação in vitro de oócitos bovinos e suas consequências até o descongelamento nos embriões vitrificados. As concentrações 0; 0,16; 0,4 e 1,0 M foram avaliadas sobre as taxas de produção de embriões, de eclosão e de expansão, conteúdo lipídico e características morfológicas. Oócitos de frigorífico (n=2.232) foram maturados durante 24 horas, parte foi submetido a análise de fluorescência, os demais foram cultivados até D7, destes os embriões grau I foram vitrificados, posteriormente aquecidos e cultivados por 48 horas. Um mínimo de 550 CCOs por tratamento foram maturados em 13 réplicas resultando em 400 embriões vitrificados. Os dados foram analisados pelo pacote estatístico SAS®. A taxa de embriões produzidos para o Controle (C=41,5 ± 1,8, n=237) foi maior (P <0,01) em relação ao PES0,16 (32,5 ±1,7, n=182) e PES1 (32,6 ±1,7, n=186), mas não diferiu do PES0,4 (35,6 ±1,7% n=210). Os grupos tratados não diferiram entre si. A taxa de eclosão (P =0,10) tendeu a ser maior para o PES1 (34,3 ±5,6, n=32) e o PES0,4 (32,4 ±5,6, n=38) em relação ao Controle (27,2 ± 5,7, n=13) e PES0,16 (22,4 ±5,8, n=17). A taxa de expansão ao fim de 48 horas de cultivo foi igual (P <0,05) para o Controle (27,1± 5,2, n=20), PES0,16 (24,3 ± 5,6, n=20) e PES1 (10,3 ± 2,0, n=12). Sendo que os grupos PES0,4 (17,7 ± 3,5, n=10) e PES1 não diferiram entre si. Maior proporção de oócitos do PES1 (P <0,01) atingiram estágios avançados de meiose (>90%) do que o Controle (50%). Não houve efeito de tratamento sobre a quantidade de células apoptóticas ou da MCI. No D9 houve aumento de células apoptóticas (P <0,01) e redução do número de células totais (P <0,01) e da MCI (P <0,01) nos blastocistos. A concentração de lipídios (triglicerídeos, fosfolipídios e colesterol) nos oócitos foi menor (P <0,01) nos grupos tratados em relação ao Controle. Os triglicerídeos do PES1 e PES0,4 não diferiram do Controle durante o cultivo; no PES0,16 foram maiores (P=0,01) do que o Controle. As concentrações de fosfolipídios e colesterol do PES0,4 e PES0,16 foram maiores (P <0,01) do que no Controle e PES1. Os blastocistos que sobreviveram e eclodiram após 48 horas do descongelamento foram 77% do PES0,4, 72% do PES1, contra 44% para o PES0,16 e 25% para o Controle indicando que houve efeito positivo do tratamento. A concentração de lipídeos foi diminuída pelo PES nos oócitos, mas aparentemente houve um efeito compensatório na fase de cultivo, portanto o PES usado somente durante a MIV pode levar a aumento de lipídeos nos embriões.

The objective was to evaluate different doses of phenazine ethosulfate (PES) during in vitro maturation of bovine oocytes and their consequences until thawing in vitrified embryos. The concentrations 0; 0.16; 0.4 and 1.0 M were evaluated on embryo production, hatching and expansion rates, lipid content and morphological characteristics. Refrigerator oocytes (n = 2,232) were matured for 24 hours, part was subjected to fluorescence analysis, the others were cultured to D7, of which the grade I embryos were vitrified, then heated and cultured for 48 hours. A minimum of 550 CCOs per treatment were matured in 13 replicates resulting in 400 vitrified embryos. Data were analyzed by SAS® statistical package. The rate of embryos produced for the Control (C = 41.5 ± 1.8, n = 237) was higher (P <0.01) compared to PES0.16 (32.5 ± 1.7, n = 182). ) and PES1 (32.6 ± 1.7, n = 186), but did not differ from PES0.4 (35.6 ± 1.7% n = 210). The treated groups did not differ from each other. The hatching rate (P = 0.10) tended to be higher for PES1 (34.3 ± 5.6, n = 32) and PES0.4 (32.4 ± 5.6, n = 38) in Control (27.2 ± 5.7, n = 13) and PES0.16 (22.4 ± 5.8, n = 17). The expansion rate after 48 hours of cultivation was the same (P <0.05) for the Control (27.1 ± 5.2, n = 20), PES0.16 (24.3 ± 5.6, n = 20) and PES1 (10.3 ± 2.0, n = 12). The groups PES0,4 (17,7 ± 3,5, n = 10) and PES1 did not differ from each other. Higher proportion of PES1 oocytes (P <0.01) reached advanced meiosis stages (> 90%) than Control (50%). There was no treatment effect on the amount of apoptotic cells or MCI. In D9 there was an increase in apoptotic cells (P <0.01) and a reduction in the number of total cells (P <0.01) and MCI (P <0.01) in blastocysts. Lipid concentration (triglycerides, phospholipids and cholesterol) in oocytes was lower (P <0.01) in treated groups compared to Control. PES1 and PES0.4 triglycerides did not differ from Control during cultivation; in PES0.16 were higher (P = 0.01) than Control. The phospholipid and cholesterol concentrations of PES0.4 and PES0.16 were higher (P <0.01) than in Control and PES1. Blastocysts that survived and hatched 48 hours after thawing were 77% of PES0.4, 72% of PES1, versus 44% of PES0.16 and 25% of Control indicating a positive treatment effect. Lipid concentration was decreased by PES in oocytes, but apparently there was a compensatory effect in the culture phase, so PES used only during IVM may lead to lipid increase in embryos.

Utilização da Fosfoetanolamina Sintética (FO-S) no sarcoma de aplicação felino estudo clínico-cirúrgico, histopatológico, imuno- histoquímico, tomográfico e termográfico.

Sarcoma de aplicação felino (SAF) é uma neoplasia cutânea mesenquimal que surge em locais de aplicação de vacina, medicamentos ou traumas frequentes, cujo tratamento se baseia nos princípios da cirurgia oncológica, ou seja, excisão com amplas margens, associada à radioterapia e/ou quimioterapia. Entretanto, pelo seu caráter maligno e infiltrativo, os índices de recidiva são altos e as terapias, com baixas taxas de sucesso. O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do agente antitumoral Fosfoetanolamina Sintética (FO-S) como terapia neoadjuvante e adjuvante, a partir das características clínicas, termográficas, tomográficas, histológicas e imuno-histoquímicas dos SAF. Vinte e um felinos foram incluídos no estudo, com idade média de 9,1 anos, peso médio de 4,8kg, sendo 76% fêmeas e 76% sem raça definida. Sete já haviam sido submetidos à cirurgia prévia para remoção do SAF, com recidiva em média 6,8 meses depois. A aplicação de FO-S foi realizada por via endovenosa, na dose de 70mg/kg, semanalmente, por quatro sessões, iniciando-se imediatamente após a cirurgia (G1 = 11 animais) ou quatro sessões pré e quatro pós procedimento cirúrgico (G2 = 10 animais). A maioria dos tumores se classificou como fibrossarcoma, sendo 57% grau II, 33% grau III e 10% grau I. As imagens termográficas obtidas por câmera infravermelha não detectaram diferença estatisticamente significante nas temperaturas da área tumoral com relação à área saudável ao redor, nem entre as temperaturas do tumor antes e após o ciclo de aplicação da FO-S, nos animais do G2. A tomografia computadorizada mostrou diferença significativa na mensuração dorsoventral das lesões, quando comparada ao uso do paquímetro, porém o aspecto e tamanho dos tumores permaneceram inalterados depois do tratamento com FO-S. O mesmo pode ser observado na análise imuno-histoquímica, que não detectou diferença na expressão de Ki-67 e caspase-3 nos tumores do G1, quando comparados àqueles submetidos a FO-S, no G2. Durante o período de acompanhamento de 18 meses, a sobrevida média foi de 9 meses, a taxa de recidiva foi de 24% e o intervalo livre de doença local foi, em média, 9 meses. Sem efeitos adversos importantes, a FO-S se mostrou segura à utilização em felinos, porém não alterou o tempo médio de intervalo livre de doença nem a sobrevida dos animais, quando comparada ao grupo controle. A inclusão de mais pacientes e maior tempo de observação se fazem necessários para avaliar a eficácia do agente no tratamento do SAF.

Feline injection-site sarcoma (FISS) is a mesenchymal neoplasm that can develop within the skin at sites of previous application of vaccine, medications or frequent traumas, whose treatment is based on the principles of oncologic surgery, i.e., excision with wide margins, associated with radiotherapy and/or chemotherapy. However, due to its malignant and infiltrative character, the rates of recurrence are high and the therapies, with low success rates. The objective of this study was to evaluate the efficacy of the antitumor agent Synthetic Phosphoethanolamine (FO-S) as neoadjuvant and adjuvant therapy, based on the clinical, thermographic, tomographic, histological and immunohistochemistry characteristics of FISS. Twenty- one cats were included, with a mean age of 9.1 years, mean weight of 4.8kg, 76% females and 76% mixed breed. Seven cats had already undergone previous surgery for removal of FISS, with recurrence on average 6.8 months later. The application of FO-S was performed intravenously, at a dose of 70mg/kg, weekly, for four sessions, starting immediately after surgery (G1 = 11 cats) or four sessions before and four after the surgical procedure (G2 = 10 cats). Most tumors were classified as fibrosarcoma, being 57% grade II, 33% grade III and 10% grade I. The thermographic images obtained by infrared camera did not detect a statistically significant difference in the temperature of the tumor area in relation to the surrounding healthy area, nor between the tumor temperatures before and after the FO-S application cycle in animals of G2. Computed tomography showed a significant difference in the dorsoventral measurement of the lesions when compared to the use of the caliper, but the appearance and size of tumors remained unchanged after treatment with FO- S. The same could be observed in the immunohistochemical analysis, which did not detect difference in expression of Ki-67 and caspase-3 in the tumors of G1, when compared to those submitted to FO-S, in G2. During the 18-month follow-up period, the mean survival was 9 months, the recurrence rate was 24%, and disease-free interval was 9 months on average. Without significant adverse effects, FO-S proved to be safe to use in cats but did not alter the mean time of disease-free interval or survival when compared to the control group. Inclusion of more patients and longer observation time are necessary to evaluate the efficacy of the agent in the treatment of FISS.

Deciphering the embryo-maternal interactome: Embryo-dependent programming of endometrial function during early pregnancy in cattle

Resumo: O sucesso gestacional depende do programa embrionário intrínseco, operando em conjunto com fatores extrínsecos que emanam do trato reprodutivo materno, bem como de uma coordenada interação entre as unidades materna e embrionária. Atualmente, o conhecimento sobre a programação do funcionamento do endométrio dependente do embrião pré-elongado é limitado. A hipótese central desta tese é que embriões bovinos são capazes de modular a função endometrial no dia 7 após o estro. No primeiro estudo, regiões espacialmente definidas do transcriptoma endometrial foram interrogadas quanto a respostas a um embrião no dia 7 in vivo. Amostras de endométrio foram coletadas da junção útero-tubárica, região anterior, medial e posterior do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo 7 dias após o estro de vacas Nelore artificialmente inseminadas e confirmadas gestantes, ou de vacas em que a inseminação foi mimetizada. A abundância de 12 dos 87 transcritos analisados foi modulada no endométrio de animais gestantes, incluindo genes estimulados por interferon (ISGs) e genes associados à biossíntese de eicosanoides. As alterações foram predominantemente nas porções mais craniais do corno uterino, onde o embrião estava localizado. Além disso, a abundância de 71 transcritos variou de acordo com a região do trato reprodutivo, independentemente da presença do embrião. Quantificação baseada em espectrometria de massa de 205 metabólitos no fluido luminal uterino (ULF) recuperado da porção mais cranial do corno uterino ipsilateral mostrou que a exposição ao embrião altera a composição do ULF no dia 7 in vivo. Modulações induzidas pelo embrião incluem aumento nas concentrações de metabólitos derivados da via das lipoxigenases e diminuição nas concentrações de aminoácidos, aminas biogênicas, acilcarnitinas e fosfolipídios. Alterações na composição do ULF podem ser devido à secreção ou depleção de moléculas específicas, executadas pelo embrião ou pelo endométrio, mas iniciadas por sinais provenientes do embrião. No segundo estudo, um modelo in vitro foi usado para estudar as alterações induzidas por embriões no transcriptoma de células epiteliais endometriais bovinas (BEEC) e investigar modos de comunicação molecular entre tecidos. Mórulas produzidas in vitro foram co-cultivadas em justaposição ou sem contato direto com BEECs. Grupos de BEECs ou embriões sozinhos foram cultivados como controles. Independentemente da justaposição à monocamada, o co-cultivo com BEECs melhorou as taxas de blastocistos no dia 7,5. A proximidade física entre embriões e a monocamada de células, no entanto, alterou a natureza e a intensidade das alterações induzidas pelos embriões no transcriptoma das células endometriais. Embriões justapostos modularam a transcrição de 1.797 versus 230 genes em BEECs não contactando diretamente os embriões, quando comparadas às células cultivadas na ausência de embriões. Vias moduladas pela presença de embriões incluíram resposta imune mediada por interferon, regulação do ciclo celular e apoptose, sinalização via prolactina e biossíntese de prostanoides. Coletivamente, a partir dos resultados obtidos nesta tese, concluímos que embriões bovinos pré-elongamento são capazes de modular a função endometrial. A presente tese fornece vias candidatas que parecem ser importantes para o condicionamento do ambiente uterino para o desenvolvimento do concepto. A sinalização embrionária precoce pode ser necessária para garantir o desenvolvimento ideal e o estabelecimento da gestação em bovinos.

Abstract: A successful pregnancy is dependent on the intrinsic embryonic program, operating in conjunction with extrinsic signals emanating from the maternal reproductive tract, as well as on a coordinated interaction between the embryonic and the maternal units. Current knowledge about the pre-elongation embryo-dependent programming of endometrial function in cattle is limited. Central hypothesis is that bovine embryos are able to modulate the endometrial function as early as day 7 after estrus. In the first study, spatially defined regions of the endometrium transcriptome were interrogated for responses to a day 7 embryo in vivo. Endometrial samples were collected from the uterotubal junction, anterior, medial and posterior regions of the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum 7 days after estrus from sham-inseminated or artificially inseminated, confirmed pregnant Nellore cows. Abundance of 12 out of 87 transcripts analyzed was modulated in the pregnant endometrium, including classic interferon-induced genes and transcripts associated to eicosanoid biosynthesis. Changes were predominantly in the most cranial portion of the uterine horn, where the embryos were located. In addition, abundance of 71 transcripts varied according to region of the reproductive tract, irrespective to the pregnancy status. Targeted mass spectrometry-based quantification of 205 metabolites in the uterine luminal fluid (ULF) recovered from the most cranial portion of the ipsilateral uterine horn showed that exposure to a day-7 embryo changes ULF composition in vivo. Embryo-induced modulation included an increase in concentrations of lipoxygenase-derived metabolites and a decrease in concentrations of amino acids, biogenic amines, acylcarnitines and phospholipids. The changed composition of the ULF could be due to secretion or depletion of specific molecules, executed by either the embryo or the endometrium, but initiated by signals coming from the embryo. In the second study, an in vitro model was used to probe embryo-induced changes on bovine endometrial epithelial cells (BEECs) transcriptome and investigate modes of inter-tissues molecular communication. In vitro-produced morulae were co-cultured in juxtaposition or without a direct contact with a BEEC monolayer. Extra groups of BEECs or embryos alone were cultured as controls. Irrespective of juxtaposition to the cell monolayer, co-culture with BEECs improved blastocyst rates on day 7.5. Physical proximity between embryos and the BEEC monolayer, nevertheless, did alter nature and intensity of embryo-induced changes on BEEC transcriptome. Embryos juxtapositioned modulated transcription of 1,797 versus 230 genes in BEECs not contacting embryos directly, in relation to cells cultured in the absence of embryos. Pathways modulated by presence of embryos included interferon-mediated immune responses, cell cycle regulation and apoptosis, prolactin signaling, and prostanoid biosynthesis. Overall, from the results obtained in the course of this thesis, we conclude that peri-hatching bovine embryos modulate the endometrial function. Herein, we provide candidate systems that might be important for conditioning the uterine environment for conceptus development. Early embryonic signaling might be necessary to guarantee optimal development and successful establishment of pregnancy in cattle.

ASSOCIAÇÃO E SELEÇÃO GENÔMICA PARA PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS UTILIZANDO HAPLÓTIPOS COMO MARCADORES EM BOVINOS NELORE

O objetivo deste estudo foram realizar associação genômica ampla (GWAS) e predição genômica utilizando haplótipos como marcadores genéticos para o perfil de ácidos graxos da gordura intramuscular do músculo Longissimus dorsi em bovinos Nelore. Foram utilizados dados de 963 machos da raça Nelore terminados em confinamento, provenientes de fazendas que integram três programas de melhoramento genético. O grupo de contemporâneo foi formado por animais nascidos na mesma fazenda e safra, e do mesmo grupo de manejo ao sobreano. Para a determinação do perfil de ácidos graxos foi utilizado para a extração dos lipídeos o método Folch e para a metilação o método Kramer. Para a genotipagem foi utilizado um painel com mais de 777.000 SNPs do BovineHD BeadChip (High-Density Bovine BeadChip) da Illumina. O controle de qualidade foi feito considerando MAF < 0,05 e Call rate < 90%. Após o CQ, 469.981 SNPs permaneceram nas análises. A imputação dos missing e o phasing do genótipo foram realizados utilizando o software FImpute. A definição dos blocos de haplótipos foi realizada baseada no desequilíbrio de ligação utilizando o software HaploView. No capítulo 2 as análises estatísticas incorporando as informações dos haplótipos foram realizadas utilizando o software ASREML implementando o método REML. O modelo incluiu efeitos fixos do grupo contemporâneo (62 níveis), haplótipo (regressão linear no número de cópias) e idade ao abate como covariável linear. Os valores de p foram ajustados pelo método de FDR. Os haplótipos associados significativamente foram selecionados ao nível de 10% de significância. Para a prospecção dos genes foi utilizado o banco de dados do NCBI na versão UMD3.1 do genoma bovino, Ensembl Genome Browser, DAVID. Foram associados significativamente (p <0,05), 4, 3, 5, 1, 6, 2 e 7 haplótipos com AGS, AGMI, AGPI, AGPI/AGS, n3, n6 e n6/n3, respectivamente. Estes haplótipos significativos abrigam genes envolvidos no metabolismo lipídico, fatores de alongamento e síntese de ácidos graxos de cadeia longa, receptores de hormônios reprodutivos, transporte e uso de ácidos graxos e colesterol, biossíntese e hidrólise de fosfolipídios e constituintes de membrana, constituintes de membranas celulares, metabolismo energético e síntese de proteína quinase. Assim, a identificação desses haplótipos associados pode contribuir para estudos adicionais para validar essas regiões e prospectar genes candidatos que seriam úteis para programas de melhoramento genético para melhorar a qualidade da carne de bovino Nelore. No capítulo 3, o modelo utilizado para estimar componentes de variância, parâmetros genéticos e predizer os valores genômicos incluiu efeitos fixos de grupo contemporâneo e idade ao abate como uma covariável linear, e o efeito genético aleatório aditivo. A acurácia utilizando haplótipos variou de 0,07 a 0,31 e a utilizando SNPs variou de 0,06 a 0,33. O coeficiente de regressão usando os haplótipos variou de 0,07 a 0,74 e utilizando SNPs variou de 0,08 a 1,45. Apesar da precisão de predição não ter sido alta para ambas as abordagens, podemos considerar a utilização da abordagem SNP na seleção genômica, pois é um método computacional mais eficiente.

The aim of this study were genome-wide association (GWAS) and genomic prediction using haplotypes approach for fatty acid profile of intramuscular fat of longissimus dorsi muscle in Nellore cattle. The investigated dataset contained records from 963 Nellore bulls, finished in feedlot (90 days) and slaughter with about two years old. Meat samples of Longissimus dorsi muscle, between the 12th and 13th ribs of the left half-carcasses, were taken to measure the fatty acids (FAs). FAs were quantified by gas chromatography (GC-2010 Plus - Shimadzu AOC 20i autoinjector) using SP-2560 capillary column (100 m x 0.25 mm diameter with 0.02 mm thickness, Supelco, Bellefonte, PA). The animals were genotyped using the high-density SNP panel (BovineHD BeadChip assay 777k, Illumina Inc., San Diego, CA). Those SNP markers with minor allele frequency less than 0.05, call rate less than 90%, monomorphic, located on sex chromosomes, and those with unknown position were removed from the analysis. After genomic quality control, 469,981 SNPs and 892 animals were available for the analyses. Missing genotypes were imputed and genotypes were phased to haplotypes using FImpute software. Haplotype blocks were defined based on linkage disequilibrium using HaploView software. In chapter 2, statistical analyzes incorporating the haplotype information were performed using ASREML software implementing the REML method. The model included fixed effects of the contemporary group (62 levels), haplotype (linear regression in number of copies) and age at slaughter as a linear covariate. The p values were adjusted by FDR method. Haplotypes significantly associated were selected at 10% significance level. For the prospection of the genes, the NCBI database was used in the UMD3.1 version of the bovine genome, the Ensembl Genome Browser and DAVID. There were significantly (p <0.05), 4, 3, 5, 1, 6, 2 and 7 haplotypes associated with SFA, MUFA, PUFA, PUFA/SFA ratio, n3, n6 and n6/n3 ratio, respectively. These significant haplotypes harboring genes involved in lipid metabolism elongation factors and long-chain fatty acid synthesis, reproductive hormone receptors, transport and use of fatty acids and cholesterol biosynthesis and hydrolysis of phospholipids and constituents membrane, cell membrane constituent , energetic metabolism and protein kinase synthesis. Thus, the identification of these associated haplotypes may contribute to further studies to validate these regions and prospect candidate genes that would be useful for breeding programs to improve the quality of Nellore beef. In chapter 3, the model used to estimate variance components, genetic parameters and predict the genomic values included fixed effects of contemporary group and age at slaughter as a linear covariate, and the additive random genetic effect. The accuracy using haplotype approach ranged from 0.07 to 0.31 and using SNP approach ranged from 0.06 to 0.33. The regression coefficient using haplotype approach ranged from 0.07 to 0.74 and using SNP approach ranged from 0.08 to 1.45. Despite prediction accuracy was not high for both approach we can consider use SNP approach in genomic selection because is more efficient computational.

PURIFICAÇÃO PARCIAL DAS RAM SEMINAL VESICLE PROTEINS (RSVP14 E RSVP22) NO PLASMA SEMINAL OVINO

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de desenvolver uma metodologia para purificar as RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) de 14 kDa e 22 kDa. O trabalho foi desenvolvido com 16 animais da raça Morada Nova, mantidos em sistema intensivo de produção, dos quais amostras de sêmen foram coletadas semanalmente por meio de eletroejaculador, para separação do plasma seminal das células espermáticas por meio de centrifugações. As proteínas do plasma seminal foram precipitadas com etanol frio e 6,15 mg/mL de proteínas totais foram submetidas à cromatografia líquida de afinidade por gelatina, utilizando uma resina Gelatina-Sepharose acoplada a um sistema cromatográfico automatizado. As proteínas foram eluídas em quatro picos cromatográficos (P1, P2, P3 e P4), dos quais P1 e P2 continham proteínas com baixa ou nenhuma afinidade pela gelatina e P3 e P4 abrangeu as proteínas com domínios de fibronectina II com alta afinidade à gelatina. Uma alíquota de 20 g de proteínas, de cada pico, foi submetida à técnica de SDS-PAGE a 12,5% e outra alíquota contendo 20 g de proteínas, foi submetida à técnica de Western Blot, utilizando anticorpos primários anti-BSPs ovinas. Os pesos moleculares das proteínas separadas por eletroforese foram determinados com o auxílio do aplicativo Quantity One, no qual foram detectadas 5 bandas proteicas em P4, com pesos moleculares entre 12 e 30 kDa. A técnica de Western Blot demonstrou marcação específica para RSVP nos quatro picos, enquanto que P1 e P2 a marcação foi menos intensa, devido alguma forma agregada ou associada a fosfolipídios das proteínas RSVPs que acarretou em uma leve marcação na imunodetecção e em P3 e P4 a marcação foi especifica. O pico P4 foi submetido a um segundo passo cromatográfico, na coluna HiTrap Heparin HP. Neste caso, o P4 originou dois picos cromatográficos (P1 e P2) bem definidos, em que P1 abrangeu as proteínas com baixa ou nenhuma afinidade a heparina e P2, as proteínas com afinidade a heparina. As proteínas dos dois novos picos foram submetidas às técnicas de SDS-PAGE a 12,5%, e Western Blot, no qual foi possível detectar a presença de 3 bandas proteicas em P1 e 3 bandas proteicas em P2. Acredita-se que a RSVP14 e RSVP22 estejam contidas na fração sem afinidade à heparina e na fração com afinidade à gelatina, respectivamente, necessitando de mais testes para comprovar nossas teorias iniciais.

The present study aimed to develop a methodology to purify the RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) of 14 kDa and 22 kDa. The work was developed with 16 animals of the Morada Nova breed, kept in an intensive production system, which the samples of semen were collected weekly by means of electro-ejaculator, to separate seminal plasma from the sperm cells through centrifugation. Seminal plasma proteins were precipitated with cold ethanol and 6.15 mg/mL of total proteins were subjected to liquid gelatin affinity chromatography using a Gelatin-Sepharose matrix coupled to an automated chromatographic system. Proteins were eluted into four peaks (P1, P2, P3 and P4), which P1 and P2 contained proteins with low or none affinity for gelatin and P3 and P4 encompassed proteins with fibronectin II domains with high affinity to gelatin. An aliquot of 20 g of proteins from each peak was subjected to the 12.5% SDS-PAGE technique and another aliquot containing 20 g of proteins was subjected to Western Blot technique using primary ovine anti-BSPs. The molecular weights of proteins separated by electrophoresis were determined with the aid of the Quantity One Software, which 5 protein bands were detected in P4, with molecular weights between 12 and 30 kDa. The Western blot technique demonstrated specific labeling for RSVP at all four peaks, whereas P1 and P2 labeling was less intense, due to some aggregate or phospholipid-associated form of RSVP that resulted in a slight immunodetection labeling, and at P3 and P4 labeling was specific. The last peak, P4, was subjected to a second chromatographic step on the HiTrap Heparin HP column. Therefore, P4 originated two well-separated chromatographic peaks (P1 and P2), where P1 encompassed the proteins with low or none affinity to heparin and P2, the proteins with affinity to heparin. Proteins from the two new peaks were submitted to 12.5% SDS-PAGE and Western Blot, which it was possible to detect the presence of 3 protein bands in P1 and 3 protein bands in P2. It is believed that RSVP14 and RSVP22 are present in the fraction with no affinity to heparin and fraction with affinity to gelatin, respectively, requiring further testing to prove our initial theories.

Estudo dos lipídeos relacionados aos mecanismos reguladores da pluripotência em Células-tronco Pluripotentes Induzidas (iPS) Humanas

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de células somáticas demonstrou que células adultas de mamíferos podem ser reprogramadas a um estágio de pluripotência através da inserção de fatores de transcrição embrionários. Esta descoberta tem levantado questões fundamentais sobre os mecanismos, que através destes fatores de transcrição, influenciam epigeneticamente as células e seus potenciais de diferenciação após a reprogramação e um normal desenvolvimento. Componentes lipídicos e lipoprotéicos afetam vários aspectos no comportamento celular durante sua manutenção e diferenciação, podendo afetar diretamente fatores essenciais em processos de reprogramação celular, manutenção da pluripotência e perfil epigenético das células. Nesse sentido, esta tese propôs o estudo da composição lipídica com diferentes abordagens entre células iPS, células-tronco embrionárias (H1) e células fibroblastos (BJ). Foram produzidas três linhagens de células pluripotentes induzidas no modelo humano que foram caracterizadas quanto 1a sua pluripotência e utilizadas, juntamente às linhagens H1 e BJ como modelos para o estudo da composição lipídica proposto. Foram identificadas e estudadas um total de 44 espécies lipídicas das classes PC, PE, PI, SM e PS, e discutidas frente a reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Foi identificado um padrão de composição fosfolipídica distinta entre células pluripotentes e não pluripotentes, e especulamos que a presença dessas espécies parecem ter um envolvimento fundamental para a manutenção da pluripotência. Este padrão, mostrou pela análise de componente principal, que durante o processo de reprogramação, alterações na composição lipídica ocorrem de forma com que a pluripotência surge durante a reprogramação, evidenciando alterações lipídicas particulares do estádio da pluripotência, sugerindo uma ligação entre estas alterações na composição lipídica com as alterações metabólicas da própria reprogramação celular. O estudo da quantificação de fosfolipídios entre linhagens celulares pluripotentes e não pluripotentes evidenciaram que existe uma diferença fosfolipídica entre estas linhagens, observamos que as linhagens iPS e H1, do ponto de vista das classes observadas e os fosfolipídios quantificados, são similares entre si e diferentes de células não pluripotentes. É evidente que estas moléculas lipídicas, individualmente, não são capazes de modular processos como a reprogramação celular, entretanto, é de extrema importância o entendimento das mesmas dentro da reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Nossos dados sugerem que a composição lipídica de células pluripotentes tem importante papel para o desenvolvimento e evolução do processo de reprogramação celular e o entendimento da manutenção da pluripotência.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from adult somatic cells has shown that mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the insertion of embryonic transcription factors. This finding has raised questions about the fundamental mechanisms through which these transcription factors epigenetically influence cells, their potential of differentiation after reprogramming and normal development. Lipid and lipoprotein components affect numerous aspects of cell behavior during its maintenance and differentiation, which can directly affect main factors in cell reprogramming processes, maintenance of pluripotency and epigenetic profile of the cells. Thus, this thesis proposed to study, with different approaches, the lipid composition of iPS cells, embryonic stem cells (H1) and fibroblast cells (BJ). Three induced pluripotent cell lines were produced in the human model. They were characterized regarding their pluripotency and used along with H1 and BJ cell lines, as models for the proposed lipid composition study. A total of 44 species of lipid from the classes PC, PE, PI, PS and SM have been identified, studied and discussed regarding cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. A different phospholipid composition pattern was observed between pluripotent and nonpluripotent cells, and it is speculated that the presence of these species appears to have a major involvement on the maintenance of pluripotency. This array showed, by the principal component analysis, that during the reprogramming process changes in the lipid composition occur, so that pluripotency takes place during reprogramming, highlighting lipid changes particular of the pluripotency state, suggesting a connection between these changes in lipid composition and the metabolic changes of cell reprogramming. The study of the quantitation of phospholipids from pluripotent and non-pluripotent cell lines indicated a phospholipid difference between these cell lines when considering the observed classes and quantified phospholipid. It was eminent that iPS lines and H1 are similar and differ from non-pluripotent cells. It is clear that these lipid molecules are not individually capable of modulating processes such as cell reprogramming, however, it is extremely important to understand them within cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. Our data suggests that the lipid composition of pluripotent cells has important role in the development and evolution of cellular reprogramming process and the understanding the maintenance of pluripotency.

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO LIPÍDICA DIETÉTICA NA ATIVIDADE ELÉTRICA CEREBRAL DE RATOS NORMAIS E SUBMETIDOS AO STATUS EPILEPTICUS

O cérebro é um órgão constituído de cerca de 60% de lipídios. Entre esses lipídios os mais importantes são os fosfolipídios, os quais podem apresentar em sua cauda hidrofóbica, ácidos graxos saturados e insaturados, e o colesterol. Alterações nas proporções desses lipídios podem alterar as propriedades físico-químicas das membranas das células do sistema nervoso. Desta forma, é razoável inferir que alterações no fornecimento dietético de lipídios possam alterar o funcionamento do cérebro, e essas alterações muitas vezes acarretam variações na atividade elétrica cerebral. Esse trabalho avaliou alterações elétricas e histológicas decorrente da suplementação com ácidos graxos insaturados (ômega-3) e de uma dieta hipercolesterolêmica (DHC), em animais normais e submetidos ao status epilepticus. A atividade elétrica dos animais foi registrada através do eletrocoticograma (ECoG), no qual foi realizado o espectro de potência e calculada a potência média para os ritmos cerebrais mais importantes, delta (0,5 - 4Hz), teta (4 - 8 Hz), alfa (8 - 14Hz) e beta (12 - 30Hz). A análise eletrofisiológica mostrou que a suplementação lipídica, tanto proveniente do ômega-3, quanto da DHC, causou uma aceleração da atividade elétrica cerebral basal. Durante o status epilepticus os animais suplementados com a DHC, apresentaram maior excitabilidade que o grupo controle e o suplementado com ômega-3, indicando um status epilepticus com maior severidade para o grupo alimentado com a DHC. A análise histológica mostrou que o status epilepticus causou lesão nas áreas CA1, CA2, CA3 e giro denteado do hipocampo, apresentando morte neuronal severa com vacuolização intensa e desestruturação das camadas celulares. Porém essas lesões foram muito mais tênues nos animais suplementados com ômega-3, revelando um efeito protetor do ômega-3 nas células nervosas durante o status epilepticus.

The brain is an organ composed of about 60% of lipids. Among these the most important lipids are the phospholipids, which may present in its hydrophobic tail, saturated and unsaturated fatty acids and cholesterol. Changes in the proportions of these lipids may alter the physicochemical properties of the membranes of the cells of the nervous system. Thus, it is reasonable to infer that changes in the dietary lipid supply may alter brain function; these changes often entail changes in brain electrical activity. This study evaluated electrical and histological changes of the nervous system resulting from supplementation with unsaturated fatty acids (omega-3) and a hypercholesterolemic diet (HCD), in animals normal and submitted to status epilepticus. The electrical activity of the animals was registered by ECoG, in which was performed the power spectrum and calculated the average power for the most important brain rhythms, delta (0.5 - 4 Hz), theta (4 - 8 Hz), Alpha (8 - 14 Hz) and beta (12 - 30Hz). Electrophysiological analysis showed that lipid supplementation, both from omega-3 as HCD, caused an acceleration of brain electrical activity. During the status epilepticus the animals supplemented with HCD showed a excitability greater than the control group and that animals supplemented with omega-3, indicating a status epilepticus with greater severity for the group fed the HCD. Histological analysis showed that the status epilepticus caused injury in the areas CA1, CA2, CA3 and the dentate gyrus of the hippocampus, all of them showing severe neuronal death with intense vacuolization and disintegration of the cell layers. However, these lesions were not easily identified in animals supplemented with omega-3, revealing a protective effect of omega-3 in nerve cells during status epilepticus.

Indicadores da eficiência reprodutiva do garanhão / Indicators of reproductive efficiency of stallion

A eficiência reprodutiva obtida no rebanho é dependente da fertilidade de ambos os progenitores. Entretanto, tende-se a atribuir maior responsabilidade pelos baixos índices de fertilidade ao final da estação de monta à fêmea, negligenciando-se a avaliação do reprodutor frente a estes resultados. Contudo, deve-se conferir maior importância às variáveis relacionadas ao macho, as quais podem contribuir diretamente para a determinação de menores taxas de fertilidade. Dentre essas variáveis destaca-se a qualidade seminal, sendo primariamente avaliada pela motilidade e morfologia espermática. No entanto, atualmente empregam-se exa- mes mais minuciosos, como: identificação de fatores de crescimento no plasma seminal, razão colesterol/fosfolipídios na membrana espermática, integridade das membranas acrossomal, mitocondrial e espermática exigindo, desta maneira, um conhecimento mais abrangente, por parte do examinador, para que se possa ter um maior poder diagnóstico e preditivo da fertilidade do reprodutor a ser utilizado.(AU)

Reproductive efficiency in the herd depends on the fertility of both mates. However, we tend to blame low fertility at the end of the breeding season to the female, ne- glecting to assess the male facing these results. However, more emphasis should be given on variables related to the male which can contribute directly to the de- termination of lower fertility rate. Among these variables, sperm quality is pointed out, which is primarily evaluated by motility and morphology. However, nowadays more detailed examinations are employed, such as identification of growth factors in seminal plasma, cholesterol/phospholipids ratio in the sperm membrane, acroso- me, mitochondrial and sperm membrane integrity, requiring a more comprehensive knowledge on the part of the examiner, who may have a greater diagnostic and predictive power of the fertility of the breeder to be used.(AU)

Caracterização molecular de ovócitos suínos de animais pré-púberes e púberes durante a maturação in vitro

Ovócitos de folículos antrais são dependentes de uma adequada regulação da expressão gênica para iniciar e completar seu processo de maturação. A maturação in vitro (MIV) é uma parte essencial da produção in vitro de embriões (PIVE). A qualidade dos ovócitos tem um papel essencial na produção e qualidade dos embriões resultantes, e a maturidade sexual da doadora é um fator que influencia as taxas de maturação. Este estudo teve como objetivo caracterizar o perfil de expressão de genes relacionados a apoptose, metabolismo lipídico e metilação do DNA e o perfil lipídico de ovócitos suínos de animais pré-púberes e púberes durante a maturação in vitro. Levando-se em consideração a maturidade sexual das fêmeas doadoras de ovócitos, as fêmeas púberes apresentaram melhores resultados tanto na recuperação como na maturação dos ovócitos (p<0,001, para ambas as analises). A quantidade de RNAm para o gene BAX foi diferente entre ovócitos imaturos e maturos in vitro de porcas, mostrando menor abundância relativa em imaturos (P = 0,09). Entre os genes relacionados ao metabolismo lipídico, o gene SLC27A4 apresentou menor abundância relativa de RNAm em ovócitos imaturos comparados com os maturos in vitro em porcas (P = 0,05). Os genes CPT2 e PLIN2 apresentaram níveis de RNAm mais baixos em ovócitos imaturos em comparação com ovócitos maturos in vitro em marrãs (P = 0,05; P = 0,02). Em relação aos genes relacionados à reprogramação da metilação do DNA, os genes DNMT3A eTET3 apresentaram níveis de RNAm mais baixos em ovócitos imaturos em relação aos maturos in vitro em marrãs (P = 0,02; P = 0,0005). Além disso, a expressão de TET3 também foi diferente nos ovócitos de porcas, mostrando níveis mais baixos nos ovócitos imaturos (P = 0,02). Diferente de todos outros genes, TET1 apresentou maior abundância relativa de RNAm em ovócitos imaturos em comparação com os ovócitos maturos in vitro em porcas (P = 0,05). Em relação ao perfil lipídico, houve uma aproximação dos perfis moleculares entre os ovócitos maturos de porcas e marrãs após o processo de maturação, com um agrupamento de lipídeos com massa superior a 700m/z que compõem uma faixa de fosfolipídios complexos. Com base em nossos resultados, podemos concluir que o armazenamento de RNAm materno (herança materna), importante para a ovogênese e para o desenvolvimento inicial do embrião, assim como uma reorganização da composição lipídica do ovócito, só são totalmente estabelecidos durante o final da ovogênese, dentro do processo de maturação do ovócito. Esse trabalho mostrou que mesmo ao final da ovogênese, com o ovócito totalmente crescido e dentro de um processo de divisão meiótica, ainda há eventos de transcrição gênica e tradução e uma grande reorganização de perfis lipídicos. Assim, é importante estudar os possíveis efeitos de diferentes sistemas de maturação in vitro sobre o estabelecimento final dos estoques maternos de RNAm e de lipídeos, essenciais ao correto desenvolvimento embrionário posterior. Finalmente, os genes que foram diferencialmente expressos durante a maturação in vitro, bem como o perfil lipídico dos ovócitos maturados, são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para qualidade de ovócitos, subsidiando o desenvolvimento e adaptação de novos protocolos de maturação in vitro em mamíferos.

Oocytes from antral follicles are dependent on adequate gene expression regulation to initiate and to undergo oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) is an essential part of the in vitro embryo production (IVP). The quality of oocytes plays an important role in determining the production and quality of the resulting embryos, and the sexual maturity of the donor is a factor that influences the maturation rate. This study aimed to characterize the expression profile of genes related to apoptosis, lipid metabolism and DNA methylation and the lipid profile in pig oocytes during in vitro maturation. Oocytes from gilts and sows were obtained from abattoirs and were matured in vitro. Regarding sexual maturity of females donors, oocytes from pubertal females showed better results both in recovery and maturation of oocytes (p<0.001 for both analyses. Considering the sexual maturity, comparing gene expression during in vitro maturation, the quantity of BAX mRNA was different between immature and in vitro matured oocytes from sows, showing lower relative abundance in immature ones (P=0.09). Among genes related to lipid metabolism, SLC27A4 showed lower relative abundance in immature compared to in vitro matured oocytes from sows (p = 0.05). CPT2 and PLIN2 genes showed lower levels in immature compared to in vitro matured oocytes from gilts (P=0.05;P=0.02). Regarding genes related to DNA methylation reprogramming, DNMT3A and TET3 showed lower levels in immature than in in vitro matured oocytes from gilts (P=0.02; P=0.0005); moreover, TET3 was different in oocytes from sows, showing lower levels in immature than in in vitro matured (P=0.02). Different of all other genes, TET1 showed higher relative abundance in immature oocytes compared to in vitro matured oocytes from sows (P=0.05). It was also observed, in relation to lipid profile, that there was an alignment between the mature oocyte of sows and gilts after the maturation process, with a group of lipids with mass greater than 700m/z, which comprise a range of complex phospholipids. Based on our results, we can conclude that the maternal mRNA storage, important to oogenesis and initial embryo development, is only totally established during the oocyte maturation. This work showed that even at the and of oogenesis, with fully grown oocyte within meiosis process, there is still gene transcription and translation events and a major lipid profiles reorganization. Thus, is important study the possible effects of different in vitro maturation systems in the final establishment of maternal mRNA and lipids stocks, which are essential to the correct subsequent embryonic development. Finally, the genes the genes were differentially expressed during in vitro maturation and the lipid profile of the maturated oocytes are potential candidates for use as molecular markers for oocyte quality, supporting the development and adaptation of new in vitro maturation protocols for mammals.

Comparação da eficácia de dois métodos de extração para determinação do perfil lipídico de ácidos graxos do sêmen ovino por meio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência / Comparison of the efficacy of two extraction methods for determination of lipid fatty acids of sheep semen by high performance liquid chromatography

A indústria de lã, leite, carne e pele de ovinos tem crescido em importância e novas biotecnologias do sêmen estão sendo estudadas para a elucidação de causas de infertilidade em machos. Sabe-se que danos causados na membrana espermática diminuem a qualidade seminal. Considerando que estas são compostas por uma bicamada de fosfolipídios e que a peroxidação lipídica é causadora de lesão celular, explica-se a importância de estudos sobre os lipídios constituintes do sêmen. A peroxidação lipídica é consequente da reação entre os lipídios e as espécies reativas de oxigênio. Esse quadro pode ser controlado pela presença de antioxidantes no sêmen. O sêmen foi coletado pela técnica da vagina artificial e após análise imediata e mediata, foi separado em duas frações: plasma seminal e pellet de espermatozoide. Seus lipídios foram extraídos por dois métodosbaseados no método Folch, Lesse Stanley modificado diferentes, utilizando clorofórmio e metanol como solventes. Após foram qualificados e quantificados pela especificidade e sensibilidade da Cromatografia Liquida de Alta Eficiência e escolheu-se a melhor extração. A análise estatística dos dados foi realizada através do programa SAS for Windows. O AG saturado predominante no espermatozoide é o mirístico e o AG insaturado predominante é o DHA, em ambas as extrações. No plasma seminal, nos dois métodos, o AG saturado que prevalece é o palmítico e o insaturado é o oleico. Dentre os dois métodos estudados, o que obtivemos melhores resultados na identificação e quantificação dos AG foi a Método 1.(AU)

The sheep industry for wool, milk and meat production is of increasing importance and new technologies for assessment of semen are in course for the elucidation of male infertility causes. It is well known that damage to the sperm membrane decreases semen quality. Considering that sperm membranes are composed by a phospholipid bilayer, and that lipid peroxidation is a major cause of cell damage, studieson the lipid components of semen are relevant. Lipid peroxidation is a consequence of the reaction between lipids and reactive oxygen species. This event may be reduced in the presence of antioxidants in semen. Semen was collected with an artificial vagina and, after sperm evaluation, samples were centrifuged to separate the sample into two fractions: seminal plasma and spermatozoa pellet. Both had their lipids extracted by two different methods based on Folch, Less& Stanley method modified, using chloroform e methanol as solvents. After the extraction, some esterified fatty acids were qualified and quantified for the sensitivity and specificity to the high performance liquid chromatography in order to determine the most efficient extraction technique in quantitative and qualitative aspects. Statistical analysis was performed using SAS software for Windows. The predominant saturated fatty acid in sperm under these experimental conditions was the myristic and the most abundant insaturated fatty acid in both extractions was DHA. In seminal plasma, in both methods, the prevailing fatty acid is the saturated palmitic and the unsaturated oleic. Among the methods evaluated, we obtained the best results of identification and quantification of fatty acids in Method 1.(AU)

PERFIL LIPÍDICO DA MEMBRANA PLASMÁTICA E ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS DE ESPERMATOZOIDES DE GARANHÕES RESISTENTES E SENSÍVEIS À CRIOPRESERVAÇÃO

A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração.

The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.

PERFIL LIPÍDICO DOS ESPERMATOZOIDES CANINOS in natura E CONGELADOS

O objetivo deste estudo foi investigar o perfil lipídico dos espermatozoidescaninos. Amostras de sêmen foram colhidas por manipulação digital penianade quatro Beagles adultos e analisadas por espectrometria de massasutilizando a técnica de ionização/dessorção a laser assistida por matrizacoplada ao analisador de tempo de voo (MALDI-TOF). Imediatamente após acolheita de sêmen, cada amostra foi dividida em duas alíquotas: uma paraposterior análise por MALDI-TOF e outra para análise imediata dascaracterísticas seminais, sendo que apenas amostras com qualidade seminaldentro dos valores de referência para a espécie foram analisadas por MALDITOF.Os experimentos realizados por MALDI-TOF foram divididos em duasetapas: em um primeiro estudo (I), as alíquotas de sêmen foram adicionadasde meios diluidores comerciais (BotuSemen?, BotuBov? ou BotuCrio?),envasadas em palhetas de sêmen e congeladas em nitrogênio líquido (-196°C),sendo também cada meio diluidor envasado e congelado separadamente, a fimde verificar a contribuição do diluidor na gama de fosfolipídios. No segundoestudo (II), as alíquotas de sêmen foram envasadas em criotubos e congeladas(-80°C) sem meio diluidor antes de serem analisadas. Em ambos os estudos,as alíquotas foram transportadas congeladas em caixa térmica contendo geloseco do laboratório de colheita e processamento de sêmen ao laboratório deespectrometria de massas (4 h). As amostras foram descongeladas esubmetidas a extração de lipídios. Os principais fosfolipídios encontrados nasanálises dos espermatozoides dos estudos I e II haviam sido anteriormenteidentificados na literatura em outros tipos de amostras biológicas, o que foiverificado por meio de seus respectivos valores da razão massa/carga (m/z).No estudo I, os principais fosfolipídios identificados nas amostras provenientesde sêmen diluído e congelado foram três fosfatidilcolinas (FCs) (m/z: 761; 783e 809) e uma (1) esfingomielina (EM) (m/z: 726), sendo esta relevante apenasna amostra proveniente de sêmen diluído com BotuCrio?. Observou-se que aFC de valor m/z 761 apareceu como um dos principais fosfolipídios nasamostras provenientes do sêmen diluído com BotuSemen? ou BotuBov?, masapareceu com intensidade relativamente baixa quando o diluidor utilizado haviasido o BotuCrio?. Nas amostras provenientes de diluidores puros, os principaisfosfolipídios identificados foram duas FCs (m/z: 761 e 783). Nas amostrasprovenientes de sêmen puro (estudo II), foram identificadas quatro FCs (m/z:761; 783; 809; e 831) e uma EM (m/z: 726), sendo que, no Macho #4, as FCsde valores m/z 761 e 831 foram observadas com baixa intensidade,diferentemente do que ocorreu nas amostras dos outros machos. Também noMacho #4, um dos fosfolipídios mais relevantes nas amostras oriundas desêmen puro foi a EM de valor m/z 726; porém, nas amostras provenientes dosêmen colhido deste animal e diluído com BotuSemen? ou BotuBov?, esta EMapareceu com baixa intensidade, o que não aconteceu quando o diluidor haviasido o BotuCrio?. Os resultados dos estudos I e II sugerem que a abundânciarelativa de alguns fosfolipídios (exemplo, FC: 761 e EM: 726) possa ter sidomascarada devido à combinação de sêmen com diluidor. Quanto ao estudo I, acredita-se que, mesmo com a série de lavagens das amostras por centrifugação, descarte do sobrenadante e ressuspensão, o pellet de espermatozoides teria retido lipídios provenientes do meio diluidor, os quais teriam sofrido precipitação, tornando-se impossível separá-los dos espermatozoides do pellet. No estudo II, o processo de congelação teria levado ao rompimento da membrana plasmática dos espermatozoides devido à ausência de substâncias crioprotetoras; no entanto, a ausência de meio diluidor permitiu a análise lipidômica sem a interferência dos constituintes lipídicos dos meios diluidores. Até onde sabemos, este foi o primeiro estudo da composição lipídica dos espermatozoides caninos por espectrometria de massas. Estudos futuros poderiam investigar a composição lipídica dos espermatozoides presentes em amostras frescas versus amostras descongeladas de sêmen, o que poderia contribuir para um melhor entendimento dos efeitos dos diferentes procedimentos de manipulação do sêmen canino sobre a sua composição lipídica.

The objective of this study was to investigate the lipid profile of canine spermatozoa. Semen samples were collected by penile digital manipulation from 4 adult Beagles and analyzed via matrix-assisted laser desorption/ ionization coupled with time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Immediately after semen collection, each sample was divided into two aliquots: one for further analysis by MALDI-TOF and another for immediate analysis of semen characteristics, and only samples with sperm quality within the reference range for the species were analyzed by MALDI-TOF. Experiments carried out by MALDI-TOF were divided into two stages: in the first study (I), semen was diluted using commercial extenders (BotuSemen®, BotuBov®, or BotuCrio®), packed in straws and frozen in liquid nitrogen (-196ºC); additionally, each extender was frozen separately in order to verify their contribution to the range of phospholipids detected. In the second study (II), raw semen samples were placed in cryotubes and frozen (-80ºC) without extenders before analysis. In both studies, samples were transported frozen on dry ice from the semen handling laboratory to the mass spectrometry laboratory (~4 h). Samples were then thawed and subjected to lipid extraction. The main phospholipids identified in studies I and II had been previously identified in the literature in other types of biological samples, which was verified by their values of the mass charge ratio (m/z). In study I, the major phospholipids identified in samples from diluted, frozen semen were three phosphatidylcholines (PCs) (m/z: 761; 783; and 809) and one (1) sphingomyelin (SM) (m/z: 726), which was relevant only in the sample from semen diluted with BotuCrio®. The PC with m/z value of 761 appeared as one of the main phospholipids in samples from semen diluted with BotuSemen® or BotuBov® but appeared in relatively low intensity when the extender used had been BotuCrio®. In samples of extenders alone, there were two main PCs (m/z: 761 and 783). In raw semen samples (Study II), the main phospholipids identified were four PCs (m/z: 761; 783; 809; and 831) and one SM (m/z: 726), and in Male # 4, the PCs with m/z values 761 and 831 were observed in low intensity, unlike what occurred in samples from the other males. Also in Male # 4, one of the major phospholipids in raw semen was SM with m/z value 726; however, in semen samples collected from this animal and diluted with either BotuSemen® or BotuBov®, this SM appeared in low intensity, which did not happen when the extender had been BotuCrio®. Studies I and II suggest that the relative abundance of some phospholipids (example, PC: 761 and SM: 726) could have been masked due to the combination of semen with extender. Regarding study I, it is believed that, despite the steps in the lipid extraction procedure that included centrifugation, discarding of the supernatant, and re-suspension of the spermatozoa pellet, lipids from the extenders might have precipitated and become entrapped in the pellet, making it impossible to separate them from the spermatozoa. In Study II, the freezing process caused rupture of the sperm plasma membrane due to the absence of cryoprotectants. However, the absence of extenders allowed for lipidomic analysis without interference from lipid constituents of extenders. To our knowledge, this was the first study of the lipid composition in canine spermatozoa by mass spectrometry. Future studies should investigate the lipid composition of spermatozoa from fresh versus frozen-thawed semen, which could potentially contribute to a better understanding of the effects of different canine semen handling procedures on its lipid composition.

INFLUÊNCIA DO ESTRESSE OXIDATIVO SOBRE AS CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS NO SÊMEN DE GARANHÕES

Muitos garanhões não respondem de forma satisfatória frente ao processo de criopreservação sendo vários os fatores envolvidos nessa intolerância. Visando elucidar resultados superiores de alguns animais aos processos de criopreservação espermática, foram realizados dois experimentos. No experimento I, o objetivo foi avaliar a ação do estresse oxidativo e as consequências no sêmen de garanhões resistentes e sensíveis ao processo de congelação espermática, verificando também a influência do fator racial frente ao processo de congelação espermática. No experimento II, o objetivo foi avaliar a influência da presença do plasma seminal sobre a resistência espermática no sêmen refrigerado de garanhões considerados bad e good coolers. Para avaliação das amostras seminais foi realizada análise computadorizada de cinética espermática (CASA, Thorne Research ¿ HTMA IVOS), análise e quantificação do estresse oxidativo pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), análise da fragmentação do DNA espermático (HALOMAX) e análises de translocação de fosfolipídios da membrana, índice de caspase ativada e quantificação de espécies reativas de oxigênio pela citometria de fluxo. No experimento I, não houve influência racial com relação à qualidade espermática, além disso, os garanhões bad freezer, que apresentaram maior perda de qualidade seminal após a congelação espermática, revelaram maiores níveis de estresse oxidativo e fragmentação do DNA espermático. No experimento II, os garanhões sensíveis à refrigeração apresentaram melhora da qualidade espermática ao retirarmos o plasma seminal. Já nos good coolers houve uma manutenção da qualidade espermática na presença do plasma seminal e uma diminuição da qualidade sem o plasma seminal. Além disso, observamos ao submeter as amostras ao teste-desafio, que as análises espermáticas se tornam mais confiáveis pelo fato de amplificar e evidenciar as diferenças.

A significant number of stallions do not respond in a satisfactory way to the cryopreservation process and that there are many factors involved. In order to elucidate the reasons why some animals have superior results in the spermatic cryopreservation processes, two experiments were conducted. In experiment I, the goal was to evaluate the action of oxidative stress and the consequences in the semen of stallions that were resistant and susceptible to the spermatic freezing process. The influence of the racial factor to the spermatic freezing process was also verified. In experiment II, the goal was to evaluate the influence of the seminal plasma presence on spermatic resistance in cooled semen of stallions considered as bad and good coolers. To evaluate seminal samples, computer analysis of the spermatic cinetic was done (CASA, Thorne Research ¿ HTM IVOS), oxidative stress levels were assessed by thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), sperm DNA fragmentation (HALOMAX) and analysis of the translocation of membrane phospholipids, activated caspase indices and quantification of ROS with flow cytometry were done. In experiment I, there was no influence of the breed factor in relation to the sperm quality of the analyses that were done. Furthermore, the bad freezers stallions, that showed the most loss of seminal quality after spermatic freezing, presented higher rates of oxidative stress and spermatic DNA fragmentation. In experiment II, the stallions that were considered sensitive showed improvement of the sperm quality as the SP was removed. Furthermore, in the good coolers we observed the preservation of sperm quality in the presence of SP and a quality decrease in the samples without the SP. Additionally, we also observed the importance of the test challenge for the evaluation of the sperm analysis, because when submitted to stressful situations, the differences were evident.

Influência do Etossulfato de Fenazina na produção in vitro de embriões bovinos, gestação e na expressão gênica da via do metabolismo do triacilglicerol

A produção in vitro (PIV) de embriões tem sido utilizada amplamente no Brasil como ferramenta para acelerar o melhoramento genético do rebanho. Quando associada à criopreservação, a PIV permite maior flexibilidade da biotecnologia e possibilita estabelecer um banco de embriões. Há a possibilidade que a alta sensibilidade à criopreservação dos embriões bovinos seja influenciada principalmente pela grande quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos, sendo isso relacionado especialmente às condições de cultivo in vitro. O Etossulfato de Fenazina (PES) consiste em um regulador do metabolismo de lipídeos. Através da oxidação de NADPH, estimula a via da pentose-fosfato e assim inibe a síntese de ácidos graxos, podendo levar a efeitos benéficos na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. O Fator de transcrição denominado proteína de ligação do elemento regulatório de esterol (SREBP-1c), regula preferencialmente a transcrição de genes da síntese de triacilglicerol e fosfolipídios e, a enzima Estearoil Co-A desaturase (SCD1) promove a síntese de ácidos graxos monoinsaturados, conferindo fluidez às membranas celulares. O objetivo desse trabalho foi avaliar a suplementaçãode diferentes concentrações do etossulfato de fenazina (PES) no meio de cultivo, durante a produção in vitro de embriões bovinos, e verificar o efeito do PES na taxa de gestação, buscando melhorar a qualidade do embrião para a criopreservação através da redução do acúmulo de lipídeos. Foram avaliadas as taxas de desenvolvimento inicial de embriões produzidos in vitro provenientes de ovários de abatedouro, e as taxas de gestação com o uso de embriões bovinosproduzidos in vitro a partir da Aspiração folicular de vacas Holandesas e vitrificados. A análise da expressão de genes relacionados com biossíntese de triacilglicerol, SCD1 e SREBP-1c, teve como finalidade auxiliar nos conhecimentos básicos dos mecanismos de ação do Etossulfato de Fenazina, e foi realizada através de PCR quantitativo em Tempo Real, utilizando pools de cinco embriões para cada grupo. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida de teste de médias, e o teste qui-quadrado para as taxas de gestação. Não houve diferença estatística na taxa de clivagem e blastocisto entre o grupo controle e os grupos tratados com 0,2M; 0,3M; 0,5M de PES no meio de cultivo in vitro. A taxa de gestação, utilizando-se embriões criopreservados, transferidos para receptoras, não foi alterada pelo uso de PES. A expressão tanto do SREBP-1c, quanto da SCD1 manteve níveis similares na presença ou ausência de PES durante o cultivo in vitro. Sendo assim faz-se necessário novos estudos para investigar mais detalhadamente o mecanismo de ação do PES nos genes da via de biossíntese de lipídeos e se é viável sua utilização a campo.

The in vitro production (IVP) of embryos has been widely used in Brazil as a tool to accelerate the genetic breeding. When combined with cryopreservation, the IVP allows greater flexibility of biotechnology and enable to establish a bank of embryos. There is a possibility that the greater sensitivity to cryopreservation of bovine embryos is influenced mainly by the large amount of intracytoplasmic lipids, and that is especially related to in vitro culture conditions. The phenazine ethosulfate (PES) consists of a lipid metabolism regulator. By NADPH oxidation, stimulates the pentose-phosphate pathway and thus inhibits the fatty acids synthesis, leading to beneficial effects on cryopreservation of bovine embryos in vitro produced. The transcription factor called sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1c), preferably regulates the gene transcription of phospholipids and triacylglycerol synthesis and the stearoyl-Co A desaturase (SCD1) enzyme promotes the monounsaturated fatty acids synthesis, giving fluidity to cell membranes. The aim of this study was to evaluate the supplementation of differentconcentrations of phenazine ethosulfate (PES) in the culture medium during in vitro production of bovine embryos, and determine the effect of PES in the pregnancy rate, aiming to improve the the embryo quality to cryopreservation by reducing the lipids accumulation. We evaluated the early development rates of in vitro produced embryos and pregnancy rates after inovulation of vitrified in vitro produced embryos derived from the Ovum Pick Up of Holstein cows. Expressionanalysis of triacylglycerol biosynthesis related genes, SCD1 and SREBP-1c, had the purpose to increase the basic knowledge on phenazine ethosulfate mechanisms of action, and was performed by Quantitative Real-Time PCR using pools of five embryos for each group. For statistical analysis, was performed ANOVA followed by mean test, and the chi-square test for pregnancy rates. There was no statistical difference in the cleavage rate and blastocyst rate between the control group and the groups treated with 0,2M; 0,3M; 0,5M of PES in the medium in vitro culture. The pregnancy rate, using cryopreserved embryos transferred to recipient was not altered by the use of PES. The expression of the SREBP-1c as well as SCD1 remained similar in the presence or absence of the PES during in vitro cultivation. Therefore it is necessary further studies to investigate in more details the PES mechanism of action in the genes of lipid biosynthesis pathway and whether it is feasible to use the field.