Genetic characterization of the haemagglutinin gene in canine distemper virus strains from naturally infected dogs in Brazil / Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)

Genetic characterization of the haemagglutinin gene in canine distemper virus strains from naturally infected dogs in Brazil / Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)

Caracterização molecular do vírus da cinomose canina, aspectos epizootiológicos, clínicos e do diagnóstico em cães naturalmente infectados

O vírus da cinomose canina (CDV) é um dos principais agentes infecciosos de cães domésticos e carnívoros silvestres, causando uma doença infecciosa multissistêmicas de alta mortalidade que acomete animais de diferentes faixas etárias, raças, machos e fêmeas e, tanto vacinados quanto não vacinados. A vacinação é o principal método de controle desta doença, no entanto, estudos vêm mostrando a possível existência de falhas vacinais em decorrência de diferença genética entre estirpes circulantes e estirpes vacinais. Dados referentes à epizootiologia são desconhecidos em Goiânia, poucos estudos comparam métodos diagnósticos em diferentes amostras em uma população de cães sintomáticos e às características moleculares do CDV em Goiás ainda não foram documentados. Este estudo objetivou determinar as características epizootiológicas do CDV, comparar os métodos diagnósticos de imunocromatografia (IC) e RT-PCR para a identificação do agente etiológico em diferentes amostras biológicas [swab conjuntival, sangue, urina, fluido cerebroespinal (FCE) e pool de amostras] e identificar as estirpes do CDV circulantes em cães naturalmente infectados e sintomáticos, no município de Goiânia, GO, Brasil, durante os anos de 2017 e 2020. Dados epizootiológicos foram coletados de 74 cães com sinais clínicos extraneurais e/ou neurais compatíveis com cinomose. Destes cães, 46 (62%) foram positivos por meio do teste de imunocromatografia (31%) ou pela técnica de RT-PCR (53%). Cães machos e fêmeas, de diferentes raças e idades foram acometidos, mas houve predominância em cães sem raça definida, adultos de um a seis anos e não vacinados. No entanto, aproximadamente 10,9% dos cães infectados e sintomáticos eram vacinados. Os sinais extraneurais predominantes foram hiporexia ou anorexia, secreção nasal e/ou ocular, desidratação e hiperqueratose de coxins e trufa. Dentre os sinais clínicos neurais os mais frequentes foram alteração de estado mental, déficit motor e mioclonias. Foi observada letalidade de aproximadamente 89% entre os animais com acometimento neurológico. As amostras de swab conjuntival, urina, pool e FCE tiveram maior frequência de positividade no teste de IC enquanto as amostras de urina e sangue, na RT-PCR. Do total de 149 amostras (sangue, urina e FCE) destinadas ao RT-PCR (gene N), o vírus foi identificado em 64 amostras (42,95%) e foram selecionadas 54 positivas para a RT-PCR seguida por Nested PCR para amplificação parcial do gene hemaglutinina (H). A amplificação parcial do gene H foi realizada e oito amostras foram sequenciadas e caracterizadas por meio da análise filogenética como pertencentes ao genótipo América do Sul 1/ Europa. Foram encontrados diferentes locais de substituição de aminoácidos no fragmento do gene H analisado das sequências identificadas e uma estirpe apresentou a mutação Y549H, típica de animais silvestres. Outros locais do fragmento apresentaram substituições em epítopos (resíduos 367, 376, 379, 381, 386 e 388) que podem interferir com a habilidade da vacina em promover proteção adequada contra a infecção pelo CDV, reduzindo sua efetividade. As estirpes isoladas foram geneticamente distante das estirpes vacinais, pertencentes ao genótipo América do Norte 1, com aproximadamente 10% de diferença nucleotídica. A partir da análise do genótipo América do Sul 1/ Europa, foram definidos dez subgenótipos. Esses achados evidenciam a relevância da infecção de cães por cinomose no Brasil, demonstrando a predominância do genótipo América do Sul 1/ Europa na região central do país e suportam a necessidade da realização de estudos epizootiológicos e de identificação molecular do CDV em outras regiões do país, em decorrência de sua grande extensão geográfica, da variabilidade de espécies animais acometidas, das diferenças moleculares entre as estirpes e da alta taxa de letalidade entre os animais infectados sintomáticos.

The canine distemper virus (CDV) is one of the main infectious agents of domestic dogs and wild carnivores, causing a multisystemic infectious disease with high mortality that affects animals of different age groups, breeds, males and females, and both vaccinated and unvaccinated. Vaccination is the main method of controlling this disease, however, studies have shown the possible existence of vaccine failures due to a genetic difference between circulating strains and vaccine strains. Data regarding epizootiology are unknown in Goiânia, few studies compare diagnostic methods in different samples in a population of symptomatic dogs and the molecular characteristics of CDV in Goiás have not yet been documented. This study aimed to determine the epizootiological characteristics of CDV, compare the diagnostic methods of immunochromatography (IC) and RT-PCR for the identification of the etiological agent in different biological samples [conjunctival swab, blood, urine, cerebrospinal fluid (CSF), and sample pool] and identify the circulating CDV strains in naturally infected and symptomatic dogs in the municipality of Goiânia, GO, Brazil, during 2017 and 2020. Epizootiological data were collected from 74 dogs with extraneural and/or neural clinical signs compatible with distemper. Of these dogs, 46 (62%) were positive using the immunochromatography test (31%) or by the RT-PCR technique (53%). Male and female dogs of different breeds and ages were affected, but there was a predominance in mixed breed dogs, adults aged one to six years and not vaccinated. However, approximately 10.9% of infected and symptomatic dogs were vaccinated. Predominant extraneural signs were hyporexia or anorexia, nasal and/or ocular discharge, dehydration, and nasal and digital hyperkeratosis. Among the neural clinical signs, the most frequent were changes in mental status, motor deficit, and myoclonus. A mortality rate of approximately 89% was observed among animals with neurological involvement. Conjunctival swab, urine, pool, and CSF samples had a higher frequency of positivity in the CI test, while urine and blood samples in RT-PCR. From a total of 149 samples (blood, urine, and FCE) destined for RT-PCR (N gene), the virus was identified in 64 samples (42.95%) and 54 positives were selected for RT-PCR followed by Nested PCR for partial amplification of the hemagglutinin (H) gene. Partial amplification of the H gene was performed and eight samples were sequenced and characterized by phylogenetic analysis as belonging to the South America 1/Europe genotype. Different amino acid substitution sites were found in the analyzed H gene fragment of the identified sequences and one strain presented the Y549H mutation, typical of wild animals. Other fragment sites had epitope substitutions (residues 367, 376, 379, 381, 386, and 388) that may interfere with the vaccine's ability to provide adequate protection against CDV infection, reducing its effectiveness. The isolated strains were genetically distant from the vaccine strains, belonging to the North America 1 genotype, with approximately 10% nucleotide difference. From the analysis of the South America 1/ Europe genotype, ten subgenotypes were defined. These findings highlight the relevance of canine distemper infection in Brazil, demonstrating the predominance of the South America 1/ Europe genotype in the central region of the country and support the need to conduct epizootiological and molecular identification studies of CDV in other regions of the country, due to its large geographic extension, the variability of animal species affected, the molecular differences between the strains and the high lethality rate among symptomatic infected animals.

CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA PROTEÍNA HEMAGLUTININA DO VÍRUS DA CINOMOSE CANINA EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS NOS ESTADOS DE MATO GROSSO E RONDÔNIA

O Morbillivirus canino (CDV) é o agente etiológico da cinomose canina (CC), uma importante doença de cães e carnívoros silvestres caracterizada por alta morbidade e mortalidade. A proteína hemaglutinina (H) presente no envelope possui importante função de adsorção viral e por isso apresenta elevada variabilidade genética em relação aos outros genes do CDV. Por essa razão tem sido utilizada para caracterizar as estirpes do CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. Diante do exposto o objetivo do presente estudo foi caracterizar a proteína hemaglutinina (H) em estirpes de CDV detectados em 15 cães naturalmente infectados no estado de Mato Grosso e Rondônia. As amostras foram coletadas de tecido nervoso central de cães que vieram a óbito. Foram inicialmente submetidas a RT-PCR para detecção do gene do nucleocapsídeo (N). As positivas foram em seguida testadas para amplificar o gene H. Em dez amostras houve amplificação completa do gene H. Análise filogenética revelou que as amostras se posicionaram em dois grupos: um geneticamente relacionado com isolados do Uruguai e, outro com linhagens oriundos de cepas brasileiras (especificamente dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul), todas as sequências foram classificadas dentro do genótipo América do Sul I/ Europa.

Canine Morbillivirus (CDV) is the etiological agent of canine distemper (CC), an important disease of dogs and wild carnivores characterized by high morbidity and mortality. The hemagglutinin (H) protein present in the envelope has an important function of viral adsorption and therefore has high genetic variability in relation to the other CDV genes. For this reason, it has been used to characterize CDV strains, allowing the identification of specific strains. Given the above, the objective of the present study was to characterize the hemagglutinin (H) protein in CDV strains detected in 15 naturally infected dogs in the states of Mato Grosso and Rondônia. The samples were collected from central nervous tissue of dogs that died. They were initially submitted to RT-PCR to detect the nucleocapsid (N) gene. The positive ones were then tested to amplify the H gene. In ten samples, there was complete amplification of the H gene. Phylogenetic analysis revealed that the samples were positioned in two groups: one genetically related to isolates from Uruguay and the other with strains from Brazilian strains (specifically from the states of Paraná and Rio Grande do Sul), all sequences were classified within the South America I / Europe genotype.

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE ENSAIO DE RT-PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS SUBTIPOS DO VÍRUS INFLUENZA A (H1/H3, N1/N2) CIRCULANTES EM SUÍNOS NO BRASIL

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/L, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.

Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/L, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.

Swine Influenza Virus: Standardization of a nested RT-PCR and subtyping of field samples circulating in Brazil from 2012-2018

O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012-2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo co-infecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012-2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas

Influenza A virus (IAV) causes an acute respiratory disease in pigs, characterized by high morbidity in the herds. The IAVs have a segmented negative sense genomic RNA, which contributes to genetic mutations and virus rearrangements. The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the main targets of host immune response, and mutations in these glycoproteins contribute to the genetic diversity of the virus. Three subtypes of swine influenza virus (SIV) circulate worldwide in the swine population: H1N1, H1N2 and H3N2. Rapid identification of viral subtypes is important for virus monitoring, assisting the detection of possible outbreaks and viral antigenic variations. The objective of this study was to standardize a RT-PCR test for the detection of SIV subtypes present in Brazil, analyzing their distribution combined with serological data from 2012-2018. The delineation of specific primers for the HA region was carried out from sequences of Brazilian samples, previously deposited at GenBank database. Characterized samples of H1N1pdm09, H3N2 and H1Delta were used as references. A first (One Step RT-PCR) and a second (Nested PCR) reaction was performed to standardize the test. Ninety-two field samples, previously positive for IAV, from 2012 to 2018 were used for the test validation. Sensitivity was assessed from the detection limit test and specificity from cross primer assays in control samples. The amplified PCR products from the field samples were sequenced and phylogenetic analysis was performed, as well as the p-distance calculation between samples of the same subtype. Partial HA sequences of H1pdm, from samples of the study and from other years, were translated and compared. Subtyping the N gene of H1Delta positive samples was performed. Serological analyzes were performed on 949 serum samples obtained from 2017-2018, evaluating the presence of antibodies against H1N1pdm09 and H3N2 by the Hemagglutination Inhibition (HI) test. The Nested test was more sensitive than the One-step reaction. There was no nonspecific cross amplification. Seventy-one (71/92-77%) of the field samples were subtyped by the Nested RT-PCR, 14 (14/71-20%) collected in 2012-2013, 35 (35/71- 49%) in 2014-2015, and 22 (22/71-31%) in 2017-2018. In 2012-2015, most of the samples were positive for H1N1pdm09, followed by H1Delta and H3N2, with H1N1pdm09 + H3N2 and H1N1pdm09 + H1Delta co-infection. In 2017-2018, there were more positive samples for H1Delta, followed by H1N1pdm and H3N2, and co-infection was also observed. From the H1Delta positive samples, only 57% (12/21) were subtyped for the N gene, with the majority positive for N2. A total of 716 serum samples were positive for IAV, and in 2017-2018 the occurrence of H3N2 was higher than H1N1pdm09 as well as the co-infection between H1N1pdm09+H3N2. By the phylogenetic analysis, partial sequences of each analyzed subtype have grouped into similar clusters. The p-distance analysis identified dissimilarity between samples into the H1Delta cluster and samples into H1N1pdm09 group. Amino acid alignment of H1N1pdm partial sequences, from different years, showed residual variations, especially at antigenic sites. The Nested RT-PCR technique was fast, sensitive and specific, which is recommended for SIV subtyping. Four subtypes of SIV circulate in Brazil. In 2012-2015 a higher occurrence of H1N1pdm was evidenced, but H3N2 was the most observed in 2017-2018. Analysis of amino acid residues of the H1N1pdm sequences demonstrated point substitutions between samples from different years, suggesting the evolution of the virus over time. Studies related to the genetic characterization of circulating SIVs in Brazil are essential to understand the evolution of viruses and their antigenic characteristics.

Neuroadaptação de cepa selvagem do CDV em camundongos (Mus musculus) e análise filogenética do gene Hemaglutinina em amostras de campo detectadas no Brasil

O vírus da cinomose canina (CDV) é um relevante patógeno de caninos domésticos e carnívoros selvagens. Pertencente á família Paramyxoviridae e ao gênero Morbillivirus, o CDV constitui o agente etiológico de uma infeção enzoótica mundialmente. Alguns relatos de cães supostamente vacinados que desenvolveram a doença trazem à tona questionamentos sobre a eficácia das formulações vacinais frente às cepas selvagens, levantando algumas hipóteses acerca da evolução do CDV. Com o objetivo de produzir uma linhagem do vírus de CDV capaz de reproduzir a enfermidade em camundongos e analisar o gene da Hemaglutinina do vírus CDV em amostras de campo de cães naturalmente infectados no Brasil, esta dissertação será apresentada na forma de dois artigos científicos. No primeiro, foi proposto o estabelecimento de uma linhagem de CDV neurotrópica para camundongos, capaz de induzir a doença a partir de uma cepa de CDV brasileira selvagem, através de inoculação intracerebral em camundongos Swiss neonatos, observando-se através de análises moleculares que não houve amplificação do material genético viral de interesse. No segundo artigo, amostras clínicas de cães naturalmente infectados no Brasil foram submetidas a um estudo filogenético utilizando o genoma full-lenght da glicoproteína H do CDV, onde foram obtidos cinco isolados distintos: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, todos agrupados no genogrupo Europa/América do Sul-1, grupo distinto do que abrange as cepas vacinais. Pesquisas de polimorfismos já descritos na literatura foram realizadas nos aminoácidos gerados, onde foi detectada a substituição R580Q nas amostras isoladas de Pernambuco, importante na eficiência da fusão e expressão da superfície proteica da hemaglutinina.

Canine distemper virus (CDV) is a relevant pathogen of domestic canines and wild carnivores. Belonging to the Paramyxoviridae family and the genus Morbillivirus, CDV is the etiologic agent of an enzootic infection worldwide. Some reports of supposedly vaccinated dogs that developed the disease raise questions about the efficacy of vaccine formulations against wild-type strains, raising some hypotheses about the development of CDV. With the objective of producing a CDV virus strain capable of reproducing the disease in mice and analyzing the Hemagglutinin CDV virus gene in field samples from naturally infected dogs in Brazil, this dissertation will be presented in the form of two scientific articles. In the first, it was proposed the establishment of a neurotropic CDV line for mice, capable of inducing the disease from a wild Brazilian CDV strain, through intracerebral inoculation in Swiss neonatal mice, observing through molecular analyzes that there was no amplification of viral genetic material of interest. In the second article, clinical samples of naturally infected dogs in Brazil were submitted to a phylogenetic study using the full-lenght genome of CDV H-glycoprotein, where five different isolates were obtained: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, all grouped in the genogroup Europe / South America-1, a group distinct from that covering the vaccine strains. Polymorphism studies already described in the literature were performed on the generated amino acids, where the R580Q substitution was detected in samples isolated from Pernambuco, important in the fusion efficiency and expression of the protein surface of hemagglutinin.

CINOMOSE EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS E ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE DA HEMAGLUTININA DO VÍRUS DA CINOMOSE

A cinomose canina é uma das enfermidades infectocontagiosas mais importantes que acomete os cães. É uma doença causada pelo vírus da Cinomose (Canine Distemper Virus - CDV), um Paramyxovirus, do gênero Morbillivirus, de ocorrência mundial, sem sazonalidade, sem predileção de sexo ou raça, apresenta maior incidência em animais jovens, podendo acometer todas as idades. No Brasil, pesquisas sobre o uso de técnicas que comparam os diferentes testes diagnósticos direto para o vírus da cinomose (CDV) associado a análise molecular e filogenética do mesmo ainda continuam escassas. Além disso, são poucos os estudos sobre epidemiologia molecular que relatam diferenças marcantes na análise filogenética do gene hemaglutinina (H) do CDV entre os isolados de campo e as cepas de referência do CDV, especialmente àquelas utilizadas na produção de vacinas. Dessa maneira, o presente trabalho tem como principal objetivo avaliar os principais métodos diagnósticos laboratoriais para identificação do CDV em cães com suspeita de cinomose associando à análise filogenética do gene H dos isolados de campo. O Ensaio imunocromatografico direto (IC), a RT-PCR e a Nested-PCR foram avaliados para detecção do CDV em diferentes amostras clínicas (urina, suabes retais e conjuntivais) de 62 animais suspeitos de cinomose, provenientes do atendimento ambulatorial do hospital veterinário da Unesp (Jaboticabal-SP) e de clínicas particulares da região. Após detecção viral as amostras foram submetidas a sequenciamento seguida de análise filogenética do gene H do CDV. Um total de 42 animais foram positivos em pelo menos uma das técnicas utilizadas neste experimento. As técnicas moleculares (RT-PCR e Nested-PCR) demonstraram maior sensibilidade que o ensaio comercial de IC. Os resultados obtidos da análise filogenética do gene H sugeriram que o grupo de isolados do CDV no Brasil são distintos das cepas vacinais e são mais relacionados genotipicamente aos isolados Europeus 1/Sul-Americanos 1. Em conclusão, a técnica Nested-PCR aplicada na detecção do CDV em suabes retais revelou-se o método mais eficaz e sensível para identificação desse vírus, que associado a análise filogenética pode ser classificado em um clado diferente das cepas vacinais sugerindo um potencial de infecção para os cães domésticos inclusive os vacinados.

Canine distemper is one of the most important infectious diseases that affects dogs. It is a Canine Distemper Virus (CDV), a Paramyxovirus, of the genus Morbillivirus, a global deforest, without seasonality, without predilection of sex or race, that is constituted by the majority of the animals, being able to affect all ages. In Brazil, research on the use of techniques that compare the different direct diagnostic tests for the distemper virus (CDV) associated with a molecular and phylogenetic analysis of the same are still scarce. In addition, there are some studies on molecular epidemiology that report differences in the phylogenetic analysis of the hemagglutinin (H) gene from CDV between the fields of action and as a reference for CDV, especially the practices used in the production of vaccines. Thus, the main objective of this study is to identify laboratory diagnoses for the identification of CDV in dogs with suspected pair association to the phylogenetic analysis of the H gene of the field isolates. The direct immunochromatographic (CI) assay, RT-PCR and nested-PCR were evaluated for the detection of CDV in different animal species (urine, swabs and conjunctival) of 62 suspected cases of distemper from the outpatient clinic of the Unesp (Jaboticabal-SP) and the private medical records of the region. After viral detection as sequential sequencing followed by phylogenetic analysis of the CDV H gene. A total of 42 animals were positive at least one of the experiment techniques in this experiment. As molecular techniques (RT-PCR and Nested-PCR) demonstrated greater sensitivity than the commercial IC test. The results obtained from the phylogenetic analysis of the H gene suggest that the group of CDV cells in Brazil are distinct from the vaccine strains and are more commonly genotyped to the following European 1 / South American 1. In conclusion, a Nested-PCR technique. CDV can be used as a more effective and sensitive method to virus infection, which is associated with a phylogenetic analysis that can be classified into one of the different clones of the vaccines, suggesting a potential for infection for animals that include the vaccinated.

Caracterização molecular de vírus da influenza equina brasileiros, 2012 e 2015

A influenza equina (EI) é uma enfermidade respiratória viral aguda que acomete equídeos de todas as idades. A doença é causada pelo vírus da influenza equina (EIV do inglês Equine Influenza Virus), que podem ser do subtipo viral H3N8 (antigo Equi-2), mundialmente distribuído, e o H7N7 (antigo Equi-1), considerado extinto desde 1980. Os EIVs pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A, possuem genoma RNA fita simples segmentado de senso negativo e são envelopados. A EI tem alta morbidade e baixa mortalidade leva a grandes perdas econômicas no ramo equestre. Os animais acometidos ficam impedidos de serem transportados ou de participarem de eventos equestres no Brasil. A rápida e fácil disseminação do EIV é bastante característico em surtos de EI. Surtos de EI foram descritos em 2012 em diversos países, incluindo o Brasil. Em 2015, um surto de EIV ocorreu em um Hospital Veterinário na cidade de São Paulo-SP. Os objetivos do presente trabalho foram: a) obter isolados do vírus da influenza equina de surtos recentes do estado de São Paulo, Brasil; b) realizar o sequenciamento dos EIVs isolados; c) promover a análise filogenética e evolutiva desses EIVs. Foram isolados 12 EIVs de um surto de EI em um hospital veterinário na cidade de São Paulo em 2015. Promoveu-se o sequenciamento dos oito genes virais dos isolados de 2015 e de uma estirpe de EIV de um surto brasileiro de 2012, e da hemaglutinina de outras duas estirpes do mesmo surto de 2012. Os vírus do surto de 2012 foram cedidos pelo Laboratório de Raiva e Encefalites Virais do Instituto Biológico de São Paulo para as análises. O sequenciamento dos genes HA e NA indicaram que os EIVs de 2012 e 2015 brasileiros são do subtipo H3N8 e pertencem à sublinhagem Flórida 1 e tiveram maiores identidades com os vírus de 2012 da América do Sul, Estados Unidos e Dubai de 2012. Os vírus de 2015 formaram um clado separado dos demais EIV Flórida 1, tanto na análise filogenética quanto na análise de relógio molecular. As análises de mutações de nucleotídeos e aminoácidos, associados à análise de perfil de hidrofobicidade sugerem mudanças em estruturas antigênicas que poderiam acarretar no maior distanciamento em relação à estirpe vacinal A/equine/South Africa/4/03.

The equine influenza (EI) is a viral acute respiratory disease that can affect equines of any age. The disease is caused by the equine influenza virus (EIV) and has two different subtypes H3N8 (formerly Equi-2) that occurs worldwide and H7N7 (formerly Equi-1), considered extinct since 1980. EIVs belong to the Orthomyxoviridae family, Influenza A genus, are enveloped and has negative segmented single strand RNA genome. EI causes high morbidity and low mortality and drives to high economic losses in equestrian industry. In Brazil, the transport and participation in equestrian events are not allowed when horses have EIV. The quickly spread pattern is easily seen in EIV outbreaks. EI outbreaks occurred in 2012 in several countries, including Brazil. In 2015, an outbreak occurred in a Veterinarian Hospital in São Paulo-SP. The objectives of the present study were: a) to obtain isolates of equine influenza virus from recent outbreaks in the State of São Paulo, Brazil; b) to promote the sequencing of these EIVs; c) to perform the phylogenetic and evolutive analysis of these EIVs. Twelve EIVs were isolated from an outbreak in a veterinarian hospital in the State of São Paulo in 2015. The eight viral genes were sequenced from EIVs of 2015 and from one EIV of a Brazilian outbreak, 2012. Also, the HA gene from two other EIVs from the same 2012-outbreak were sequenced. The viruses from the 2012-outbreak were from the Laboratory of Rabies and Viral Encephalitis, Instituto Biológico de São Paulo. Sequencing on HA and NA genes indicates that the Brazilian 2012 and 2015 EIVs are H3N8 subtype, belong to the Florida 1 sublineage and were more identical to the 2012 EIVs from South America, United States and Dubai. In the phylogenetic tree and the molecular clock the EIVs from 2015 grouped in a cluster that was separeted from other Florida 1 EIVs. The nucleotide, amino acid and hydrophobicity analysis suggest changes in antigenic structures that could lead to differences from the vaccine strain A/equine/South Africa/4/03.

Some virulence genes of Escherichia coli isolated from cloacal swabs of healthy Alagoas Curassows (Pauxi mitu) in Brazil / Alguns genes de virulência de Escherichia coli isoladas de mutuns-do-nordeste (Pauxi mitu) sadios no Brasil

Birds of the Cracidae family (curassows, guans, and chachalacas) are endemic of the Neotropics and 50 species are currently classified. Brazil has 22 species, seven of which are considered threatened. The Alagoas Curassow (Pauxi mitu) species is considered extinct in the wild; but about 120 birds are alive in captivity. Conservation of this species depends entirely on correct management. Health reports of both wildlife and captive curassows are rare. In this study the presence of Escherichia coli was evaluated in 23 healthy Alagoas Curassows from two private breeding centres. E. coli was isolated from cloacal swabs, and the presence of genes encoding cytotoxic necrotising factor 1 (cnf1), alpha-haemolysin (hly), aerobactin (iuc), serum resistance (iss) and the following adhesions: S fimbriae (sfa), pili associated with pyelonephritis (pap) and temperature-sensitive haemagglutinin (tsh) were investigated. E. coli was isolated from 78.3% (18/23) of the birds, and the percentage of curassows colonized by E. coli was similar between the two facilities. From the 22 E. coli isolates, 15 (68.2%) were positive for at least one virulence factor by PCR, and the most frequently found gene was iss (50%). No curassows had clinical signs of disease. Nevertheless, the presence of some E. coli strains may be a concern to the wildlife in captivity. Additional health surveillance studies are essential to guarantee successful conservation programmes for threatened cracids in Brazil.(AU)

Aves da família Cracidae (mutuns, jacutingas e aracuãs) são endêmicas da região Neotropical com 50 espécies atualmente classificadas. O Brasil possui 22 espécies nesta família e sete delas são consideradas ameaçadas de extinção. O mutum-do-nordeste (Pauxi mitu) é considerado extinto na natureza, no entanto, aproximadamente 120 indivíduos são mantidos em cativeiro. A conservação desta espécie depende inteiramente de um manejo correto. Informações sobre o status sanitário de mutuns são raras, tanto em vida livre quanto em cativeiro. Neste estudo a presença de Escherichia coli foi avaliada em 23 mutuns-do-nordeste sadios de dois criatórios particulares. E. coli foi isolada a partir de suabes cloacais, em seguida, foi avaliada a presença de genes que codificam fator citotóxico necrotizante 1 (cnf1), alfa-hemolisina (hly), produção de aerobactina (iuc) e resistência sérica (iss) e genes que codificam os seguintes fatores de virulência: fímbria S (sfa), pili associado à pielonefrite (pap) e hemaglutinina termosensível (tsh). E. coli foi isolada de 78,3% (18/23) das aves e o percentual de mutuns positivos para E. coli foi semelhante entre as duas criações. De 22 isolados de E. coli, 15 (68,2%) foram positivos para pelo menos um fator de virulência pela PCR e o gene mais frequente foi o iss (50%). Nenhuma ave apresentava sinal clínico de doença, no entanto, a presença de determinadas cepas de E. coli pode representar uma preocupação em relação às aves silvestres mantidas em cativeiro. Estudos adicionais de monitoria do status sanitário do plantel são essenciais para garantir o sucesso de futuros programas de conservação de cracídeos ameaçados no Brasil.(AU)

Detecção molecular e análise filogenética do gene H de amostras do vírus da cinomose canina em circulação no município de Campinas, São Paulo / Molecular detection and phylogenetic analysis of the gene H from canine distemper virus isolates circulating at the municipality of Campinas, São Paulo

O vírus da cinomose canina (CDV), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae, é o agente etiológico de doença neurológica e sistêmica em cães. O diagnóstico laboratorial da infecção requer o isolamento viral ou detecção do material genético do vírus em secreções ou tecidos de cães com suspeita clínica da doença. A diversidade genética entre os isolados de CDV pode ser aferida pelo sequenciamento efilogenia molecular do gene que codifica a hemaglutinina viral (gene H), havendo atualmente um especial interesse em comparar as amostras circulantes a campo com o genogrupo América-1, que abrange as cepas presentes nas vacinas disponíveis no mercado. No presente estudo, foi realizada a detecção molecular do gene H de CDV a partir de amostras biológicas colhidas ante- e post- -mortem de 15 cães com sinais clínicos sugestivos de cinomose na região metropolitana de Campinas, São Paulo. Dez dos 15 cães analisados tiveram ao menos um órgão positivo na detecção molecular e os amplicons obtidos foram submetidos ao sequenciamento nucleotídico seguido de análise filogenética molecular. De forma semelhante ao que já foi reportado para estudo analisando a diversidade do gene H em outros países, a reconstrução filogenética obtida para as amostras de casos de cinomose da região de Campinas demonstrou as mesmas foram agrupadas junto a amostras norte-americanas, europeias e japonesas recentes, em um grupo genético distinto do grupo de amostras clássicas de CDV, nomeado America-1, o qual engloba as estirpes vacinais Snyder Hill, Onderstepoort e Lederle.(AU)

Canine distemper virus (CDV), a Morbillivirus of the family Paramyxoviridae, is the etiological agent of neurological and systemic disease in dogs. The laboratory diagnosis of infection requires viral isolation or detection of genetic material of the virus in secretions or tissues of dogs with clinical suspicion of the disease. The genetic diversity among isolates of CDV can be assessed by sequencing and phylogenetic analysis of the gene that encodes the viral hemagglutinin (H gene), and there is currently a special interest in comparing the strains currently circulating in the field with the genogroup America-1, which comprises strains present in vaccines available in the market. In this study, the molecular detection of CDV gene H was performed from biological samples harvested ante-and post-mortem from 15 dogs with clinical signs suggestive of canine distemper in the metropolitan region of Campinas, São Paulo. Ten of the 15 dogs examined had at least one positive organ under molecular detection and the obtained amplicons were sequenced and further analyzed by molecular phylogenetic analysis. Similarly to what has already been reported on previous studies regarding the diversity of the gene H in other countries, the phylogenetic reconstruction obtained for the samples of cases of distemper from Campinas region showed they were grouped with the North American, European and Japanese newly described samples, a genetic group distinguished from classical samples of CDV, named America-1, which encompasses the vaccine strains Snyder Hill, Onderstepoort and Lederle.(AU)

Isolation and characterization of a pandemic H1N1 influenza virus in pigs in Brazil / Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.

Isolation and characterization of a pandemic H1N1 influenza virus in pigs in Brazil / Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.(AU)

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.(AU)

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.(AU)

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.(AU)

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos.

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. (AU)

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found. (AU)

Genes associated with pathogenicity of avian Escherichia coli (APEC) isolated from respiratory cases of poultry / Genes associados à patogenicidade de Escherichia coli patogênica para aves (APEC) isoladas de frangos de corte com sintomatologia clínica respiratória

The virulence mechanisms of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) have been continually studied and are believed to be multi-factorial. Certain properties are primarily associated with virulent samples and have been identified in avian isolates. In this study a total of 61 E. coli, isolates from chicken flocks with respiratory symptomatology, were probed by Polimerase Chain Reation (PCR) for the presence of genes responsible for the adhesion capacity, P fimbria (papC) e F11 fimbria (felA), colicin production (cvaC), aerobactin presence (iutA), serum resistance (iss), temperature-sensitive hemagglutinin (tsh), and presence of K1 and K5 capsular antigens (kpsII). The iss gene was detected in 73,8 percent, tsh in 55,7 percent, iutA in 45,9 percent, felA in 39,3 percent, papC in 24,3 percent, cvaC in 23 percent and kpsII in18 percent.(AU)

Os mecanismos de virulência das amostras de Escherichia coli potencialmente patogênicas para aves (APEC) têm sido continuamente estudados e acredita-se ser multifatorial. Certas propriedades são associadas primariamente a amostras virulentas e vêm sendo identificadas em amostras de E. coli isoladas de aves. Neste estudo um total de 61 amostras de E. coli, isoladas de frangos de corte com problemas respiratórios, foram testadas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para a presença dos genes responsáveis pela capacidade de adesão, fimbria P (papC) e fimbria F11 (felA), produção de colicinas (cvaC), presença de aerobactina (iutA), resistência sérica (iss), hemaglutinina temperatura sensível (tsh) e presença de dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsII). O gene iss foi detectado em 73,8 por cento, tsh em 55,7 por cento, iutA em 45,9 por cento, felA em 39,3 por cento, papC em 24,3 por cento, cvaC em 23 por cento e kpsII em 18 por cento.(AU)

Detecção do vírus da cinomose canina por RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos para os genes da fosfoproteína, hemaglutinina e neuraminidase / Detection of canine distemper virus by RT-PCR using oligonucleotides targeted to the phosphoprotein, hemagglutinin and neuraminidase genes

Empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa para detecção do vírus da cinomose canina (CC). Para a padronização da técnica foram selecionados quatro pares de oligonucleotídeos (P1, P2, N1, H1), baseados em seqüências dos genes da fosfoproteína, neuraminidase e hemaglutinina, sendo utilizadas três cepas vacinais de vírus da CC como controles positivos. Foram analisadas três amostras isoladas de cães com cinomose e quatro amostras provenientes de cães com suspeita clínica de cinomose. Não houve amplificação nas amostras com suspeita clínica da doença. Os resultados obtidos com os oligonucleotídeos P1 e N1 foram superiores aos de H1. Os oligonucleotídeos P2 foram considerados inapropriados para a detecção do vírus da CC. Os amplicons obtidos com os oligonucleotídeos P1, N1 e H1 foram clivados com endonucleases de restrição, sendo os perfis das amostras virais comparados aos da amostra vacinal Lederle, utilizada como referência. Um padrão similar de restrição foi observado em todas as amostras analisadas(AU)

The reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect canine distemper virus (CDV). Four oligonucleotide pairs were selected (P1, P2, N1, H1), based on the sequences of the phosphoprotein, hemagglutinin and nuraminidase genes for assay standardization, and three CDV vaccine strains were used as positive controls. Three viral isolates from dogs with canine distemper and four samples from animals clinically suspected of distemper were analysed. No amplification was detected in suspected samples. Results obtained by using P1 and N1 oligonucleotides were superior to those with H1 ones. P2 oligonucleotides were considered inadequate for CDV detection. Amplicons resulting from amplification of P1, N1 and H1 oligonucleotides were submitted to cleavage by restriction endonucleases and restriction patterns of viral samples were compared to that of Lederle strain used as reference. A similar restriction pattern was observed in all analysed samples(AU)

Produção de antígenos recombinantes do vírus da doença de Newcastle para aplicação no imunodiagnóstico

Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN

Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN

Perfil de restrição de um fragmento do gene da hemaglutinina amplificado pela RT-PCR a partir de estirpes vacinais e selvagens do vírus da cinomose canina / Restriction pattern of a hemagglutinin gene amplified by RT-PCR from vaccine strains and wild-type canine distemper virus

Fragmentos com 721 pares de bases do gene da hemaglutinina (H) do vírus da cinomose canina (CDV), amplificados pela RT-PCR a partir de três estirpes vacinais (Snyder Hill, Onderstepoort e Rockborn) e de 27 amostras de campo, provenientes de cães com cinomose, foram clivados com as endonucleases Hinf I and Rsa I. A seleção das enzimas foi realizada por meio de análises in silico de seqüências do CDV depositadas em bases públicas de dados. Tanto as estirpes vacinais quanto as amostras selvagens do CDV apresentaram com a enzima Hinf I o mesmo perfil de restrição, confirmando a identidade do fragmento amplificado pela RT-PCR, uma vez que todas as estirpes com seqüências disponíveis (GenBank) têm sítios de restrição para essa enzima nas mesmas posições. O perfil de restrição das estirpes vacinais Snyder Hill e Onderstepoort, que diferem entre si, foi confirmado com a enzima Rsa I que também clivou a estirpe Rockborn nas mesmas posições que a estirpe Snyder Hill. Todas as 27 amostras de campo do CDV apresentaram com a enzima Rsa I o mesmo perfil de restrição, indicando conservar os mesmos sítios de restrição para essa enzima. O perfil das amostras de campo foi diferente daquele obtido nas três estirpes vacinais. Os perfis de restrição do gene que codifica a hemaglutinina do CDV, gerados pela enzima Rsa I, sugerem diferenças moleculares entre as estirpes vacinais e as selvagens circulantes na região norte do estado do Paraná e abrem a perspectiva da elaboração de análises moleculares comparativas mais complexas, como o seqüenciamento de todo o gene H, de estirpes do CDV identificadas em diferentes regiões brasileiras.(AU)

The restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay of a 721 bp fragment from hemagglutinin (H) gene of canine distemper virus (CDV) amplified by RT-PCR was analyzed with Hinf I and Rsa I enzymes. Clinical samples from 27 dogs with natural canine distemper infection, and three vaccine (Snyder Hill, Onderstepoort and Rockborn) CDV strains were analyzed. All RT-PCR amplified product from CDV wild-type and vaccine-strains had the same RFLP pattern with Hinf I enzyme showing the amplicon specificity. The RFLP pattern for CDV vaccine-strains generated with Rsa I enzyme was the expected by in silico analysis. All 27 wild-type CDV strains present the same Rsa I enzyme RFLP pattern that was different from vaccine-strains pattern, suggesting molecular differences between vaccine-strains and wild-type of CDV from dogs population in North region of Paraná State/Brazil. These results open the perspectives of the accomplishment of comparative molecular analysis, such as sequencing of the whole gene H, of CDV wild-type strains identified in different Brazilian regions.(AU)