EFEITOS DO DESMAME NA FUNÇÃO MITOCONDRIAL, ESTRESSE OXIDATIVO, INFLAMAÇÃO E APOPTOSE EM LEITÕES DE DIFERENTES PESOS AO NASCER

O período pós-desmame é caracterizado por uma alta incidência de deficiência energética celular, distúrbios intestinais e infecções bacterianas que podem levar a doenças graves. Evidências indicam que a função mitocondrial e o estresse oxidativo estão intimamente relacionados no controle da eficiência energética celular, resposta imune e bactérias patogênicas. Portanto, estratégias eficazes que visam melhorar a saúde metabólica dos leitões e aumentar vigor durante o período pós-desmame precisam ser desenvolvidas. No entanto, mesmo que tal conceito seja altamente promissor, poucas informações estão disponíveis atualmente em relação à intensidade e duração desse estresse em leitões com normal e baixo peso ao nascimento. Portanto, objetivou-se caracterizar marcadores do metabolismo energético e estresse oxidativo ao longo do período peri-desmame. Um total de 30 (trinta) porcas multíparas foram inseminadas e as leitegadas foram padronizadas em 10 leitões. Os leitões foram distribuídos para um dos dois grupos experimentais: leitões de peso normal ao nascimento (NPN, 1,73 ± 0,01 kg, n = 60) e leitões de baixo peso ao nascimento (BPN, 1,01 ± 0,01 kg, n = 60). Em seguida, 10 leitões de cada grupo foram selecionados aos 14, 21, 23, 25, 29 e 35 dias de idade para a coleta de amostras de plasma e órgãos (fígado, jejuno e rins). Observou-se aumento significativo (P < 0,05) do dano oxidativo ao DNA (8-OHdG) e das proteínas plasmáticas (grupo carbonila). Uma diminuição (P < 0,05) no nível de energia celular na forma de adenosina trifosfato (ATP) foi observada no fígado após o desmame. Essa diminuição na produção de energia mitocondrial está relacionada à atividade mitocondrial maior (P<0,05) da enzima antioxidante glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD) no fígado, mucosa intestinal e rins de leitões após o desmame. Além disso, os níveis de dano oxidativo ao DNA (8-OHdG) mensurados no plasma e protéina hépatica foram maiores (P < 0,05) nos leitões BPN. Na sequência foram analisados ensaio de RT2 ProfilerTM PCR de genes relacionadas à função mitocondrial, estresse oxidativo, processos de inflamação e apoptose em leitões NPN (23d, 35d vs. 14d). A expressão dos genes selecionados foi avaliada por RT- PCR quantitativo. Essas análises revelaram que a expressão de RNAm das moléculas inflamatórias (IL-8 e CCL19) aumentou após o desmame na mucosa intestinal, enquanto a expressão de genes que codificam subunidades da cadeia respiratória mitocondrial (NDUFA2 e NDUFA5) foi reduzida no fígado de ambos os grupos (P < 0,05). Os principais moduladores da apoptose mitocondrial (BCL2A1 e BNIP3) e do sistema de defesa antioxidante (TXNRD2, GPx3, HMOX1) foram altamente expressos em leitões BPN comparados a NPN (P < 0,05). Além disso, os níveis sistêmicos de moléculas inflamatórias (TNF- e IL1-) aumentaram logo após o desmame e foram maiores nos leitões NPN (P < 0,05). Esses resultados indicaram que o desmame causa diminuição da energia mitocondrial no fígado, intestino e rim, em associação com condições de estresse oxidativo. Além disso, esses resultados sugerem que defesas antioxidantes, resposta inflamatória e apoptose estão comprometidas em leitões BPN.

The period following weaning is characterised by a high incidence of energetic deficiencies, intestinal disturbances and bacterial infections that led to serious diseases. Evidence indicates that mitochondrial function and oxidative stress are closely related to controlling cellular energetic efficiency, immune response and bacterial pathogenesis. Thus, effective strategies aiming to improve metabolic health of piglets and increased their robustness during the post-weaning period need to be developed. However,little information is currently available regarding the intensity and duration of this stress in both normal and low weight piglets. The objective was to characterize markers of energy metabolism and oxidative status throughout the peri- weaning period. Thirty (30) multiparous sows were inseminated, and litters were standardized to 10 piglets. Piglets were designed to one of two experimental groups: normal birth weight piglets (NBW, 1.73 ± 0.01 kg, n = 60) and low birth weight piglets (LBW, 1.01 ± 0. 01 kg, n = 60). Then, 10 piglets from each group were selected at 14, 21, 23, 25, 29 and 35 days of age to collect plasma and organ (liver, intestinal mucosa and kidney) samples. Analysis revealed a significant increase (P < 0.05) in plasma levels of both oxidative damage to DNA (8-OHdG) and proteins (protein carbonyls) measured in plasma increased after weaning. A decrease (P < 0.05) in cellular energy level in the form of adenosine triphosphate (ATP) content, known to be produced in mitochondria, was observed in the liver after weaning. This decrease in mitochondrial energy production was found to be linked to significantly higher (P < 0.05) mitochondrial activity major antioxidant glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) in liver, intestinal mucosa and kidney of piglets after weaning. Additionally, the levels of oxidative damage to DNA (8-OHdG) measured in plasma and of liver protein carbonyls were found to be higher (P < 0.05) in LBW piglets. RT2 Profiler TM PCR arrays were assessed for genes related to mitochondrial function, oxidative stress, inflammation and apoptosis in NBW piglets (d 23 and 35 vs. d 14). The expression of selected genes was assessed by quantitative PCR. These analyzes revealed that the mRNA expression of inflammatory molecules (IL-8 and CCL19) increased after weaning in the intestinal mucosa, while the expression of genes encoding subunits of the mitochondrial respiratory chain (NDUFA2 and NDUFA5) was reduced in the liver of both groups (P <0.05). The main modulators of mitochondrial apoptosis (BCL2A1 and BNIP3) and the antioxidant defense system (TXNRD2, GPx3, HMOX1) were highly expressed in LBW piglets compared to NBW (P <0.05). In addition, the systemic levels of inflammatory molecules (TNF- and IL1- ) increased in the days after weaning and are higher in NBW piglets (P <0.05). These results indicated that weaning causes decrease in mitochondrial energy in liver, intestine and kidney after associated with oxidative stress conditions. Further, these findings suggest that antioxidant defenses, inflammatory response and apoptosis, are compromised in LBW piglets.

EFEITOS DA DIETA E DA EFICIÊNCIA ALIMENTAR DE TOUROS JOVENS NELORE SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E ACÚMULO INTRACELULAR DE LIPÍDEOS EM EMBRIÕES PRÉ-IMPLANTACIONAIS PRODUZIDOS IN VITRO

Na bovinocultura de corte, a alimentação corresponde ao maior custo associado à produção de carne. A avaliação do consumo alimentar residual (CAR) tem sido uma ferramenta importante para direcionar a seleção de bovinos de corte e otimizar economicamente esta atividade. No entanto, alguns estudos mostram uma diminuição da motilidade, do perímetro escrotal, uma menor taxa de prenhez e parto em animais eficientes para CAR. Uma estratégia para solucionar tais problemas é a suplementação ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) que não apenas aumentam a densidade energética da dieta, mas também atuam na melhoria do desempenho reprodutivo. No entanto, o ideal é que tais características de seleção para CAR e efeito da suplementação com AGPs sejam passadas à prole, assim o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito paterno da seleção para consumo alimentar residual (CAR) e da suplementação dos touros com AGs para a PIVE, o acúmulo de lipídio embrionário e a expressão de genes. Animais classificados em baixo CAR e alto CAR foram utilizados no experimento. O delineamento experimental obedeceu a um esquema fatorial 2 x 2 (CAR x Suplementação), a análise estatística foi realizada pelo programa JPM (versão 5.0.1, SAS Institute). Após a amostragem, os animais foram separados aleatoriamente em dois grupos: com suplementação de AGs protegido e com suplementação controle (sem AGs protegido). O experimento foi composto por quatro tratamentos, o sêmen dos touros foi congelado (4 tratamentos), sendo 6 animais suplementados com AGs protegido (3 baixo CAR e 3 alto CAR) e 6 animais com suplementação controle, sem AGs (3 baixo CAR e 3 alto CAR). O sêmen foi utilizado para produção in vitro de embriões; os blastocistos foram reservados para análise da quantificação de lipídios e os blastocistos expandidos para análise da expressão gênica. A quantificação de lipídios foi avaliada utilizando o corante Sudan Black B 1% e as imagens foram analisadas pelo programa Image J (National Institutes of Health, USA). A análise de expressão gênica dos embriões foi feita pela técnica de qPCR utilizando o sistema de micro-fluídica Biomark HD (Fluidigm®, South San Francisco, CA, USA). Não houve diferença na produção in vitro de embriões oriundos de animais CAR- ou CAR+, nem entre os tratamentos suplementados com AGs. Embriões de touros CAR+ apresentaram maior conteúdo lipídico quando comparado com o grupo CAR-. Os genes que apresentaram diferença associados à dieta foram o HMOX1, SREBF1 e o GPX4. Os referentes ao perfil CAR que diferiram foram o PLAC8, PPARGC1A e o NFE2L2. Os relacionados com a interação entre dieta e CAR que apresentaram diferença foram o RPLP0, ATF4, H3F3A, HSF1, HMGCS1, SLC2A5, NANOG, REST e o GPX4. Conclui-se que a dieta e a seleção para CAR dos touros afetou a expressão gênica dos embriões produzidos in vitro utilizando o sêmen desses animais.

In beef cattle, feed corresponds to the highest cost associated with meat production. The evaluation of the selection for residual feed intake (RFI) has been an important tool to direct the selection of beef cattle and economically optimize this activity. However, some studies show a decrease in motility, scrotal perimeter, a lower pregnancy and calving rate in efficient animals for RFI. One strategy to solve such problems is polyunsaturated fatty acid (PUFA) supplementation that not only increases the energy density of the diet, but also improves reproductive performance. However, the ideal is that these characteristics of selection for RFI and effect of the supplementation with PUFA are passed to offspring, so the aim of this work was to evaluate the paternal effect of selection for residual feed intake and supplementation of bulls with fatty acids for in vitro produced embryos (IVPE), accumulation of embryonic lipid and gene expression. Animals classified under low RFI and high RFI were used in the experiment. The experimental design was based on a 2 x 2 factorial scheme (RFI x Supplementation), the statistical analysis was performed by the JPM program (version 5.0.1, SAS Institute). The animals were randomly divided into two groups: with protected fatty acids supplementation and with control supplementation (without protected fatty acids). The experiment was composed of four treatments, the semen of the bulls was frozen (4 treatments), 6 animals were supplemented with protected fatty acids (3 low RFI and 3 high RFI) and 6 animals with control supplementation, without protected fatty acids (3 low RFI and 3 high RFI). The semen was used for IVPE; blastocysts were reserved for analysis of lipid quantification and expanded blastocysts for analysis of gene expression. The quantification of lipids was evaluated using the Sudan Black B 1% dye and the images were analyzed by program Image J (National Institutes of Health, USA). The gene expression analysis of the embryos was done by the qPCR technique using the Biomark HD microfluidic system (Fluidigm®, South San Francisco, CA, USA). There was no difference in the in vitro production of embryos from RFI- or RFI+ animals, there was also no difference between treatments (supplementation). Embryos from RFI+ bulls presented higher intracytoplasmic lipid content than embryos from RFI- bulls. The genes that showed differences associated with the diet were HMOX1, SREBF1 and GPX4. The RFI associated genes that differed were PLAC8, PPARGC1A and NFE2L2. Those related to the interaction between diet and RFI that presented difference were RPLP0, ATF4, H3F3A, HSF1, HMGCS1, SLC2A5, NANOG, REST and GPX4. In conclusion, the diet and the selection for RFI of the bulls affected the gene expression of the embryos produced in vitro using the semen of these animals.