Platelet rich plasma associated with heterologous fresh and thawed chondrocytes on osteochondral lesions of rabbits / Associação de plasma rico em plaquetas e condrócitos heterólogos frescos e descongelados em lesão osteocondral de coelhos

Chondrocytes obtained from stifle joint of New Zealand White rabbits were cultivated. Half of cells were maintained in culture for later implantation and the others frozen during six months to evaluate viability. A circular osteochondral defect was created in the right stifle of other twenty seven rabbits. The control group (CG) received no treatment. The thawed (TH) and fresh (FH) heterologous groups received, respectively, an implant of cultivated thawed or fresh heterologous chondrocytes associated with platelet rich plasma (PRP). The CG group showed greatest pain and lameness compared to the other groups seven days after the implantation. Microscopically, at 45 and 90 days, the TH and FH groups showed filling with cartilaginous tissue containing chondrocytes surrounded by a dense matrix of glycosaminoglycans. In the CG group, healing occurred with vascularized fibrous connective tissue without integration to the subchondral bone. Cryopreserved heterologous chondrocytes were viable for implantation and healing of osteochondral lesions; the association with PRP allows the fixation of cells in the lesion and offers growth factors which accelerates repair with tissue similar to articular hyaline cartilage.(AU)

Cultivaram-se condrócitos obtidos da articulação do joelho de coelhos. Metade das células foi mantida em cultura para posterior implantação, e a outra metade foi congelada durante seis meses com a finalidade de avaliar a viabilidade. Criou-se um defeito circular osteocondral no joelho direito de outros vinte e sete coelhos. O grupo controle (GC) não recebeu tratamento. Os grupos descongelado (TH) e fresco (FH) receberam, respectivamente, implantes heterólogos de condrócitos cultivados descongelados e frescos, associados com PRP. O grupo GC apresentou maior dor e claudicação em comparação com os outros grupos aos sete dias após o implante. Microscopicamente, aos 45 e 90 dias, os grupos TH e FH mostraram preenchimento da falha com tecido cartilaginoso contendo condrócitos circundados por uma matriz densa de glicosaminoglicanos. Nesse período, no grupo CG, a cura ocorreu com tecido conjuntivo fibroso vascularizado e sem integração com o osso subcondral. Condrócitos heterólogos criopreservados foram viáveis para implantação e tratamento de lesões osteocondrais; a associação com o PRP permitiu a fixação de células na lesão e ofereceu fatores de crescimento que aceleraram a reparação com o tecido semelhante à cartilagem hialina articular.(AU)

Implante de condrócitos homólogos em defeitos osteocondrais de cães: padronização da técnica e avaliação histopatológica / Homologous articular chondrocytes implantation in osteochondral defects of dogs: technique and histopathological evaluation standardization

Padronizou-se a metodologia para cultura de condrócitos em cães e avaliou-se seu implante em lesões osteocondrais, utilizando-se a membrana biossintética de celulose (MBC) como revestimento. Dez cães, adultos e clinicamente sadios, foram submetidos à artrotomia das articulações fêmoro-tíbio-patelares. Defeitos de 4mm de diâmetro e profundidade foram induzidos no sulco troclear de ambos os membros. MBC foi aplicada na base e na superfície das lesões. Os defeitos do membro direito foram preenchidos com condrócitos homólogos cultivados formando o grupo-tratado (GT); os do membro esquerdo, sem implante celular, foram designados grupo-controle (GC). A evolução pós-operatória foi analisada com especial interesse nos processos de reparação da lesão, por meio de histomorfometria e imuno-histoquímica para colágeno tipo II e sulfato de condroitina. A cultura de condrócitos homólogos apresentou alta densidade e taxa de viabilidade. Observou-se integridade do tecido neoformado com a cartilagem adjacente na avaliação histológica, em ambos os grupos. Na imuno-histoquímica, verificou-se predomínio de colágeno tipo II no GT. Morfometricamente, não houve diferença significativa entre o tecido fibroso e o fibrocartilaginoso entre os grupos. A cultura de condrócitos homólogos de cães foi exequível. O tecido neoformado apresentou qualidade discretamente superior associado ao implante homólogo de condrócitos, contudo não promoveu reparação por cartilagem hialina.(AU)

The aim of the study is to standardize the methodology to achieve canine chondrocytes culture, and evaluate its implant on osteochondral defects made in the femoral trochlear sulcus of dogs, using the cellulose biosynthetic membrane (CBM) as coating. Ten healthy adult dogs without locomotor disorders were used. All animals were submitted to arthrotomy of stifle joints and defects of four millimeters in diameter x four millimeters deep were done in the femoral trochlear sulcus of both limbs. CBM were applied in the lesion base and surface of all limbs. In the treated group (TG), defects of the right limb were filled with cultivated homologous chondrocytes, and in control group (CG), defects of the left limb were left without cellular implant. Postoperative follow up was done by histomorphometry and Collagen type II and anti-chondroitin sulfate immunohistochemistry. The homologous chondrocytes culture showed high density and viability rate. Upon immunohistochemistry the predominance of type II collagen in extracellular matrix of TG was verified. However, no significant statistical difference was observed between the groups upon histomorphometry analysis of fibrous and fibrocartilaginous tissues. Canine homologous chondrocytes culture was practicable. Neoformed tissue showed slightly higher quality in TG, but without promoting repair by the hyaline cartilage.(AU)

Reparação de defeitos osteocondrais de cães com implante de cultura de condrócitos homólogos e membrana biossintética de celulose: avaliação clínica, ultrassonográfica e macroscópica / The repair of osteochondral defects in dogs with homologous articular chondrocytes and biosynthetic cellulose membrane: clinical, ultrasound and macroscopic evaluation

Avaliou-se o implante de condrócitos homólogos em lesões osteocondrais, utilizando a membrana biossintética à base de celulose (MBC) como revestimento. Dez cães adultos e clinicamente sadios foram submetidos à artrotomia das articulações fêmoro-tíbio-patelares. Defeitos de quatro milímetros de diâmetro por quatro milímetros de profundidade foram induzidos na tróclea femoral de ambos os membros. A MBC foi aplicada na base e superfície das lesões. Os defeitos do membro direito foram preenchidos com condrócitos homólogos cultivados e formaram o grupo tratado (GT); e os defeitos do membro esquerdo, sem implante celular, formaram o grupo controle (GC). Os animais foram avaliados clínica e ultrassonograficamente aos 30 e 60 dias. A evolução pós-operatória dos cães foi analisada com especial interesse nos processos de reparação da lesão, por meio de macroscopia. Não houve diferença clínica e ultrassonográfica entre os grupos. Entretanto, à macroscopia, ocorreu maior prevalência de formação de tecido cicatricial esbranquiçado no GT. O tecido neoformado apresentou melhor qualidade associado ao implante homólogo de condrócitos, mas não promoveu reparação por cartilagem hialina.(AU)

The aim of the study was to evaluate the repair of deep cartilaginous defects made in the femoral trochlear sulcus of dogs, using the cellulose biosynthetic membrane (CBM) as coating. Ten healthy adult dogs without locomotor disorders were used. All animals were submitted to arthrotomy of stifle joints and defects with four millimeters diameter x four millimeters deep were done in the femoral trochlear sulcus of both limbs. CBM was applied in the lesion's base and surface of all limbs. In the treated group (TG), the defects of the right limb were filled with cultivated homologous chondrocytes, and in control group (CG), the defects of the left limb were filled without cellular implant. The animals were evaluated by physical examination and ultrasound at 30 and 60 days. The postoperative follow up of the dogs was done by macroscopy with special interest in the healing process of the osteochondral defect. No clinical and ultrasonographic differences were observed in both groups. In the macroscopic evaluation higher prevalence of whitish scar tissue formation was noted in TG, but without statistical difference. The neoformed tissue showed slightly higher quality in TG, but without promoting repair by the hyaline cartilage.(AU)

Effect of freezing on rabbit cultured chondrocytes / Efeitos do congelamento sobre condrócitos cultivados de coelhos

This work evaluated the effect of freezing on chondrocytes maintained in culture, aiming the establishment of a cell bank for future application as heterologous implant. Chondrocytes extracted from joint cartilage of nine healthy New Zealand White rabbits were cultivated and frozen with the cryoprotector 5 percent dimethylsulfoxide for six months. Phenotypic and scanning electron microscopy analyses were carried out to identify morphological and functional differences between fresh and thawed cells. After enzymatic digestion, a total of 4.8x10(5)cells per rabbit were obtained. Fresh chondrocytes showed a high mitotic rate and abundant matrix was present up to 60 days of culture. Loss of phenotypic stability was notable in the thawed chondrocytes, with a low labeling of proteoglycans and weak immunostaining of type II collagen. The present study showed important loss of chondrocyte viability under the freezing conditions. For future in vivo studies of heterologous implant, these results suggests that a high number of cells should be implanted in the host site in order to achieve an adequate number of viable cells. Furthermore, the chondrocytes should be implanted after two weeks of culture, when the highest viability rate is found.(AU)

Avaliaram-se os efeitos do congelamento sobre condrócitos mantidos em cultura, com o objetivo de se estabelecer um banco celular para futura aplicação como implante heterólogo. Condrócitos extraídos da cartilagem articular de nove coelhos saudáveis, da raça Nova Zelândia Branca, foram cultivados e submetidos ao congelamento, com o citoprotetor sulfóxido de dimetila a 5 por cento, por um período de seis meses. Análises fenotípicas e de microscopia eletrônica de varredura foram realizadas com o objetivo de identificar diferenças morfológicas e funcionais entre as células frescas e as descongeladas. Após a digestão enzimática, foram obtidas 4,8x10(5) células por coelho. Os condrócitos frescos apresentaram elevada taxa mitótica e abundante presença de matriz até os 60 dias de cultura. Nas culturas dos condrócitos descongelados, a perda de estabilidade fenotípica foi marcante, o que foi demonstrado pela baixa intensidade da coloração dos proteoglicanos e pela fraca imunomarcação do colágeno tipo II. Sob as condições de congelamento utilizadas, houve importante perda de viabilidade condrocítica. Para futuros estudos in vivo de implante heterólogo, estes resultados sugerem que o elevado número de células deve ser implantado no sítio hospedeiro, com o objetivo de se obter maior quantidade de células viáveis, e que os condrócitos deverão ser implantados com duas semanas de cultivo, período em que apresentam melhor taxa de viabilidade.(AU)

Estudo da biocompatibilidade do gel de quitosana associada ao fosfato de glicerol para reparação de defeitos osteocondrais induzidos experimentalmente na tróclea do talus de eqüinos / Study of chitosan - glycerol phosphate gel biocompatibility in experimentally induced equine talus osteochondral defect

Os estudos na área de engenharia de tecidos aplicada à reparação da cartilagem articular estão voltados ao desenvolvimento de uma matriz biocompatível que permita a diferenciação, proliferação e manutenção de células para produção de cartilagem hialina. A quitosana é um biomaterial e vem sendo estudada como suporte para condrócitos e para liberação controlada de substâncias. O objetivo deste trabalho foi estudar a biocompatibilidade do gel de quitosana associada ao fosfato de glicerol para reparação de defeitos osteocondrais induzidos experimentalmente na tróclea do talus de eqüinos. Foram utilizados cinco cavalos da raça Mangalarga, de três anos de idade, e por artroscopia foi criado um defeito osteocondral na tróclea lateral do talus de cada articulação. De forma aleatória um defeito foi escolhido para implante do gel de quitosana - fosfato de glicerol, e o defeito da articulação contralateral foi mantido vazio, servindo como controle. Para acompanhamento da evolução do processo de reparação da cartilagem articular foram realizados os exames físico, radiográfico e ultrassonográfico; análise do líquido sinovial (física, celularidade, quantificação de proteína, condroitim sulfato e ácido hialurônico); e análise da cartilagem articular (histológica e produção de proteoglicanos). Os resultados obtidos de todas as avaliações realizadas foram semelhantes entre os defeitos tratados e controle. O gel de quitosana fosfato de glicerol é biocompatível com o ambiente articular e pode ser indicado para futuras aplicações como suporte de células e para liberação controlada de medicamentos

The tissue engineering studies applied to articular cartilage repair are focused on the development of scaffold biocompatibility allowing the differentiation, proliferation and cells maintenance providing production of the hyaline cartilage. Chitosan is a biomaterial that has been evaluated as a scaffold for chondrocyts implant and also as a drug-delivery control material. The aim of this work was to evaluate the chitosan glycerol phosphate gel biocompatibility in experimentally induced equine talus osteochondral defect. Five three years old Mangalarga breed horses were submitted to arthroscopy for osteochondral defect production on the lateral troclea of the talus in both tibiotarsal joints by arthroscopy. In a random form one defect was chosen for chitosan-glycerol phosphate gel implant, and the defect of the opposed joint was kept empty and used as a control. For the assessment of the articular cartilage repair process was performed the physic, radiographic and ultrassonographic exams; the synovial fluid analyze (physic, cellularity, protein quantification, chondroitin sulphate and hialuronan); and the articular cartilage analyze (hystologic and proteoglicans production). The results obtained in all evaluations performed were similar between the treated and control defects. The chitosan glycerol phosphate gel is biocompatible with the articular environment and can be indicate for future applications as an scaffold for cells support and drug-delivery control system

A terapia celular no reparo de lesões osteocondrais / Cellular therapy on osteochondral injuries repair

A cartilagem hialina articular é um tecido conjuntivo responsivo a cargas que apresenta baixa celu¬laridade e elevada concentração de água em sua matriz. Como não possui vascularização, a nutrição desse tecido é feita a partir de substâncias encontradas no líquido sinovial. As lesões da cartilagem articular apresentam baixa capacidade regenerativa devido à ausência de vascularização e à incapa¬cidade dos condrócitos em migrar para as áreas centrais da lesão. O uso de implante de condrócitos expandidos em laboratório e, mais recentemente, o uso de células tronco mesenquimais, constituem técnicas de terapia celular que permitem a formação de um tecido com características morfológicas e biomecânicas semelhantes à cartilagem hialina articular capaz de conduzir à melhora clínica do paciente. O objetivo deste trabalho é revisar a fisiopatologia da reparação da cartilagem hialina e fa¬miliarizar o cirurgião veterinário com as recentes técnicas de terapia celular utilizadas no tratamento das lesões osteocondrais(AU)

The hyaline articular cartilage is a load-bearing connective tissue with low quantity of cells and an elevated concentration of water inside the matrix. Due to absence of vascularization, the nutrition in this tissue is made by substances from synovial liquid. The articular cartilage injuries possess a low regenerative capacity due to the absence of vascularization and the incapacity of chondrocytes to migrate until the middle of lesion. The use of chondrocytes implantation expanded in laboratory, and more recently, the use of mesenchymal stem cells, constitutes cellular therapy techniques that allow tissue formation with morphological and biomechanical characteristics similar to hyaline cartilage capable to lead the clinical improvement of the patient. The aim of this review is to describe the phy¬siopathology of hyaline cartilage repair and give information to veterinary surgeon about the early techniques of cell therapy used in the treatment of osteochondral injury(AU)

A terapia celular no reparo de lesões osteocondrais / Cellular therapy on osteochondral injuries repair

A cartilagem hialina articular é um tecido conjuntivo responsivo a cargas que apresenta baixa celu¬laridade e elevada concentração de água em sua matriz. Como não possui vascularização, a nutrição desse tecido é feita a partir de substâncias encontradas no líquido sinovial. As lesões da cartilagem articular apresentam baixa capacidade regenerativa devido à ausência de vascularização e à incapa¬cidade dos condrócitos em migrar para as áreas centrais da lesão. O uso de implante de condrócitos expandidos em laboratório e, mais recentemente, o uso de células tronco mesenquimais, constituem técnicas de terapia celular que permitem a formação de um tecido com características morfológicas e biomecânicas semelhantes à cartilagem hialina articular capaz de conduzir à melhora clínica do paciente. O objetivo deste trabalho é revisar a fisiopatologia da reparação da cartilagem hialina e fa¬miliarizar o cirurgião veterinário com as recentes técnicas de terapia celular utilizadas no tratamento das lesões osteocondrais

The hyaline articular cartilage is a load-bearing connective tissue with low quantity of cells and an elevated concentration of water inside the matrix. Due to absence of vascularization, the nutrition in this tissue is made by substances from synovial liquid. The articular cartilage injuries possess a low regenerative capacity due to the absence of vascularization and the incapacity of chondrocytes to migrate until the middle of lesion. The use of chondrocytes implantation expanded in laboratory, and more recently, the use of mesenchymal stem cells, constitutes cellular therapy techniques that allow tissue formation with morphological and biomechanical characteristics similar to hyaline cartilage capable to lead the clinical improvement of the patient. The aim of this review is to describe the phy¬siopathology of hyaline cartilage repair and give information to veterinary surgeon about the early techniques of cell therapy used in the treatment of osteochondral injury

Condrócitos homólogos cultivados implantados em lesões osteocondrais experiemntais em cães

O presente trabalho tem por objetivo padronizar a metodologia para cultura de condrócitos caninos e avaliar seu implante em lesões osteocondrais, utilizando a membrana biossintética à base de celulose (MBC) como revestimento. Dez cães, adultos e clinicamente sadios foram submetidos ao procedimento de artrotomia das articulações fêmoro-tíbio-patelares. Defeitos de quatro milímetros de diâmetro por quatro milímetros de profundidade forma induzidos no sulco troclear de ambos os membros. A MBC foi aplicada na base e superfície das lesões, os defeitos do membro direito preenchidos com os condrócitos homólogos cultivados, o Grupo Tratado (GT), e os do membro esquerdo, sem implante celular, o Grupo Controle (GC). Os animais foram avaliados clínica e ultrassonograficamente aos 30 e 60 dias. A evolução pósoperatória dos cães foi analisada com especial interesse nos processos de reparação da lesão, por meio de macroscopia, histomorfometria e imunoistoquímica. A cultura de condrócitos homólogos apresentou alta densidade e taxa de viabilidade. Não houve diferença clínica e ultrassonográfica entre os grupos. Entretanto, à macroscopia, houve maior prevalência de formação de tecido cicatricial esbranquiçado no GT. Observouse integridade do tecido neoformado com a cartilagem adjacente na avaliação histopatológica, em ambos os grupos. Na imunoistoquímica, verificou-se predomínio de colágeno tipo II no GT. Entretanto, morfometricamente, não houve diferença significativa entre tecido fibroso e fibrocartilaginoso entre os grupos. A cultura de condrócitos homólogos de cães foi exequível. O tecido neoformado apresentou qualidade discretamente superior associado ao implante homólogo de condrócitos. Contudo, não promoveu reparação por cartilagem hialina

The aim of the present study is standardize the methodology to achievement of canine chondrocytes culture, and evaluated its implant on deep cartilaginous defects, using the cellulose biosynthetic membrane (CBM) as coating. Ten adults healthy dogs (Canis familiaris) were submitted to arthrotomy of stifle joints. Defects of four millimeters diameter x four millimeters deep were realized in the femoral trochlear sulcus of both limbs. CBM were applied in the lesions base and surface of all limbs. In the treated group (TG), the defects of the right limb were filled with cultivated homologous chondrocytes, and in control group (CG), the defects of the left limb were filled without cellular implant. The animals were evaluated by physical examination and ultrasound at 30 and 60 days. The postoperative follow up of the dogs were done by macroscopy, histomorphometry and immunohistochemistry with special interest in healing process front to osteochondral defect. The homologous chondrocytes culture showed high density and viability rate. No clinical and ultrasonographic differences were observed in both groups. At macroscopy evaluation was noted higher prevalence of whitish scar tissue formation in TG. At histopathological evaluation was observed neoformed tissue integration with adjacent cartilage in both groups. At immunohistochemistry was verified predominance of type II collagen in TG. However, no significant statistical difference was observed between the groups at histomorphometry analysis of fibrous and fibrocartilaginous tissues. The canine homologous chondrocytes culture was practicable. The neoformed tissue showed slightly higher quality in TG, but without promote repair by hyaline cartilage

Cultivo de condrócitos equinos e avaliação de sua condrogenicidade mediante implante de células associadas ao hidrogel em subcutâneo de camundongos atímicos

As afecções articulares são de grande importância e de relevante incidência para o eqüino atleta, sendo a osteoartrite a causa mais comum de afastamento deste de sua atividade esportiva. Após a degeneração da cartilagem ocorre o reparo com formação de fibrocartilagem, tecido de qualidade inferior a cartilagem original. Dessa forma, a promoção do reparo articular mediante implante de condrócitos promoveria potencialmente uma reparação benéfica e adequada. Os benefícios do implante de condrócitos isolados (isentos da matriz cartilagínea adjacente) incluem a transferência de células metabolicamente ativas que preencherão lacunas existentes na superfície articular através de mitose e produção de adequada matriz extracelular. O implante de condrócitos previamente sedimentados em matriz tridimensional possibilita que tais células mantenham suas características diferenciadas e de síntese. O objetivo do presente trabalho foi padronizar o cultivo e multiplicação de condrócitos em laboratório, avaliando seu potencial condrogênico, bem como o comportamento destas células quando sedimentadas em hidrogel, utilizado como substrato para sua dediferenciação e viabilizar o futuro implante em lesões de cartilagem articular eqüina. O experimento apresentou as seguintes etapas: colheita de cartilagem da articulação femoropatelar eqüina (pós mortem), processamento laboratorial (isolamento dos condrócitos, cultivo das células obtidas em estufa e sedimentação dos condrócitos finais em hidrogel), implante subcutâneo em camundongos e avaliação do tecido neoformado. Foram utilizados 40 camundongos atímicos divididos em 2 grupos: 20 animais implantados com condrócitos isoladamente (grupo A) e 20 animais com estas células sedimentadas em hidrogel (grupo B). A avaliação histológica foi realizada aos 45 e 60 dias após o implante. Nos animais do grupo A não...

Joint injury and joint disease are the most important and common causes of wastage in horses that perform athletic events. Articular cartilage shows a limited intrisic repair capacity and once it was lesioned the resultant tissue becomes fibrocartilaginous that differs from native hialine cartilage in composition, structural organization and is unable to withstand the demands of the mechanical environment. The transplantation of chondrocytes directly to a cartilage defect is one strategy that would promise for stimulating the functional repair of articular cartilage defects. Cell transplatation can be used alone or in conjuntion with scaffolds. The potential benefits of isolated chondrocytes transplantation include transference of metabolically active cells capable of resurfacing by mitoses process and extracelular matrix local production. Cells transplanted within a carrier, surrounding system (three-dimensional) conserve their differentiation and syntesis features. This study objective was to standardize chondrocytes in vitro culture and expantion, evaluate their chondrogenic capacity and interaction with the three-dimensional carrier system (hydrogel) with the future purpose of performing implants in equine articular cartilage lesions in order to create a favorable environment for resurfacing. Equine articular cartilage was harvested at necropsy from femoral condyles and patela of different donors within 24 h post mortem. Chondrocytes were isolated by matrix digestion, cultured and seeded in hidrogel scaffolds. Chondrocytes were injected subcutaneously in 20 athimic mice (group A) and hidrogel seeded chondrocytes were implanted in other 20 (group B) to evaluate in vivo chondrogenesis. Mice were euthanized after 40 and 60 days and the implantation site was excised and fixed for histologic examination. The specimens from group A did not show cartilage formation. Some specimens from...