Comparative analysis of the hormone production and gene expression profiles in ovine uterus tissue during oestrus cycle synchronized using medroxyprogesterone acetate plus eCG and prostaglandin analogue / Análise comparativa da produção de hormônios e perfis de expressão gênica em tecido uterino ovino durante o ciclo estral sincronizado usando acetato de medroxiprogesterona mais eCG e análogo de prostaglandina

The combination of medroxyprogesterone acetate (MPA) and gonadotropin chorionic (eCG) has been widely used to synchronize oestrus cycle in sheep, but their effects on the gene expression in uterine tissue are yet to be elucidated. To evaluate the effect of MPA + eCG or prostaglandin analogue (PA) treatments on the rate of oestrus cycle synchronization, as well as further hormone production and gene expression profiles in uterine tissue, 14 Santa Inês ewes were randomly selected. The MPA + eCG group (n=7) received intravaginal insertion of MPA-impregnated sponges for 14 days and was administered 350 IU eCG on the day of sponge withdrawal. The PA group (n=7) was administered two doses of 100 µg of PA separated by 12 days. The ewes were assessed for the rate of oestrus cycle synchronization and the serum concentrations of progesterone (P4) and estradiol (E2). Additionally, the expression of estrogen receptor (ERα), progesterone receptor (P4R), and immunolocalization of interferon receptor (IFNAR1) in the uterine tissue samples collected 15th day post-mating were examined. The rate of oestrus cycle synchronization was 100% (n=7/7) and 57.14% (n=4/7) in the MPA + eCG and PA groups, respectively. Moreover, the MPA + eCG group exhibited higher serum concentration of P4 than the PA group (p < 0.05). However, the E2 serum concentration did not differ between the two groups (p > 0.05). The relative expression of P4R and ERα mRNA analyzed using real-time PCR and immunodetection of IFNAR1 were similar between the two groups tested (p > 0.05). Conclusively, MPA + eCG treatment improved the rate of oestrus cycle synchronization and endogenous P4 production; however, it did not affect the expression of sex steroid receptors and IFNAR1 in uterine ovine tissue.(AU)

A combinação de acetato de medroxiprogesterona (MPA) com gonadotrofina coriônica (eCG) é amplamente utilizada para sincronizar o estro de ovelhas, mas seus possíveis efeitos sobre a expressão gênica em tecido uterino não foram elucidados. Para avaliar o efeito dos protocolos MPA + eCG ou análogo de prostaglandina (PA) sobre a taxa de sincronização do estro, bem como na futura produção hormonal e expressão gênica em tecido uterino, 14 ovelhas Santa Inês foram selecionadas. O grupo MPA + eCG (n=7) recebeu a inserção de esponjas impregnadas de MPA por via intravaginal por 14 dias e 350 UI de eCG no dia da retirada da esponja. O grupo PA recebeu duas doses de 100 µg de PA administradas com 12 dias de intervalo. As ovelhas foram avaliadas quanto à taxa de sincronização do estro, concentração sérica de progesterona (P4) e estradiol (E2). Além disso, foram examinadas a expressão do receptor de estradiol (ERα), receptor de progesterona (P4R) e localização do receptor de interferon (IFNAR1), a partir de amostras de tecido uterino coletadas 15 dias após o acasalamento. A taxa de sincronização do estro foi 100% (n = 7/7) e 57,14% (n = 4/7) nos grupos MPA + eCG e PA, respectivamente. Além disso, o grupo MPA + eCG apresentou maior concentração sérica de P4 em comparação com o grupo PA (P < 0,05). No entanto, a concentração sérica de E2 não diferiu entre os grupos testados (P > 0,05). A expressão relativa de RNAm para P4R e ERα analisado por PCR em tempo real e imunodetecção de IFNAR1 foi semelhante entre os grupos testados (P > 0,05). Em conclusão, o tratamento com MPA + eCG melhora a taxa de sincronização do estro e a produção de progesterona endógena; contudo, não afeta a regulação da expressão de receptores de esteroides sexuais e IFNAR1 no tecido uterino de ovinos.(AU)

Imunodetecção de Toxoplasma gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas / Immunodetection of Toxoplasma gondii in placenta tissue of naturally infected goats

A imuno-histoquímica (IHQ) é considerada uma ferramenta rápida e precisa para a identificação de protozoários, como Toxoplasma gondii, em tecidos fetais e placentários. Neste estudo foi avaliada a imunodetecção de Toxoplasma gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas. Foram coletadas e analisadas 80 amostras de placentas de cabras procedentes de único rebanho com sorologia positiva para T. gondii na técnica de ELISA. Na histopatologia, 27/80 amostras apresentaram lesões sugestivas de infecção por protozoários. Após a avaliação histopatológica, procedeu-se à realização da técnica de imuno-histoquímica, obtendo-se 85,2% (23/27) de amostras com marcação positiva. A imunodetecção ocorreu no epitélio de revestimento das vilosidades coriônicas e foi classificada de acordo com o grau de intensidade da imunomarcação. Também foi evidenciada imunomarcação no interior dos vasos sanguíneos fetais em 8,69% (2/23) das amostras. Este estudo demonstrou que a técnica de IHQ se comportou como uma ferramenta valiosa no diagnóstico da infeção por T. gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas e complementou, de forma decisiva, o diagnóstico, além de agregar maior valor aos resultados obtidos nas análises histopatológica e sorológica.(AU)

Immunohistochemistry (IHC) is considered to be a rapid and accurate tool for the identification of protozoa such as Toxoplasma gondii in fetal and placental tissues. In this study, we evaluated the immunodetection of Toxoplasma gondii in placental tissue from naturally infected goats. A total of 80 samples of goat placentas from a single herd with positive ELISA serology for T. gondii were collected and analyzed. In the histopathology, 27/80 samples presented lesions suggestive of protozoal infection. After the histopathological evaluation, the immunohistochemistry technique was performed, obtaining 85.2% (23/27) of samples with positive marking. Immunodetection occurred in the lining epithelium of the chorionic villi and was classified according to the degree of intensity of the immunostaining. Immunostaining within the fetal blood vessels was also evidenced in 8.69% (2/23) of the samples. This study demonstrated that the IHQ technique behaved as a valuable tool in the diagnosis of T. gondii infection in placental tissue of naturally infected goats completing the diagnosis in a decisive way and adding greater value to the results obtained in the histopathological and serological analysis.(AU)

Imunodetecção de Toxoplasma gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas / Immunodetection of Toxoplasma gondii in placenta tissue of naturally infected goats

A imuno-histoquímica (IHQ) é considerada uma ferramenta rápida e precisa para a identificação de protozoários, como Toxoplasma gondii, em tecidos fetais e placentários. Neste estudo foi avaliada a imunodetecção de Toxoplasma gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas. Foram coletadas e analisadas 80 amostras de placentas de cabras procedentes de único rebanho com sorologia positiva para T. gondii na técnica de ELISA. Na histopatologia, 27/80 amostras apresentaram lesões sugestivas de infecção por protozoários. Após a avaliação histopatológica, procedeu-se à realização da técnica de imuno-histoquímica, obtendo-se 85,2% (23/27) de amostras com marcação positiva. A imunodetecção ocorreu no epitélio de revestimento das vilosidades coriônicas e foi classificada de acordo com o grau de intensidade da imunomarcação. Também foi evidenciada imunomarcação no interior dos vasos sanguíneos fetais em 8,69% (2/23) das amostras. Este estudo demonstrou que a técnica de IHQ se comportou como uma ferramenta valiosa no diagnóstico da infeção por T. gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas e complementou, de forma decisiva, o diagnóstico, além de agregar maior valor aos resultados obtidos nas análises histopatológica e sorológica.(AU)

Immunohistochemistry (IHC) is considered to be a rapid and accurate tool for the identification of protozoa such as Toxoplasma gondii in fetal and placental tissues. In this study, we evaluated the immunodetection of Toxoplasma gondii in placental tissue from naturally infected goats. A total of 80 samples of goat placentas from a single herd with positive ELISA serology for T. gondii were collected and analyzed. In the histopathology, 27/80 samples presented lesions suggestive of protozoal infection. After the histopathological evaluation, the immunohistochemistry technique was performed, obtaining 85.2% (23/27) of samples with positive marking. Immunodetection occurred in the lining epithelium of the chorionic villi and was classified according to the degree of intensity of the immunostaining. Immunostaining within the fetal blood vessels was also evidenced in 8.69% (2/23) of the samples. This study demonstrated that the IHQ technique behaved as a valuable tool in the diagnosis of T. gondii infection in placental tissue of naturally infected goats completing the diagnosis in a decisive way and adding greater value to the results obtained in the histopathological and serological analysis.(AU)

Influence of apoptosis on liver and spleen resistance in dogs with visceral leishmaniosis / Influência da apoptose na resistência hepática e esplênica de cães com leishmaniose visceral

Abstract The aim of this study was to evaluate apoptosis and parasite load in the liver and spleen of dogs with visceral leishmaniosis (VL), using immunohistochemistry. Liver and spleen samples from 71 dogs with VL were used. The parasite load in the spleen and liver showed significant difference between organs in infected group (P=0.0219). The density of the parasite load in the spleen (median=2.4) was higher than liver (median=0.8). Immunodetection of apoptotic cells was predominant in lymphocytes and differ between the infected and control group in spleen (P=0.0307) and liver (P=0.0346). There was a significant correlation between apoptosis and parasite load (P = 0.0084; r=0.3104) only in the spleen of the infected group, where it was observed that, when increasing the number of apoptotic cells increases the parasitic load. It was concluded that the liver and spleen of infected dogs presented greater numbers of cells undergoing apoptosis (lymphocytes) than the control group, thus suggesting that this process may be contributing towards the survival of Leishmania in these organs, because lymphocyte in apoptosis did not have the ability to present and recognize the antigen, allowing the survival of the parasite.

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a apoptose e a carga parasitária no fígado e baço de cães com leishmaniose visceral (LV), pela técnica de imuno-histoquímica. Foram utilizadas amostras de fígado e baço de 71 cães com LV. A carga parasitária no baço e fígado mostrou diferença significativa entre os órgãos no grupo infectado (P=0,0219). A densidade da carga de parasita no baço (média=2,4) foi maior do que no fígado (média=0,8). A imunodetecção de células em apoptose foi predominante nos linfócitos, com diferenças entre o grupo infectado e controle no baço (P=0,0307) e fígado (P=0,0346). Houve uma correlação positiva fraca entre apoptose e carga parasitária (P=0,0084; r=0,3104) apenas no baço do grupo infectado, onde observou-se que quando aumentava o número de células em apoptose aumentava a carga parasitária. Concluiu-se que o fígado e o baço de cães infectados apresentam um maior número de células que sofrem apoptose (linfócitos) do que o grupo controle, sugerindo que este processo possa contribuir para a sobrevivência de Leishmania nestes órgãos, pois os linfócitos em apoptose não tiveram a capacidade de apresentar e reconhecer o antígeno, permitindo a sobrevivência do parasita.

Influence of apoptosis on liver and spleen resistance in dogs with visceral leishmaniosis / Influência da apoptose na resistência hepática e esplênica de cães com leishmaniose visceral

Abstract The aim of this study was to evaluate apoptosis and parasite load in the liver and spleen of dogs with visceral leishmaniosis (VL), using immunohistochemistry. Liver and spleen samples from 71 dogs with VL were used. The parasite load in the spleen and liver showed significant difference between organs in infected group (P=0.0219). The density of the parasite load in the spleen (median=2.4) was higher than liver (median=0.8). Immunodetection of apoptotic cells was predominant in lymphocytes and differ between the infected and control group in spleen (P=0.0307) and liver (P=0.0346). There was a significant correlation between apoptosis and parasite load (P = 0.0084; r=0.3104) only in the spleen of the infected group, where it was observed that, when increasing the number of apoptotic cells increases the parasitic load. It was concluded that the liver and spleen of infected dogs presented greater numbers of cells undergoing apoptosis (lymphocytes) than the control group, thus suggesting that this process may be contributing towards the survival of Leishmania in these organs, because lymphocyte in apoptosis did not have the ability to present and recognize the antigen, allowing the survival of the parasite.(AU)

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a apoptose e a carga parasitária no fígado e baço de cães com leishmaniose visceral (LV), pela técnica de imuno-histoquímica. Foram utilizadas amostras de fígado e baço de 71 cães com LV. A carga parasitária no baço e fígado mostrou diferença significativa entre os órgãos no grupo infectado (P=0,0219). A densidade da carga de parasita no baço (média=2,4) foi maior do que no fígado (média=0,8). A imunodetecção de células em apoptose foi predominante nos linfócitos, com diferenças entre o grupo infectado e controle no baço (P=0,0307) e fígado (P=0,0346). Houve uma correlação positiva fraca entre apoptose e carga parasitária (P=0,0084; r=0,3104) apenas no baço do grupo infectado, onde observou-se que quando aumentava o número de células em apoptose aumentava a carga parasitária. Concluiu-se que o fígado e o baço de cães infectados apresentam um maior número de células que sofrem apoptose (linfócitos) do que o grupo controle, sugerindo que este processo possa contribuir para a sobrevivência de Leishmania nestes órgãos, pois os linfócitos em apoptose não tiveram a capacidade de apresentar e reconhecer o antígeno, permitindo a sobrevivência do parasita.(AU)

Correlation between systolic function and presence of myofibroblasts in doxorubicin-induced cardiomyopathy / Correlação entre função sistólica e presença de miofibroblastos na cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina

Cardiotoxicity induced by doroxubicin generates systolic disfunction and myocardial remodeling with presence of myofibroblasts. These cells are thought to be attracted to the injured heart to avoid the development of congestive heart failure. The objective of this study was to evaluate the systolic dysfunction generated by doxorubicin through Doppler echocardiography, and its correlation with the presence of myofibroblasts in the myocardium. Twenty-five New Zealand White rabbits were divided into two groups (control, and treated with doxorubicin). The drug was administered for six weeks; Doppler echocardiography was performed before the first, and after the last administration of doxorubicin. Immuno detection of myofibroblasts was performed by immunohistochemistry. The treated group exhibited significant reduction in systolic function as assessed by Doppler echocardiography, and increased frequency of myofibroblasts, which were present in similar amounts in the left ventricle, interventricular septum, and right ventricle. There was a significant negative correlation between number of myofibroblasts in the interventricular septum and in the left ventricle with systolic function indices, which reveals that the higher the number of fibroblasts, the worst systolic function is in rabbits treated with doxorubicin. Increase in myofibroblast numbers was not sufficient to preserve systolic function.(AU)

A cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina gera disfunção sistólica e remodelamento miocárdico, com presença de miofibroblastos. Acredita-se que essas células sejam atraídas para a não evolução do quadro de insuficiência cardíaca congestiva. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a função sistólica gerada pela doxorrubicina por meio da ecodopplercadiografia e correlacioná-la com a presença de miofibroblastos no miocárdio. Foram utilizados 25 coelhos da raça Nova Zelândia, alocados em dois grupos (controle e tratados com doxorrubicina). O fármaco foi administrado por seis semanas e a ecodopplercardiografia foi realizada no momento zero e após a última administração da doxorrubicina. A imunodetecção dos miofibroblastos foi realizada por imuno-histoquímica. Houve redução significativa na função sistólica, observada na ecodopplercardiografia e aumento na imundetecção dos miofibroblastos nos animais tratados, na mesma intensidade no ventrículo esquerdo, septo interventricular e ventrículo direito. Houve correlação negativa significativa entre o número de miofibroblastos no septo interventricular e no ventrículo esquerdo com os índices de função sistólica, revelando que quanto mais miofibroblastos presentes, pior é a função sistólica de coelhos tratados com doxorrubicina. O aumento do número de miofibroblastos não foi suficiente para manutenção da função sistólica.(AU)

IMUNODETECÇÃO DE TOXOPLASMA GONDII EM ÚTERO GESTACIONAL E PLACENTA DE TAYASSUÍDEOS SILVESTRES DA AMAZÔNIA PERUANA

O Toxoplasma gondii é um protozoário cosmopolita e intracelular obrigatório que afeta animais endotérmicos, incluindo o homem. A transmissão pode ocorrer pelas vias horizontal e vertical, esta última, em geral, acaba desencadeando patologias reprodutivas. Com isso, objetivou-se investigar a ocorrência de T. gondii em espécies da Família Tayassuidae de vida livre da Amazônia peruana, pela imunomarcação do protozoário em tecido de útero gestacional e placenta. Para tanto, as amostras de tecido uterino e placentário de 36 Pecari tajacu e 42 Tayassu pecari foram analisadas pelas técnicas de histopatologia e imuno- histoquímica, com os resultados correlacionadospelo teste qui-quadrado. Um total de 12 animais foram positivos (06 P. tajacu e 06 T. pecari). Na IHQ o T. pecari exibiu 7,14% de positividade para T. gondii em útero gestacional e 9,52% em placenta, enquanto o P. tajacuapresentou 11,11% em útero gestacional e 8,33% em placenta. As amostras imunorreativas em IHQ apresentaram intensidade variando de moderada a forte em ambos os órgãos das espécies analisadas, sendo observada as formas parasitárias no epitélio e tecido conjuntivo uterino e placentário, porém sem a observância das lesões características nos tecidos avaliados pelas técnicas de histotopatologia e IHQ. Com isso foi possível determinar a existência da circulação do T. gondii em espécimes T. pecari e P. tajacu de vida livre da Amazônia peruana, possibilitando a continuidade do ciclo deste parasito no ecossistema da região e a transmissão vertical do parasito nestas espécies. Além de ser a primeira pesquisa que relaciona a imunodetecção de T. gondii em espécimes de T. pecari e P. tajacu analisando amostras de útero gestacional e placenta com detecção pela IHQ, que mostrou ser uma técnica altamente sensível.

Toxoplasma gondii is a mandatory cosmopolitan and intracellular protozoan that affects endothermic animals, including humans. Transmission can occur through horizontal and vertical routes, the latter, in general, ends up triggering reproductive pathologies. Thus, the objective was to investigate the occurrence of T. gondii in species of the Tayassuidae Family of free life in the Peruvian Amazon, by immunomarking the protozoan in gestational uterus and placenta tissue. For that, the samples of uterine and placental tissue of 36 Pecari tajacu and 42 Tayassu pecari were analyzed by the techniques of histopathology and immunohistochemistry, with the results correlated by the chi-square test. A total of 12 animals were positive (06 P. tajacu and 06 T. pecari). In IHC, T. pecari exhibited 7.14% positivity for T. gondii in gestational uterus and 9.52% in placenta, while P. tajacu presented 11.11% in gestational uterus and 8.33% in placenta. The immunoreactive samples in IHC showed intensity varying from moderate to strong in both organs of the analyzed species, with parasitic forms being observed in the epithelium and uterine and placental connective tissue, but without observing the characteristic lesions in the tissues evaluated by the histotopathology and IHC techniques. With that, it was possible to determine the existence of the circulation of T. gondii in T. pecari and P. tajacu specimens of free life in the Peruvian Amazon, allowing the continuity of the cycle of this parasite in the region's ecosystem and the vertical transmission of the parasite in these species. In addition to being the first research that links the immunodetection of T. gondii in specimens of T. pecari and P. tajacu, analyzing samples of gestational uterus and placenta with IHC detection, which proved to be a highly sensitive technique.

IMUNOMARCAÇÃO DE Leishmania sp. E ASPECTOS HISTOLÓGICOS NA TERCEIRA PÁLPEBRA DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania (leishmania) chagasi

Abstract Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a disease with multisystemic injuries, and among the various tissues affected, the third eyelid (TE) is often involved. This ocular adnexa has been studied for the leishmaniasis pathogenesis elucidation and for diagnosis advance. This study aimed to carry out the parasite immunodetection and evaluate histologic lesions in TE of Leishmania (leishmania) chagasi naturally infected dogs. Twenty-six TE samples from infected dogs were submitted to histologic evaluation and to immunohistochemistry for Leishmania sp. The main lesion observed in the third eyelid conjunctiva (TEC) was lymphoplasmacytic inflammation, with Mott cells and parasitized histiocytes. Additionally, loss of epithelial stratification, ulceration, goblet cells thinning or hyperplasia were often found. The same inflammatory pattern was observed in the third eyelid lacrimal gland (TELG), often accompanied by acinar atrophy and secretory ducts dilatation. Immunohistochemistry revealed parasitism in all samples, in different intensities.

Resumo A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença que envolve lesões multissistêmicas e, dentre os vários tecidos acometidos, a terceira pálpebra está frequentemente envolvida. Este anexo ocular tem sido alvo de estudo tanto para a elucidação da patogênese da doença quanto para o avanço diagnóstico. O presente trabalho teve por objetivo avaliar as alterações histológicas presentes na terceira pálpebra de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi e realizar a imunodetecção do parasita. Vinte e seis amostras de terceira pálpebra de cães sintomáticos foram avaliadas quanto à coloração de HE e à imunoistoquímica com soro de cão positivo para Leishmania sp. A principal alteração observada na conjuntiva da terceira pálpebra foi infiltração inflamatória predominantemente linfoplasmocitária, com células de Mott e histiócitos parasitados permeando a área de exsudação. Adicionalmente, perda de estratificação e ulceração epitelial, rarefação ou hiperplasia de células caliciformes foram achados costumazes. Na glândula lacrimal da terceira pálpebra, o mesmo padrão inflamatório foi observado, acompanhado frequentemente de atrofia acinar e dilatação dos ductos secretórios. A imunoistoquímica revelou parasitismo em todas as amostras, em diferentes intensidades.

Immunodetection of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in mammary carcinomas of female dogs / Imunodetecção de células dendríticas mieloides e plasmocitoides nos carcinomas mamários em cadelas

Dendritic cells have attracted great interest from researchers as they may be used as targets of tumor immune evasion mechanisms. The main objective of this study was to evaluate the relationship between the dendritic cells (DCs) subpopulation in simple type mammary carcinomas in female dogs. Two groups of samples were used: the control group consisted of 18 samples of mammary tissue without changes and the tumor group with 26 simple type mammary carcinomas. In these groups, we evaluated the immunodetection of immature and mature myeloid DCs, plasmacytoid DCs and MHC-II. In mammary tumor, mature myeloid DCs predominated in the peritumoral region, while immature myeloid DCs and plasmacytoid DCs were evident in the intratumoral region. Immunostaining of MHC-II was visualized in mammary acini (control group), in tumor cells and inflammatory infiltration associated with tumors. The comparison between the control and tumor groups showed a statistically significant difference between immature myeloid DCs, mature myeloid DCs and plasmacytoid DCs. The immunodetection of MHC-II was not significant when comparing the groups. The predominance of immature DCs in the tumor group is possibly related to an inefficient immune response, promoting the development and survival of tumor cells. The presence of plasmacytoid DCs in the same group suggests a worse prognosis for female dogs with mammary tumors. Therefore, the ability of differentiation of canine dendritic cells could be influenced by neoplastic cells and by the tumor microenvironment.(AU)

As células dendríticas têm despertado grande interesse dos pesquisadores, pois podem ser alvo dos mecanismos de evasão imune do tumor. O objetivo principal deste estudo foi avaliar a relação entre as subpopulações de células dendríticas (DCs) nos carcinomas mamários do tipo simples em cadelas. Dois grupos de amostras foram utilizados, o grupo controle composto por 18 amostras de tecido mamário sem alterações e o grupo tumor com 26 carcinomas mamários do tipo simples. Nestes grupos foram avaliadas a imunodetecção de DCs mieloides imaturas e maduras, DCs plasmocitoides e de MHC-II. Nas mamas com tumor, as DCs mieloides maduras predominaram na região peritumoral, enquanto que as DCs mieloides imaturas e as DCs plasmocitoides foram evidentes na região intratumoral. A imunomarcação do MHC-II foi visualizada nos ácinos mamários (grupo controle), nas células tumorais e no infiltrado inflamatório associado aos tumores. Na comparação entre os grupos controle e tumor houve diferença estatística significativa entre as DCs mieloides imaturas, DCs mieloides maduras e DCs plasmocitoides. A imunodetecção de MHC-II não foi significativa na comparação entre os grupos. A predominância de DCs imaturas no grupo tumor, possivelmente, está relacionada com uma resposta imune ineficiente, favorecendo o desenvolvimento e a sobrevivência das células tumorais. A presença das DCs plasmocitoides no mesmo grupo sugere um prognóstico pior para cadelas com tumores de mama. Portanto, a capacidade de diferenciação das células dendríticas caninas poderia ser influenciada pelas células neoplásicas e pelo microambiente tumoral.(AU)

Imunomarcação de Leishmania sp. e aspectos histológicos na terceira pálpebra de cães naturalmente infectados por Leishmania (leishmania) chagasi / Hystopathology and Leishmania sp. Immunostaining in third eyelid of Leishmania (Leishmania) chagasi naturally infected dogs

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a disease with multisystemic injuries, and among the varioustissues affected, the third eyelid (TE) is often involved. This ocular adnexa has been studied for theleishmaniasis pathogenesis elucidation and for diagnosis advance. This study aimed to carry out theparasite immunodetection and evaluate histologic lesions in TE of Leishmania (leishmania) chagasinaturally infected dogs. Twenty-six TE samples from infected dogs were submitted to histologicevaluation and to immunohistochemistry for Leishmania sp. The main lesion observed in the thirdeyelid conjunctiva (TEC) was lymphoplasmacytic inflammation, with Mott cells and parasitizedhistiocytes. Additionally, loss of epithelial stratification, ulceration, goblet cells thinning or hyperplasiawere often found. The same inflammatory pattern was observed in the third eyelid lacrimal gland(TELG), often accompanied by acinar atrophy and secretory ducts dilatation. Immunohistochemistry revealed parasitism in all samples, in different intensities.(AU)

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença que envolve lesões multissistêmicas e, dentre osvários tecidos acometidos, a terceira pálpebra está frequentemente envolvida. Este anexo ocular temsido alvo de estudo tanto para a elucidação da patogênese da doença quanto para o avanço diagnóstico.O presente trabalho teve por objetivo avaliar as alterações histológicas presentes na terceira pálpebrade cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi e realizar a imunodetecção do parasita. Vintee seis amostras de terceira pálpebra de cães sintomáticos foram avaliadas quanto à coloração de HEe à imunoistoquímica com soro de cão positivo para Leishmania sp. A principal alteração observadana conjuntiva da terceira pálpebra foi infiltração inflamatória predominantemente linfoplasmocitária,com células de Mott e histiócitos parasitados permeando a área de exsudação. Adicionalmente, perdade estratificação e ulceração epitelial, rarefação ou hiperplasia de células caliciformes foram achadoscostumazes. Na glândula lacrimal da terceira pálpebra, o mesmo padrão inflamatório foi observado,acompanhado frequentemente de atrofia acinar e dilatação dos ductos secretórios. A imunoistoquímicarevelou parasitismo em todas as amostras, em diferentes intensidades.(AU)

Imunomarcação de Leishmania sp. e aspectos histológicos na terceira pálpebra de cães naturalmente infectados por Leishmania (leishmania) chagasi / Hystopathology and Leishmania sp. Immunostaining in third eyelid of Leishmania (Leishmania) chagasi naturally infected dogs

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a disease with multisystemic injuries, and among the varioustissues affected, the third eyelid (TE) is often involved. This ocular adnexa has been studied for theleishmaniasis pathogenesis elucidation and for diagnosis advance. This study aimed to carry out theparasite immunodetection and evaluate histologic lesions in TE of Leishmania (leishmania) chagasinaturally infected dogs. Twenty-six TE samples from infected dogs were submitted to histologicevaluation and to immunohistochemistry for Leishmania sp. The main lesion observed in the thirdeyelid conjunctiva (TEC) was lymphoplasmacytic inflammation, with Mott cells and parasitizedhistiocytes. Additionally, loss of epithelial stratification, ulceration, goblet cells thinning or hyperplasiawere often found. The same inflammatory pattern was observed in the third eyelid lacrimal gland(TELG), often accompanied by acinar atrophy and secretory ducts dilatation. Immunohistochemistry revealed parasitism in all samples, in different intensities.

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença que envolve lesões multissistêmicas e, dentre osvários tecidos acometidos, a terceira pálpebra está frequentemente envolvida. Este anexo ocular temsido alvo de estudo tanto para a elucidação da patogênese da doença quanto para o avanço diagnóstico.O presente trabalho teve por objetivo avaliar as alterações histológicas presentes na terceira pálpebrade cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi e realizar a imunodetecção do parasita. Vintee seis amostras de terceira pálpebra de cães sintomáticos foram avaliadas quanto à coloração de HEe à imunoistoquímica com soro de cão positivo para Leishmania sp. A principal alteração observadana conjuntiva da terceira pálpebra foi infiltração inflamatória predominantemente linfoplasmocitária,com células de Mott e histiócitos parasitados permeando a área de exsudação. Adicionalmente, perdade estratificação e ulceração epitelial, rarefação ou hiperplasia de células caliciformes foram achadoscostumazes. Na glândula lacrimal da terceira pálpebra, o mesmo padrão inflamatório foi observado,acompanhado frequentemente de atrofia acinar e dilatação dos ductos secretórios. A imunoistoquímicarevelou parasitismo em todas as amostras, em diferentes intensidades.

SUSCEPTIBILIDADE DO BAÇO CANINO À INFECÇÃO POR Leishmania infantum

A Leishmaniose Visceral (LV) é uma antropozoonose cosmopolita, cujo mais importante reservatório urbano do parasita Leishmania infantum é o cão. Na LV canina é descrito um quadro de imunossupressão induzida pelo parasita, que pode suprimir a resposta anti-leishmania. O fator de transcrição STAT3 é ativado para a indução da expressão de citocinas associadas a resposta imune Th2, bem como, este fator é uma peça chave para a ligação do STAT6 com genes-alvo na indução da resposta imunossupressora Th2. O baço é o principal órgão linfoide responsável pela ativação de resposta imune sistêmica, no entanto, o mesmo mantém a infecção durante todo o curso da LV. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar 27 amostras de baços de cães com LV naturalmente infectados e comparar a imunodetecção do STAT3 e do STAT6 com a densidade de macrófagos parasitados (imunomarcação) e a intensidade das lesões esplênicas. Para isto, foram utilizadas amostras de baço de 31 cães (27 amostras de cães infetados e 4 amostras de baço de cães livre de LV) provenientes do arquivo de blocos do Departamento de Patologia Veterinária, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Unesp, campus de Jaboticabal. As amostras foram divididas nos grupos de animais controle (GC), assintomático (GA) e sintomático (GS). Os cães do grupo GS, seguidos de GA apresentaram inflamação granulomatosa, com macrófagos parasitados ou não predominantemente em polpa vermelha. Também houve a redução da área da polpa branca, rarefação linfoide e apoptose de linfócitos T. A detecção dos STATs foi observada em linfócitos e macrófagos e foi maior nos grupos infectados, exceto no grupo GS para STAT6. A imunodetecção do parasito mostrou diferenças entre os grupos GS e GA. Portanto conclui-se que STAT3 e STAT6 estavam associadas as lesões esplênicas e a presença do parasito em animais infectados. Estes fatores de transcrição podem estar contribuindo para a susceptibilidade do baço a infecção por Leishmania infantum.

Visceral Leishmaniasis (LV) is a cosmopolitan anthropozoonosis whose largest volume is the urban reservoir of the parasite Leishmania infantum is the dog. A parasite-induced immunosuppression picture, described in LVC, may suppress the response against leishmania. The transcription factor STAT3 is activated to induce the expression of cytokines associated with Th2 immune response, as well as, this factor is a key piece for the binding of STAT6 with target genes in the induction of Th2 immunosuppressive response. The spleen is the major lymphoid organ responsible for the activation of systemic immune response; however, it maintains the infection throughout the course of VL. Therefore, the objective of this study was to evaluate 27 samples from spleens of dogs with naturally infected LV and correlate the immunodetection of STAT3 with the density of parasitized macrophages (immunostaining) and the severity of splenic injuries. For this, spleen samples of 31 (27 samples of infected dogs and 4 samples of spleen of free- LV dogs) from the archive of the Department of Veterinary Pathology, Faculty of Agrarian and Veterinary Sciences (FCAV) of Unesp, Jaboticabal campus, were used. The samples were divided into groups of animals as control (CG), asymptomatic (GA) and symptomatic (GS). The dogs of the GS group, followed by GA, presented granulomatous inflammation, with parasitized or non-parasitized macrophages, reduced white pulp area, linear rarefaction and T lymphocyte apoptosis. The detection of STATs was observed in lymphocytes and macrophages and was higher in infected groups, except in the GS group for STAT6. The immunodetection of the parasite was differentiated between the GS and GA groups. Therefore, it was concluded that STAT3 and STAT6 were associated with splenic lesions and the presence of the parasite in infected animals and may be contributing to the susceptibility of the virus to infection by Leishmania infantum.

AVALIAÇÃO DA IMUNOMARCAÇÃO de COX-2 EM CARCINOMAS INTESTINAIS CANINOS

Devido ao aumento da expectativa de vida dos animais de estimação, o aparecimento de neoplasias tem se tornado uma importante afecção na Medicina Veterinária. As neoplasias gastrointestinais de cães são pouco diagnosticadas e sua etiologia é desconhecida. As localizações mais frequentes são o jejuno, cólon e reto. Objetivou-se avaliar a Cox-2 por meio de imunohistoquímica e a intensidade de PAS positivo nas amostras de intestinos de cães saudáveis (GS) e com neoplasia (GN). As neoplasias foram classificadas por análise histopatológica. As diferenças foram significativas quando P<0.05 (testes não paramétricos). Nas amostras neoplásicas observou-se imunodetecção acentuada de COX-2, quando comparadas aos cães saudáveis, com diferenças significativas entre os grupos. O mesmo ocorreu para a intensidade de PAS, onde se observou diminuição do número de células caliciformes e aumento na produção de muco nas amostras neoplásicas, enquanto nas amostras saudáveis observou-se marcação intensa nas células caliciformes. Com isso pode-se concluir que a COX está envolvida na capacidade do tumor evadir as defesas do sistema imunológico. Apesar da relação entre o processo inflamatório, mais especificamente o papel das prostaglandinas, e o desenvolvimento e propagação tumoral ser bastante claro, ainda muito se têm a ser esclarecido.

Due to the increase in the life expectancy of the pets, the appearance of neoplasias has become an important affection in the Veterinary Medicine. Gastrointestinal neoplasms of dogs are poorly diagnosed and their etiology is unknown. The most frequent locations are jejunum, colon and rectum. The objective of this study was to evaluate Cox-2 by means of immunohistochemistry and the positive PAS intensity in intestinal samples from healthy dogs (GS) and neoplasia (GN). The neoplasms were classified by histopathological analysis. The differences were significant when P <0.05 (non-parametric tests). In the neoplastic samples, marked COX-2 immunodetection was observed when compared to healthy dogs, with significant differences between groups. The same was observed for PAS intensity, where a decrease in the number of goblet cells and an increase in the mucus production were observed in the neoplastic samples, while in the healthy samples intense marking was observed in the goblet cells. With this we can conclude that COX is involved in the ability of the tumor to evade the defenses of the immune system. Although the relationship between the inflammatory process, more specifically the role of prostaglandins, and tumor development and propagation is very clear, much remains to be elucidated.

Alterações provocadas por Neospora caninum e imunodetecção de Toxoplasma gondii em placentas de cabras sem raça definida

O Toxoplasma gondii e o Neospora caninum são protozoários que causam diversas desordens reprodutivas em animais. Este estudo foi realizado com objetivo em cabras, os danos placentários causados por esses protozoários durante a gestação. No primeiro experimento foi realizada, análise ultraestrutural em placentas de animais infectados experimentalmente por N. caninum. Os animais foram divididos em 4 grupos, e inoculados em diferentes tempos gestacionais: G1, com inoculação aos 40 dias de gestação (n=4); G2, animais inoculados aos 90 dias de gestação (n=4); G3, inoculados aos 120 dias de gestação (n=4) e G4, grupo controle (n=3). Quando observado sofrimento fetal, as cabras foram eutanasiadas para coleta dos placentomas. Estes foram fixados em glutaraldeído com tampão fosfato a 2,5% refrigerado. As amostras foram pós-fixadas, desidratadas e incluídas em Époxy e, posteriormente realizados cortes em ultramicrótomo e analisadas. Foram identificadas lesões celulares graves como degenerações, vacuolização celular, retração nuclear/degeneração nuclear, restos celulares, em uma das amostras, o protozoário foi visualizado. Em conclusão, os achados ultraestruturais apresentados indicam modificações celulares degenerativas acentuadas em placentas de cabras induzidas por N. caninum. No segundo experimento, utilizou-se placentas provenientes de animais naturalmente infectados por T. gondii. Foram avaliadas 213 amostras de placenta de animais sorologicamente positivos em ELISA, submetidos a exames histopatológicos. Apenas 23 amostras apresentaram lesões características para protozoários e 4 foram provenientes de animais sorologicamente negativos, porém que também apresentaram as mesmas lesões. As amostras placentárias passaram por processo de desidratação, diafanização e inclusão em parafina. Os cortes de placentas foram submetidos a imunohistoquímica (IHQ) utilizando anticorpo anti-Toxoplasma gondii e o kit comercial DAKO LSAB2 System-HRP. Dessas amostras de placenta obtidas, 85,2% (23/27) foram positivas na IHQ e 81,5% (22/27) apresentaram lesões compatíveis com a infecção por T. gondii. A imunoexpressão ocorreu em células epiteliais das vilosidades placentárias. A técnica de IHQ demonstrou ser uma ferramenta valiosa no diagnóstico de T. gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas complementando de forma decisiva e agregando maior valor aos resultados obtidos na análise histopatológica e sorológica

Toxoplasma gondii and Neospora caninum are protozoa that cause various reproductive disorders in animals. With the objective of studying the reproductive disorders in goats, aiming at the placental damages caused by these protozoa, this study was carried out. The study consists of two stages, the first, ultrastructural analysis in placentas of 15 animals infected experimentally by N. caninum. The animals were divided into 4 groups, and inoculated at different gestational times: G1, with inoculation at 40 days of gestation (n = 4); G2, animals inoculated at 90 days of gestation (n = 4); G3, inoculated at 120 days of gestation (n = 4) and G4, control group (n = 3). When fetal distress was observed, the goats were euthanized to collect the placentomas. These were fixed in glutaraldehyde with 2.5% refrigerated phosphate buffer. The samples were sent to the Keizo Asami Immunopathology Laboratory for post-fixation, dehydration and inclusion in Epoxy and later to the Center of Strategic Technologies of the Northeast, where cuts were made in ultramicrotome and observation. Serious cell lesions such as degeneration, cell vacuolization, nuclear retraction / nuclear degeneration, cellular debris were identified in one of the samples, the protozoan was visualized and organelle degradation of placental cells. In conclusion, the ultrastructural findings presented indicate marked degenerative cell changes in N. caninum-induced goat placentas. In the second, immunohistochemistry was used in placentas from animals naturally infected with T. gondii. 213 placenta samples from serologically positive animals in ELISA, and also submitted to histopathological exams. Of these, 23 samples had characteristic lesions for protozoa and 4 were from serologically negative animals, but also had the same lesions. The placental samples underwent cleavage, dehydration, diaphanization and paraffin inclusion. Block cuts were performed by immunohistochemistry using anti-Toxoplasma gondii antibody and the commercial DAKO LSAB2 System-HRP kit. Of these placenta samples obtained, 85.2% (23/27) were positive in IHC and 81.5% (22/27) had lesions compatible with T. gondii infection. Immunoexpression occurred in epithelial cells of the placental villi. The IHQ technique proved to be a valuable tool in the diagnosis of T. gondii in placental tissue of naturally infected goats complementing in a decisive way and adding greater value to the results obtained in the histopathological and serological analysis

CONTRIBUIÇÃO DOS ASTRÓCITOS NA LEUCOENCEFALITE CANINA IMUNOMEDIADA CAUSADA PELO VÍRUS DA CINOMOSE

No sistema nervoso central (SNC) a homeostase é mantida pelo contato célula a célula e por meio da expressão de receptores de membrana em neurônios, que se ligam a microglia para mantê-la em estado quiescente. Os astrócitos também contribuem com este processo, além disso, eles exercem inúmeras funções para a manutenção da imunotolerância local. Em situação de injúria, os astrócitos podem apresentar um efeito deletério, pois ativam a resposta imune e os efeitos da neuroinflamação e podem contribuir para o agravamento dos sinais clínicos neurológicos. Na cinomose canina, enfermidade infecciosa que pode cursar com desmielinização e inflamação no SNC, acredita-se que além do vírus, o processo inflamatório contribua com as lesões na substância branca. Portanto, os objetivos do presente estudo foram avaliar o papel dos astrócitos na encefalite causada pelo vírus da cinomose, por meio da imunodetecção de MHC-II, linfócitos T CD3, MMP9, MIF e GFAP nas áreas de desmielinização do encéfalo, a fim de verificar se estes achados podem estar relacionados à extensão ou gravidade das lesões encefálicas. Para isso realizou-se um estudo retrospectivo do arquivo de blocos de parafina, onde utilizou- se 21 blocos de encéfalos (cerebelo) de cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose (grupo infectado), bem como, encéfalos de cinco animais livres de doenças sistêmicas ou que afetem o SNC (grupo controle). Na análise imunohistoquímica das amostras verificou-se marcação aumentada de GFAP, MHC-II, MMP9 e MIF nas áreas de desmielinização e no neuropilo adjacente, observada principalmente em astrócitos. A detecção de CD3 foi restrita aos manguitos perivasculares. Nas áreas de necrose liquefativa, as células Gitter foram positivas para MMP-9, MIF e MHC-II. Por esses fatos conclui-se que os astrócitos ativados influenciam no afluxo de linfócitos T para o encéfalo, resultando em leucoencefalite, que contribui para o agravamento da lesão viral nos cães do grupo infectado. Nas fases mais avançadas, os fagócitos ativados (células Gitter) nas áreas de necrose liquefativa continuam a produção de mediadores inflamatórios, mesmo após a morte dos astrócitos nestes locais, agravando as lesões encefálicas.

In the central nervous system (CNS) homeostasis is maintained by cell- to-cell contact and by the expression of membrane receptors on neurons, which bind to microglia to keep it in a quiescent state. Astrocytes also contribute to this process, in addition, they exert numerous functions for the maintenance of local immunotolerance. In a situation of injury, astrocytes may have a deleterious effect, since they activate the immune response and the effects of neuroinflammation and may contribute to the worsening of clinical neurological signs. In canine distemper, an infectious disease that can occur with demyelination and inflammation in the CNS, it is believed that in addition to the virus, the inflammatory process contributes to lesions in the white matter. Therefore, the objectives of the present study were to evaluate the role of astrocytes in encephalitis caused by the distemper virus, by immunodetection of MHC-II, CD3, MMP9, MIF and GFAP T lymphocytes in the areas of brain demyelination, in order to verify whether these findings may be related to the extent or severity of brain lesions. For this, a retrospective study of the paraffin block file was carried out, using 21 blocks of cerebellum from dogs naturally infected with the distemper virus (infected group), as well as the brains of five disease-free animals systemic or affecting the CNS (control group). In the immunohistochemical analysis of the samples, there was an increased marking of GFAP, MHC-II, MMP9 and MIF in the areas of demyelination and adjacent neuropil, observed mainly in astrocytes. CD3 detection was restricted to perivascular cuffs. In areas of liquefiable necrosis, Gitter cells were positive for MMP-9, MIF and MHC-II. By these facts it is concluded that the activated astrocytes influence the influx of T lymphocytes to the brain, resulting in leukoencephalitis, which contributes to the worsening of the viral lesion in dogs of the infected group. In the more advanced stages, activated phagocytes (Gitter cells) in the areas of liquefying necrosis continue the production of inflammatory mediators, even after the death of the astrocytes in these places, aggravating the brain lesions.

Efeito da terapia com células tronco mesenquimais na proteinúria de cães com doença renal crônica

A proteinúria de origem renal é um indicador de lesão e atua na progressão da doença renal crônica em cães. Na rotina clínica, várias são as recomendações em relação à terapia de manutenção, que visam minimizar ou retardar a progressão da doença. Com o recente progresso na pesquisa sobre a terapia com as células tronco mesenquimais (CTM), tem-se discutido sobre a possibilidade de minimização dos mecanismos inflamatórios e imunológicos de autoperpetuação da lesão renal com a sua utilização, assim a análise sequencial das proteínas urinárias por métodos qualitativos, tais como a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e a imunodetecção das proteínas por Western Blot pode trazer subsídios para esta avaliação. Portanto, como hipótese, suscita-se que a administração de CTM em cães com DRC possa trazer benefícios com o intuito de minimizar o desenvolvimento da proteinúria, contribuindo para o retardo na velocidade de progressão da doença renal. Trata-se de um estudo prospectivo, longitudinal, duplo-cego e randomizado em que foram avaliados 22 cães com DRC, tratados com solução fisiológica (SF) ou CTM e avaliados a cada 30 a 45 dias em 12 momentos, divididos em grupos de acordo com o estágio da doença, grupo A (estágio 2, SF:n=6, CTM:n=3) e grupo B (estágio 3, SF:n=6, CTM:n=7). Observou-se que os cães do Grupo B apresentaram proteinúria mais intensa, maior porcentagem de proteínas de alto peso molecular, maior imunodetecção de albumina, proteínas ligadas ao retinol e a vitamina D e menor imunodetecção de proteína de Tamm-Horsfall ao longo do acompanhamento, quando comparado ao Grupo A. Os resultados obtidos nesse estudo, não permitiu definir conclusões contundentes de que a terapia com a CTM tenha trazido alterações importantes que indicasse o seu benefício. Os dados sugerem que os cães nos estágios iniciais da DRC (estágio 2) poderiam ser os mais favorecidos com a referida terapia, entretanto mais estudos contemplando um número maior de animais, como o maior tempo de acompanhamento devem ser conduzidos para tal investigação.

Protein of renal origin is an indicator of injury and acts on the progression of chronic kidney disease in dogs. In the clinical routine, several recommendations regarding maintenance therapy are aimed at minimizing or delaying the progression of the disease. With the recent progress in the research on mesenchymal stem cell therapy (CTM), it has been discussed the possibility of minimizing the inflammatory and immunological mechanisms of self-perpetuation of the renal lesion with its use, thus the sequential analysis of the urinary proteins by qualitative methods such as polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the immunodetection of proteins by Western blot can prove the efficacy of the therapy. Therefore, as hypothesis, it is suggested that the administration of CTM in dogs with CKD can fetch benefits in order to minimize the development of proteinuria, contributing to the delay in the rate of progression of renal disease. This is a prospective, longitudinal, double-blind, randomized study in which 22 dogs with CKD were treated with physiological solution (SF) or CTM and evaluated every 30 to 45 days in 12 moments divided into groups according to (stage 2, SF: n = 6, CTM: n = 3) and group B (stage 3, SF: n = 6, CTM: n = 7). Group B dogs were found to have more intense proteinuria, a higher percentage of high molecular weight proteins, greater albumin immunodetection as well as retinol-binding protein and vitamin D-binding protein, and decreased Tamm-Horsfall protein immunodetection throughout follow-up, when compared to Group A. The results obtained in this study did not allow to draw conclusive conclusions that CTM therapy brought important changes that indicated its benefit. The data suggest that dogs in the early stages of CKD (stage 2) could be the most favored with such therapy, however more studies contemplating a larger number of animals, such as longer follow-up, should be conducted for such investigation.

RELAÇÃO ENTRE AS CÉLULAS DENDRÍTICAS E OS LINFÓCITOS T REGULATÓRIOS EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS

Os tumores mamários malignos possuem várias formas de evadir o sistema imune e, dentre elas está a modulação das células dendríticas (DCs), por interferência na sua maturação, resultando em apresentação de antígenos ineficiente aos linfócitos T e consequente indução da tolerância imunológica. As DCs moduladas pelo tumor recrutam muitos linfócitos T regulatórios (Tregs) para o microambiente tumoral, o que amplia os efeitos imunossupressores locais. A forte relação entre as DCs e os linfócitos Tregs no microambiente tumoral ainda foi pouco estudada, principalmente em cães. Por isso, este estudo teve o objetivo de avaliar a relação existente entre as DCs e os linfócitos Tregs em carcinomas mamários caninos do tipo simples de cadelas, por meio da técnica de imunohistoquímica. Foram utilizadas 10 amostras de glândula mamária sem tumor (G1) e 40 amostras de neoplasias mamárias (G2: adenomas; G3: carcinomas papilares; G4: carcinomas tubulares e G5: carcinomas sólidos), que foram submetidas a imunodetecção de linfócitos Treg (FOXP3+), linfócitos T CD4 e T CD8, MHC-II, DCs mieloides (imaturas e maduras), as citocinas TGF-, IL-10, a enzima Indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO) e dos receptores de quimiocina (CCR6 e CCR7). A maioria das células, citocinas e receptores imunológicos mostraram correlação positiva dentro da população tumoral e controles avaliados, principalmente sobre o efeito fixo idade, que teve alta correlação positiva com o tamanho tumoral e com CCR6. Quanto às correlações negativas, o anticorpo CD83 foi o único que não teve correlação significativa positiva com nenhuma outra variável. Observou-se que houve ocorreu relação entre as DCs mieloides imaturas/maduras e linfócitos Tregs, bem como TGF- e IL-10, e a enzima IDO apresentaram marcante presença nas amostras malignas. A imunodetecção de CCR6 e CCR7 ocorreu principalmente nos tumores mais agressivos, onde CCR6 teve alta relação com as pacientes mais idosas e com tumores maiores, o que, no final de tudo pode refletir que o envelhecimento do sistema imunológico possa ser mais um fator pró-tumoral.

The malignant mammary tumors have several ways of evading the immune system, including the modulation of dendritic cells (DCs), by interfering with their maturation, resulting in inefficient presentation of antigens to T cells and consequent induction of immunological tolerance. Tumor-modulated DCs recruit many regulatory T cells (Tregs) into the tumor microenvironment, which amplifies local immunosuppressive effects. The strong relationship between DCs and Tregs cells into the tumor microenvironment was poorly studied, especially in dogs. Therefore, this study aimed to evaluate the relationship between DCs and Tregs cells in the simple type canine mammary carcinomas, using the immunohistochemical technique. Ten samples of mammary gland without tumor (G1) and 40 samples of mammary neoplasms (G2: adenomas, G3: papillary carcinomas, G4: tubular carcinomas and G5: solid carcinomas) were submitted to immunodetection of Treg cells (FOXP3 +), CD4 and CD8 T cells, MHC-II, myeloid DCs (immature and mature), cytokines TGF-, IL-10, Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and chemokine receptors (CCR6 and CCR7). Most of the cells, cytokines and immunological receptors showed positive correlation within the tumor population and controls evaluated, mainly on the fixed effect "age that had high positive correlation with the tumor size and with CCR6. As for the negative correlations, the CD83 antibody was the only one that had no significant positive correlation with any other variable. It was observed that there was a relationship between immature / mature myeloid DCs and Tregs cells, as well as TGF- and IL-10, and the IDO enzyme showed a marked presence in the malignant samples. Immunodetection of CCR6 and CCR7 occurred mainly in the most aggressive tumors, where CCR6 had a high relation with older patients and with larger tumors, which, in the end, may reflect that the aging of the immune system may be more of a pro- tumor.

AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA DISULFETO ISOMERASE A1 (PDIA1) COMO MARCADOR PARA A QUALIDADE SEMINAL EM GARANHÕES

O período de puberdade, em equinos, define-se pela aparição de espermatozóides maduros no ejaculado de animais jovens, bem como a maturação das funções endócrinas. Os espermatozóides precisam passar por um processo de maturação no epidídimo. Para se obter marcadores moleculares que permitam estabelecer a fertilidade de um garanhão, é necessário um melhor conhecimento das proteínas presentes em espermatozóides imaturos e maduros, uma das quais é a PDI (proteína dissulfeto-isomerase). A PDI foi descrita também como importante marcador de fertilidade no plasma seminal e espermatozóides de diversas espécies. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença da PDI no epidídimo equino durante a puberdade, e quantificá-la no fluido e espermatozóides epididimários. Visou verificar a presença da PDI no plasma seminal e espermatozóides ejaculados, em garanhões férteis e subférteis. Foram realizados dois experimentos: Experimento 1: utilizou-se 22 equinos Crioulos saudáveis, castrados e divididos em três grupos: G1: potros até 24 meses, G2: de 25-36 meses e G3: a partir de 36 meses. Imediatamente após a castração, foi efetuada a dissecação do epidídimo para a coleta de fluido epididimário, o qual foi separado dos espermatozoides por centrifugação a 800 g por 10minutos. O sobrenadante foi removido, e criopreservado a -196º C. Os espermatozóides foram ressuspendidos em PBS e armazenados a -196º C. Para a dosagem de proteína das amostras, utilizou-se o método de Kit BCA espectrofotômetro e a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% SDS- Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Para a visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas quantificadas pela utilização do software livre ImageJ. A PDI foi identificada nos três grupos avaliados na análise proteômica do fluido , e espermatozoides epididimários, sendo sua quantidade inferior no G1 em relação aos grupos dois (2) e três (3). Em conclusão, a expressão da PDI nos espermatozóides e fluido epididimários de potros castrados cirurgicamente, aumenta conforme o animal atinge a maturidade sexual. Experimento 2- Utilizou-se 12 garanhões adultos que já haviam sido submetidos à pelo menos duas temporadas de monta na região da Campanha do Rio Grande do Sul, efetuando-se quatro (4) coletas de cada garanhão, fora da estação de monta, respeitando-se um intervalo de 48h entre coletas. Imediatamente após a coleta, analisou-se motilidade, vigor e concentração com auxílio de microscópio óptico e retirou-se uma alíquota de sêmen para avaliação das patologias espermáticas. A partir dos dados obtidos, os garanhões foram divididos em dois grupos: Grupo 1: motilidade não inferior a 70%, tendo-se uma média de 76,04±5,89% e histórico reprodutivo de temporadas anteriores com índice de prenhez mínimo por temporada de 80%. Grupo 2: motilidade igual ou inferior a 30%, com média de 11,83±11,21%, e histórico reprodutivo de temporadas anteriores de índices de prenhez inferiores a 35%. Efetuadas as análises, as mostras foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos para separar o plasma seminal, de mesma forma que no Exp. 1. Os pellets passaram por ressuspensão em PBS gelado e posteriormente armazenados a -196º C. As amostras foram submetidas à dosagem das proteínas, para serem submetidas à eletroforese, utilizando-se géis de poliacrilamida a 10% SDS-Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Na visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas foram quantificadas pela utilização do software livre Image J. Ao analisar a presença da PDI no plasma seminal dos garanhões, verificou-se sua expressão em ambos os grupos; porém não houve diferença de expressão da PDI entre eles(p0,05). Não houve também relação da PDI com motilidade, nem com a concentração espermática. Considerando os dados obtidos no presente experimento, não foi possível relacionar a PDI com qualidade espermática e assim considerá-la como um potencial marcador de fertilidade em equinos. São necessários mais estudos que possam envolver outros fatores moleculares inclusive as demais proteínas da família das PDIs.

Puberty, in the equine species, may be defined by the appearance of mature spermatozoa in young animals´ ejaculates, as well as endocrine function maturation. One of the proteins found in immature and mature spermatozoa is PDI (protein dissulfide-isomerase). PDI was also described as an important fertility marker both in seminal plasma and sperm of many species. is responsible for rearranging dissulfide bonds, necessary for sperm adhesion proteins to link to the oocyte. The aim of this work was to identify PDI in equine epididymis during puberty, and quantify it in epididymal sperm and fluid of fertile and subfertile sperm. Two experiments were performed. Experiment 1-twentytwo healthy Crioulo colts were surgically castrated, and divided in three groups: G1: until 24 months; G2: from 25-36 months and G3: more than 36 months. Immediately after castration, testicles were measured, weighed, and the epididymis was dissecated for epididymal fluid collection, which was centrifuged at 800 g for 10minutes to separate epididymal fluid from sperm. Supernatant was removed, and cryopreserved at -196º C. Sperm were re-suspended in PBS and stored at -196º C. Protein dosing of samples was performed with BCA Kit and electrophoresis at 10% SDS-Page. To detect proteins, primary antibody was incubated for at least 6 hours at 4º C, and then incubation with secondary antibody conjugated with anti-mouse IgG or anti-rat IgG. To see bands, ECL Kit in X-ray films was used, and the bands quantified with softwareImageJ. In the three groups PDI was identified, in epididymal fluid and epididymal sperm, but in smaller amount in G1 when compared with Groups 2 and 3. In conclusion, expression of PDI in epididymal fluid and sperm of surgically castrated colts, increases as the animal attains sexual maturity. Experiment 2- The aim of this work was to verify the presence of PDI in equine seminal plasma and sperm, quantify it and to compare its expression on seminal plasma from fertile and subfertile stallions. Twelve adult stallions with at least two breeding season were used. For the study, four collections of each animal were performed. Immediately after collection, analysis of motility, velocity, concentration and sperm morphology were performed. Stallions were divided in two groups, according to the semen analysis and previous breeding history: Group 1: motility greater than 70% and previous history of pregnancy rates higher than 80%; Group 2: sperm motility less or equal than 30% and breeding history of less than 35% of pregnacy per season. After the analysis, samples were centrifuged at 800 g/10minutes to remove seminal plasma. Samples were prepared as described in Exp. 1. The expression of PDI in seminal plasma was seen in both groups, but with no statistical difference between them. There was no correlation of PDI with sperm motility or concentration. According to these findings, it is not possible to consider PDI as a fertility marker in stallions. More research is needed, involving other mollecular factors, including other PDIs family proteins.

PURIFICAÇÃO PARCIAL DAS RAM SEMINAL VESICLE PROTEINS (RSVP14 E RSVP22) NO PLASMA SEMINAL OVINO

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de desenvolver uma metodologia para purificar as RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) de 14 kDa e 22 kDa. O trabalho foi desenvolvido com 16 animais da raça Morada Nova, mantidos em sistema intensivo de produção, dos quais amostras de sêmen foram coletadas semanalmente por meio de eletroejaculador, para separação do plasma seminal das células espermáticas por meio de centrifugações. As proteínas do plasma seminal foram precipitadas com etanol frio e 6,15 mg/mL de proteínas totais foram submetidas à cromatografia líquida de afinidade por gelatina, utilizando uma resina Gelatina-Sepharose acoplada a um sistema cromatográfico automatizado. As proteínas foram eluídas em quatro picos cromatográficos (P1, P2, P3 e P4), dos quais P1 e P2 continham proteínas com baixa ou nenhuma afinidade pela gelatina e P3 e P4 abrangeu as proteínas com domínios de fibronectina II com alta afinidade à gelatina. Uma alíquota de 20 g de proteínas, de cada pico, foi submetida à técnica de SDS-PAGE a 12,5% e outra alíquota contendo 20 g de proteínas, foi submetida à técnica de Western Blot, utilizando anticorpos primários anti-BSPs ovinas. Os pesos moleculares das proteínas separadas por eletroforese foram determinados com o auxílio do aplicativo Quantity One, no qual foram detectadas 5 bandas proteicas em P4, com pesos moleculares entre 12 e 30 kDa. A técnica de Western Blot demonstrou marcação específica para RSVP nos quatro picos, enquanto que P1 e P2 a marcação foi menos intensa, devido alguma forma agregada ou associada a fosfolipídios das proteínas RSVPs que acarretou em uma leve marcação na imunodetecção e em P3 e P4 a marcação foi especifica. O pico P4 foi submetido a um segundo passo cromatográfico, na coluna HiTrap Heparin HP. Neste caso, o P4 originou dois picos cromatográficos (P1 e P2) bem definidos, em que P1 abrangeu as proteínas com baixa ou nenhuma afinidade a heparina e P2, as proteínas com afinidade a heparina. As proteínas dos dois novos picos foram submetidas às técnicas de SDS-PAGE a 12,5%, e Western Blot, no qual foi possível detectar a presença de 3 bandas proteicas em P1 e 3 bandas proteicas em P2. Acredita-se que a RSVP14 e RSVP22 estejam contidas na fração sem afinidade à heparina e na fração com afinidade à gelatina, respectivamente, necessitando de mais testes para comprovar nossas teorias iniciais.

The present study aimed to develop a methodology to purify the RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) of 14 kDa and 22 kDa. The work was developed with 16 animals of the Morada Nova breed, kept in an intensive production system, which the samples of semen were collected weekly by means of electro-ejaculator, to separate seminal plasma from the sperm cells through centrifugation. Seminal plasma proteins were precipitated with cold ethanol and 6.15 mg/mL of total proteins were subjected to liquid gelatin affinity chromatography using a Gelatin-Sepharose matrix coupled to an automated chromatographic system. Proteins were eluted into four peaks (P1, P2, P3 and P4), which P1 and P2 contained proteins with low or none affinity for gelatin and P3 and P4 encompassed proteins with fibronectin II domains with high affinity to gelatin. An aliquot of 20 g of proteins from each peak was subjected to the 12.5% SDS-PAGE technique and another aliquot containing 20 g of proteins was subjected to Western Blot technique using primary ovine anti-BSPs. The molecular weights of proteins separated by electrophoresis were determined with the aid of the Quantity One Software, which 5 protein bands were detected in P4, with molecular weights between 12 and 30 kDa. The Western blot technique demonstrated specific labeling for RSVP at all four peaks, whereas P1 and P2 labeling was less intense, due to some aggregate or phospholipid-associated form of RSVP that resulted in a slight immunodetection labeling, and at P3 and P4 labeling was specific. The last peak, P4, was subjected to a second chromatographic step on the HiTrap Heparin HP column. Therefore, P4 originated two well-separated chromatographic peaks (P1 and P2), where P1 encompassed the proteins with low or none affinity to heparin and P2, the proteins with affinity to heparin. Proteins from the two new peaks were submitted to 12.5% SDS-PAGE and Western Blot, which it was possible to detect the presence of 3 protein bands in P1 and 3 protein bands in P2. It is believed that RSVP14 and RSVP22 are present in the fraction with no affinity to heparin and fraction with affinity to gelatin, respectively, requiring further testing to prove our initial theories.

Caracterização da Enzima Conversora de Angiotensina no Sêmen de Touros Nelore

Esse estudo foi realizado com o objetivo de imunolocalizar a enzima conversora de angiotensina (ECA) no sêmen de touros Nelore, sua caracterização antes e depois da criopreservação do sêmen e sua importância na capacitação espermática. Utilizaram-se amostras de sêmen de cinco touros Nelore, sexualmente maduros, para a imunolocalização e padrão de localização. Para a caracterização antes e depois do congelamento/descongelamento, foram utilizadas amostras de 10 touros Nelore, sexualmente maduros. Após a coleta, a metade do ejaculado foi congelado e a outra metade foi processada in natura. Imediatamente após a coleta ou descongelamento, o sêmen foi centrifugado duas vezes e o pellet ressuspendido com TALP. As amostras foram padronizadas numa concentração de 100 x 106 espermatozoides em 100 L e submetidas ao western blot e à imunocitoquímica utilizando-se o anticorpo anti-ECA. O anticorpo monoclonal utilizado foi capaz de reconhecer pelo menos uma banda de proteínas com 100 kDa na suspensão de espermatozoides dos touros Nelore, bem como no plasma seminal destes mesmos animais. A imunodetecção da ECA no espermatozoide foi caraterizada pela coloração intensa observada sobre toda a região periacrosomal, demonstrando a localização desta enzima no espermatozoide dos animais avaliados. Após o descongelamento, percebeu-se que o processo de criopreservação reduziu a intensidade das bandas de proteínas em aproximadamente 70% da quantidade inicial (P<0,05), mostrando que houve perda desta enzima durante o protocolo utilizado. pela técnica de imunocitoquímica também observou-se uma redução na intensidade do corante fluorescente, entretanto, não houve alteração na localização da enzima. Houve redução da capacitação espermática e reação do acrossomo no grupo tratado com inibidor da ECA (captopril - 10M) (P<0,05), o que indica ação da enzima nesses processos.

This study was conducted to determinate the imunolocalization of the angiotensin converting enzyme (ACE) in the semen of Nelore bulls, its characterization before and after cryopreservation and its importance in sperm capacitation. Were used semen samples from five Nellore sexually mature bulls, for immunolocalization and pattern location, and for characterization before and after freeze / thawing, samples were used from 10 Nellore sexually mature bulls. After collection with artificial vagina, half of the ejaculate was frozen and half was processed in natura. Immediately after collection or thawing, the semen was centrifuged twice and resuspended pellet with TALP. Samples were standardized to a concentration of 100 x 106 sperm in 100 L and subjected to western blot and immunocytochemistry using anti-ACE antibody. The monoclonal antibody used was able to recognize a band of 100 kDa protein in spermatozoa suspension of Nellore as well as seminal plasma of these same animals. Immunodetection ACE in sperm was characterized by intense staining observed on all periacrosomal region, showing the location of this enzyme in sperm of animals worked. After thawing, it was noticed that the cryopreservation process reduced the intensity of the protein bands in over 70% of the initial quantity (P <0.05), showing that this enzyme was lost during the protocol used. The immunocytochemistry technique also showed a reduction in the intensity of fluorescent dye, however, there was no change in the enzyme's location. There was reduction in sperm capacitation and acrosome reaction in the group treated with ACE inhibitor (captopril - 10 mM) (P <0.05), indicating action of the enzyme in these processes.