Espermatozoides epididimários: refrigeração e criopreservação / Epididymal spermatozoa: refrigeration and criopreservation

A recuperação de espermatozoides epididimários após a morte possibilita a utilização do material genético de reprodutores de interesse zootécnico que morrem inesperadamente e de espécimes selvagens ou ameaçadas de extinção. O período máximo após a morte pelo qual os espermatozoides permanecem viáveis varia conforme a temperatura de armazenamento dos epidídimos. A refrigeração e a congelação são os métodos utilizados para preservação espermática, contudo os espermatozoides epididimários apresentam peculiaridades em seus processos de preservação. A refrigeração de espermatozoides epididimários pode ser realizada in situ ou in vitro, sendo que estas duas formas de refrigeração apresentam vantagens e desvantagens inerentes às técnicas. Os espermatozoides epididimários apresentam maior resistência à variações de temperatura e osmolaridade que tornam os processos de preservação diferentes dos aplicados ao sêmen colhido em vagina artificial ou eletroejaculação. Esta revisão visa foi compilar trabalhos referentes à recuperação e preservação espermática epididimária.(AU)

The recovery of epididymal spermatozoa after death is used to avail genetic material of breeding herders of zootechnical interest who die unexpectedly and of wild or endangered species. The maximum post mortem period by which sperm remain viable varies with the storage temperature of the epididymis. Refrigeration and cryopreservation are methods for sperm preservation, however, epididymal spermatozoa present peculiarities in their preservation processes. The cooling of epididymal spermatozoa can be performed in situ or in vitro, these two forms of refrigeration have advantages and disadvantages inherent in the techniques. The epididymal spermatozoa have greater resistance to variations in temperature and osmolarity that make conservation processes different from those applied to semen collected in an artificial vagina or electroejaculation. This review aims to compile works referring to epididymal sperm retrieval and preservation.(AU)

Espermatozoides epididimários: refrigeração e criopreservação / Epididymal spermatozoa: refrigeration and criopreservation

A recuperação de espermatozoides epididimários após a morte possibilita a utilização do material genético de reprodutores de interesse zootécnico que morrem inesperadamente e de espécimes selvagens ou ameaçadas de extinção. O período máximo após a morte pelo qual os espermatozoides permanecem viáveis varia conforme a temperatura de armazenamento dos epidídimos. A refrigeração e a congelação são os métodos utilizados para preservação espermática, contudo os espermatozoides epididimários apresentam peculiaridades em seus processos de preservação. A refrigeração de espermatozoides epididimários pode ser realizada in situ ou in vitro, sendo que estas duas formas de refrigeração apresentam vantagens e desvantagens inerentes às técnicas. Os espermatozoides epididimários apresentam maior resistência à variações de temperatura e osmolaridade que tornam os processos de preservação diferentes dos aplicados ao sêmen colhido em vagina artificial ou eletroejaculação. Esta revisão visa foi compilar trabalhos referentes à recuperação e preservação espermática epididimária.

The recovery of epididymal spermatozoa after death is used to avail genetic material of breeding herders of zootechnical interest who die unexpectedly and of wild or endangered species. The maximum post mortem period by which sperm remain viable varies with the storage temperature of the epididymis. Refrigeration and cryopreservation are methods for sperm preservation, however, epididymal spermatozoa present peculiarities in their preservation processes. The cooling of epididymal spermatozoa can be performed in situ or in vitro, these two forms of refrigeration have advantages and disadvantages inherent in the techniques. The epididymal spermatozoa have greater resistance to variations in temperature and osmolarity that make conservation processes different from those applied to semen collected in an artificial vagina or electroejaculation. This review aims to compile works referring to epididymal sperm retrieval and preservation.

Assessment of different in vitro sperm challenges and in vivo fertility of bovine semen batches / Avaliação de diferentes desafios espermáticos in vitro e da fertilidade in vivo de partidas de sêmen bovino

The aim of this work was to submit sperm cells to different laboratory challenges and to compare in vitro results with in vivo semen fertility. Four different batches from the same Brangus bull were used in a timed-AI program of 332 Brangus cows. Each batch (B) was submitted to the following procedure: semen sample was thawed at 36°C for 30 seconds (control). Sperm motility parameters, plasma membrane integrity, sperm morphology, and concentration were assessed. Then, an aliquot of thawed sample was incubated in a water bath at 45°C for 40 min (thermal challenge group; TCG) and another aliquot was centrifuged at 500 xg (Percoll gradient 45%/90%) for 15 min (centrifugation challenge group; CCG). Centrifuged semen was also submitted to another thermal challenge, being incubated (water bath) at 45°C for 40 min (centrifugation + thermal challenge group; CTCG). At the end of each challenge (CCG, TCG, and CTCG), the same laboratory tests used for control group were repeated. The following conception rates (CR) were observed for each batch: B1 = 48.9% (44/90); B2 = 44.2% (23/52); B3 = 55.5% (40/72); B4 = 43.2% (51/118); (p < 0.10). In the lab, B3 presented higher (p ≤ 0.05) progressive motility (PM) than B4 after thawing (control group) and after all sperm challenges (TCG, CCG, and CTCG). However, despite B3 and B4 having demonstrated a similar percentage of plasma membrane integrity (PMI) to the control group (B3 = 66.7 ± 1.3 and B4 = 65.2 ± 3.3), B3 demonstrated higher (P ≤ 0.05) percentage of PMI (37.2 ± 2.5) than B4 (26.7 ± 3.3) after passing through the most stressing in vitro challenge (CTCG). The semen batch presenting the highest resistance to in vitro challenges was the one that presented a trend for higher in vivo fertility, suggesting that submitting semen samples to laboratory challenges may be an interesting alternative for selecting batches with greater field fertility.(AU)

O objetivo deste estudo foi estressar células espermáticas em diferentes desafios laboratoriais e comparar os resultados in vitro com a fertilidade in vivo do sêmen. Quatro partidas de um mesmo touro Brangus foram utilizadas em um programa de IATF de 332 vacas Brangus. Cada partida foi submetida ao seguinte procedimento: a amostra de sêmen foi descongelada a 36°C por 30 segundos (grupo controle). Foram avaliados parâmetros de motilidade espermática (CASA), integridade da membrana plasmática (PMI), morfologia e concentração espermática. Em seguida, uma alíquota da amostra descongelada foi incubada em banho-maria a 45°C durante 40 minutos (grupo de desafio térmico, TCG) e outra alíquota foi centrifugada a 500 xg (gradiente de Percoll 45%/90%) durante 15 min (grupo desafio de centrifugação, CCG). Uma aliquota do sêmen centrifugado foi ainda submetida ao desafio térmico, sendo incubado a 45°C durante 40 min (grupo de desafio térmico + centrifugação, CTCG). No final de cada desafio (CCG, TCG e CTCG), os mesmos testes laboratoriais utilizados para o grupo de controle foram realizados. A seguinte taxa de concepção (CR) foi observada para cada partida (B): B1 = 48,9% (44/90), B2 = 44,2% (23/52), B3 = 55,5% (40/72) e B4 = 43,2% (51/118); (P < 0,10). No laboratório, B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) motilidade progressiva (PM) do que B4 logo após o descongelamento (grupo controle) e após todos os desafios laboratoriais (TCG, CCG e CTCG). Porém, apesar de B3 e B4 demonstrarem similar porcentagem de PMI no grupo controle (B3 = 66,7 ± 1,3 e B4 = 65,2 ± 3,3), B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) PMI (37,2 ± 2,5%) do que B4 (26,7 ± 3,3%) após passar pelo maior desafio laboratorial (CTCG). A partida seminal que in vitro apresentou maior resistência aos desafios laboratoriais foi a mesma que apresentou tendência para maior fertilidade in vivo. Assim, sugere-se que submeter amostras seminais a desafios laboratoriais pode ser uma alternativa interessante para selecionar partidas com maior fertilidade a campo.(AU)

Assessment of different in vitro sperm challenges and in vivo fertility of bovine semen batches / Avaliação de diferentes desafios espermáticos in vitro e da fertilidade in vivo de partidas de sêmen bovino

The aim of this work was to submit sperm cells to different laboratory challenges and to compare in vitro results with in vivo semen fertility. Four different batches from the same Brangus bull were used in a timed-AI program of 332 Brangus cows. Each batch (B) was submitted to the following procedure: semen sample was thawed at 36°C for 30 seconds (control). Sperm motility parameters, plasma membrane integrity, sperm morphology, and concentration were assessed. Then, an aliquot of thawed sample was incubated in a water bath at 45°C for 40 min (thermal challenge group; TCG) and another aliquot was centrifuged at 500 xg (Percoll gradient 45%/90%) for 15 min (centrifugation challenge group; CCG). Centrifuged semen was also submitted to another thermal challenge, being incubated (water bath) at 45°C for 40 min (centrifugation + thermal challenge group; CTCG). At the end of each challenge (CCG, TCG, and CTCG), the same laboratory tests used for control group were repeated. The following conception rates (CR) were observed for each batch: B1 = 48.9% (44/90); B2 = 44.2% (23/52); B3 = 55.5% (40/72); B4 = 43.2% (51/118); (p < 0.10). In the lab, B3 presented higher (p ≤ 0.05) progressive motility (PM) than B4 after thawing (control group) and after all sperm challenges (TCG, CCG, and CTCG). However, despite B3 and B4 having demonstrated a similar percentage of plasma membrane integrity (PMI) to the control group (B3 = 66.7 ± 1.3 and B4 = 65.2 ± 3.3), B3 demonstrated higher (P ≤ 0.05) percentage of PMI (37.2 ± 2.5) than B4 (26.7 ± 3.3) after passing through the most stressing in vitro challenge (CTCG). The semen batch presenting the highest resistance to in vitro challenges was the one that presented a trend for higher in vivo fertility, suggesting that submitting semen samples to laboratory challenges may be an interesting alternative for selecting batches with greater field fertility.(AU)

O objetivo deste estudo foi estressar células espermáticas em diferentes desafios laboratoriais e comparar os resultados in vitro com a fertilidade in vivo do sêmen. Quatro partidas de um mesmo touro Brangus foram utilizadas em um programa de IATF de 332 vacas Brangus. Cada partida foi submetida ao seguinte procedimento: a amostra de sêmen foi descongelada a 36°C por 30 segundos (grupo controle). Foram avaliados parâmetros de motilidade espermática (CASA), integridade da membrana plasmática (PMI), morfologia e concentração espermática. Em seguida, uma alíquota da amostra descongelada foi incubada em banho-maria a 45°C durante 40 minutos (grupo de desafio térmico, TCG) e outra alíquota foi centrifugada a 500 xg (gradiente de Percoll 45%/90%) durante 15 min (grupo desafio de centrifugação, CCG). Uma aliquota do sêmen centrifugado foi ainda submetida ao desafio térmico, sendo incubado a 45°C durante 40 min (grupo de desafio térmico + centrifugação, CTCG). No final de cada desafio (CCG, TCG e CTCG), os mesmos testes laboratoriais utilizados para o grupo de controle foram realizados. A seguinte taxa de concepção (CR) foi observada para cada partida (B): B1 = 48,9% (44/90), B2 = 44,2% (23/52), B3 = 55,5% (40/72) e B4 = 43,2% (51/118); (P < 0,10). No laboratório, B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) motilidade progressiva (PM) do que B4 logo após o descongelamento (grupo controle) e após todos os desafios laboratoriais (TCG, CCG e CTCG). Porém, apesar de B3 e B4 demonstrarem similar porcentagem de PMI no grupo controle (B3 = 66,7 ± 1,3 e B4 = 65,2 ± 3,3), B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) PMI (37,2 ± 2,5%) do que B4 (26,7 ± 3,3%) após passar pelo maior desafio laboratorial (CTCG). A partida seminal que in vitro apresentou maior resistência aos desafios laboratoriais foi a mesma que apresentou tendência para maior fertilidade in vivo. Assim, sugere-se que submeter amostras seminais a desafios laboratoriais pode ser uma alternativa interessante para selecionar partidas com maior fertilidade a campo.(AU)

Qualidade do sêmen caprino diluído em tris contendo diferentes formulações do extrato bruto de mauritia flexuoxa / Sperm quality goat diluted in three different formulations containing extract of crude mauritia flexuoxa

The need for scientific development in goat became larger in order to subsidize farmers withbiotechnology to animal breeding. The advent of frozen semen increased by male progeny, possiblemanipulation and genetic material storage. It seeks to diluents free of animal substances, to ensure food safety inbiological processes. The objective of this research was seminal diluent develop using Mauritia flexuoxa extractas an additive. Obtaining the extract was from dehydrated raw materials, semen collection was performed withartificial vagina and in vitro spermatic evaluation through full force and motility. The extract prepared in TRISdiluent is included at different concentrations. Semen was diluted and evaluated the heat resistance at 37°C. Weevaluated the membrane integrity after 5, 10, 15, 30, 60 and 120 minutes of incubation at 37°C. It wasconcluded that significant differences were observed using Mauritia flexuosa extract.(AU)

Qualidade do sêmen caprino diluído em tris contendo diferentes formulações do extrato bruto de mauritia flexuoxa / Sperm quality goat diluted in three different formulations containing extract of crude mauritia flexuoxa

The need for scientific development in goat became larger in order to subsidize farmers withbiotechnology to animal breeding. The advent of frozen semen increased by male progeny, possiblemanipulation and genetic material storage. It seeks to diluents free of animal substances, to ensure food safety inbiological processes. The objective of this research was seminal diluent develop using Mauritia flexuoxa extractas an additive. Obtaining the extract was from dehydrated raw materials, semen collection was performed withartificial vagina and in vitro spermatic evaluation through full force and motility. The extract prepared in TRISdiluent is included at different concentrations. Semen was diluted and evaluated the heat resistance at 37°C. Weevaluated the membrane integrity after 5, 10, 15, 30, 60 and 120 minutes of incubation at 37°C. It wasconcluded that significant differences were observed using Mauritia flexuosa extract.

Análise do óleo essencial de Origanum majorana relacionada ao seu potencial tóxico e antineoplásico

O câncer é apontado como um problema de saúde pública de proporções mundiais, 11 uma vez que as taxas de incidência são crescentes, a mortalidade é alta e as 12 opções de tratamento farmacológico disponíveis apresentam efeitos adversos 13 graves e vêm perdendo sua eficácia ao longo do tempo, devido ao desenvolvimento 14 de mecanismos de resistência pelas células neoplásicas. Frente a essa realidade, a 15 indústria farmacêutica tem nas plantas medicinais um amplo painel de moléculas 16 potencialmente eficazes e menos tóxicas a serem estudadas. A tualmente já está 17 cientificamente comprovado qu e os compostos químicos presentes nas plantas 18 medicinais podem proteger as células de eventos carcinogênicos, agindo contra a 19 promoção e a progressão tumorais. Porém, os mesmos princípios ativos que 20 conferem as propriedades terapêuticas a essas plantas, ta mbém podem ser os 21 responsáveis pelos seus efeitos tóxicos e reações adversas. Nesse contexto, o 22 presente trabalho tem como objetivos estudar a citotoxicidade do óleo essencial de 23 Origanum majorana (OEOM) em células espermáticas suínas e hemácias e o seu 24 me canismo de ação intracelular em linhagens celulares não neoplásicas (MDBK 25 Madin Darby Bovine Kidney) e neoplásicas (B16F10 melanoma murino) e 26 determinar a sua composição química. A determinação da toxicidade do OEOM in 27 vitro foi avaliada nas células es permáticas através de parâmetros de cinética (CASA 28 = Computer Assisted Sperm Analisys) e de estrutura (citometria de fluxo), o 29 mecanismo de ação nas células MDBK e B16F10 foi avaliado por citometria de fluxo, 30 e a atividade hemolítica em eritrócitos caninos , pelo teste em meio líquido e em meio 31 sólido com ágar sangue de ovinos. Para a identificação dos compostos químicos do 32 óleo essencial foi utilizado cromatógrafo a gás acoplado a detector de massas 33 (GC/MS QP 2010SE Shimadzu, Japão), equipado com auto injet or AOC 20i. As 34 quantificações foram feitas por área normatizada e as identificações dos compostos 35 pelo espectrômetro de massas, utilizando a biblioteca NIST 8 do GC/MS. O OEOM é 36 composto majoritariamente por terpenos, principalmente por gama terpinen o , cis 37 sabineno hidratado e 4 terpineol. Na avaliação imediata da cinética espermática o 38 OEOM reduziu a motilidade total (MT) e progressiva (MP) e a distância média 39 percorrida (DAP) em todas as concentrações testadas, enquanto que, após 24 horas, 40 as concentraçõe s tóxicas foram de 1 a 4 mg.mL 1 . Na citometria de fluxo, as 41 estruturas afetadas foram as mitocôndrias (PMM) em todas as concentrações e a 42 membrana, que teve a sua fluidez reduzida com 0,25 e 1 mg.mL 1 de OEOM. As 43 concentrações de OEOM capazes de provocar hemólise em ambos os tipos 44 celulares foram 1, 2 e 4 mg.mL 1 , chegando a percentuais de 90 a 100% de hemólise. 45 Nos testes com a linhagem celular MDBK observou se redução de espécies reativas 46 de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações utilizadas de utilizadas de 1 OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, 2 os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e 3 aumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mLaumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mL--1 1 4 causaram redução na flcausaram redução na fluidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, uidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, 5 respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram 6 na concentração de 0,5 mg.mLna concentração de 0,5 mg.mL--11.. Os resultados obtidos nesse estudo apontam para Os resultados obtidos nesse estudo apontam para 7 a elevada toxicidade celular demonstrada, pra elevada toxicidade celular demonstrada, principalmente, nas concentrações entre incipalmente, nas concentrações entre 8 1 e 4 mg.mL1 e 4 mg.mL--11 do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto 9 ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático 10 para as células neoplásicas utilizadas, devido à interferênciapara as células neoplásicas utilizadas, devido à interferência no ciclo celular, sem no ciclo celular, sem 11 exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados 12 à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi 13 alterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando osalterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando os 14 resultados desse estudo, concluiresultados desse estudo, conclui--se que o OEOM é uma promissora fonte de se que o OEOM é uma promissora fonte de 15 moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é 16 capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, 17 mesmo em concentrações mesmo em concentrações baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células 18 sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e 19 não foi observada nas células MDBK.não foi observada nas células MDBK.

Cancer is identified as a public health problem of worldwide proportions, since 12 incidence rates are increasing, mortality is high and the pharmacological treatment 13 options available have serious adverse effects and have been losing their 14 effectiveness over time due to the development of resistance mechanisms by 15 neoplastic cells. Faced with this reality, the pharmaceutical industry has in medicinal 16 plants a wide panel of potentially effective and less toxic molecules to be studied. It is 17 now scientifically proven that chemical compounds present in medicinal plants can 18 protect cells from carcinogenic events, acting against tumor promotion and 19 progression. However, the same active ingredients that give therapeutic properties to 20 these plants, may also be responsible for their toxic effects and adverse reactions. In 21 this context, the present work aims to study the cytotoxicity of the essential oil of 22 Origanum majorana (OEOM) in swine sperm cells and red blood cells and its 23 mechanism of intracellular action in non-neoplastic (MDBK - Madin Darby Bovine 24 Kidney) and neoplastic cell lines ( B16F10 - murine melanoma) and determine its 25 chemical composition. The determination of OEOM toxicity in vitro was evaluated in 26 sperm cells through kinetic parameters (CASA = Computer Assisted Sperm 27 Analyzes) and structure (flow cytometry), the mechanism of action in MDBK and 28 B16F10 cells was evaluated by flow cytometry. , and hemolytic activity in canine 29 erythrocytes, by testing in liquid and solid media with sheep blood agar. For the 30 identification of the chemical compounds of the essential oil, a gas chromatograph 31 coupled to a mass detector (GC / MS-QP 2010SE-Shimadzu, Japan) was used, 32 equipped with an AOC-20i auto injector. The quantifications were made by 33 standardized area and the identification of the compounds by the mass spectrometer, 34 using the NIST 8 library of the GC / MS. OEOM is composed mainly of terpenes, 35 mainly gamma-terpineno, cis-sabinene hydrate and 4-terpineol. In the immediate 36 evaluation of sperm kinetics, OEOM reduced total (MT) and progressive (MP) motility 37 and average distance traveled (DAP) in all concentrations tested, whereas, after 24 38 hours, toxic concentrations were 1 to 4 mg.mL -1. In flow cytometry, the affected 39 structures were the mitochondria (PMM) in all concentrations and the membrane, 40 which had its fluidity reduced with 0.25 and 1 mg.mL-1 of OEOM. The concentrations 41 of OEOM capable of causing hemolysis in both cell types were 1, 2 and 4 mg.mL-1, 42 reaching percentages of 90 to 100% of hemolysis. In tests with the MDBK cell line, a 43 reduction in reactive oxygen species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) was 44 observed in all concentrations of OEOM used in MDBK cells, and also in the S phase 45 of the cell cycle. In B16F10 cells, treatments with OEOM reduced ROS and G2 cells 1 and increased cells in S phase. The concentrations of 0.25 and 0.5 mg.mL-1 caused 2 a reduction in fluidity and an increase in membrane potential mitochondrial, 3 respectively in the MDBK lineage, while LPO in B16F10 cells decreased in the 4 concentration of 0.5 mg.mL-1. The results obtained in this study point to the high 5 cellular toxicity demonstrated, mainly, in the concentrations between 1 and 4 mg.mL-1 6 of the OEOM in the swine sperm cells and in the erythrocytes. As for the mechanism 7 of action of the OEOM, it is possible to assume that its effect is cytostatic for the 8 neoplastic cells used, due to the interference in the cell cycle, without exerting toxic 9 effects in the MDBK lineage, since the parameters related to the plasma membrane 10 and production and ERO reduced. Cell viability was not altered in any of the strains 11 used in the tests. Considering the results of this study, it is concluded that OEOM is a 12 promising source of molecules with therapeutic potential for the treatment of cancer, 13 since it is able to promote the interruption of cell proliferation of the neoplastic 14 lineage, even at low concentrations. The toxicity shown by OEOM in blood and 15 sperm cells was more evident at higher concentrations and was not seen in MDBK 16 cells.

AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DO SÊMEN EQUINO SUBMETIDO A DIFERENTENTES TRATAMENTOS APÓS A DESCONGELAÇÃO

Nesta Tese, constituída de dois experimentos, objetivou-se testar, in vitro e in vivo, a adição de diferentes pós-diluentes ao sêmen equino descongelado e seus efeitos sobre a motilidade espermática e a atividade da acrosina imediatamente após o descongelamente e durante o teste de termoresistência (TTR). A avaliação in vivo foi realizada considerando-se a fertilidade de éguas artificialmente inseminadas. O sêmen foi envasado em palhetas de 4 mL, descongelado a 50°C por 40 segundos e incubado a 37ºC no TTR durante 90 e 120 minutos, respectivamente, no primeiro e no segundo experiemento. No primeiro adicionou-se a Solução Ringer e o Diluente Merk ao sêmen de dois reprodutores (R1 e R2). Somente a motilidade progressiva no sêmen do R2 decresceu (P<0.05), respectivamente, aos 60 e 90 minutos no sêmen do grupo Controle (14.3±7.7; 3.3±2.7) em relação ao acrescido do Diluente Merk (23.0±2.7; 10.0±0.0), não diferindo daquele acrescido da Solução Riger (20.0±5.0; 8.0±4.4). A motilidade total no sêmen de ambos os animais decresceu (P<0.05), respectivamente, aos 60 e 90 minutos no sêmen do grupo Controle (R1= 26.0±4.1 vs 7.0±2.7; R2= 20.0±3.5 vs 6.0±2.2) em relação ao acrescido da Solução Ringer (R1= 35.0±5.0 vs 19.0±6.5; R2= 32.0±3.7 vs 13.0±2.7) e do Diluente Merk (R1= 40.0±5.0 vs 23.0±6.7; R2= 38.0±5.7 vs 22.0±2.7). A atividade da acrosina no sêmen de ambos os animais não diferiu (P>0.05) entre os tratamentos, mas a atividade no sêmen do R1 foi superior (P<0.05) a do R2 em todas as avaliações no TTR. Imediatamente após o descongelamento e após 90 minutos do TTR, a atividade dessa enzima (%) no sêmen do grupo Controle foi, respectivamente, de 89.6±1.6 vs 81.4±1.8 (R1) e de 86.6±1.9 vs 73.8±3.5 (R2), no acrescido da Solução Ringer foi de 89.1±1.6 vs 81.4±1.3 (R1) e de 87.0±1.5 vs 74.2± (R2) e no acrescido do Diluente Merk foi de 89.2±1.3 vs 81.8±1.0 (R1) e de 86.9±1.6 vs 74.6±3.3 (R2). A prenhez (%) com o sêmen do grupo Controle foi de 50.0 (R1) e 20.0 (R2), com o acrescido da Solução Ringer foi de 50.0 (R1) e 30.0 (R2) e com o acrescido do Diluente Merk foi de 60.0 (R1) e 30.0 (R2) não havendo diferença (P>0.05) entre os tratamentos e entre os animais. No segundo experimento adicionou-se ao sêmen de 10 reprodutores, as soluções Fisiológica, Tyrode ou o Diluente de Congelamento sem conter glicerol. A motilidade progressiva decresceu (P<0.05) a partir de 30 minutos no sêmen descongelado (44.3±7.7 vs viii 33.6±11.6) e no da Solução Fisiológica (44.3±7.9 vs 35.4±11.5) e somente a partir de 60 minutos no sêmen contendo solução tyrode (44.4±8.1 vs 28.6±12.2) ou Diluente de Congelamento (44.4±8.1 vs 28.7±13.2). A motilidade total decresceu (P<0.05) a partir de 60 minutos no sêmen descongelado (53.1±6.1 vs 37.5±13.4) e no da Solução Fisiológica (53.2±6.0 vs 40.1±11.4) e somente a partir de 90 minutos no sêmen contendo Solução Tyrode (53.5±6.3 vs 36.8±12.5) ou Diluente de Congelamento (53.6±5.9 vs 37.9±14.3). A atividade da acrosina quantificada no início do TTR (92.5±6.2) somente decresceu (P<0.05) a partir de 60 minutos sem diferir (P>0.05) entre os tratamentos. Ao término do TTR, sua atividade no sêmen descongelado (71.8±9.9) também não diferiu (P>0.05) daquelas do sêmen diluído com Solução Fisiológica (70.2±9.2), Solução Tyrode (70.2±10.2) e Diluente de Congelamento (69.0±9.7). Os resultados de prenhez obtidos com a inseminação artificial utilizando o sêmen descongelado (37.8%) não diferiu (P<0.05) daqueles com o sêmen diluído em Solução Fisiológica (40.0%), Solução Tyrode (38.5%) ou Diluente de Congelamento (34.7%). Os resultados permitem concluir que a precisão diagnóstica da motilidade espermática é igualmente eficiente aquela da atividade da acrosina e que ambas podem ser utilizadas para predizer a capacidade fecundante dos espermatozóides. Ainda permitem concluir que a adição de pós-diluentes ao sêmen descongelado não contribui para aumentar fertilidade de éguas artificialmente inseminadas.

In this thesis, consisting of two experiments, aimed to test, in vitro and in vivo, the addition of different post-diluents to thawed equine semen and their effects on sperm motility and acrosine activity immediately after thawing and during the test. Resistance Resistance (TTR). In vivo evaluation was performed considering the fertility of artificially inseminated mares. Semen was packaged in 4 mL straws, thawed at 50 ° C for 40 seconds and incubated at 37 ° C in TTR for 90 and 120 minutes, respectively, in the first and second experiments. In the first, Ringer's Solution and Merk Diluent were added to the semen of two breeders (R1 and R2). Only the progressive motility in R2 semen decreased (P <0.05), respectively, at 60 and 90 minutes in the Control group semen (14.3 ± 7.7; 3.3 ± 2.7) in relation to the Merk Diluent plus (23.0 ± 2.7; 10.0 ± 0.0), not differing from that added with the Riger Solution (20.0 ± 5.0; 8.0 ± 4.4). The total semen motility of both animals decreased (P <0.05), respectively, at 60 and 90 minutes in the Control group semen (R1 = 26.0 ± 4.1 vs 7.0 ± 2.7; R2 = 20.0 ± 3.5 vs 6.0 ± 2.2) in increase of Ringer's Solution (R1 = 35.0 ± 5.0 vs 19.0 ± 6.5; R2 = 32.0 ± 3.7 vs 13.0 ± 2.7) and Merk Diluent (R1 = 40.0 ± 5.0 vs 23.0 ± 6.7; R2 = 38.0 ± 5.7 vs 22.0 ± 2.7). The acrosine activity in semen of both animals did not differ (P> 0.05) between treatments, but the activity in semen of R1 was higher (P <0.05) than of R2 in all TTR evaluations. Immediately after thawing and after 90 minutes of TTR, the activity of this enzyme (%) in the Control group semen was, respectively, 89.6 ± 1.6 vs 81.4 ± 1.8 (R1) and 86.6 ± 1.9 vs 73.8 ± 3.5 (R2). , plus Ringer's Solution was 89.1 ± 1.6 vs 81.4 ± 1.3 (R1) and 87.0 ± 1.5 vs 74.2 ± (R2) and plus Merk Diluent was 89.2 ± 1.3 vs 81.8 ± 1.0 (R1) and 86.9 ± 1.6 vs 74.6 ± 3.3 (R2). Pregnancy (%) with Control group semen was 50.0 (R1) and 20.0 (R2), with Ringer's Solution plus 50.0 (R1) and 30.0 (R2) and with Merk Diluent plus 60.0. (R1) and 30.0 (R2) with no difference (P> 0.05) between treatments and between animals. In the second experiment was added to the semen of 10 breeders, Physiological solutions, Tyrode or Freezing Diluent without glycerol. Progressive motility decreased (P <0.05) from 30 minutes in thawed semen (44.3 ± 7.7 vs 33.6 ± 11.6) and in Physiological Solution (44.3 ± 7.9 vs 35.4 ± 11.5) and only from 60 minutes in semen containing tyrode solution (44.4 ± 8.1 vs 28.6 ± 12.2) or Freezing Diluent (44.4 ± 8.1 vs 28.7 ± x 13.2). Total motility decreased (P <0.05) from 60 minutes in thawed semen (53.1 ± 6.1 vs 37.5 ± 13.4) and in Physiological Solution (53.2 ± 6.0 vs 40.1 ± 11.4) and only from 90 minutes in semen containing Tyrode Solution (53.5 ± 6.3 vs 36.8 ± 12.5) or Freezing Diluent (53.6 ± 5.9 vs 37.9 ± 14.3). Acrosine activity quantified at the onset of TTR (92.5 ± 6.2) only decreased (P <0.05) from 60 minutes without differing (P> 0.05) between treatments. At the end of TTR, its activity in thawed semen (71.8 ± 9.9) also did not differ (P> 0.05) from those of semen diluted with Physiological Solution (70.2 ± 9.2), Tyrode Solution (70.2 ± 10.2) and Freezing Diluent (69.0 ± 9.7). Pregnancy results obtained with artificial insemination using thawed semen (37.8%) did not differ (P <0.05) from those with semen diluted in Physiological Solution (40.0%), Tyrode Solution (38.5%) or Freezing Diluent (34.7%). ). The results allow us to conclude that the diagnostic accuracy of sperm motility is equally efficient as that of acrosine activity and that both can be used to predict sperm fertilization capacity. It is also concluded that the addition of post-diluents to thawed semen does not contribute to increase fertility of artificially inseminated mares.

Influência do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado sobre a capacitação e hiperativação espermática em sêmen suíno conservado sob refrigeração à 17 °C por 72 horas

Resumo: A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado nas inseminações artificiais. Substâncias protetoras presentes nos diluidores comerciais atuam cada vez mais em favor da manutenção da viabilidade celular durante esta etapa. Entretanto, embora alterações estruturais e principalmente funcionais muitas vezes não sejam identificadas nas análises empregadas rotineiramente para avaliação da qualidade seminal, a ocorrência das mesmas em resposta as baixas temperaturas de armazenamento e seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro, gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17 °C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen (CASA); e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Além disso, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de interação entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade do espermatozoide quando avaliada sob condições de capacitação in vitro, podendo ainda ser observada maior resistência às lesões de acrossoma em espermatozoides preservados sob esta condição (P < 0,05). O presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao seu armazenamento à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à qualidade e funcionalidade espermática.

Abstract: Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Commercial extenders increasingly work in favor of maintaining sperm viability during this period by its protective substances. However, although structural and mainly functional changes are often not identified in the routine semen evaluation, their occurrence in response to low storage temperatures and their direct effects on sperm fertilizing ability have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during the liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of interaction between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality when evaluated under conditions of in vitro capacitation. Furthermore, boar sperm stored under this condition present a greater resistance to acrosome damages when compared to others (P < 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage at 17 °C for 72 hours is not detrimental to sperm quality and functionality.

INFLUÊNCIA DA SAZONALIDADE NAS CARACTERÍSTICAS REPRODUTIVAS DE CARNEIROS DE RAÇAS LEITEIRAS

TOAZZA, Rafael. Influência da sazonalidade nas características reprodutivas de carneiros de raças leiteiras. 2018, 83 p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Lages, 2018. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da sazonalidade nas características reprodutivas de carneiros de raças leiteiras. Ao longo de um ano, o sêmen de 13 carneiros Frisona Milchschaf e Lacaune tiveram o sêmen coletado mensalmente, tendo seus parâmetros reprodutivos e características seminais avaliadas. A cada estação do ano, o sêmen coletado foi congelado e descongelado, sendo avaliado quanto a motilidade, vigor, teste de termo resistência (TTR), teste hiposmótico, presença de patologias espermáticas e eficiência na fecundação in vitro (FIV) heteróloga com oócitos bovinos. A motilidade progressiva para sêmen fresco na primavera foi superior às demais estações do ano, sendo observada a pior motilidade no inverno. Já o vigor apresentou variações inconstantes ao longo das estações. Defeitos maiores e menores apresentaram variações significativas ao longo dos meses, porém em nenhum deles houve número de anormalidades que possibilitasse classificar os carneiros como inaptos para a reprodução. O perímetro escrotal foi maior durante os meses mais quentes. O inverso ocorreu com a consistência testicular, que aumentou nos meses mais frios e diminuiu nos meses mais quentes. Volume, turbilhão e concentração espermática foram muito variáveis independente do mês, mas provavelmente por efeito do regime de monta intensivo utilizado (dados não publicados). Houve uma influência sazonal na criotolerância, sendo que na avaliação após o descongelamento, observou-se que a sobrevivência do sêmen congelado no outono foi superior ao congelado no verão. Não foram observadas diferenças significativas na avaliação morfológica e na integridade de membrana, nas diferentes estações. Não houve diferença estatística na taxa de recuperação de espermatozoides após submissão ao processo de migração swim up, nem entre as taxas de clivagem após FIV heteróloga (52,6; 50,5; 46,5 e 45,5%) para verão, outono, primavera e inverno, respectivamente. Houve influência da temperatura ambiente na consistência e perímetro testicular, bem como um efeito da estação do ano na motilidade progressiva e vigor tanto no sêmen fresco como após submissão ao TTR, com maior motilidade na primavera (estação não reprodutiva) em relação ao outono (estação reprodutiva). No inverno, os carneiros apresentaram sêmen de pior qualidade. A sazonalidade influenciou a criotolerância do sêmen de carneiros leiteiros, com maior sobrevivência sendo observada no outono. Mesmo com estas influências, as taxas de clivagem semelhantes após FIV heteróloga, demonstram que é possível congelar sêmen de carneiros leiteiros em qualquer estação do ano, com boa viabilidade. Finalmente, não existe efeito sazonal em relação a morfologia nem a integridade de membrana do sêmen descongelado de carneiros de raças leiteiras.

Toazza, Rafael. The influence of seasonality on dairy rams reproductive features. 2018, 83 p. Dissertation (Master in Animal Science). Santa Catarina State University. Post Graduate Program in Animal Science. Lages, 2018. This work aimed to investigate the role played by seasonality in the reproductive features of dairy rams. Semen was collected monthly for one year from 13 rams from either Frisona Milchschaf or Lacaune breeds in order to evaluate both their reproductive parameters and seminal characteristics. Semen samples frozen at every season were later thawed for assessment of sperm motility and vigor, as well as for survival to the thermal resistance test (TRT) and to the hyposmotic test. The presence of sperm pathologies and the efficiency after heterologous in vitro fertilization (IVF) of bovine oocytes were also assessed. The progressive motility for fresh semen during spring was higher than for all the other seasons, while the lowest motility was observed in the winter, whereas the vigor had inconsistent variations over the seasons. Major and minor defects presented significant variations over the months, however none of them showed enough abnormalities to score the rams as unable for reproduction. The scrotal perimeter increased during the warmest months. The consistency had an inverse relation, increasing during the coldest months, and decreasing during the warmest months. Volume, gross motility and sperm concentration varied despite the months, and suffered a possible effect from the intense breeding regimen performed (unpublished data). There was a seasonal influence in the semen cryotolerance, with higher survival rates in autumn frozen semen, in comparison to summer frozen semen. The morphological evaluation and membrane integrity showed no significant differences over the different seasons. There were no statistically differences for sperm recovery rate after swim up, nor in the cleavage rates after heterologous IVF (52.6, 50.5, 46.5 and 45.5%) for summer, fall, spring and winter, respectively. There was an influence of the housing temperature in the testicular consistency and perimeter. There was also an effect of the season on sperm progressive motility and vigor of the fresh semen, as well as after submission to the TRT, with higher motility in the spring (non-reproductive season) in comparison to autumn (reproductive season). In the winter, semen quality was the worst. The seasonality influenced the semen cryotolerance of dairy rams, with better survival rates in autumn. Despite all these influences, the similar cleavage rates obtained after heterologous IVF demonstrate that it is possible to freeze semen from dairy rams at any season of the year, with good viability. Finally, neither sperm cell morphology nor membrane integrity showed seasonal effects on the thawed semen of dairy rams.

INFLUÊNCIA DA CATALASE NO MEIO DE CONGELAÇÃO NAS CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE TOUROS DA RAÇA NELORE SUPLEMENTADOS OU NÃO COM GORDURA PROTEGIDA

Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) são integrantes da membrana celular espermática, e embora favoreçam sua fluidez, são extremamente susceptíveis ao estresse oxidativo. Nesse contexto, o presente estudo objetivou avaliar a influência da catalase no meio de congelação para criopreservação do sêmen de machos da raça Nelore suplementados com gordura protegida, a fim de evitar a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs). Foram utilizados 12 machos da raça Nelore mantidos em pastagem de capim-marandu em lotação contínua e taxa de lotação fixa. Os animais foram divididos em dois grupos: suplementados dos 14 aos 24 meses de idade (S+), ou não suplementados (S-). A colheita de sêmen foi realizada aos 24 meses, e as amostras de sêmen a fresco foram submetidas a analise computadorizada de cinética espermática (CASA). Posteriormente, as amostras foram divididas em duas frações e foram criopreservadas após a adição de meio de congelação, de igual composição, contendo catalase (C+) ou não (C-). Após o descongelamento do sêmen foram realizadas: avaliações de CASA; teste de termorresistência rápido (TTR); integridade das membranas plasmática e acrossomal; potencial mitocondrial, desestabilização da membrana e produção da ERO ânion superóxido (O2 -); produção da EROs; produção in vitro de embriões (PIVE) e quantificação intracitoplasmática de lipídio dos embriões. O delineamento experimental utilizado foi um esquema fatorial 2X2 (suplementação x catalase), totalizando 4 tratamentos (S+, S-, C+ e C-). A análise dos dados foi realizada utilizando o procedimento PROC MIXED do SAS. Os parâmetros de cinética espermática do sêmen a fresco foram maiores para o grupo S- (motilidade total e porcentagem de células rápidas) quando comparados com o grupo S+ (MT: 91,33 x 85,83%; RAP: 89,00 x 84,33% respectivamente) (P<0,05). Houve interação entre SUP*CAT para a frequência de batimento de cabeça (BCF) (P<0,05). O grupo S+, apresentou valores maiores, quando comparado com o grupo S- para: membrana plasmática e acrossomal lesadas (MPAL) (11,29 X 2,89% respectivamente); mediana da população total de células totais (5,66 x 4,41) (P<0,05); células lesadas (6,54 X 5,39 respectivamente) (P<0,05) e produção de O2- depois do TTR; (6,47 X 5,36 respectivamente) (P<0,05); quantificação lipídica intracitoplasmática, quando avaliado média/área de blastocistos (0,323 X 0,300 respectivamente) (P<0,05).O grupo S+ com catalase apresentou menores valores de MPAL após o TTR (10,11 X 17,69) (P<0,05). Não foram observadas diferenças entre os grupos para os valores de TTR na cinética espermática; produção de EROs e no desenvolvimento embrionário na PIVE. Os resultados do presente estudo sugerem que a dieta influenciou negativamente na qualidade seminal e possivelmente contribuiu para a peroxidação lipídica causada pelo O2-. Além disso, a dieta influenciou fortemente na quantificação lipídica intracitoplasmática. Por outro lado, a catalase no meio de congelação foi benéfica evidenciando que a suplementação com gordura protegida pode ser vantajosa se utilizada em associação com antioxidantes.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) comprise an important component of a sperm cell membrane. Although improving the membrane fluidity, they are extremely susceptible to oxidative stress. In this context, this study aimed to evaluate the catalase influence on extender for semens cryopreservation of Nellore Bulls supplemented with sources of PUFA in order to avoid reactive species of oxygen (ROS) production. Therefore, we have included twelve Nellore bulls kept in Marandu grass pasture in continuous stocking and fixed stocking rate. Bulls were divided in two groups: supplemented at 14 to 24 months old (S+), or non-supplemented (S-). The sperm collections were performed at 24 months old and fresh semen samples were analyzed by computer-assisted sperm analysis (CASA). Subsequently, we have divided these samples into two equal portions, which were both cryopreserved after same composition extender medium addition, containing catalase (C+) or not (C-). After thawing semen, computer-assisted sperm analysis (CASA); rapid test of thermo resistance (TTR); plasma membrane integrity, acrosomal membrane integrity; mitochondrial membrane potential, membrane destabilization; production of ROS superoxide anion (O2 -); ROS ; in vitro embryo production (IVEP) and intracellular lipid content of embryos were performed. The experimental design used was a 2X2 factorial (supplementation x catalase), with 4 treatments (SUPL, CONTR, C+ e C-). Data analysis was performed using SAS PROC MIXED procedure. Sperm kinetic parameters of fresh semen were higher for S- (total motility and percentage of rapid sperm) than S+ (MT: 91.33 x 85.83%; RAP: 89.00 x 84.33% respectively) (P<0.05). We have also observed an interaction between SUP*CAT for beat cross frequency (BCF) (P<0.05). The S+ group has presented higher values compared to S- for damage percentage of plasma and acrosomal membranes (DPAM) (11.29 X 2.89%, respectively); median for total population of total cells (5.66 x 4.41, respectively) (P<0.05); damaged cells (6.54 x 5.39, respectively) (P<0.05) and O2- production after TTR 96.47 x 5.36, respectively) (P<0.05); intracellular lipid content, when evaluated the mean/area of blastocysts (0.323 X 0.300 respectively) (P<0.05). The S+ group with catalase presented lower DPAM values after TTR (10.11 X 17.69 respectively) (P <0.05). No differences were observed between the groups for TTR values on spermatic kinetics, ROS production and on embryonic development in IVEP. Our results suggest that diet has negatively influenced seminal quality and possibly contributed to lipid peroxidation caused by O2-. In addition, diet strongly influenced intracytoplasmic lipid quantification. On the other hand, catalase in the extent was beneficial in showing that supplementation with protected fat may be advantageous if used in combination with antioxidants.

AVALIAÇÃO DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO E USO DE ANTIMICROBIANOS NA QUALIDADE DE DOSES SEMINAIS DE SUÍNOS

A bacteriospermia pode prejudicar a qualidade das doses de sêmen suíno. Desta forma, a adição de antimicrobianos (ATM) aos diluentes de sêmen é imprescindível para a manutenção da qualidade das doses inseminantes. Contudo, a crescente ocorrência de resistência bacteriana tem impulsionado a redução do uso de ATM na suinocultura. Nesse sentido, o armazenamento das doses inseminantes em baixas temperaturas pode ser uma alternativa para a remoção dos ATM dos diluentes comerciais. Sendo assim, no presente estudo, foram realizados dois experimentos para avaliar a qualidade espermática e a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de doses de sêmen suíno submetidas a baixas temperaturas de armazenamento, na ausência ou presença de ATM. No experimento 1, as motilidades (total e progressiva) das doses com ATM foram maiores conforme aumentou a temperatura de armazenamento (P<0,01). Nas doses sem ATM, as motilidades foram inferiores nas mantidas a 5 °C do que nas demais (P<0,05). O número de UFC/mL foi menor nas doses sem ATM mantidas a 5 e 10 °C do que a 17 °C (P<0,05), mas não houve diferença entre as temperaturas de armazenamento nas doses com ATM (P>0,05). As integridades de acrossoma e de membrana plasmática não foram afetadas (P>0,05) pelo uso de ATM, mas foram influenciadas pela temperatura de armazenamento (P<0,0001). No experimento 2, os machos foram categorizados em BONS e RUINS de acordo com a motilidade progressiva das doses com ATM armazenadas a 5 °C nas 120 h, sendo investigado o efeito dessas categorias sobre as variáveis estudadas. A motilidade total das doses armazenadas a 17 °C foi superior à das mantidas a 5 °C diluídas sem ATM (P<0,05). Os percentuais de motilidade progressiva e de acrossomas normais foram superiores nas doses mantidas a 17 °C do que nas mantidas a 5 °C, com ou sem ATM (P<0,05). O número de UFC/ml foi maior nas doses diluídas sem ATM do que nas demais (P<0,05). Após a categorização dos machos, as motilidades (total e progressiva) foram maiores nos machos BONS do que nos RUINS (P<0,05), sem diferença significativa (P>0,05) nas integridades (acrossomal e de membrana plasmática). Apesar de a qualidade espermática ter sido afetada negativamente pelas baixas temperaturas, o armazenamento das doses de sêmen suíno a 5 °C é possível, uma vez que foi mantida a viabilidade espermática in vitro, por até 5 dias, acima do nível mínimo considerado adequado para a inseminação artificial. Contudo, o uso de doses sem antimicrobianos ainda precisa de otimização, posto que que as baixas temperaturas de armazenamento reduzem, mas não inibem por completo o crescimento bacteriano.

Bacteriospermia can impair boar semen dose quality. Thus, the addition of antibiotics (ATB) is indispensable for maintaining semen doses quality. Nevertheless, growing bacterial resistance occurrence have had driven to a reduction in use of ATB in pig industry. In this sense, storage of semen doses at low temperature may be an alternative to removal ATB of commercial semen extenders. Therefore, the aim of the present study was to assess sperm quality and number of colony-forming units (CFU mL-1) in boar semen doses stored at low storage temperatures with or without ATB, in two experiments. In experiment 1, in semen doses with ATB, total and progressive motility increased as the storage temperature increased (P<0.01). In semen doses without ATB, total and progressive motility were observed to be lower when stored at 5 °C than at 10 and 17 °C (P<0.05). The number of CFU mL-1 was lower in semen doses without ATB stored at 5 and 10 °C than at 17 °C (P<0.05), but there was no difference among storage temperatures in doses with ATB (P>0.05). Acrosome and sperm membrane integrity were not influenced (P>0.05) by using ATB, but they were influenced by storage temperature (P<0,0001). In experiment 2, boars were grouped in GOOD and POOR according to progressive motility in doses stored for up to 120 h at 5 °C. So, the effect of this classification on assessed variables, was investigated. Total motility was higher in doses stored at 17 °C than in doses without ATB stored at 5 °C (P<0.05). The percentages of progressive motility and normal acrosomes were higher in doses stored at 17 °C than in doses stored at 5 °C, with or without ATB (P<0.05). The number of CFU mL-1 was higher in doses without ATB than in remaining ones (P<0.05). Total and progressive motility were observed to be higher in GOOD than in POOR boars (P<0.05). There was no difference between groups of boars in acrosome and membrane integrity (P>0.05). Despite sperm quality was negatively affected by low temperatures, the storage of boar semen doses at 5 °C is possible, since sperm viability in vitro was maintained for up to 5 days, fulfilling the requirements of semen quality to be used in artificial insemination. Nevertheless, the use of semen doses without ATB will need optimization, since low storage temperatures decreased bacterial growth, but not completely inhibit it.

AVALIAÇÕES FUNCIONAIS E BIOQUÍMICAS PARA TOUROS DE ALTA FERTILIDADE

A predição da fertilidade de touros é uma área da pesquisa que tem recebido muita atenção devido a sua importância na indústria de bovinocultura de corte. Um modelo de predição de fertilidade baseado na avaliação precoce dos parâmetros da qualidade de sêmen permitiria identificar e remover indivíduos com fertilidade potencialmente baixa de programas de reprodução. Entretanto, parâmetros convencionais utilizados na avaliação espermática in vitro têm mostrado resultados limitados quanto à capacidade de predizer o potencial de fertilidade do sêmen in vivo. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar a relação entre a qualidade do sêmen in vitro e a fertilidade in vivo de touros, por meio da correlação de dados de análises bioquímicas e de cinética espermática com a taxa de prenhez. Amostras de sêmen congelado de seis touros Aberdeen Angus foram classificadas como fertilidade alta (n = 3) e baixa (n = 3). O pool de sêmen foi avaliado para a cinética de espermática (sistema computadorizado de análise espermática; CASA), produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica, atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e capacidade antioxidante total. As amostras foram avaliadas imediatamente após o descongelamento (PT); após teste de resistência térmica (TRT) a 36ºC por 3 horas; após seleção de espermática (SS) pelo gradiente de densidade de Percoll; e após SS + TRT. Os parâmetros de cinética espermática: motilidade total (MTOT, 51,29±5,60%), motilidade progressiva (MP; 36,12±5,56%) e frequência de batimentos do flagelo (BCF; 8,11±0,77 hz) foram significativamente maiores em touros de baixa fertilidade quando comparados aos touros de alta fertilidade. A velocidade curvilinear (VCL; 40,15±7,92 m/s) foi maior em touros de alta fertilidade após SS + TRT. A velocidade linear (VSL; r = -0,99), a velocidade média do percurso (VAP; r=-0,99), linearidade (LIN; r = -0,98) e BCF (r = -0,99) foram correlacionadas com alta fertilidade após SS + TRT. ROS demonstrou correlação (r=-0,98) com fertilidade após SS. Houve uma diminuição significativa dos níveis de FRAP e ROS após SS em touros de baixa e alta fertilidade (P0,05), enquanto que uma diminuição da peroxidação lipídica foi observada apenas em touros de alta fertilidade. Os resultados não mostraram diferença significativa entre touros de fertilidade baixa e alta na peroxidação lipídica. No entanto, houve uma correlação (r=-0,99) entre a peroxidação lipídica e alta fertilidade após PT e SS + TRT. Esses resultados sugerem que espermatozoides de touros de alta fertilidade são capazes de prevenir o dano induzido pelo estresse oxidativo. Os dados de cinética espermática obtidos pelo CASA demonstram que a avaliação das combinações dos parâmetros poderia predizer a fertilidade in vivo de forma mais precisa do que a avaliação individual desses parâmetros. Além disso, a separação espermática em gradiente de Percoll reduziu os níveis de estresse oxidativo, consequentemente, melhorando a qualidade espermática. O presente estudo compartilha informações uteis para o desenvolvimento futuro de modelos de predição de fertilidade em touros.

Prediction of bull fertility is an area of research that has received much attention due to its importance in the beef cattle industry. A prediction model of fertility based on early assess of semen quality parameters would allow identify and remove sires with potentially low fertility from breeding programs. However, conventional parameters used on in vitro sperm assessments have shown limited results in the ability to predict the fertility potential of semen in vivo. Therefore, the aim of the present study was to investigate the relationship between in vitro semen quality and in vivo fertility of bulls by correlating biochemical and sperm kinetics data with pregnancy rate. Frozen semen samples from six Aberdeen Angus bulls were classified as high (n=3) and low (n=3) fertility. Semen pool was evaluated to sperm kinetics (computer assisted sperm analysis; CASA), reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation, superoxide dismutase enzyme (SOD) activity and total antioxidant capacity. Samples were evaluated immediately after thawing (PT); after thermal-resistance test (TRT) at 36ºC for 3 hours; after sperm selection (SS) by Percoll density gradient; and after SS + TRT. Sperm kinetic parameters: total motility (MTOT; 51.29±5.60%), progressive motile (MP; 36.12±5.56%) and beat cross-frequency (BCF; 8.11±0.77 hz) were significantly higher in low-fertility bulls when compared to high fertility ones. Curvilinear velocity (VCL; 40.15±7.92 µm/s) was greater in high fertility bulls after SS + TRT. Straight-line velocity (VSL; r=-0.99), average path velocity (VAP; r=-0.99), linearity (LIN; r=-0.98), and BCF (r=- 0.99) were correlated to high fertility after SS + TRT. ROS showed correlation (r=-0.98) with fertility after SS. There was a significant decrease of FRAP and ROS levels following SS in both low and high fertility bulls (P0.05), whereas a decrease of lipid peroxidation was observed only in high fertility bulls. The results showed no significant difference between low and high fertility bulls in lipid peroxidation. However, there was a correlation (r=-0.99) between lipid peroxidation and high fertility after PT and SS + TRT. Sperm kinetic data obtained by CASA showed that the assessment of a combination parameters could predict in vivo fertility more accurately than the assess of an individual one. In addition, spermatic separation by the Percoll gradient reduced oxidative stress levels, hence, improving sperm quality. The present study shares useful information for the future development of fertility prediction models in bulls. Keywords: . . .

Criopreservação de sêmen bovino com antioxidantes: avaliações funcionais e fecundação in vitro

O objetivo deste trabalho foi avaliar a adição de antioxidantes no processo de criopreservação de sêmen bovino, a partir de testes complementares (motilidade e vigor espermáticos pós criopreservação, teste de termorresitência rápido, integridade de membranas plasmática e acrossomal, estresse oxidativo e morfologia espermática) e na fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o ejaculado de nove animais foram divido em quatro frações, correspondente a cada tratamento, sendo estes: grupo controle sêmen diluído com extensor Tris gema; grupo vitamina sêmen diluído em Tris gema acrescido de 2,5 mM/mL de vitamina C; grupo glutationa sêmen diluído em Tris gema acrescido de 2,5 mM/mL de glutationa reduzida e o grupo associado sêmen diluído em Tris gema acrescido de vitamina C e glutationa reduzida com metade das concentrações (1.25mM/mL). Posteriormente o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetidas a criopreservação utilizando equipamento automatizado TK-3000®. Para FIV, ovários de abatedouros foram aspirados para obtenção dos oócitos grau I e II. Estes foram submetidos à maturação in vitro (MIV), seguida de fertilização in vitro (FIV) onde cada gota contendo os oócitos maturados, foi adicionada o sêmen capacitado correspondente a cada tratamento. A taxa de fecundação foi atribuída de embriões divididos em dois ou mais blastômeros. Houve diferença estatística (P< 0,05) na motilidade espermática para o grupo associado, contudo para vigor espermático os grupos não diferiram, o mesmo ocorreu para integridade de membrana plasmática e acrossomal. O grupo associado apresentou maior percentual de células com estresse oxidativo (P< 0,05) e menores percentuais de defeitos espermáticos maiores. O grupo glutationa apresentou maior taxa de fecundação (P< 0,05). Dessa forma, concluiu-se que a associação da vitamina C e glutationa reduzida favoreceu a motilidade espermática pós descongelação, porém os antioxidantes não apresentaram efeito preventivo quanto aos danos estruturais sofridos pelas membranas plasmáticas. E que associação dos antioxidantes proporciona maior estresse oxidativo e o uso de glutationa reduzida garante maior capacidade fecundante.

The aim of this study was to evaluate the addition of antioxidants in cryopreservation process of bovine semen, from complementary tests (stamina and sperm motility post thawing, quick thermos-resistance test, acrosomal and plasma membranes integrity, oxidative stress and sperm morphology) and in in vitro fertilization (IVF). Therefore, the ejaculate from nine animals was divided in four fractions, corresponding to one treatment each, these being: control group semen diluted in Tris yolk; vitamin group semen diluted in Tris yolk plus 2.5 mM/mL of vitamin C; glutathione group semen diluted in Tris yolk plus 2.5 mM/mL of reduced glutathione and associated group semen diluted in Tris yolk plus half of the concentration (1.25 mM/mL), later the semen was packed into french straws and submitted to cryopreservation through an automatized equipment, TK 3000®. For IVF, ovaries from slaughterhouses were aspirated to obtain oocytes grades I and II. These were submitted to in vitro maturation (IVM) followed by IVF; where each drop containing the matured oocytes, was combined with the capacitated semen, corresponding to each treatment. Fertilization rate was assigned to embryos divided into two or more blastomeres. There was statistical difference (P< 0.05) for sperm motility for the associated group, however the groups didnt differ for sperm stamina, the same occurred to acrosomal and plasma membranes integrity. The associated group showed higher percentage of cells with oxidative stress (P< 0.05) and smaller percentage for major sperm defects. Glutathione group showed higher fertilization rate (P< 0.05). Therefore, we can conclude that the association of vitamin C and reduced glutathione favored sperm motility post thawing, however, the antioxidants didnt show a preventive effect about the structural damage suffered by plasma membranes. And that the association of the antioxidants provides higher oxidative stress and the use of reduced glutathione guarantees increased fertilizing capacity.

Uso do diluente água de coco em pó (ACP-103®) na conservação prolongada do sêmen do varrão: avaliação in vitro e in vivo / Use of powder coconut water as extender (ACP-103®) for boar semen longer preservation: in vitro and in vivo evaluations

O sêmen de oito reprodutores foi coletado e de cada ejaculado separou-se um total de 1,75x10(9)sptz, com concentração de 35x10(6)sptz/mL. Usou-se o Beltsville Thawing Solution (BTS) como controle para testar o diluente água de coco em pó (ACP). O dia de coleta foi o dia zero (D0), sendo o sêmen conservado durante cinco dias, com análises diárias no D0 e nos quatro dias seguintes (D1, D2, D3 e D4). A avaliação da qualidade espermática baseou-se nos resultados do vigor espermático, da porcentagem de células móveis, da morfologia espermática, da integridade da membrana plasmática e dos resultados de fertilidade. As avaliações do vigor espermático (4,1) e da porcentagem de espermatozoides móveis (91 por cento) ficaram acima dos parâmetros mínimos exigidos (3,0 e 70 por cento) para sua utilização em programas de inseminação artificial, pois não houve influência sobre as variáveis analisadas pelo protocolo experimental. O resultado médio da resistência osmótica foi de 71,3 por cento de espermatozoides com cauda enrolada. Não houve diferenças entre os dois diluentes testados para a característica células com acrossoma intacto (BTS = 67,1 por cento; ACP = 71,2 por cento). O sêmen diluído em ACP apresentou maior número de células vivas (77,7 por cento) com membrana plasmática íntegra (74,2 por cento) após a conservação. A escolha do diluente ACP é aconselhável para uso de rotina em laboratórios que trabalhem com conservação de sêmen suíno. Apesar dos bons resultados in vitro obtidos com o diluente ACP, o BTS apresentou os melhores resultados de fertilidade, 86,7 por cento e 96,7 por cento, respectivamente.(AU)

The semen of eight boars was collected and a total of 1.75x10(9) spermatozoa were separated from each ejaculate, obtaining a concentration of 35x10(6)sptz/mL. The Beltsville Thawing Solution (BTS) was used as control, being tested the powder coconut water as extender (PCW). The day of collection was considered day zero (D0), and the semen was conserved for five days, with analyses on D0 and on four subsequent days (D1, D2, D3, and D4). The evaluation of spermatic quality was based on the results of spermatozoa vigour, cells motility, spermatic morphology, plasmatic membrane integrity, and fertility. The evaluations of the in natura semen presented mean values of spermatozoa vigour (4.1) and mobile spermatozoids percentage (91 percent) above the demanded minimum parameters (3.0 and 70 percent) for its use in artificial insemination programs without influencing on the analyzed variables. The mean results of the osmotic resistance were excellent, with 71.3 percent of spermatozoids with coiled tail. There were no differences between the two extenders tested for the characteristic cells with intact acrossome (BTS = 67.1 percent; PCW = 71.2 percent). The semen diluted in PCW extender presented a higher number of alive cells (77.7 percent) with a complete plasmatic membrane (74.2 percent) after conservation period. The choice of PCW extender is advisable for the routine use in laboratories that work with conservation of swine semen. In spite of the good results in vitro with the PCW extender, the BTS presented the best fertility results, 86.7 percent and 96.7 percent, respectively.(AU)

Efeito de diferentes crioprotetores e aditivos no diluente sobre a qualidade seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador

Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os efeitos de diferentes crioprotetores e aditivos na criopreservação do sêmen equino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Para tanto, foram designados dois experimentos (E). No E1 objetivou-se comparar o efeito do glicerol (GLIC) e da dimetilformamida (DMFA), associados ou não, sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento, o que conferiu quatro grupos experimentais: glicerol a 5 % (GLIC), dimetilformamida a 5 % (DMFA), dimetilformamida a 3% associada ao glicerol a 2 % (DG) e o tratamento controle, composto pelo diluente comercial Botu-Crio® (BC). Já no E2 objetivou-se avaliar o efeito do congelamento de sêmen de garanhões em diluente contendo glicerol e/ou dimetilformamida, associados à antocianina (ATC) e/ou colesterol carreado por ciclodextrina (CCC). Para tanto, os ejaculados foram congelados em dez diferentes tratamentos, de acordo com as associações entre crioprotetores e aditivos. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas mediante teste de termo-resistência (TTR) e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e peroxidação lipídica da membrana plasmática; a avaliação quanto à organização da bicamada lipídica só foi realizada no E1. Os melhores resultados obtidos no TTR do E1 foram referentes aos tratamentos DMFA e DG (p<0,05), que mantiveram as maiores médias de motilidade espermática total após trinta minutos de incubação a 37 oC. O potencial mitocondrial não sofreu alteração frente aos tratamentos aplicados (p>0,05). A maior proporção de células com integridade de membrana plasmática e acrossomal foi observada nos tratamentos DMFA e BC (p<0,05). A análise de organização de membrana revelou maior desorganização no tratamento GLIC (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio no tratamento DMFA e menor proporção no tratamento GLIC x (p<0,05). Quanto à peroxidação da bicamada lipídica, não foram observadas diferenças entre os valores médios nos tratamentos (p>0,05). Em relação ao E2, não houveram interações entre crioprotetores e diluentes para maioria das características estudadas, sendo as comparações realizadas entre grupos de tratamentos. Entre os crioprotetores, o grupo DMFA apresentou os melhores resultados quanto à motilidade espermática durante o TTR, seguido do grupo DG (p<0,05) e dentre os aditivos os grupos CCC e AC foram superiores aos demais (p<0,05). Em relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, os grupos BC e GLIC apresentaram os piores resultados dentre os crioprotetores, assim como os grupos BC e ATC dentre os aditivos (p<0,05). As maiores médias obtidas quanto ao potencial mitocondrial foram referentes aos grupos DMFA e DG entre os crioprotetores, e CCC e AC entre os aditivos (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio nos grupos DMFA e DG dentre os crioprotetores, e nos grupos CCC e AC dentre os aditivos (p<0,05). Em relação à peroxidação da membrana plasmática foi observada interação entre crioprotetores e aditivos na população de células viáveis (p<0,05), de forma a revelar melhor associação da CCC à DMFA. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que os tratamentos DMFA e DG apresentaram melhores condições para manutenção da viabilidade espermática in vitro, de forma que ambos podem sem utilizados como alternativa em diluidores na criopreservação de sêmen equino. Em relação ao uso da CCC, a sua associação deve ser feita preferencialmente com a DMFA. Os resultados obtidos quanto à ação da ATC não foram satisfatórios, necessitando de novos estudos quanto à concentração ideal e seus efeitos no congelamento de sêmen de garanhões.

The aim of this study was to compare the effects of different cryoprotectants and additives in cryopreservation of Mangalarga Marchador stallions semen on sperm viability in vitro post-thaw. Thus, we designed two experiments (E). In E1 we aimed to compare the effect of glycerol and dimethylformamide, associated or not, on the sperm viability post-thawing. Therefore we collected thirty ejaculates from four stallions. Each one was divided into four treatments: 5% glycerol (GLYC), 5% dimethylformamide (DMFA), an association of 2% glycerol and 3% dimethylformamide (DG) and control treatment compound by Botu- Crio®. In E2 we aimed to evaluate the effect of stallions semen freezing in diluent containing glycerol and or dimethylformamide associated with the anthocyanin (ATC) and or cholesterol loaded cyclodextrin (CCC). We collected forty-eight ejaculates of eight stallions and each one was frozen in ten different treatments, according to the associations between cryoprotectants and additives. The samples of both experiments were evaluated by thermo- resistance test (TTR) and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential, intracellular peroxide hydrogen production, lipid peroxidation and organization of the plasma membrane bilayer (only E1). The E1 best results on the TTR were related to DMFA and DG treatments (p<0.05), who maintained the highest average total sperm motility after thirty minutes of incubation at 37 ° C. Mitochondrial potential was not affected by any group (p>0.05). The highest proportion of cells with plasma and acrosomal membrane integrity was observed in DMFA and BC treatments (p<0.05). The analysis revealed the organization of membrane disruption was greater in GLIC treatment (p<0.05). We observed a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in the treatment DMFA and a lower proportion in GLIC treatment (p<0.05). As for the peroxidation of the lipid bilayer, no differences were observed between treatments (p>0.05). About E2 there were no interactions between cryoprotectants and diluents for most traits, xiwith comparisons made between treatment groups. Among the cryoprotectants, DMFA group showed the best results on the TTR, followed by DG group (p <0.05) and among the additives CCC and AC groups were superior to the others (p <0.05). Regarding the integrity of plasma and acrosomal membrane, the BC and GLYC groups showed the worst results among cryoprotectants, as well as BC and ATC groups among the additives (p <0.05). The highest mean about mitochondrial potential were related to DMFA and DG groups among cryoprotectants, and CCC and AC between additives (p <0.05). There was a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in DMFA and DG groups from the cryoprotectants, and CCC and AC groups among the additives (p <0.05). In relation to the plasma membrane peroxidation was observed interaction between cryoprotectants and additives in the population of viable cells (p <0.05), in order to better reveal the association CCC plus DMFA. It was concluded that the DMFA and DG treatments showed better conditions for maintaining sperm viability in vitro, so both can use like alternative method for cryopreservation of stallion semen. The association with the CCC should be made preferably by with DMFA. The results related to ATC were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing stallions.

Influência da sensibilidade individual de varrões sobre a qualidade espermática após descongelação / Influence of boar individual sensibility on spermatic quality after tawing

Diversos trabalhos têm demonstrado diferenças na qualidade espermática do sêmen descongelado entre diversos reprodutores suínos, demonstrando variações na resistência individual dos espermatozóides destes animais ao processo de congelação. Este trabalho teve por objetivo testar o sêmen proveniente de diferentes reprodutores para se identificar sensibilidades individuais ao processo de congelação. Quatro machos foram coletados, em recipiente de 500 mL coberto por gaze para separação da parte gelatinosa e protegido por envoltório térmico. Cada amostra continha 112 x106 sptz/mL para as análises in vitro. A técnica de Paquignon foi utilizada para a congelação do sêmen. Após a descongelação, a 37oC durante 30 segundos, o conteúdo de cada palheta foi ressuspenso após descongelação no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS). Foram avaliadas em microscopia óptica o vigor e a motilidade espermática após descongelação (M1), ressuspensão (M2) e 10 minutos (M3) e 2 horas de incubação (M4) a 37oC. A morfologia do acrossoma foi analisada em esfregaço de sêmen feito em M3. Foi utilizado o teste de Mann Whitney através do General Linear Models do programa Statistical Analysis System (SAS 6.03, 1988) a 5% (p<0,05).(AU)

Several works have been demonstrating differences in spermatic quality of the thawed semen among several swine males. Variations are diagnosed in the individual resistance of the spermatozoids of these animals to the freezing process. This work had for objective to test the semen from the different boars to identify individual sensibilities to the freezing process. Four males were collected, in recipient with 500 mL covered by filter for separation of the gelatinous part and protected by thermal wrapper. Each sample contained 112 x106 sptz/mL for the in vitro analyses. The Paquignon technique was used for the semen freezing. After descongelation at 37oC during 30 seconds, the content of each slat was diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS). They were analysed in optical microscopy, the vigour and the spermatic motility, after descongelation (M1), dilution (M2) , 10 minutes (M3) and 2 hours of incubation (M4) at 37oC. The acrossome morphology was analyzed in M3. The Mann Whitneys test was used with the Lineal General Models in Statistical Analysis System Program (HEALTHY 6.03, 1988) at 5% (p<0,05).(AU)

Influência da sensibilidade individual de varrões sobre a qualidade espermática após descongelação / Influence of boar individual sensibility on spermatic quality after tawing

Diversos trabalhos têm demonstrado diferenças na qualidade espermática do sêmen descongelado entre diversos reprodutores suínos, demonstrando variações na resistência individual dos espermatozóides destes animais ao processo de congelação. Este trabalho teve por objetivo testar o sêmen proveniente de diferentes reprodutores para se identificar sensibilidades individuais ao processo de congelação. Quatro machos foram coletados, em recipiente de 500 mL coberto por gaze para separação da parte gelatinosa e protegido por envoltório térmico. Cada amostra continha 112 x106 sptz/mL para as análises in vitro. A técnica de Paquignon foi utilizada para a congelação do sêmen. Após a descongelação, a 37oC durante 30 segundos, o conteúdo de cada palheta foi ressuspenso após descongelação no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS). Foram avaliadas em microscopia óptica o vigor e a motilidade espermática após descongelação (M1), ressuspensão (M2) e 10 minutos (M3) e 2 horas de incubação (M4) a 37oC. A morfologia do acrossoma foi analisada em esfregaço de sêmen feito em M3. Foi utilizado o teste de Mann Whitney através do General Linear Models do programa Statistical Analysis System (SAS 6.03, 1988) a 5% (p<0,05).

Several works have been demonstrating differences in spermatic quality of the thawed semen among several swine males. Variations are diagnosed in the individual resistance of the spermatozoids of these animals to the freezing process. This work had for objective to test the semen from the different boars to identify individual sensibilities to the freezing process. Four males were collected, in recipient with 500 mL covered by filter for separation of the gelatinous part and protected by thermal wrapper. Each sample contained 112 x106 sptz/mL for the in vitro analyses. The Paquignon technique was used for the semen freezing. After descongelation at 37oC during 30 seconds, the content of each slat was diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS). They were analysed in optical microscopy, the vigour and the spermatic motility, after descongelation (M1), dilution (M2) , 10 minutes (M3) and 2 hours of incubation (M4) at 37oC. The acrossome morphology was analyzed in M3. The Mann Whitney’s test was used with the Lineal General Models in Statistical Analysis System Program (HEALTHY 6.03, 1988) at 5% (p<0,05).

Utilização de diferentes touros na IATF : características seminais e suas relações com as taxas de fertilidade a campo

Tem sido frequentemente demonstrado que variadas taxas de concepção podem ser obtidas de acordo com o sêmen utilizado, evidenciando uma importante variabilidade individual do reprodutor com relação à fertilidade. Além disso, as grandes dimensões dos rebanhos, associado ao intenso e crescente uso dos protocolos de IATF no Brasil, tem estimulado, cada vez mais, a prática do descongelamento simultâneo de diversas palhetas de sêmen em um mesmo descongelador. Entretanto, sob essas condições, o banho-maria do descongelador poderia atuar como ambiente de incubação para o sêmen, o que poderia influenciar a viabilidade do espermatozoide. Assim, o presente estudo teve por objetivos: 1) determinar o efeito da sequência de inseminação, após descongelamento simultâneo de diversas palhetas de sêmen, na taxa de concepção e na qualidade seminal; 2) investigar a fertilidade in vivo, bem como diversas características espermáticas in vitro, do sêmen de diferentes reprodutores utilizados no mesmo programa de IATF; 3) identificar, dentre as diversas análises laboratoriais realizadas, o grupo de características espermáticas consideradas importantes na predição da taxa de concepção. Para tal, o presente experimento foi realizado em duas etapas. A primeira etapa consistiu em um estudo a campo delineado para determinar a taxa de concepção após IATF de fêmeas pós-parto da raça Nelore (n=947), utilizando sêmen de três partidas de cada um dos três touros da raça Angus (n=9). A segunda etapa consistiu em um estudo laboratorial delineado para investigar diversas características espermáticas das doses de sêmen utilizadas no respectivo programa de IATF, utilizando as mesmas condições de descongelamento do estudo a campo. As seguintes análises laboratoriais foram realizadas: análise computadorizada do movimento...

It has been reported that different conception rates can be obtained according to the semen used, indicating a significant variability regarding sire fertility. Furthermore, the large size of reproductive herds associated with the intense use of Timed-AI protocols in Brazil, has stimulated the routine practice of simultaneous thawing of multiple semen straws in the same thawing-bath. However, under these conditions, the thawing-bath could act as an incubator environment for the semen, which could influence the sperm viability. Thus, this study aimed to: 1) determine the effect of sequence of insemination after simultaneous thawing of multiple semen straws on conception rate and semen quality; 2) investigate the in vivo fertility, as well as several in vitro sperm characteristics, from different sires used in the same Timed-AI program; 3) identify, among the several in vitro sperm variables evaluated in laboratory, the group of sperm characteristics considered important in the prediction of conception rate. Hence, this study was conducted in two experiments. The first experiment was a field study designed to determine conception rate after Timed-AI of suckled multiparous Nelore cows (n = 944) using three semen batches from three Angus bulls (n = 9). The second experiment was a laboratory study designed to investigate several sperm characteristics of semen used in the Timed-AI program, using the same thawing conditions applied in the field experiment. The following laboratory analyses were performed: computer assisted semen analysis, hypo-osmotic swelling test, sperm resistance after 2 hours of thermal incubation, sperm morphology, integrity of plasma and acrosomal membranes, plasma membrane stability, lipid peroxidation, sperm morphology and chromatin condensation. According to the present experiment, it was concluded that...

Efeito do resfriamento do sêmen eqüino sobre sua congelabilidade / Effect of freezing and thawing protocols on post-thaw quality of equine semen

Utilizaram-se 25 ejaculados de cinco garanhões da raça Mangalarga Marchador, para avaliar dois protocolos de congelamento. No primeiro tratamento, resfriou-se o sêmen até 5ºC (curva de resfriamento - CR) antes do congelamento, no segundo, congelou-se o sêmen sem resfriamento (SC). Compararam-se duas formas de descongelamento, a 37ºC e a 75ºC/sete segundos. Os protocolos foram avaliados pelo teste de termo resistência (TTR - motilidade total e vigor) e pela funcionalidade da membrana plasmática (teste hiposmótico e eosina nigrosina). A motilidade total no tempo zero do TTR foi melhor (P<0,05) para o sêmen do tratamento CR, quando comparado com o do SC, em ambas as temperaturas de descongelamento, respectivamente, 46,7% e 21,0% (descongelamento a 37ºC), e 44,2% e 24,6% (descongelamento a 75ºC). Na mesma ordem, o número de espermatozóides vivos foi maior (P<0,05) no tratamento CR, 71,0% e 54,6% (descongelamento a 37ºC), e 77,4% e 54,1% (descongelamento a 75ºC). O sêmen do tratamento CR apresentou maior reação (P<0,05) ao teste hiposmótico e maior vigor (P<0,05) que o do SC. O sêmen descongelado a 75ºC apresentou melhor vigor (P<0,05) que o descongelado a 37ºC, independentemente do protocolo de congelamento. Os resultados mostraram, in vitro, o efeito benéfico do resfriamento do sêmen antes do congelamento.(AU)

Two freezing protocols and two thawing methods were evaluated on 25 ejaculates from five stallions of the Mangalarga Marchador breed. In the first freezing method, semen was cooled to 5ºC before freezing (CR); and in the second, semen at room temperature was frozen directly (SC). The two thawing methods were thawing semen at 37ºC for 30 seconds versus thawing at 75ºC for 7 seconds. Thawed semen was evaluated by the thermal resistance test (TRT- total motility and vigor) and by integrity of sperm membranes (the hypo-osmotic test and the eosine-nigrosine test). Semen that was cooled before freezing had higher (P<0.05) motility immediately post-thaw than semen that was more abruptly frozen (46.7% versus 21.0% for semen thawed at 37ºC and 44.1% versus 24.5% for semen thawed at 75ºC, respectively). At both thawing temperatures, the percentage of live spermatozoa was higher (P<0.05) in CR treatment than in the SC method (71% versus 54.6% for semen thawed at 37ºC and 77.3% versus 54.1% for semen thawed at 75ºC, respectively). The CR treatment also resulted in better hypo-osmotic test results and better semen vigor than did the SC treatment. Semen thawed at 75ºC showed better (P<0.05) vigor than semen thawed at 37ºC, independent of the semen freezing method. In conclusion, there were substantial benefits on subsequent semen quality from cooling of semen before it was frozen.(AU)