Effect of different gonadotropins on in vitro maturation of sheep oocytes / Efeito de diferentes gonadotrofinas na maturação in vitro de oócitos ovinos

The aim of this study was to examine the effect of replacing the use of follicle-stimulating hormone (FSH) with equine chorionic gonadotropin (eCG) and human chorionic gonadotropin (hCG) on the in vitro maturation (IVM) of sheep oocytes. After sheep ovaries were collected (n=300), the cumulus-oocyte complexes were aspirated, selected, and divided into four groups according to the IVM medium: CON group, in which the basic IVM medium was used; and eCG, hCG, and FSH groups, in which the oocytes were immersed in basic IVM medium with 10 IU/mL eCG, 10 IU/mL hCG, and 10 µg/mL FSH-p, respectively. In vitro maturation of the oocytes was performed at 38.5 °C, in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air, for 24 h. Subsequently, the oocytes were evaluated for the degree of cumulus-cell expansion, chromatin configuration, GSH levels, and active mitochondria. There were no significant differences for the rate of cumulus cell expansion. The percentage of oocytes in MII was higher in the eCG group than in the CON and hCG groups (P<0.05) and similar to that of the FSH group. In conclusion, eCG can be used as a substitute for FSH in IVM of sheep oocytes.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da gonadotrofina coriônica equina (eCG) e da gonadotrofina coriônica humana (hCG), em substituição ao uso de hormônio folículo estimulante (FSH) na maturação in vitro (MIV) de oócitos ovinos. Após a coleta de ovários (n=300) ovinos, os complexos cúmulus-oócitos (CCOs) foram aspirados, selecionados e divididos em quatro grupos de acordo com o meio de MIV: grupo CON, em que foi utilizado o meio MIV base; e grupos ECG, HCG e FSH, em que os oócitos foram imersos em meio MIV base adicionado de 10 UI/mL de eCG, 10 UI/mL de hCG e 10 µg/mL de FSH-p, respectivamente. A MIV dos oócitos foi realizada a 38,5°C, em atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas. Posteriormente, os oócitos foram avaliados, quanto grau de expansão das células do cumulus, configuração da cromatina, níveis de GSH e mitocôndrias ativas. Não foram observadas diferenças significativas com relação à taxa de expansão de células do cumulus. A percentagem de oócitos em MII foi maior no grupo ECG do que no grupo CON e HCG (P<0,05) e semelhante ao grupo FSH. Em conclusão, a eCG pode ser utilizada em substituição ao FSH na MIV de oócitos ovinos.

Dynamics of nuclear and cytoplasm maturation of bovine oocytes cultivated in vitro in medium supplemented with fulerol / Dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos cultivados in vitro em meio suplementado com fulerol

The aim of this work was to evaluate, in vitro, the dynamics of nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in traditional IVM medium (CT) and supplemented with fullerol (MF50), for 36 hours. The nuclear maturation of CT (n=300) and MF50 (n=270) every 6 hours, stained with Hoechst33342 and cytoplasmic, the mitochondrial distribution of CT (n=197) and MF50 (n=159) at every 12 hours, stained with Mitotracker Orange. At 6 hours, CT oocytes (19%) were in MI (metaphase I), while in MF50 they were in GV (germ vesicle) or GVB (GV breakeage), repeating at 12 hours. At 18 hours, 46.3% were matured in CT, and 20% in MF50. At 24 hours, 43.9% of maturation was observed in the MF50 group, and 63.8% in the CT. At 30 and 36 hours, the maturation pattern was stable, but with the onset of oocyte degeneration. There was a delay in cytoplasmic maturation with 36 hours (P < 0.05) in MF50 (53.9% of mature gametes), compared to CT (69.8%). With immature cytoplasm, they were 10.4% and 31.7% for CT and MF50 (P< 0.05), respectively. It was concluded that fullerol possibly interfered in the expansion of cumulus oophorus cells, as well as delayed the meiotic progression and cytoplasmic maturation.

O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos em meio MIV tradicional (TC) e suplementado com fulerol (MF50), durante 36 horas. Na maturação nuclear do TC (n=300) e do MF50 (n=270) a cada seis horas, corados com Hoechst 33342, e na citoplasmática, avaliou-se a distribuição mitocondrial do TC (n=197) e do MF50 (n=159) a cada 12 horas, corados com Mitotracker Orange (Life® Technologies). Às seis horas, oócitos do TC (19%) se encontravam em MI (metáfase I), enquanto no MF50 estavam em VG (vesícula germinativa) ou QVG (quebra VG), repetindo com 12 horas. Às 18 horas, 46,3% estavam maturados no TC, e 20% no MF50. Com 24 horas, verificaram-se 43,9% de maturação no grupo MF50, e 63,8% no TC. Às 30 e 36 horas, o padrão de maturação foi estável, mas com início de degeneração oócitária. Houve retardo na maturação citoplasmática com 36 horas (P<0,05) no MF50 (53,9% de gametas maduros), comparado ao TC (69,8%). Com citoplasma imaturo, foram 10,4% e 31,7% para TC e MF50 (P<0,05), respectivamente. Conclui-se que o fulerol possivelmente interferiu na expansão das células do cumulus oophorus, bem como retardou a progressão meiótica e a maturação citoplasmática dos oócitos.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Maturação in vitro de oócitos de cutias (Dasyprocta prymnolopha, Wagler 1831) seguida de fertilização in vitro e ativação partenogenética / In vitro maturation of agoutis (Dasyprocta prymnolopha) oocytes followed by in vitro fertilization and parthenogenetic activation

O objetivo foi avaliar protocolos de maturação in vitro (MIV) para oócitos de cutias, seguida de fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AP). Os oócitos imaturos (CCOs) foram obtidos por fatiamento do ovário, após OSH, e submetidos a três grupos: MAT - 16 (16 horas de maturação), MAT - 20 (20 horas de maturação) e MAT - 24 (24 horas de maturação), em incubadora de cultivo a 38,8°C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa. A maturação foi analisada pela presença do primeiro corpúsculo polar. Em seguida, os CCOs maduros foram submetidos à FIV, com período de coincubação dos CCOs e dos espermatozoides de 15h, a 38,8ºC e 5% de CO2, e AP com ionomicina. Os grupos de MIV foram analisados utilizando-se o teste qui-quadrado e, nos experimentos de FIV e AP, foram analisadas a taxa de clivagem e a proporção de desenvolvimento embrionário. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS. Houve diferença significativa entre os grupos de maturação, tendo os grupos MAT - 20 e MAT - 24 apresentado maior porcentagem de oócitos maturados in vitro. As taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário foram de 8,6% e 2,9%, respectivamente, na FIV, e de 63,6% e 15,1%, na AP. Entretanto, nos dois casos, o embrião não passou do estágio de mórula.(AU)

The objective was to evaluate IVM protocols for agouti oocytes, followed by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA). The immature oocytes (CCOs) were obtained by slicing the ovary after OSH and submitted to three groups: MAT - 16 (16 hours maturation), MAT - 20 (20 hours maturation) and MAT - (24 hours maturation), in a culture incubator at 38.8°C, with an atmosphere of 5% CO2 and 95% relative humidity. The maturation was analyzed by the presence of the first polar corpuscle. Then, mature CCOs were submitted to IVF, with co-incubation period of CCOs and spermatozoa from 15h to 38.8°C and 5% of CO2, and PA with inomycin. The IVM groups were analyzed using the chi-square test and in the FIV and PA experiment the rate of cleavage and the rate of embryonic development were analyzed. Statistical analysis was performed using the SAS program. There was a significant difference between the maturation groups, and the MAT - 20 and MAT - 24 groups showed a higher percentage of matured oocytes in vitro. The rates of cleavage and embryonic development were 8.6% and 2.9%, respectively in FIV and 63.6% and 15.1% in PA. However, in both cases the embryo did not pass beyond the morula stage.(AU)

Maturação in vitro de oócitos de cutias (Dasyprocta prymnolopha, Wagler 1831) seguida de fertilização in vitro e ativação partenogenética / In vitro maturation of agoutis (Dasyprocta prymnolopha) oocytes followed by in vitro fertilization and parthenogenetic activation

O objetivo foi avaliar protocolos de maturação in vitro (MIV) para oócitos de cutias, seguida de fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AP). Os oócitos imaturos (CCOs) foram obtidos por fatiamento do ovário, após OSH, e submetidos a três grupos: MAT - 16 (16 horas de maturação), MAT - 20 (20 horas de maturação) e MAT - 24 (24 horas de maturação), em incubadora de cultivo a 38,8°C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa. A maturação foi analisada pela presença do primeiro corpúsculo polar. Em seguida, os CCOs maduros foram submetidos à FIV, com período de coincubação dos CCOs e dos espermatozoides de 15h, a 38,8ºC e 5% de CO2, e AP com ionomicina. Os grupos de MIV foram analisados utilizando-se o teste qui-quadrado e, nos experimentos de FIV e AP, foram analisadas a taxa de clivagem e a proporção de desenvolvimento embrionário. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS. Houve diferença significativa entre os grupos de maturação, tendo os grupos MAT - 20 e MAT - 24 apresentado maior porcentagem de oócitos maturados in vitro. As taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário foram de 8,6% e 2,9%, respectivamente, na FIV, e de 63,6% e 15,1%, na AP. Entretanto, nos dois casos, o embrião não passou do estágio de mórula.(AU)

The objective was to evaluate IVM protocols for agouti oocytes, followed by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA). The immature oocytes (CCOs) were obtained by slicing the ovary after OSH and submitted to three groups: MAT - 16 (16 hours maturation), MAT - 20 (20 hours maturation) and MAT - (24 hours maturation), in a culture incubator at 38.8°C, with an atmosphere of 5% CO2 and 95% relative humidity. The maturation was analyzed by the presence of the first polar corpuscle. Then, mature CCOs were submitted to IVF, with co-incubation period of CCOs and spermatozoa from 15h to 38.8°C and 5% of CO2, and PA with inomycin. The IVM groups were analyzed using the chi-square test and in the FIV and PA experiment the rate of cleavage and the rate of embryonic development were analyzed. Statistical analysis was performed using the SAS program. There was a significant difference between the maturation groups, and the MAT - 20 and MAT - 24 groups showed a higher percentage of matured oocytes in vitro. The rates of cleavage and embryonic development were 8.6% and 2.9%, respectively in FIV and 63.6% and 15.1% in PA. However, in both cases the embryo did not pass beyond the morula stage.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.(AU)

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.

Goat incubator: Can bovine oocytes be matured in the uterine horn of a goat? / Cabra incubadora: os oócitos bovinos podem ser maturados no corno uterino de uma cabra?

We used a goat as a live incubator, along with associated nonsurgical embryo transfer techniques, to perform ex situ (in vivo) maturation of bovine oocytes. Immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from 3-8 mm follicles from slaughterhouse ovaries were randomly split into two groups for in vitro (IVM; n = 38) and ex situ maturation (ESM; n = 40). IVM was performed for a period of 24 h at 38.5 ºC and with 5% CO2 in the air of maximum humidity. For ESM, a presynchronized nulliparous goat (12 months old) received 40 immature COCs in the uterine horn apiece, via the transcervical route. After 24 h the structures were retrieved through uterine flushing. Analyses of nuclear maturation and lipid quantification were performed on oocytes from both groups. Fluorescent intensity was compared using the Student’s t-test. Forty-seven percent of the structures were recovered after uterine flushing (19/40). The nuclear maturation rate was 94.5% (18/19) and 81.6% (31/38) for the ESM and IVM groups, respectively. In vitro-matured COCs contained more lipid droplets, expressed as a higher amount (p < 0.05) of emitted fluorescent light than ex situ-matured COCs (858 ± 73 vs. 550 ± 64 arbitrary fluorescence units, respectively). This is the first report to associate nonsurgical embryo transfer techniques and a goat as a live incubator for the maturation of bovine oocytes. We

Utilizamos uma cabra como incubadora viva, juntamente com técnicas de transferência de embriões não cirúrgicas associadas, para realizar a maturação ex situ (in vivo) de oócitos bovinos. Os complexos cumulus-oócitos bovinos (COCs), aspirados de folículos de 3-8 mm de ovários de abatedouro foram aleatoriamente divididos em dois grupos para maturação in vitro (IVM; n = 38) e ex situ (ESM; n = 40). A MIV foi realizada por um período de 24 h no meio TCM-199, a 38,5 ºC, e com 5% de CO2 em umidade máxima. Para o ESM, uma cabra nulípara pré-sincronizada (12 meses de idade) recebeu 40 COCs imaturos no ápice do corno uterino, por via transcervical. Após 24 h as estruturas foram recuperadas através de lavagem uterina. Análises de maturação nuclear e quantificação de lipídios foram realizadas em oócitos de ambos os grupos. A intensidade de fluorescente foi comparada usando o teste t de Student. Quarenta e sete por cento das estruturas foram recuperadas após lavagem uterina (19/40). A taxa de maturação nuclear foi de 94,5% (18/19) e 81,6% (31/38) para os grupos ESM e IVM, respectivamente. Os COCs maturados in vitro continham mais gotículas lipídicas, expressos como uma quantidade maior (p < 0,05) da luz fluorescente emitida do que os COCs ex situ (858 ± 73 vs 550 ± 64 unidades de fluorescência arbitrárias, respectivamente). Este é o primeiro relató

Effect of Rolipram on in vitro maturation, gene expression and embryonic development in bovines / Efeito de rolipram na maturação in vitro, expressão gênica e desenvolvimento embrionário em bovinos

The aim of this work was to evaluate the effect of the Rolipram during the maturation of bovine oocytes and gene expression of embryos produced in vitro. Bovine ovaries were collected in slaughterhouse. The COCs were selected and divided into 5 groups: Control 0 time; Control: IVM for 24 hours; Rolipram treatments with IVM blocking for 24 hours in maturation medium containing (100, 150 and 200µM). After 24 hours all groups were reseated in IVM for another 24 hours. Subsequently COCs were subjected to the same IVM system and fertilized, being checked for cleavage post fertilization and for blastocyst. In addition, performed expression of the following genes: Mater, BMP15 and Bax. No difference was found in gene expression. Of oocytes evaluated shortly after follicular aspiration, 79.00% were in GV, GVBD, MI, while 13.40%, were in MII and 7.60%, D/NI. Significant difference was observed in different concentrations (T100, T200 and T150µM) in oocytes that have reached the MII phase compared to control treatments (P= 0.003). Differences were observed in cleavage rate (P< 0.05) between T150 and T200 when compared to the C/24 Group. A high difference was observed on blastocyst rate (P< 0.001) among treatments compared to the control group.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do rolipram durante a maturação de oócitos bovinos, expressão gênica e embriões produzidos in vitro. Os ovários bovinos foram coletados no matadouro. Os COCs foram selecionados e divididos em cinco grupos: controle 0 tempo; controle: MIV por 24 horas; tratamentos rolipram com bloqueio MIV por 24 horas em meio de maturação contendo 100, 150 e 200µM. Após 24 horas, todos os grupos foram recolocados em MIV por mais 24 horas. Subsequentemente COCs foram submetidos ao mesmo sistema MIV e fertilizados, sendo avaliada a taxa de clivagem e de blastocisto, além da expressão dos seguintes genes: Mater, BMP15 e Bax. Nenhuma diferença foi observada na expressão gênica. Dos oócitos avaliados logo após a aspiração folicular, 79,0% estavam em GV, GVBD, MI, enquanto 13,40% estavam em MII, e 7,60% em D/NI. A diferença significativa foi observada em diferentes concentrações (T100, T200 e T150µM) em oócitos que atingiram a fase MII em comparação aos tratamentos de controle (P=0,3). Diferenças foram observadas nas taxas de clivagem (P<0,5) entre T150 e T200 quando comparadas com as taxas do grupo C/24. Uma grande diferença foi observada na taxa de blastocisto (P<0,1) entre os tratamentos em relação ao grupo controle.(AU)

Effect of Rolipram on in vitro maturation, gene expression and embryonic development in bovines / Efeito de rolipram na maturação in vitro, expressão gênica e desenvolvimento embrionário em bovinos

The aim of this work was to evaluate the effect of the Rolipram during the maturation of bovine oocytes and gene expression of embryos produced in vitro. Bovine ovaries were collected in slaughterhouse. The COCs were selected and divided into 5 groups: Control 0 time; Control: IVM for 24 hours; Rolipram treatments with IVM blocking for 24 hours in maturation medium containing (100, 150 and 200µM). After 24 hours all groups were reseated in IVM for another 24 hours. Subsequently COCs were subjected to the same IVM system and fertilized, being checked for cleavage post fertilization and for blastocyst. In addition, performed expression of the following genes: Mater, BMP15 and Bax. No difference was found in gene expression. Of oocytes evaluated shortly after follicular aspiration, 79.00% were in GV, GVBD, MI, while 13.40%, were in MII and 7.60%, D/NI. Significant difference was observed in different concentrations (T100, T200 and T150µM) in oocytes that have reached the MII phase compared to control treatments (P= 0.003). Differences were observed in cleavage rate (P< 0.05) between T150 and T200 when compared to the C/24 Group. A high difference was observed on blastocyst rate (P< 0.001) among treatments compared to the control group.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do rolipram durante a maturação de oócitos bovinos, expressão gênica e embriões produzidos in vitro. Os ovários bovinos foram coletados no matadouro. Os COCs foram selecionados e divididos em cinco grupos: controle 0 tempo; controle: MIV por 24 horas; tratamentos rolipram com bloqueio MIV por 24 horas em meio de maturação contendo 100, 150 e 200µM. Após 24 horas, todos os grupos foram recolocados em MIV por mais 24 horas. Subsequentemente COCs foram submetidos ao mesmo sistema MIV e fertilizados, sendo avaliada a taxa de clivagem e de blastocisto, além da expressão dos seguintes genes: Mater, BMP15 e Bax. Nenhuma diferença foi observada na expressão gênica. Dos oócitos avaliados logo após a aspiração folicular, 79,0% estavam em GV, GVBD, MI, enquanto 13,40% estavam em MII, e 7,60% em D/NI. A diferença significativa foi observada em diferentes concentrações (T100, T200 e T150µM) em oócitos que atingiram a fase MII em comparação aos tratamentos de controle (P=0,3). Diferenças foram observadas nas taxas de clivagem (P<0,5) entre T150 e T200 quando comparadas com as taxas do grupo C/24. Uma grande diferença foi observada na taxa de blastocisto (P<0,1) entre os tratamentos em relação ao grupo controle.(AU)

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.(AU)

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.(AU)

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P < 0.05) than that of the FIV Control group, which was 31.07%. In the third experiment, the means of CR and BR (P > 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...(AU)

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P < 0,05) ao grupo controle FIV 31,07%. No terceiro experimento as médias das TC e TB (P > 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

Contenido lipídico, actividad mitocondrial y desarrollo embrionario temprano de ovocitos provenientes de vacas mestizas (Bos taurus indicus) / Lipid content, mitochondrial activity and early embryo development in oocyte collected from crossbred cows (Bos taurus indicus) / Conteúdo lipídico, atividade mitocondrial e desenvolvimiento embrionário precoce de oócitos coletados de vacas mestiças (Bos taurus indicus)

El objetivo de la presente investigación fue el de valorar el efecto de la predominancia fenotípica sobre el contenido lipídico como indicador de la calidad ovocitaria. Los COCs fueron recuperados mediante aspiración folicular y sometidos a maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro (CIV). Se determinó el contenido lipídico y actividad mitocondrial en ovocitos inmaduros y MIV. La tasa de maduración total se ubicó en 75%, con valores de 80,6% y 69,3% para ovocitos predominantemente B. indicus y predominantemente B. taurus, respectivamente. La tasa de fecundación total fue de 27,6%, para ovocitos predominantemente B. indicus y predominantemente B. taurus, esta fue de 26,1% y 29%, respectivamente. Se observó un total de embriones divididos de 52,1% y 58,9% tras 48 y 72 horas post inseminación (hpi), respectivamente. Por otro lado, para el grupo predominantemente B. indicus se apreció un 55,5% y 57,5% de embriones divididos tras 48 y 72 hpi. Mientras que para el grupo predominantemente B. taurus se apreció un 52,1% y 58,9% de embriones divididos tras 48 y 72 hpi. Ovocitos inmaduros presentaron mayor número de gotas lipídicas pequeñas (p <0,0001), en contraste con los ovocitos MIV que presentaron mayor número de gotas lipídicas medianas y grandes (p < 0,0001). Ovocitos predominantemente B. indicus presentaron mayor número de gotas lipídicas pequeñas (p = 0,0005) y medianas (p = 0.005), mientras que para las gotas lipídicas grandes no se apreciaron diferencias significativas. Ovocitos MIV presentaron mayor actividad mitocondrial que el grupo de ovocitos inmaduros (p < 0,05), sin observarse efecto de la predominancia fenotípica sobre este parámetro. La valoración del contenido lipídico no resultó un factor predictivo de la calidad ovocitaria en hembras mestizas.(AU)

The objective of this research was to evaluate the effect of phenotypic predominance on lipid content, mitochondrial activity and early developmental competence as indicators of oocyte quality. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered through follicular aspiration, and underwent in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of presumptive zygotes. Lipid content and mitochondrial activity in immature and IVM oocytes were determined. A maturation rate of 80.6% and 69.3% was found for oocytes predominantly B. indicus and predominantly B. taurus, respectively. Total fertilization rate was 27.6%; 26.1% for predominantly B. indicus oocytes and 29% for predominantly B. taurus oocytes. A total of 55.5% and 57.5% of cleaved embryos after 48 and 72 h post-insemination (hpi) in predominantly B. indicus group were observed, respectively. As for the predominantly B. taurus group, 48.6% and 60.4% of cleaved embryos were found after 48 and 72 hpi, respectively. In both groups, immature oocytes showed a greater amount of small lipidic droplets (p <0.0001); IVM decreased the number of small lipid droplets (p < 0.0001) and increased the number of medium and large lipid droplets (p < 0.0001). Predominantly B. indicus oocytes had a greater number of small and medium-sized lipid droplets, while there were no significant differences in large lipid droplets. IVM oocytes had higher mitochondrial activity than immature oocytes group (p < 0.05) without any effect of phenotypic predominance on this parameter. Assessment of lipid content was not a predictive factor of oocyte quality in crossbred cows.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da predominância fenotípica no conteúdo lipídico como um indicador da qualidade do oócito. Os COC foram recuperados por aspiração folicular e submetidos a maturação in vitro (IVM), fertilização in vitro (FIV) e cultura in vitro (CIV). Determinou-se o conteúdo lipídico e atividade mitocondrial em oócitos imaturos e IVM. A taxa de maturação total era de 75%, com valores de 80,6% e 69,3% para oócitos predominantemente B. Indicus e predominantemente B. taurus, respectivamente. A taxa de fertilização total foi de 27,6%, para oócitos predominantemente B. indicus e predominantemente B. taurus, este foi de 26,1% e 29%, respectivamente. Um total de 52,1% de embriões divididos e 58,9% foi observada após 48 e 72 horas após a inseminação (hpi), respectivamente. Além disso, para o grupo predominantemente B. indicus 55,5% e 57,5% embrião clivada após 48 e 72 hpi foi observado. Enquanto para o grupo predominantemente B. taurus 52,1% e 58,9% dos embriões divididos após 48 e 72 hpi respectivamente. Oócitos imaturos mostraram gotas lipídicas mais pequenas (p<0,0001), em contraste com oócitos IVM com maior número de gotas lipídicas médias e grandes (p <0,0001). Oócitos predominantemente B. indicus mostraram mais gotas lipídicas pequenas (p = 0,0005) e médias (p = 0,005), enquanto que para as gotas lipídicas grandes não foram observadas diferenças significativas. Oócitos IVM tiveram maior atividade mitocondrial que o grupo de oócitos imaturos (p < 0,05), não houve efeito de predominância fenotípica sobre este parâmetro. A avaliação do conteúdo lipídico não foi um preditor de qualidade dos oócitos nas vacas mestiças.(AU)