Vacuolização neuronal e degeneração espinocerebelar em filhote de Rottweiler / Neuronal vacuolation and spinocerebellar degeneration in a Rottweiller puppy

Background: Spinocerebellar degenerations and neuronal vacuolations are alterations characterized by the formation of vacuoles in the nervous tissue, commonly called status spongiosus. This condition occurs in young Rottweiler dogs causing a disease called Neuronal Vacuolation and Spinocerebellar Degeneration. Clinically, it presents with ataxia of the pelvic limbs, which evolves to generalized ataxia, tetraparesis, and laryngeal paralysis. Histologically, spongiform and vacuolar alterations of the neuropil and neurons are highlighted. This reports a case of neuronal vacuolation and spinocerebellar degeneration in a Rottweiler puppy. Case: Necropsy was performed on the cadaver of a 5-month-old Rottweiler bitch that had been presenting with ataxia for approximately 1 month, in addition to dyspnea, pulmonary crepitations, and microphthalmia. Macroscopic evaluation revealed pale ocular and oral mucosae; marked gastric dilatation and abdominal distension; pulmonary hemorrhage and edema; hepatosplenomegaly; fatty degeneration of the liver; and congestion of meningeal blood vessels. Microscopically, histological evaluation of the spinal cord showed an increase in gray matter cellularity with marked presence of oligodendrocytes and microglia cells; moderate to severe multifocal intracytoplasmic micro- and macrovacuoles with displacement of the neurons' nuclei to the periphery of the cell; central chromatolysis of the neurons adjacent to neurons affected by vacuolation; and mild multifocal necrosis associated with mild multifocal neuronophagia. The white matter exhibited discrete digestion chambers, in addition to marked diffuse congestion of the leptomeninges. In the cerebellum, neurons in the nerve nuclei (emboliform, globose, and fastigial) showed moderate multifocal vacuoles in the cytoplasm, whereas adjacent neurons showed central chromatolysis, necrosis, and mild neuronophagia. Additional histological findings included lymphoid hyperplasia, fatty degeneration of the liver, pulmonary edema, and pulmonary hemorrhage. Discussion: Spongiform and degenerative encephalopathies are diseases recognized worldwide, mainly in cattle and sheep. However, the identification of these changes in new species has led to the need for further investigations. In dogs, the first reports occurred in 1995 and 1997 in Rottweiler animals. This disease affects young dogs, and although its pathogenesis is not completely known, it is believed to be associated with a genetic mutation in the RAB3GAP1 gene. Clinically, it is associated with clinical neurological manifestations, including progressive ataxia of the pelvic limbs, changes in spinal reflex, disordered proprioceptive reactions, laryngeal paralysis, as well as behavioral and gait alterations. In the clinical evaluation, leukoencephalomyelopathy and neuroaxonal dystrophy should be diseases considered as possible differential diagnoses, as they present with similar alterations. However, in histological evaluation, the exclusion of both is basically due to the absence of neuronal vacuolization. Unfortunately, the definitive diagnosis is only made post mortem, through a histopathological evaluation of the nervous tissue. Because it is a disease whose pathogenesis is little known and which shows signs of having a genetic character, histopathological examination for diagnostic purposes in young animals with neurological signs is of great importance.

Neuroprotection and immunomodulation by dimethyl fumarate and a heterologous fibrin biopolymer after ventral root avulsion and reimplantation

Ventral root avulsion (VRA) is an experimental approach in which there is an abrupt separation of the motor roots from the surface of the spinal cord. As a result, most of the axotomized motoneurons degenerate by the second week after injury, and the significant loss of synapses and increased glial reaction triggers a chronic inflammatory state. Pharmacological treatment associated with root reimplantation is thought to overcome the degenerative effects of VRA. Therefore, treatment with dimethyl fumarate (DMF), a drug with neuroprotective and immunomodulatory effects, in combination with a heterologous fibrin sealant/biopolymer (FS), a biological glue, may improve the regenerative response. Methods: Adult female Lewis rats were subjected to VRA of L4-L6 roots followed by reimplantation and daily treatment with DMF for four weeks. Survival times were evaluated 1, 4 or 12 weeks after surgery. Neuronal survival assessed by Nissl staining, glial reactivity (anti-GFAP for astrocytes and anti-Iba-1 for microglia) and synapse preservation (anti-VGLUT1 for glutamatergic inputs and anti-GAD65 for GABAergic inputs) evaluated by immunofluorescence, gene expression (pro- and anti-inflammatory molecules) and motor function recovery were measured. Results: Treatment with DMF at a dose of 15 mg/kg was found to be neuroprotective and immunomodulatory because it preserved motoneurons and synapses and decreased astrogliosis and microglial reactions, as well as downregulated the expression of pro-inflammatory gene transcripts. Conclusion: The pharmacological benefit was further enhanced when associated with root reimplantation with FS, in which animals recovered at least 50% of motor function, showing the efficacy of employing multiple regenerative approaches following spinal cord root injury.(AU)

Spongiform leukoencephalopathy in an adult mixed breed female dog

Leukoencephalomyelopathy is a nonspecific lesion characterized by widespread vacuolation of central nervous system white matter. It is mainly of genetic basis, occurring in young pure breed dogs. This report describes a neurodegenerative disease associated to demyelination in an adult mixed breed female dog. After 20 days in a kennel with12 other dogs, the dog showed progressive nervous signs with ataxia and inability to maintain balance. No other dog was affected. After 15 days, the animal was euthanized in extremis and necropsied. No macroscopic lesions of diagnostic relevance were present. Microscopically, status espongiosus was observed in white matter throughout the length of theneuroaxis, from frontal brain lobe to lumbar spinal cord. Specific stains of Kluver Barrera and immunohistochemistry for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated neurofilaments, microglia, astrocytosis, oligodendrocytosis and myelin proteins in brain and spinal cord sections showed demyelination, axonal fragmentation and degeneration, microgliosis and decrease of oligodendrocytes. The anatomopathological study and epidemiological data suggests a primary demyelination due to decrease in number and function of oligodendrocytes, which is probably of genetic basis with lateonset.

The effect of rosmarinic acid on deformities occurring in brain tissue by craniectomy method: histopathological evaluation of IBA-1 and GFAP expressions

Purpose To investigate the role of Rosmarinic acid (RA) in the prevention of traumatic brain injury and the immunohistochemical analysis of IBA-1 and GFAP expressions. Methods Healthy male rats were randomly divided into 3 groups consisting of 10 rats. Groups were as follows; control group, traumatic brain injury (TBI) group, and TBI+RA group. After traumatic brain injury, blood samples were taken from the animals and analyzed with various biochemical markers. And then IBA-1 and GFAP expressions were evaluated immunohistochemically. Results Significant results were obtained in all biochemical parameters between groups. Immunohistochemical sections showed IBA-1 not only in microglia and macrophage activity but also in degenerative neurons in blood vessel endothelial cells. However, GFAP reaction and post-traumatic rosmarinic acid administration showed positive expression in astrocytes with regular structure around the blood vessel. Conclusion Rosmarinic acid in blood vessel endothelial cells showed that preserving the integrity of astrocytic structure in the blood brain barrier may be an important antioxidant.(AU)

Spongiform leukoencephalopathy in an adult mixed breed female dog

Leukoencephalomyelopathy is a nonspecific lesion characterized by widespread vacuolation of central nervous system white matter. It is mainly of genetic basis, occurring in young pure breed dogs. This report describes a neurodegenerative disease associated to demyelination in an adult mixed breed female dog. After 20 days in a kennel with12 other dogs, the dog showed progressive nervous signs with ataxia and inability to maintain balance. No other dog was affected. After 15 days, the animal was euthanized in extremis and necropsied. No macroscopic lesions of diagnostic relevance were present. Microscopically, status espongiosus was observed in white matter throughout the length of theneuroaxis, from frontal brain lobe to lumbar spinal cord. Specific stains of Kluver Barrera and immunohistochemistry for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated neurofilaments, microglia, astrocytosis, oligodendrocytosis and myelin proteins in brain and spinal cord sections showed demyelination, axonal fragmentation and degeneration, microgliosis and decrease of oligodendrocytes. The anatomopathological study and epidemiological data suggests a primary demyelination due to decrease in number and function of oligodendrocytes, which is probably of genetic basis with lateonset.(AU)

Neuroprotection and immunomodulation by dimethyl fumarate and a heterologous fibrin biopolymer after ventral root avulsion and reimplantation

Background: Ventral root avulsion (VRA) is an experimental approach in which there is an abrupt separation of the motor roots from the surface of the spinal cord. As a result, most of the axotomized motoneurons degenerate by the second week after injury, and the significant loss of synapses and increased glial reaction triggers a chronic inflammatory state. Pharmacological treatment associated with root reimplantation is thought to overcome the degenerative effects of VRA. Therefore, treatment with dimethyl fumarate (DMF), a drug with neuroprotective and immunomodulatory effects, in combination with a heterologous fibrin sealant/biopolymer (FS), a biological glue, may improve the regenerative response. Methods: Adult female Lewis rats were subjected to VRA of L4-L6 roots followed by reimplantation and daily treatment with DMF for four weeks. Survival times were evaluated 1, 4 or 12 weeks after surgery. Neuronal survival assessed by Nissl staining, glial reactivity (anti-GFAP for astrocytes and anti-Iba-1 for microglia) and synapse preservation (anti-VGLUT1 for glutamatergic inputs and anti-GAD65 for GABAergic inputs) evaluated by immunofluorescence, gene expression (pro- and anti-inflammatory molecules) and motor function recovery were measured. Results: Treatment with DMF at a dose of 15 mg/kg was found to be neuroprotective and immunomodulatory because it preserved motoneurons and synapses and decreased astrogliosis and microglial reactions, as well as downregulated the expression of pro-inflammatory gene transcripts. Conclusion: The pharmacological benefit was further enhanced when associated with root reimplantation with FS, in which animals recovered at least 50% of motor function, showing the efficacy of employing multiple regenerative approaches following spinal cord root injury.(AU)

Neurobehavioral and neuroprotector effects of caffeine in animal models

This review aims to analyze and contrast the neurological effects associated with the use of caffeine on neurobehavior and neuroprotection in animal models. Caffeine belongs to the group of methylxanthines that exert a direct effect on adenosine receptors associated with inhibitory or excitatory G proteins, generating modification of cyclic AMP activity and intracellular calcium flow which produces alterations in the modulation system of the neurotransmitters dopamine and glutamate. The regulation of the neurotransmission systems generates protection against the inflammation of the central nervous system, by activation of the microglia and reinforcement of the blood-brain barrier. This drug will also restore cognition or prevent memory loss in Parkinson's or Alzheimer's diseases. It is important to establish new study models in other species to assess whether the behavior of the molecule is similar and to obtain other clinical applications in its behavioral and neuroprotective effects.(AU)

Neurobehavioral and neuroprotector effects of caffeine in animal models

This review aims to analyze and contrast the neurological effects associated with the use of caffeine on neurobehavior and neuroprotection in animal models. Caffeine belongs to the group of methylxanthines that exert a direct effect on adenosine receptors associated with inhibitory or excitatory G proteins, generating modification of cyclic AMP activity and intracellular calcium flow which produces alterations in the modulation system of the neurotransmitters dopamine and glutamate. The regulation of the neurotransmission systems generates protection against the inflammation of the central nervous system, by activation of the microglia and reinforcement of the blood-brain barrier. This drug will also restore cognition or prevent memory loss in Parkinson's or Alzheimer's diseases. It is important to establish new study models in other species to assess whether the behavior of the molecule is similar and to obtain other clinical applications in its behavioral and neuroprotective effects.

Estudos dos efeitos morfológicos e comportamentais da administração de doxorrubicina associada à curcumina e ao resveratrol em ratos wistar

A doxorrubicina (DOX) é conhecida por causar prejuízos cognitivos em pacientes submetidos a longos períodos de quimioterapia (déficits conhecidos como chemobrain). Existe, assim, urgente necessidade por estratégias terapêuticas capazes de permitir o retorno dos sobreviventes de câncer a sua prévia qualidade de vida. A curcumina (CUR), pigmento de coloração amarela extraído de rizomas de cúrcuma (Curcuma longa L.), e o resveratrol (RSV), um polifenol natural, possuem atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Objetivo: O objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos comportamentais e morfológicos da administração de CUR e RSV em associação com a DOX, a fim de verificar se tais substâncias podiam aliviar a neurotoxicidade descrita para a DOX. Métodos: Ratos Wistar, machos adultos, foram divididos em 4 grupos: DOX (2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, via intraperitoneal - i.p.), DOX+RSV (DOX, 2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, i.p.; RSV, 10 mg/kg/dia por 28 dias, gavagem), DOX+CUR (DOX, 2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, i.p.; CUR, 100 mg/kg/dia por 28 dias, gavagem) e controle (CTR, solução salina a 0,9%, i.p.). Foram realizadas análises comportamentais (campo aberto e teste de reconhecimento de novos objetos - NORT). Os encéfalos foram coletados e processados para a análise histopatológica pelas técnicas de coloração luxol fast blue e hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica para expressão de GFAP (proteína glial fibrilar ácida) em astrócitos e de Iba1 (molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado 1) na micróglia. Resultados: Os ratos injetados com DOX apresentaram comprometimento da memória de curto e longo prazo, como visto no NORT às 3 e 24 horas após a habituação, e aumento da expressão de GFAP e de Iba1, respectivamente, em astrócitos e na micróglia do córtex frontal, hipotálamo e hipocampo. Tais déficits cognitivos foram revertidos pela CUR em ambos os períodos e pelo RSV às 24 horas. A astrogliose e a microgliose induzidas pela DOX foram revertidas pelo RSV, assim como pela CUR. Não foram observados sinais de desmielinização e de perda neuronal em qualquer grupo. Conclusão: Dessa forma, a CUR e o RSV se mostraram capazes de reverter a perda de memória, a astrogliose e a microgliose induzidas pela quimioterapia com DOX.

ABSTRACT Doxorubicin (DOX) is known to cause cognitive impairments in patients submitted to long-term chemotherapy (deficits also known as chemobrain). Therefore, there is an urgent need for therapeutic strategies capable of returning cancer survivors back to their previous quality of life. The present study investigated whether resveratrol (RSV) or curcumin (CUR) administration could affect mnemonic function and brain morphological changes following DOX administration in rats. Male Wistar rats were divided into 4 groups: DOX group (2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus distilled water for 28 days, oral gavage - OG), DOX+RSV group (DOX, 2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus RSV, 10 mg/kg/day for 28 days, OG), DOX+CUR group (DOX, 2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus CUR, 100 mg/kg/day for 28 days, OG) and control (CTR) group (0.9% saline solution/week for 4 weeks, i.p., plus distilled water for 28 days, OG). Behavioral analyses (open field - OF - and the novel object recognition test - NORT) were performed. Brains were collected and analyzed by hematoxylin-eosin and luxol fast blue staining techniques and by immunohistochemistry for GFAP (glial fibrillary acidic protein) expression in astrocytes and Iba1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1) expression in microglia. DOX-injected rats presented short-term and long-term memory impairments as seen in the NORT at 3 and 24 hours after habituation and increased GFAP and Iba1 expression, respectively, in astrocytes and microglia of the frontal cortex, hypothalamus and hippocampus. Such cognitive deficits were reverted by CUR at both periods and by RSV at 24 hours. DOXinduced astrogliosis and microgliosis were reverted by RSV and CUR. No signs of demyelination or neuronal loss were found in any group. Thus, CUR and RSV reverted memory loss, astrogliosis and microgliosis induced by DOX monotherapy.

Estudo dos efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos da administração de doxorrubicina no período da infância de ratos Wistar, tratados ou não com resveratrol ou curcumina, e avaliados em idade adulta

As antraciclinas são potentes agentes quimioterápicos que revolucionaram o manejo do câncer infantil. Elas formam a base de uma série de protocolos terapêuticos usados para tratar tumores sólidos e hematológicos em crianças. Efeitos físicos e psicológicos adversos de longo prazo acompanham a sobrevivência de muitas das crianças curadas e submetidas a protocolos quimioterapêuticos e podem não se manifestar até a idade adulta, afetando diversos aspectos da função cognitiva, incluindo alterações de atenção, memória, velocidade de processamento, intelecto, desempenho acadêmico e saúde emocional. Objetivo: O presente estudo busca investigar a ocorrência da disfunção cognitiva em ratos adultos tratados com doxorrubicina (DOX) durante a infância, em associação ou não com o resveratrol (RSV), um polifenol natural que possui efeitos nootrópicos, ou com a curcumina (CUR), um pigmento amarelo extraído da Curcuma longa, que possui ação antioxidante e anti-inflamatória, analisando-se os possíveis efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos de tais administrações. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar machos, com duas semanas de idade, injetados com DOX (2,5 mg/kg, uma vez por semana, via intraperitoneal - IP, durante três semanas e 0,1 mL/kg/dia de água destilada por via oral - VO), em associação ou não com RSV (10 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO), ou com CUR (100 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO). Os animais do grupo controle receberam uma injeção semanal de solução fisiológica a 0,9% por via IP (mesmo volume) e água destilada diariamente (VO). Durante o período experimental, foram realizados estudos comportamentais, incluindo o teste de campo aberto, o teste de reconhecimento de novos objetos e o teste do labirinto de Barnes. Os encéfalos foram coletados e analisados pela técnica de coloração com hematoxilina-eosina e por imuno-histoquímica para a GFAP (glial fibrillary acidic protein) em astrócitos; para o marcador de micróglia Iba1 e para o marcador de apoptose caspase-3. As áreas analisadas incluíram o córtex frontal, o hipocampo (CA1, CA2 e CA3) e o hipotálamo. A análise morfométrica demonstrou que os ratos injetados com DOX apresentaram maior expressão de GFAP, Iba1 e caspase 3 em todas as áreas analisadas e que, tanto o RSV, quanto a CUR, foram capazes de diminuir tais expressões. A administração de DOX durante a infância foi capaz de causar prejuízos à memória espacial, e às memórias de curto e de longo prazo na vida adulta dos animais. Tais alterações foram prevenidas pela CUR, mas não pelo RSV. A DOX, em associação ou não com RSV e CUR, também demonstrou interferir, a longo prazo, na atividade de enzimas modificadoras da metilação (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A e KDM6B) e da acetilação de histonas (HAT1, SIRT1 e PCAF) na região do hipocampo destes animais. Os resultados sugerem que a astrogliose, a microgliose e a apoptose apresentadas na idade adulta estão relacionadas com o uso de DOX durante a infância e que o tratamento com RSV ou CUR foi capaz de minimizar tais alterações. No entanto, só a CUR demonstrou exercer efeito protetor em relação aos déficits de memória induzidos pela quimioterapia. Conclusão: Por fim, as alterações encontradas em importantes enzimas moduladoras da metilação e da acetilação de histonas na região do hipocampo sugerem que tais alterações morfológicas e comportamentais podem ser influenciadas por fatores epigenéticos e que o RSV e a CUR podem exercer ações protetivas aos danos tardios induzidos pela quimioterapia na infância.

Anthracyclines are potent chemotherapeutic agents that have revolutionized childhood cancer management. They form the backbone of a range of therapeutic treatments used to treat solid, hematologic tumors in children. Long-term adverse physical and psychological effects accompany cured children following chemotherapeutic protocols and may not manifest until adulthood, affecting several aspects of cognitive function, including changes in attention, memory, processing speed, intellect, performance academic and emotional health. The present study aims to investigate the occurrence of cognitive dysfunction in adult rats treated with doxorubicin (DOX) during childhood, in association or not with resveratrol (RSV), a natural polyphenol that has nootropic effects, or with curcumin (CUR), a yellow pigment extracted from Curcuma longa, which has antioxidant and anti-inflammatory actions, analyzing the morphological, behavioral, and epigenetic effects of such administrations. Two-week-old male Wistar rats injected with DOX (2.5 mg / kg, once a week, intraperitoneally - IP, for three weeks and 0.1 mL / kg / day of distilled water by oral - VO), in association or not with RSV (10 mg / kg / day, during the same period, VO), or with CUR (100 mg / kg / day, during the same period, VO). The animals in the control group received a weekly injection of 0.9% saline solution via IP (same volume) and daily distilled water (VO). During the experimental period, behavioral studies were carried out, including the open field test, the new object recognition test, and the Barnes maze test. The brains were collected and analyzed by the hematoxylin-eosin staining technique and by immunohistochemistry for GFAP (glial fibrilary acidic protein) in astrocytes; for the microglia marker Iba1 and for the apoptosis marker caspase-3. Areas investigated included the frontal cortex, the hippocampus (CA1, CA2 and CA3) and the hypothalamus. Morphometric analysis showed that rats injected with DOX presented increased expression of GFAP, Iba1 and caspase 3 in all areas and that both RSV and CUR were able to prevent such increases. The administration of DOX during childhood was able to impair spatial memory, and short- and long-term memories during adult life. Such deficits were prevented by CUR administration, but not with RSV. DOX, in association or not with RSV and CUR also affected, in the long term, the activity of methylation modifying enzymes (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A and KDM6B) and of acetylation enzymes (HAT, SIRT1 and PCAF) for histones in the hippocampus of these animals. The results suggest that astrogliosis, microgliosis and apoptosis in adulthood are related to the use of DOX during childhood and that treatment with RSV or CUR was able to minimize changes. However, only CUR presented a protective effect in relation to chemotherapy-induced memory deficits. Finally, changes found in important histone methylation and acetylation modulating enzymes in the hippocampus suggest that morphological and behavioral changes may be influenced by epigenetic factors and that RSV and CUR may exert preventive actions against late changes induced by childhood chemotherapy.

Avaliação morfoquantitativa do efeito da inibição da aromatase no hipocampo de ratos Wistar (Rattus norvegicus)

Sabe-se que as mulheres possuem maior susceptibilidade ao desenvolvimento da doença de Alzheimer se comparado aos homens em idade avançada, tal predileção pode estar relacionada à deficiência crônica de estrógenos em virtude da menopausa, pois este hormônio é sabidamente de grande relevância para a proteção e modulação do sistema nervoso central; a deficiência desse hormônio pode influenciar a capacidade das células da micróglia em degradar -amilóides no cérebro. Sabendose que o hipocampo é uma das regiões alvo da doença de Alzheimer e está relacionado aos déficits de memória e aprendizagem. Objetivou-se avaliar o efeito da inibição de estradiol sobre o volume do hipocampo de ratos Wistar (Rattus norvegicus) submetidos a déficits deste hormônio em um período de 120 dias, já que a atrofia do hipocampo representa um importante marcador para o diagnóstico da doença de Alzheimer. Para tanto, técnicas histológicas para o encéfalo e ferramentas de quantificação baseadas na Estereologia foram aplicadas sobre o encéfalo de fêmeas de ratos Wistar submetidas a extirpação gonadal, bem como inibição da aromatase pela administração de letrozol.

It is known that women are more susceptible to the development of Alzheimer's disease when compared to men of advanced age; this predilection may be related to chronic estrogen deficiency due to menopause, since this hormone is known to be of great relevance for the protection and modulation of the central nervous system; deficiency of this hormone may influence the ability of microglial cells to degrade - amyloids in the brain. The hippocampus is one of the target regions of Alzheimer's disease and is related to memory and learning deficits. The aim of this study was to evaluate the effect of the inhibition of estradiol on the total volume of Rattus norvegicus hippocampus submitted to deficits of this hormone in a period of 120 days, since hippocampal atrophy represents an important marker for the diagnosis of Alzheimer's disease. For this, histological techniques for the brain and stereological quantification tools were applied to the brain of female Wistar rats submitted to gonadal extirpation, as well as inhibition of aromatase by the administration of letrozole.

EFEITOS DA TERAPIA COM CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS MULTIPOTENTES EM CÃES COM ENCEFALOMIELITE PELO VÍRUS DA CINOMOSE

As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) são células adultas que residem em diversos tecidos do corpo e possuem capacidade proliferativa, imunomoduladora, anti-inflamatória e neuroregenerativa representado pela secreção de citocinas e fatores neurotróficos. O tecido neural possui baixa capacidade regenerativa após lesões traumáticas, inflamatórias e degenerativas, sendo alvo de estudos com uso de MSCs devido ao seu potencial terapêutico. A cinomose é uma doença viral infectocontagiosa comum em cães que acomete o sistema nervoso central refletindo em sinais clínicos neurológicos causadas por lesões desmielinizantes, resultantes da replicação viral no interior dos oligodendrócitos e de células da microglia, pela regulação do complexo de histocompatibilidade de classe I e infiltração de células inflamatórias. Nesse sentido, com o intuito de reduzir os sinais clínicos neurológicos, o objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia terapêutica das MSCs derivadas do tecido adiposo canino pela via intratecal (IT) em cães com encefalomielite viral por cinomose. Foram utilizados 10 cães, sem raça definida, apresentando sinais neurológicos de início agudo e progressivo com diagnóstico positivo pelo teste de Reação em Cadeia pela Polimerase quantitativo (qPCR). No momento 0 (M0), foi realizado exame neurológico, teste qPCR, hemograma e bioquímica sérica. No momento 1 (M1), os animais foram submetidos à anestesia para exame de ressonância magnética (RM), seguido da colheita do líquido cefalorraquiano (LCR), e então transplante de 10x106 MSCs pela via IT. Trinta dias após o transplante no momento 2 (M2), foram realizados o exame clínico, neurológico, hemograma, bioquímico, RM e analise do LCR. De acordo com os resultados obtidos nas condições experimentais descritas conclui-se que a via intratecal para o transplante das ASCs alogênicas em cães é viável e segura, pois demonstrou ser minimamente invasiva, rápida e permite transplantar um grande número de células no espaço subaracnóideo. As ASCs alogênicas por via intratecal demonstraram ser efetivas na melhora dos sinais clínicos.

Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult cells that reside in various tissues of the body and have proliferative, immunomodulatory, anti-inflammatory and neurooregenerative capacity represented by secretion of cytokines and neurotrophic factors. Neural tissue has low regenerative capacity after traumatic lesions, inflammatory and degenerative, being the target of studies with the use of MSCs due to its therapeutic potential. Distemper is a common viral disease, infectious and contagious of dogs that affects the central nervous system reflecting on clinical neurological signs caused by demyelinating lesions, resulting from viral replication within the oligodendrocytes and microglial cells, by regulation of the class I histocompatibility complex and infiltration of inflammatory cells. Thus, in order to reduce neurological clinical signs, the objective of this study was to evaluate the therapeutic efficacy of MSCs derived from canine adipose tissue by the intrathecal route (IT) in dogs with viral encephalomyelitis due to distemper. Ten dogs were used, mixed breed, presenting neurological signs of acute and progressive onset with positive diagnosis by quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). At time 0 (M0), neurological examination, qPCR test, blood count and serum biochemistry were performed. At the moment 1 (M1), the animals were submitted to anesthesia for magnetic resonance imaging (MRI), followed by cerebrospinal fluid (CSF) harvest, and then transplantation of 10x106 MSCs via the IT. Thirty days after transplantation at time 2 (M2), clinical, neurological, hemogram, biochemical, MRI and CSF analyzes were performed. According to results in the experimental conditions described, it is concluded that the via intrathecal for the transplantation of allogeneic ASCSs in dogs is viable and safe as it has been shown to be minimally invasive, rapid and allows to transplant a large number of cells in the subarachnoid space. Intrathecal allogeneic ASCSs have been shown to be effective in improving clinical signs.

CONTRIBUIÇÃO DOS ASTRÓCITOS NA LEUCOENCEFALITE CANINA IMUNOMEDIADA CAUSADA PELO VÍRUS DA CINOMOSE

No sistema nervoso central (SNC) a homeostase é mantida pelo contato célula a célula e por meio da expressão de receptores de membrana em neurônios, que se ligam a microglia para mantê-la em estado quiescente. Os astrócitos também contribuem com este processo, além disso, eles exercem inúmeras funções para a manutenção da imunotolerância local. Em situação de injúria, os astrócitos podem apresentar um efeito deletério, pois ativam a resposta imune e os efeitos da neuroinflamação e podem contribuir para o agravamento dos sinais clínicos neurológicos. Na cinomose canina, enfermidade infecciosa que pode cursar com desmielinização e inflamação no SNC, acredita-se que além do vírus, o processo inflamatório contribua com as lesões na substância branca. Portanto, os objetivos do presente estudo foram avaliar o papel dos astrócitos na encefalite causada pelo vírus da cinomose, por meio da imunodetecção de MHC-II, linfócitos T CD3, MMP9, MIF e GFAP nas áreas de desmielinização do encéfalo, a fim de verificar se estes achados podem estar relacionados à extensão ou gravidade das lesões encefálicas. Para isso realizou-se um estudo retrospectivo do arquivo de blocos de parafina, onde utilizou- se 21 blocos de encéfalos (cerebelo) de cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose (grupo infectado), bem como, encéfalos de cinco animais livres de doenças sistêmicas ou que afetem o SNC (grupo controle). Na análise imunohistoquímica das amostras verificou-se marcação aumentada de GFAP, MHC-II, MMP9 e MIF nas áreas de desmielinização e no neuropilo adjacente, observada principalmente em astrócitos. A detecção de CD3 foi restrita aos manguitos perivasculares. Nas áreas de necrose liquefativa, as células Gitter foram positivas para MMP-9, MIF e MHC-II. Por esses fatos conclui-se que os astrócitos ativados influenciam no afluxo de linfócitos T para o encéfalo, resultando em leucoencefalite, que contribui para o agravamento da lesão viral nos cães do grupo infectado. Nas fases mais avançadas, os fagócitos ativados (células Gitter) nas áreas de necrose liquefativa continuam a produção de mediadores inflamatórios, mesmo após a morte dos astrócitos nestes locais, agravando as lesões encefálicas.

In the central nervous system (CNS) homeostasis is maintained by cell- to-cell contact and by the expression of membrane receptors on neurons, which bind to microglia to keep it in a quiescent state. Astrocytes also contribute to this process, in addition, they exert numerous functions for the maintenance of local immunotolerance. In a situation of injury, astrocytes may have a deleterious effect, since they activate the immune response and the effects of neuroinflammation and may contribute to the worsening of clinical neurological signs. In canine distemper, an infectious disease that can occur with demyelination and inflammation in the CNS, it is believed that in addition to the virus, the inflammatory process contributes to lesions in the white matter. Therefore, the objectives of the present study were to evaluate the role of astrocytes in encephalitis caused by the distemper virus, by immunodetection of MHC-II, CD3, MMP9, MIF and GFAP T lymphocytes in the areas of brain demyelination, in order to verify whether these findings may be related to the extent or severity of brain lesions. For this, a retrospective study of the paraffin block file was carried out, using 21 blocks of cerebellum from dogs naturally infected with the distemper virus (infected group), as well as the brains of five disease-free animals systemic or affecting the CNS (control group). In the immunohistochemical analysis of the samples, there was an increased marking of GFAP, MHC-II, MMP9 and MIF in the areas of demyelination and adjacent neuropil, observed mainly in astrocytes. CD3 detection was restricted to perivascular cuffs. In areas of liquefiable necrosis, Gitter cells were positive for MMP-9, MIF and MHC-II. By these facts it is concluded that the activated astrocytes influence the influx of T lymphocytes to the brain, resulting in leukoencephalitis, which contributes to the worsening of the viral lesion in dogs of the infected group. In the more advanced stages, activated phagocytes (Gitter cells) in the areas of liquefying necrosis continue the production of inflammatory mediators, even after the death of the astrocytes in these places, aggravating the brain lesions.

EFEITO DO FLAVONOIDE AGATHISFLAVONA NA MODULAÇÃO DA RESPOSTA GLIAL E NA POPULAÇÃO DE NEURÔNIOS CORTICAIS EM MODELO IN VITRO DE TRAUMATISMO CRANIOENCEFÁLICO

Em um primeiro momento, utilizou-se a prospecção científica para a avaliação ao nível mais alto de desenvolvimento em artigos científicos sobre pesquisa com o flavonoide agathisflavona. A pesquisa prospectiva resultou em 81 produções científicas expressas em diversos periódicos, submetidas por diferentes países, com aumento no número de publicações verificado na última década. Entre as atividades biológicas do flavonoide agathisflavona, já demonstradas, estão efeito hepatoprotetor, antiprotozoario, antibiótico, antiviral, imunomodulador, neurogênico e neuroprotetor. Nesta perspectiva, foi possível investigar os avanços no estudo do flavonoide agathisflavona para desenvolvimento de novas terapêuticas. Em um segundo momento, testou-se os efeitos da agathisflavona em um modelo in vitro de TCE. O TCE é uma patologia multifatorial, sendo causa importante de incapacitação em seres humanos e animais. A depender do estresse mecânico causado pelo TCE, os astrócitos reagem com mudanças complexas de fenótipo e função conhecidas como astrogliose. Em casos de dano tecidual severo, os astrócitos proliferam na área imediatamente adjacente à lesão e se entrelaçam formando a cicatriz glial que, apesar de importante para mitigar o dano inicial do TCE também interfere na posterior regeneração do SNC. O flavonoide agathisflavona tem demonstrado efeito neuroprotetor, neurogênico e imunomodulador, o que pode ser benéfico em situações de TCE. Neste estudo foram investigados os efeitos do flavonoide agathisflavona em um modelo in vitro de TCE em culturas primárias de córtex cerebral embrionário murino em termos de modulação da resposta astrocitária, integridade de neurônios e modulação de fatores neurotróficos e imunomodulatórios. Comparado com os controles, tratamento com agathisflavona (1 µM) diminuiu a expressão de GFAP e espessamento de processos astrocitários observado nas culturas lesionadas, e gerou um aumento no número de corpos de neurônios e crescimento de neuritos que adentram a lesão. Agathisflavona (0,1 e 1 µM) também induziu aumento na expressão de fatores neurotróficos NGF e GDNF, assim como da enzima arginase-1, associada com microglias de perfil neuroprotetor M2. Os resultados encontrados no presente estudo demonstram que o flavonoide agathisflavona modula a resposta astrocitária e formação de cicatriz glial, estimulando a recomposição da rede neural em um modelo in vitro de TCE, o que pode ser considerado para terapia de TCE.

Initially, scientific prospecting was used for evaluation at the highest level of development in scientific papers on research with the flavonoid agathisflavone. The prospective research resulted in 81 scientific productions expressed in several journals, submitted by different countries, with an increase in the number of publications verified in the last decade. Among the biological activities of the flavonoid agathisflavone, already demonstrated, are hepatoprotective, antiprotozoal, antibiotic, antiviral, immunomodulatory, neurogenic and neuroprotective effect. In this perspective, it was possible to investigate the advances in the study of the flavonoid agathisflavone for the development of new therapeutics. In a second step, the effects of agathisflavone on an in vitro model of TBI were tested. ECT is a multifactorial pathology, being an important cause of incapacitation in humans and animals. Depending on the mechanical stress caused by TBI, astrocytes react with complex phenotype and function changes known as astrogliosis. In cases of severe tissue damage, astrocytes proliferate in the area immediately adjacent to the lesion and intertwine forming a glial scar which, while important to mitigate the initial damage of the TBI, also interferes with the subsequent regeneration of the CNS. The flavonoid agathisflavone has demonstrated neuroprotective, neurogenic and immunomodulatory effects, which may be beneficial in situations of TBI. In this study we investigated the effects of flavonoid agathisflavone on an in vitro model of TBI in primary cultures of murine embryonic cerebral cortex in terms of modulation of astrocytic response, neuron integrity and modulation of neurotrophic and immunomodulatory factors. Compared with the controls, treatment with agathisflavone (1 M) decreased GFAP expression and thickening of astrocyte processes observed in the injured cultures, and generated an increase in the number of neuron bodies and neurite outgrowth that entered the lesion. Agathisflavone (0.1 and 1 M) also induced increased expression of NGF and GDNF neurotrophic factors, as well as the arginase-1 enzyme, associated with M2 neuroprotective profile microglia. The results found in the present study demonstrate that the flavonoid agathisflavone modulates the astrocytic response and glial scar formation, stimulating the neural network recomposition in an in vitro model of TBI, which can be considered for TBI therapy.

EFEITO DA MONOCROTALINA NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE RATOS: GLIOSE REACIONAL E NEUROTIXICIDADE

Algumas espécies de plantas são responsáveis por intoxicação em animais o que resulta em significativas perdas econômicas diretas e indiretas ao Brasil. Dentre essas, a Crotalaria retusa destaca-se pelo seu alto teor do alcaloide pirrolizidínico monocrotalina (MCT), que é capaz de desencadear graves intoxicações com acometimento do Sistema Nervoso Central (SNC). Estudos já demonstram que células gliais e neurônios são alvos de efeitos citotóxicos da MCT e seu metabólito dehidromonocrotalina (DHMC), e estudos já verificaram que células astrocitárias são capazes de metabolizar a MCT. Contudo mais pesquisas que auxiliem na elucidação dos consequentes danos causados ao SNC de animais intoxicados e mecanismos de neurotoxicidade se fazem necessárias. Isto exposto, o presente trabalho objetivou avaliar possíveis alterações na memória espacial e na concentração de aminoácidos, bem como danos neuronais e ativação glial resultantes da intoxicação experimental pela MCT. Para tal, vinte ratos (Wistar, 60 dias) foram randomicamente divididos em dois grupos e receberam em dose única, via gavagem oral, 109 mg/Kg de MCT (n=10, grupo teste) ou solução salina a 0,9% (n=10, grupo controle). Após 72 horas da administração, o teste comportamental Y-maze foi executado, seguido da coleta de líquor, para dosagem de aminoácidos, e coleta do cérebro, para análise de dano neuronal através da técnica do Fluoro-Jade B e coloração por Cresil Violeta, além de imunoistoquímica para verificação de reatividade glial. No teste Y-maze, o desempenho dos animais tratados com MCT foi similar aos não tratados. Resultados semelhantes foram obtidos a partir da dosagem de aminoácidos presentes no líquor, não houve diferença entre os grupos. Já na avaliação de dano neuronal foi observado aumento no número de neurônios em processo de morte nos cérebros dos animais tratados com MCT. A imunoistoquímica revelou que tanto astrócitos quanto microglias ativaram-se frente à intoxicação pela MCT. Os resultados demonstram que a ingestão da MCT é capaz de induzir toxicidade em neurônios e ativação astrocitária e microglial no córtex e hipocampo de ratos, enquanto aparenta não influenciar na memória de trabalho dos animais, bem como nos níveis de aminoácidos presentes no líquor. Entretanto, a continuação da investigação se faz necessária para melhor compreensão do distúrbio neurológico resultante do quadro, incluindo as células alvo e suas vias de ação.

Some species of plants are responsible for intoxication in animals which results in significant direct and indirect economic losses in Brazil. Among these, Crotalaria retusa stands out due to its high content of monocrotaline pyrrolizidine alkaloid (MCT), which is capable of triggering severe intoxications with Central Nervous System (CNS) involvement. Studies have shown that glial cells and neurons are targets of cytotoxic effects of MCT and its metabolite dehydromonocrotalin (DHMC), and studies have already found that astrocytic cells are able to metabolize MCT, but more research that helps elucidate the consequent damage to the CNS of intoxicated animals and mechanisms of neurotoxicity are necessary. The present work aimed to evaluate possible alterations in spatial memory and amino acid concentration, as well as neuronal damage and glial activation resulting from experimental intoxication by MCT. Twenty rats (Wistar, 60 days) were randomly divided into two groups and received in a single dose, via oral gavage, 109 mg / kg MCT (n = 10, test group) or 0.9% saline solution (n = 10, control group). After 72 hours of administration, the Y-maze behavioral test was performed, followed by collection of cerebrospinal fluid, for amino acid dosage, and of the brain, for analysis of neuronal damage through the Fluoro-Jade B technique and Cresil Violet staining, besides immunohistochemistry to verify glial reactivity. In the Y-maze test, the performance of MCT treated animals was similar to those not treated. Similar results were obtained from the dosage of amino acids present in the CSF, there was no difference between the groups. In the evaluation of neuronal damage, an increase was observed in the number of neurons undergoing death in the brains of animals treated with MCT. Immunohistochemistry revealed that both astrocytes and microglia were activated against MCT intoxication. The results demonstrate that MCT ingestion is able to induce toxicity in neurons and astrocytic and microglial activation in the cortex and hippocampus of rats, whereas it appears to not influence the working memory of the animals as well as the levels of amino acids present in the CSF. However, further research is needed to better understand the resulting neurological disorder, including target cells and their pathways of action.

ATIVIDADE CITOTÓXICA E ANTI-INFLAMATÓRIA DE EXTRATO DE FOLHAS DE Jatropha curcas L. EM CÉLULAS GLIAIS

A Jatropha curcas L. (J. curcas L.), planta da família da Euforbeáceae, conhecida localmente como pinhão manso, apresenta alta plasticidade adaptativa, sendo cultivada em diferentes regiões de clima tropical e subtropical do mundo. Configura-se uma alternativa na medicina popular tradicional e veterinária para tratamentos de várias condições patológicas. Estudos demonstram que ação farmacológica como antimicrobiano, antifúngico, antioxidante, cicatrizante e anti-inflamatório possa está associado à presença de classes de compostos bioativos como os flavonoides e taninos. No entanto, não existem relatos da ação de compostos isolados desta planta no Sistema Nervoso Central (SNC). A escassez de conhecimento técnico-científico sobre a espécie gera uma demanda por estudos mais aprofundados. Assim o presente estudo objetivou realizar um mapeamento prospectivo sitemático sobre evolução tecnológica das diversas utilizações da planta Jatropha curcas L., obter extrato metanólico de folhas de J. curcas L. (EJC) e suas frações (FnEJC), realizar triagem fitoquímica qualitativa dos bioativos do EJC e investigar a atividade citotóxica e anti-inflamatória em culturas primárias de células gliais submetidas a estímulo inflamatório. A prospecção de registros tecnológicos a partir da base de dados do Escritório Europeu de Patentes (Espacenet®), entre o período de 1983 a 2012, não revelou documentos de tecnologiais (patentes) com finalidade terapêutica farmacológica da J. curcas L. A triagem fitoquímica do EJC apresentou resultado positivo para xantonas, leucoantocianidinas, catequinas (taninos catéquicos), flavanonas e flavonoides, xantonas, esteroides, terpenoides e saponinas. Foi observada atividade anti-inflamatória do extrato metanólico de folhas de J. curcas L. e frações em células gliais obtidas a partir de córtex cerebral de ratos Wistar neonatos, tratadas com lipopolissacarideo de Escherichia coli (LPS 1 g mL-1). O EJC (0,1 g mL-1 a 1.000 g mL-1) não foi citotóxica para as células gliais e apresentou EC50 de 10,794 g mL-1. O tratamento com LPS induziu ativação de astrócitos e microglias caracterizada por modificações morfológicas e da expressão de marcadores epecíficos GFAP e Iba-1, respectivamente além dada ativação do Fator Nuclear kaap B (NF-kB) em astrócitos além de aumento da produção de Oxido nítrico (NO). O Tratamento com o EJC preservou células quiescentes e atenuou ativação de células gliais pós indução inflamatória. Observou-se que EJC, F1EJC e F2EJC (0,1 g mL-1) inibiram a produção de NO, inclusive após estímulo inflamatório com LPS. Os resultados sugerem que o EJC inibe a ativação do NF-kB por apresentar compostos bioativos da J. curcas L. com possível bloqueio da resposta glial na regulação de genes envolvidos no processo inflamatório. Os resultados também contribuíram para a geração do documento de depósito de patente no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) no intuito de assegurar as novas descobertas desenvolvidas.

Jatropha curcas L. (Euforbeáceae), known locally as pinhão manso, is a plant with highly adaptable plant cultivated in different regions of tropical and subtropical regions of the world. Its adopeted in traditional folk medicine for the treatment of various pathological conditions, including arthritis, wounds and especially inflammation. Parts of the plant heve been demonstrated biological activites, as antimicrobial, antifungal, antioxidant, healing and anti-inflammatort, however, there are no evidences about effects on the Central Nervous System (CNS). Increasing evidence shows that glia cells, in speciall astrocytes and microglia, play a crucial role in the inflammatory response in the CNS, implicated in the pathogenesis and progression of neurodegenerative diseases. The glial reaction (gliosis) is chacterized by a set of alterations including changes in the synthesis and distribution of cytoskeletal proteins, release of molecules involved in inflammation, and reduced ability to regulate extracellular neurotransmitters and ions. The objective of the present work was to perform a prospective study about the technological evolution of the various uses of the Jatropha curcas L., to obtain a methanolic extract from leaves of J. curcas L. (EJC) and its fractions (FnEJC), to perform qualitative phytochemical study of EJC and to investigate the cytotoxic and anti-inflammatory activity in primary cultures of glial cells submitted to inflammatory stimuli. The prospection of technological registrations from the database of the European Patent Office (Espacenet®), the platform with the largest number of associates in the world, between the yars of 1983 and 2012, did not reveal technology documents (patents) with pharmacological therapeutic purpose of J. curcas L. Phytochemical screening of EJC showed positive results for xanthones, leucoanthocyanidins, catechins (catheteric tannins), flavanones and flavonoids, xanthones, steroids, terpenoids and saponins. Glial cell cultures were obtained from the cerebral cortex of neonates Wistar rats and treated wit LPS (1 g mL-1). EJC at 0.1 1,000 g mL-1 was not toxic to glial cells, and presented EC50 of 10.794 g mL-1. Treatment with LPS induced astrocyte and microglia activation characterized by morphological modifications and changes on expression of GFAP and Iba-1, markers of astrocytes and microglia, respectively, as well as activation of transcription factor NF-kB and production of NO. EJC treatment associated with LPS attenuated gliosis and activation of the LPS-induced Nuclear kaap B Factor (NF-kB). Moreover, (EJC) and fractions F1EJC and F2EJC reduced LPS-induced prodution of NO. Togheter these results indicates that EJC presentes anti-inflammatory antivity in reative glial cells associated to inibition of NF-kB. The results also contributed to the generation of the patent document of invention in the National Institute of Industrial Property (INPI) in order to ensure the new discoveries developed.

Biologia do glioblastoma multiforme da dinâmica de ativação microglial ao papel do canal de potássio Kv 10.1

O glioblastoma multiforme é o tumor cerebral mais agressivo. Já a micróglia representa 30% da massa tumoral e desempenha um importante papel na tumorigênese. Este trabalho buscou estudar o padrão de infiltração e alteração morfológica da micróglia no tecido tumoral formado por células da linhagem GL261mCherry implantadas ortotopicamente. Além disto, buscou-se examinar o papel do canal de potássio Kv 10.1, correlacionado ao crescimento tumoral, primeiro na interação da micróglia com as células tumorais e, segundo, frente à lesão celular causada pelo fármaco de escolha ao tratamento do glioma, a temozolomida. Camundongos CX3CR1-EGFP receberam injeções intracorticais de células de glioblastoma multiforme capazes de expressar a proteína fluorescente mCherry. Microscopia de epifluorescência e confocal foram empregadas nas análises morfométricas, ao passo que a microscopia do tipo 2-photon (2P-LSM) foi usada para visualizar as células tumorais e microgliais no cérebro de animais vivos. Os resultados deste estudo revelaram uma microgliose intensa em áreas cerebrais logo após a implantação do tumor, isto é, aos 30 minutos. Nos primeiros três dias, a micróglia tende a formar aglomerados de células em torno dos tumores. Para, em seguida, infiltrar no centro tumoral, onde permanece durante todos os pontos de tempo estudados, de 6 a 18 dias. Com o aumento da massa tumoral, as células tumorais perdem progressivamente a sua forma original, assumindo uma morfologia heterogênea e difusa; o tamanho do corpo celular (perímetro) passou de 10 µm, três dias após o implante, para 52 µm aos 18 dias. Em contato com o glioma, a micróglia também muda sua morfologia. A forma tornou-se amebóide, com corpos celulares alargados. O corpo celular (área) cresceu de 366±0.0 µm2, na micróglia em vigilância, para 1310±146.0 µm2 e ramificações curtas, ou mesmo ausência de ramificações no fenótipo ativado. Aos 12 dias após o implante, foi notada a presença de células multinucleadas de glioma, os policariócitos, em contato íntimo com a micróglia ativada. Sobre o canal Kv-10.1, este foi expresso em células cultivadas de glioma, de micróglia (linhagem BV-2) e também em tecido tumoral de camundongos implantados com o tumor. A supressão deste canal, em células de glioma, potencializou a injúria por TMZ em 29%, conforme ensaio de MTT. Em conclusão, a micróglia apresentou um padrão espaço-temporal de infiltração no glioma, o que favorece influências recíprocas e pró-tumorigênicas. Já o canal Kv-10.1, pode tanto representar uma via de comunicação entre estes tipos celulares, quanto ser um potencial alvo para a terapêutica do glioma, já que foi capaz de potencializar os efeitos da temozolomida na morte celular de linhagens de glioma.

Glioblastoma multiforme is the most aggressive brain tumor. Microglia represents 30% of the tumor mass, and plays a role in tumorigenesis. This work studied the pattern of microglial growth into brain tumor tissue formed by orthotopically implanted glioma cells of the established GL261 cell line. In addition, we examined the expression of the Kv 10.1 potassium channel that frequently correlates with tumor growth. CX3CR1-EGFP mice received intracortical injections of GL261 tumor cells with stable expression of the red fluorescent protein mCherry. Epifluorescence - and confocal laser-scanning microscopy were employed in the analysis of tissue sections, whereas two-photon laser-scanning microscopy (2P-LSM) was used to visualize tumor cells and microglia in the brain of living animals. Our results revealed an intense microgliosis in brain areas already shortly after tumor implantation, i.e. at 30 minutes. In the first three days, microglia formed clusters of cells around tumors mass. Then cells infiltrated the tumor area, where they remained during all the time points studied, from 6 to 18 days. As tumor increased in size, GL261 cells progressively lost their original shape, assuming a heterogeneous and diffuse morphology. Soma size increased from 10 to 52 µm. In contact with the glioma, microglia also changed its morphology. Cell bodies enlarged from 366±0.0 µm2, in quiescent microglia, to 1310±146.0 µm2. The shape became amoeboid, with enlarged cell bodies and short processes (or even absence of them). Remarkably, we found microglial processes that closely surrounded glioma cells. Microglia also grew around multinucleated polycariocytes, found in tumors at 12 days. The Kv 10.1 channel was expressed in cultured GL261 cells, microglia cell line (BV-2) and also in mouse tumors. Suppression of Kv10.1 caused a 29% decrease in the viability of glioma cells injured by TMZ. In conclusion, microglia presented a temporal and spatial pattern of infiltration in glioma tumors, which favors reciprocal and protumorigenic influences. Kv 10.1 expressed by glioma cells in close contact with microglia may represent a communication pathway between microglia and cancer cells and, could be a potential target for antiglioma gene therapy, since it potentiated the effects of temozolomide in glioma cell lines.

Avaliação da resposta imune e inflamatória na encefalite experimentalmente induzida em camundongos pela infecção pelo vírus da estomatite vesicular e herpersvírus bovino tipo 5

O presente trabalho compreende o estudo da resposta imune e inflamatória no sistema nervoso central (SNC) de camundongos ou ratos-veadeiros (Peromyscus maniculatus) frente a infecção por dois diferentes tipos de vírus neurotrópicos, o vírus da estomatite vesicular (VEV) e o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Na primeira etapa, foi avaliada a função das células residentes do SNC no tocante à expressão de quimiocinas durante a infecção pelo VEV em ratos-veadeiros. No presente estudo, durante a encefalite causada pelo vírus da estomatite vesicular sorotipo New Jersey (VEVNJ) em ratos-veadeiros, as quimiocinas RANTES e MCP-1 foram expressas somente no bulbo olfatório (BO), local onde o vírus estava restrito. A expressão de quimiocinas foi seguida de um influxo de células inflamatórias no BO tardiamente no curso da doença aguda. A quimiocina RANTES foi expressa por neurônios, astrócitos e micróglia, ao passo que MCP-1 foi expressa por neurônios e astrócitos. Embora os astrócitos e a micróglia tenham respondido à infecção pelo VEVNJ ao expressarem quimiocinas, os neurônios foram o principal tipo celular infectado pelo vírus. Portanto, os neurônios infectados podem exercer um papel crucial na geração da resposta imune no BO. A sinalização entre neurônios e outras células residentes do SNC muito provavelmente é o mecanismo pelo qual os astrócitos e micróglia são ativados durante a encefalite causada pelo VEVNJ. Os resultados aqui apresentados, também indicam que a expressão de RANTES e MCP-1 no BO de ratos-veadeiros infectados pelo VEVNJ pode ajudar a prevenir a disseminação do vírus para outras áreas do SNC. Na segunda etapa, foi avaliada a susceptibilidade de camundongos isogênicos BALB/c frente à infecção pelo BoHV-5 em camundongos isogênicos BALB/c em diferentes dias pós-inoculação (DPI). O BoHV-5 quando inoculado pela via intracraniana foi capaz de infectar e se replicar no SNC de camundongos BALB/c. Entretanto, até o momento avaliado (15 DPI), os animais sobreviveram a infecção sem apresentar sinais neurológicos evidentes. A infecção foi acompanhada de uma resposta imune do tipo Th1 importante, com expressão significativa das citocinas IFN- e TNF-, e quimiocina CCL-2. A expressão das citocinas e quimiocinas se deu principalmente no início da infecção (3 e 4 DPI), a qual foi seguida por uma meningo-encefalite com manguitos perivasculares e periventriculite, compostas predominantemente por macrófagos e linfócitos. Após a expressão significativa das citocinas e quimiocina, os animais foram capazes de debelar a infecção aguda, uma vez que partículas virais viáveis não foram detectadas após o 6 DPI. Entretanto, o BoHV-5 foi capaz de infectar o gânglio trigeminal, uma vez que grande quantidade de DNA de BoHV-5 foi detectada no 3 DPI, o que foi confirmado pela presença de antígenos virais no citoplasma de neurônios do gânglio trigeminal de camundongos BALB/c infectados.

The present work comprises the study of immune and inflammatory responses in the central nervous system (CNS) of mice or deer mice (Peromyscus maniculatus) during infection by two different neurotropic viruses, the vesicular stomatitis virus (VSV) and bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). In the first part, the role of CNS resident cells regarding chemokine expression in deer mice infected with VSV was evaluated. Here, we demonstrated that during vesicular stomatitis New Jersey virus (VSNJV) encephalitis in deer mice, chemokines RANTES and MCP-1 are expressed only in the olfactory bulb (OB), where the virus was restricted. This chemokine expression was followed by the influx of inflammatory cells to the OB later in the course of acute disease. Neurons, astrocytes and microglia expressed RANTES, whereas MCP-1 was expressed by neurons and astrocytes. Although astrocytes and microglia responded to VSNJV infection by expressing chemokines, neurons were the predominantly infected cell type. Therefore, infected neurons may have a critical role in initiating an immune response in the OB. The signaling between neurons and other CNS resident cells is most likely the mechanism by which astrocytes and microglia are activated during the course of VSV encephalitis. Our results also indicate that the expression of RANTES and MCP-1 in the OB of deer mice infected with VSNJV might help prevent the spread of VSNJV to other areas of CNS. In the second part of the study, the susceptibility of isogenic BALB/c mice to BoHV-5 infection was evaluated in different days post-inoculation (DPI). BoHV-5, when inoculated through intracranial route, was able to infect and replicate within the CNS of BALB/c mice. However, until the evaluated time (15 DPI), the mice was able to survive without showing prominent neurological signs. The infection was accompanied by an important Th1 immune response, with a significant expression of the cytokines IFN- and TNF-, and chemokine CCL-2. The expression of these cytokines and chemokines was detected mainly on the early course of infection (3 and 4 DPI), and was followed by a meningoencephalitis with perivascular cuffing and periventriculitis, composed mainly by macrophages and lymphocytes. After the expression of cytokines and chemokine, the mice were able to curb BoHV-5 acute infection, since viable viral particles were not detected after 6 DPI. However, BoHV-5 was able to infect the trigeminal ganglia, since a large number of BoHV-5 DNA copies was detected on 3 DPI, which was confirmed by the presence of viral antigens within the cytoplasm of neurons in the trigeminal ganglia of infected BALB/c mice.

Expressão astrocitária da proteína fibrilar glial ácida (GFAP) e concentrações plasmáticas de TNF- e IL-1 em ratos tratados com amitriptilina, gabapentina, metadona e morfina

Citocinas pró-inflamatórias e células gliais, principalmente micróglia, têm sido implicadas na sensibilização da dor persistente. Menos conhecido é o papel dos astrócitos nessa regulação. O objetivo do estudo foi o de medir os níveis plasmáticos de IL-1 e TNF- e a expressão do marcador astrocitário GFAP, após administração, em ratos saudáveis, de doses terapêuticas de curta duração de algumas drogas comumente utilizadas no tratamento da dor neuropática. Ratos Wistar machos foram divididos em cinco (5) grupos, recebendo por nove (9) dias- (1) amitriptilina (Amt- 10 mg/kg/dia, por gavagem solução); (2) gabapentina (Gb- 60 mg/kg/dia, por gavagem); (3) metadona (Me- 4,5 mg/kg/dia, via intraperitoneal - IP); (4) morfina (Mo- 10 mg/kg/dia, IP); ou (5) salina a 0.9%, IP). Amostras do encéfalo foram coletadas para estudo imuno-histoquímico da expressão astrocitária de GFAP no tronco encefálico e núcleo accumbens (NAc). A área das células GFAP-positivas foi calculada com uso do programa Metamorph e os níveis plasmáticos de citocinas foram determinados por ELISA. Enquanto os níveis de TNF- diminuíram nos grupos tratados com Mo, Me e Gb, a IL-1 diminuiu apenas com a Me. A expressão astrocitária de GFAP diminuiu no tronco encefálico com todas as drogas, enquanto aumentou no NAc com Amt, Me e Mo.

Pro-inflammatory cytokines and glial cells, especially microglial cells, have been implicated in persistent pain sensitization. Less is known about the role of astrocytes in its regulation. The aim of this study was to measure, after the administration of short-term therapeutic doses of some commonly used neuropathic pain relievers in healthy rats, the plasma levels of IL-1 and TNF- and the expression of the astrocytic biomarker GFAP. Male Wistar rats were divided into 5 groups, receiving for 9 days- (1) amitriptyline (Amt- 10 mg/kg/day, by gavage); (2) gabapentin (Gb - 60 mg/kg/day, by gavage; (3) methadone (Me- 4,5 mg/kg/day, intraperitoneal route- IP); (4) morphine (Mo- 10 mg/kg/day, IP); or (5) 0.9% saline solution, IP. Brain samples were collected for immunohistochemical study for GFAP expression in the brainstem and nucleus accumbens (NAc). The area of GFAP-positive cells was calculated using Metamorph software and plasma levels of IL-1 and TNF- were measured by ELISA. Plasma TNF- levels were decreased in the groups treated with Mo, Me and Gb, but not in the Amt-treated group. IL-1 decreased only in rats treated with Me. The astrocytic expression of GFAP was decreased in the brainstem with all drugs, while it was increased in the NAc with Amt, Me and Mo.

Transplante alogênico de células-tronco mesenquimais induz alteração do perfil de citocinas pró e antiflamatórias e de fatores neurotróficos no tratamento da lesão espinal

O objetivo deste estudo foi comparar dois protocolos de tratamento da lesão espinal aguda com células-tronco mesenquimais criopreservadas, extraídas do tecido adiposo (CTM-AD) de ratos Lewis eGFP. Avaliou-se a expressão de marcadores de superfície, capacidade de diferenciação e viabilidade celular pré e pós criopreservação de CTM-ADsubmetidas à três meios de criopreservação com concentrações distintas de soro fetal bovino (SFB). Os resultados demonstraram que as CTM-AD não perdem sua multipotência, não modificam a expressão fenotípica e apresentam alta viabilidade celular por até 90 dias de criopreservação. Avaliou-se também os efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores do tratamento único (grupo GI) e duplo (grupo GII) com CTM-AD alogênicas criopreservadas por via intravenosa após lesão espinal Os grupos tratados (GI e GII) foram avaliados conjuntamente com o grupo sham (GS) e controle negativo (GC) atravéz da escala de função motora (BBB), expressão dos transcriptos gênicos de interleucina-10 (IL-10), interleucina-1 beta (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator de transformação do crescimento (TGF-), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neutrófico derivado da glia (GDNF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Adicionalmente realizou-se quantificação por imunohistoquímica do infiltrado inflamatório (anti-CD68), integridade neuronal (anti-NeuN), e ativação de astrócitos (anti-GFAP). Quando comparado ao grupo GC, os grupos tratados com CTM apresentaram maiores escores nas avaliações funcionais a partir de 72h após lesão, sendo a média dos maiores escores alcançada pelo grupo GII; menor expressão de CD68 e GFAP juntamente com a redução da degeneração da substância branca e maior expressão de NeuN. O tratamento com as células também resultou em aumento da expressão de IL-10, GDNF, VEGF e redução da expressão de TNF- e TGF-. Adicionalmente o grupo GII apresentou redução da expressão de IL-1 e aumento da expressão de BDNF. Conclui-se que o tratamento alogênico com duas aplicações de CTM-AD criopreservadas promove melhor recuperação da atividade motora, reduz o infiltrado inflamatório, ativa células da micróglia/macrógafos com fenótipo antinflamatório, aumenta a quantidade de neurônios íntegros, reduz a degeneração da substância branca e a ativação de astrócitos na medula espinal e aumenta a secreção do fator neurotrófico BDNF.

This thesis aimed to compare two treatment protocols with cryopreserved allogenic adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) after spinal cord injury. Experiment 1 evaluated pre-freeze and pos-freeze populations of AD-MSCs response to freezing at 30, 60 and 90 days following cryopreservation. Plasticity, cell surface phenotype and cell viability were evaluated at different times after thawing technique. Results showed that MSC do not lose their multipotency, do not alter phenotypic profile and have a high cell viability for up to 90 days of cryopreservation. Experiment 2 evaluated the immunomodulatory and neuroprotective effects of cryopreserved allogenic adipose-derived MSCs after spinal cord injury (SCI). Treatment effects were comparatively evaluated by quantitation of gene expression of interleukin-10 (IL-10), interleukin-1 beta (IL-1), tumor necrosis factor (TNF-), transforming growth factor (TGF -), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial derived neurotrophic factor (GDNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Immunohistochemical analyzes were used to quantify inflammatory infiltrate (anti-CD68), neural integrity (anti-NeuN), and astrocytes activation (anti-GFAP). Frozen adipose-derived MSCs were transplanted after three hours (GI) and three hours and seven days after SCI (GII). The results were compared with animals without SCI (GS) and SCI without treatment (GC). MSCs treated groups had higher scores in functional assessments from 72h after injury, being the average of the highest scores achieved by the GII; lower expression of CD68 and GFAP along with reducing of degeneration of the white matter and increased expression of NeuN. The treatment with the cells also resulted in increased IL-10 expression, GDNF, VEGF and reduced of TNF- and TGF- expression. Additionally the GII decreased IL-1 expression and increased BDNF expression. The results suggest that early intravenous injection of AD-MSCs after acute SCI promotes better recovery of function, prevent futher damage through enhancement of anti-inflammatory mechanisms, reduces the inflammatory infiltrate, active anti-inflammatory phenotype of microglia, increase neuron viability, reduces the degeneration of the white matter and astrocyte activation in SCI. In addition, treatment with double applications of AD-MSCs was superior to the single administration of these cells, resulting in improved motor response and secretion of BDNF.