Quinolones resistance in Salmonella spp. isolated from broilers and chickens carcasses under federal inspection

ABSTRACT: We analyzed 77 Salmonella spp. strains, from which 20 were isolated from broilers (cloacal swabs) and 57 from chickens from slaughterhouses under federal inspection. The following serotypes were identified: Salmonella Saint Paul (29), Salmonella Heidelberg (27), Salmonella Anatum (9), Salmonella Cerro (5), Salmonella Senftenberg (5), Salmonella enterica (O: 4,5) (1) and Salmonella enterica (O: 9.12) (1). Fifteen strains (19.5%) were resistant to enrofloxacin, six (7.8%) to ciprofloxacin, and 26 (33.8%) to nalidixic acid in the Disk Diffusion Test. The fifteen enrofloxacin resistant strains were selected for the PCR to detect the genes gyrA, gyrB, parC, and parE, and genetic sequencing to identify mutations in these genes. Five strains (33.3%) had point mutations in the gyrA gene, and one (6.7%) presented a point mutation in the parC gene. None of the 15 strains had mutations in the gyrB and parE genes, and none had more than one mutation in the gyrA gene or the other genes. The presence of point mutations in the strains studied corroborates with the phenotypic resistance observed to nalidixic acid. However, it did not explain the resistance to fluoroquinolones found in the 15 strains. Other mechanisms may be related to the fluoroquinolones resistance, highlighting the need for additional mutation screening.

RESUMO: Foram analisadas neste estudo 77 estirpes de Salmonella spp., 20 isoladas de frangos vivos (suabes de cloaca) e 57 isoladas de carcaças, provenientes de abatedouros frigoríficos sob Inspeção Federal. Foram identificados os seguintes sorotipos: Salmonella Saint Paul (29), Salmonella Heidelberg (27), Salmonella Anatum (9), Salmonella Cerro (5), Salmonella Senftenberg (5), Salmonella enterica (O: 4,5) (1) e Salmonella enterica (O: 9,12) (1). Do total de estirpes estudadas, 15 (19,5%) se mostraram resistentes à enrofloxacina, seis (7,8%) à ciprofloxacina e 26 (33,8%) ao ácido nalidíxico no Teste de Difusão em Disco. Foram selecionadas as 15 estirpes resistentes à enrofloxacina para a realização da PCR para detecção dos genes gyrA, gyrB, parC e parEe para sequenciamento genético do produto da PCR para identificação de mutações nesses genes. Cinco estirpes (33,3%) apresentaram mutações pontuais no gene gyrA e uma (6,7%) apresentou mutação pontual no gene parC. Nenhuma das 15 estirpes apresentou mutações nos genes gyrB e parE e nenhuma apresentou mais de uma mutação no gene gyrA ou nos outros genes. A existência apenas de mutações pontuais em alguns genes das estirpes analisadas está de acordo com a resistência fenotípica observada ao ácido nalidíxico, mas não explica a resistência às fluoroquinolonas encontrada nas 15 estirpes. Outros mecanismos de resistência podem estar relacionados à resistência encontrada às fluoroquinolonas e estudos adicionais são necessários para investigar sua presença.

Quinolones resistance in Salmonella spp. isolated from broilers and chickens carcasses under federal inspection / Resistência à quinolonas em Salmonella spp. isoladas de frangos vivos e carcaças sob inspeção federal

We analyzed 77 Salmonella spp. strains, from which 20 were isolated from broilers (cloacal swabs) and 57 from chickens from slaughterhouses under federal inspection. The following serotypes were identified: Salmonella Saint Paul (29), Salmonella Heidelberg (27), Salmonella Anatum (9), Salmonella Cerro (5), Salmonella Senftenberg (5), Salmonella enterica (O: 4,5) (1) and Salmonella enterica (O: 9.12) (1). Fifteen strains (19.5%) were resistant to enrofloxacin, six (7.8%) to ciprofloxacin, and 26 (33.8%) to nalidixic acid in the Disk Diffusion Test. The fifteen enrofloxacin resistant strains were selected for the PCR to detect the genes gyrA, gyrB, parC, and parE, and genetic sequencing to identify mutations in these genes. Five strains (33.3%) had point mutations in the gyrA gene, and one (6.7%) presented a point mutation in the parC gene. None of the 15 strains had mutations in the gyrB and parE genes, and none had more than one mutation in the gyrA gene or the other genes. The presence of point mutations in the strains studied corroborates with the phenotypic resistance observed to nalidixic acid. However, it did not explain the resistance to fluoroquinolones found in the 15 strains. Other mechanisms may be related to the fluoroquinolones resistance, highlighting the need for additional mutation screening.(AU)

Foram analisadas neste estudo 77 estirpes de Salmonella spp., 20 isoladas de frangos vivos (suabes de cloaca) e 57 isoladas de carcaças, provenientes de abatedouros frigoríficos sob Inspeção Federal. Foram identificados os seguintes sorotipos: Salmonella Saint Paul (29), Salmonella Heidelberg (27), Salmonella Anatum (9), Salmonella Cerro (5), Salmonella Senftenberg (5), Salmonella enterica (O: 4,5) (1) e Salmonella enterica (O: 9,12) (1). Do total de estirpes estudadas, 15 (19,5%) se mostraram resistentes à enrofloxacina, seis (7,8%) à ciprofloxacina e 26 (33,8%) ao ácido nalidíxico no Teste de Difusão em Disco. Foram selecionadas as 15 estirpes resistentes à enrofloxacina para a realização da PCR para detecção dos genes gyrA, gyrB, parC e parEe para sequenciamento genético do produto da PCR para identificação de mutações nesses genes. Cinco estirpes (33,3%) apresentaram mutações pontuais no gene gyrA e uma (6,7%) apresentou mutação pontual no gene parC. Nenhuma das 15 estirpes apresentou mutações nos genes gyrB e parE e nenhuma apresentou mais de uma mutação no gene gyrA ou nos outros genes. A existência apenas de mutações pontuais em alguns genes das estirpes analisadas está de acordo com a resistência fenotípica observada ao ácido nalidíxico, mas não explica a resistência às fluoroquinolonas encontrada nas 15 estirpes. Outros mecanismos de resistência podem estar relacionados à resistência encontrada às fluoroquinolonas e estudos adicionais são necessários para investigar sua presença.(AU)

Prevalência da mutação causadora da paralisia periódica hipercalêmica em equinos da raça Quarto de Milha no Brasil / Prevalence of the hypercalemic periodic paralysis mutation in Quarter Horses in Brazil

A paralisia periódica hipercalêmica (HYPP) é uma das principais enfermidades genéticas de caráter dominante que acometem cavalos da raça Quarto de milha (QM). A HYPP é causada por uma mutação pontual no gene SCN4A e, apesar de estar presente nos cavalos QM no Brasil, dados sobre a prevalência da HYPP são escassos. O objetivo deste trabalho foi verificar a prevalência da mutação responsável pela HYPP em cavalos QM, utilizados nas modalidades esportivas de rédeas (n=160), apartação (n=160), tambor e baliza (n=160), corrida (n=160) e conformação (n=101). Foram utilizados DNA sanguíneo dos 741 equinos; o teste genético para enfermidade foi padronizado e as amostras sequenciadas para identificação da mutação no gene alvo. A prevalência de HYPP na população amostrada foi de 4,2%, sendo que somente na linhagem de conformação foram identificados animais positivos (30,7%). Medidas de controle mais efetivas devem ser adotadas para diminuir a prevalência da HYPP.(AU)

Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP) is one of the major dominant genetic diseases which affect Quarter horses (QH). The HYPP is caused by a point mutation in the SCN4A gene and despite the presence of HYPP in Brazilian QH, limited data on the disease prevalence are available. The aim of this study was to investigate the HYPP mutation in QH belonging to reining (n=160), cutting (n=160), barrel racing (n=160), racing (n=160) and halter (n=101) competitive disciplines. Blood DNA from 741 horses were used. Genetic tests were standardized and samples were sequenced to identify the mutation on the target gene. The prevalence of HYPP on the sampled population was 4.2% and the positive animals (30.7%) were only identified in the halter lineage. More effective actions on HYPP control should be done to reduce the disease prevalence. .(AU)

Molecular analysis of NSP4 coding gene of porcine rotavirus in Brazil / Análise molecular do gene codificador da NSP4 de rotavírus suínos no Brasil

The non-structural protein 4 (NSP4) has different roles in rotaviral replication, morphogenesis, and enterotoxin-like activity causing secretory diarrhea. A total of 11 partial nucleotide sequences of NSP4 coding gene were defined from group A rotavirus circulating in Brazilian swine herds. On comparing the viral sequences of diarrheagenic peptide area (amino acid 114-135), there was a single point mutation at amino acid 135 presented by two strains with amino acid alanine, and valine in the others. The NSP4 gene phylogeny showed that all strains clustered into E1 genotype, and the nucleotide identity between Brazilian strains ranged from 92.4% and 100%, while the putative amino acid identity, between 95.8% and 100%. Only one site (138aa) was positively selected and at least 119 were negatively selected. As a conclusion, these data demonstrate the occurrence of a common NSP4 genotype described elsewhere in pigs and low diversity between the samples from the surveyed areas

A proteína não estrutural 4 (NSP4) desempenha diferentes funções na replicação e na morfogênese dos rotavírus, apresentando, ainda, uma atividade de enterotoxina, causando diarreia do tipo secretória. Um total de 11 sequências parciais de nucleotídeos do gene codificador da NSP4 de rotavírus suínos de criações brasileiras foram definidas como pertencentes ao grupo A. Comparando-se as sequências virais da área do peptídeo toxigênico, que compreende a porção entre os aminoácidos de 114 a 135, constatou-se uma única mutação pontual no aminoácido 135, sendo que duas amostras apresentaram alanina, e as demais, valina. A análise filogenética do gene demonstrou que todas as amostras pertencem ao genotipo E1, e que a identidade nucleotídica das amostras brasileiras variou de 92,4% a 100%, enquanto que a identidade de aminoácidos, de 95,8% a 100%. Apenas um resíduo (aa 138) sofreu seleção positiva enquanto que pelo menos outros 119 apresentam seleção negativa. Assim, esses dados mostram a ocorrência de um genotipo comum da NSP4 já descrito anteriormente em suínos, com uma baixa diversidade entre as amostras encontradas

Molecular analysis of NSP4 coding gene of porcine rotavirus in Brazil / Análise molecular do gene codificador da NSP4 de rotavírus suínos no Brasil

The non-structural protein 4 (NSP4) has different roles in rotaviral replication, morphogenesis, and enterotoxin-like activity causing secretory diarrhea. A total of 11 partial nucleotide sequences of NSP4 coding gene were defined from group A rotavirus circulating in Brazilian swine herds. On comparing the viral sequences of diarrheagenic peptide area (amino acid 114-135), there was a single point mutation at amino acid 135 presented by two strains with amino acid alanine, and valine in the others. The NSP4 gene phylogeny showed that all strains clustered into E1 genotype, and the nucleotide identity between Brazilian strains ranged from 92.4% and 100%, while the putative amino acid identity, between 95.8% and 100%. Only one site (138aa) was positively selected and at least 119 were negatively selected. As a conclusion, these data demonstrate the occurrence of a common NSP4 genotype described elsewhere in pigs and low diversity between the samples from the surveyed areas(AU)

A proteína não estrutural 4 (NSP4) desempenha diferentes funções na replicação e na morfogênese dos rotavírus, apresentando, ainda, uma atividade de enterotoxina, causando diarreia do tipo secretória. Um total de 11 sequências parciais de nucleotídeos do gene codificador da NSP4 de rotavírus suínos de criações brasileiras foram definidas como pertencentes ao grupo A. Comparando-se as sequências virais da área do peptídeo toxigênico, que compreende a porção entre os aminoácidos de 114 a 135, constatou-se uma única mutação pontual no aminoácido 135, sendo que duas amostras apresentaram alanina, e as demais, valina. A análise filogenética do gene demonstrou que todas as amostras pertencem ao genotipo E1, e que a identidade nucleotídica das amostras brasileiras variou de 92,4% a 100%, enquanto que a identidade de aminoácidos, de 95,8% a 100%. Apenas um resíduo (aa 138) sofreu seleção positiva enquanto que pelo menos outros 119 apresentam seleção negativa. Assim, esses dados mostram a ocorrência de um genotipo comum da NSP4 já descrito anteriormente em suínos, com uma baixa diversidade entre as amostras encontradas(AU)

Caracterização fenotípica e análise do sistema nervoso central dos camundongos mutantes equilíbrio e mergulhador induzidos pelo agente mutagênico n-ethyl-n-nitrosourea

O agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) é amplamente utilizado para produzir novas mutações em camundongos, dando origem aos mutantes recessivos equilíbrio (eqlb), que possui uma mutação pontual no gene NADPH oxidase 3 (Nox3), cromossomo 17 e mergulhador (mlh), no gene Otopetrin 1 (Otop1), cromossomo 5; sendo que ambos apresentam alterações vestibulares. Devido à semelhança da função do aparelho vestibular humano e do camundongo, a análise comportamental desses modelos pode ser uma valiosa contribuição para identificar alterações no controle do equilíbrio e do movimento. Deste modo, com o objetivo caracterizar o comportamento dos mutantes eqlb e mlh foram realizados os seguintes testes: avaliação da atividade geral por observação direta no campo aberto, coordenação motora na trave elevada, labirinto em cruz elevada (LCE), para avaliar o comportamento do tipo ansioso, labirinto em T e reconhecimento de objetos para avaliar a memória, além do teste de suspensão pela cauda para verificar o comportamento do tipo depressivo. Os resultados mostraram que em comparação aos camundongos BALB/c, os mutantes eqlb e mlh apresentaram redução do reflexo auricular, reflexo de endireitamento, resposta ao toque, na locomoção e na frequência de levantar. A redução do reflexo auricular, da resposta ao toque e do redução do reflexo de endireitamento mostrou um possível prejuízo do sistema psicomotor. A redução da frequência de levantar provavelmente foi consequência da dificuldade motora dos camundongos mutantes. Os resultados do teste da trave elevada indicaram que os mutantes eqlb e mlh apresentaram um prejuízo motor principalmente relacionado à coordenação motora. O tempo de imobilidade aumentado no teste de suspensão pela cauda e a incapacidade de nadar em camundongos eqlb e mlh reforçaram o papel do sistema vestibular na manutenção da percepção de gravidade, movimento e equilíbrio.

The mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) is widely used to produce new mutations in mice, giving origin to the equilíbrio (eqlb) which has a mutation in the NADPH oxidase 3 (Nox3) gene, chromosome 17 and mergulhador (mlh) in the gene Otopetrin 1 (Otop1), chromosome 5; both mutant strain showed vestibular impairment. Due to the similarity of the vestibular apparatus between human and mouse, the behavioral analysis of the mutant can be a valuable contribution to identify alterations involved in the control of balance and movement. This study aimed to characterize the behavior of eqlb and mlh mutant mice using the following behavioral tests: evaluation of the general activity by direct observation in the open field, motor coordination in the balance beam, elevated plus maze to evaluate the behavior of the anxious type, T-maze and recognition of objects to evaluate memory. In addition, tail suspension test was used to verify depressive like behavior. The results showed that in relation to the BALB/c mice, the mutants eqlb and mlh showed reduction of auricular reflex, surface-righting reflex, touch response, locomotion and rearing frequency. The reduction of the auricular reflex and the touch response pointed to the impairment of the psychomotor system, and the reduction of the surface-righting reflex showed a possible impairment of the psychomotor system. The reduction in the rearing frequency was, probably, a consequence of the motor impairment observed in the mutant strains. The results of the elevated plus maze test indicated that the mutants eqlb and mlh showed motor impairment mainly related to motor coordination. The increased immobility time in the tail suspension test and the inability to swim in eqlb and mlh mice reinforced the role of the vestibular system in maintaining the perception of gravity, movement, and balance.

Atrofia progressiva de retina associada a mutação no gene PRCD - método de detecção genética em cães / Atrofia progesiva de retina asociada con la mutación en el gen PRCD-metodo de detección genética en los caninos / Progressive retinal atrophy caused by a PRCD gene mutation-genetic-based detection method in dogs

Nos cães, a atrofia progressiva de retina é uma doença causada por uma mutação pontual no gene PRCD, que leva à cegueira no seu estágio final. Na Argentina, o diagnóstico é realizado atualmente por meio de exame clínico e de eletrorretinografia. Essa enfermidade apresenta herança recessiva, com portadores assintomáticos capazes de transmitir a mutação para os seus filhotes, o que evidencia a necessidade de um diagnóstico por meio de teste genético, que permita a detecção precoce de portadores e doentes. No presente trabalho, descreve-se uma técnica para a detecção genética da APR-PRCD, por meio de método de sequenciamento, que determina a sucessão de nucleotídeos na região de PRCD onde se localiza a mutação. Foram utilizadas amostras de suabe bucal de dezoito cães (quinze poodles e três cockers) com atrofia de retina diagnosticada por exame clínico. Como controle foram utilizadas amostras de dez animais das mesmas raças, que não possuíam alterações oftalmológicas.

Canine progressive retinal atrophy is a disease caused by a mutation in the PRCD gene, which progresses toward end-stage blindness. In Argentina, the current method of diagnosis is by clinical examination and electroretinography. The fact that this condition is a recessive trait, with unaffected carriers that can transmit the mutation to their offspring, highlights the importance of a genetic screening procedure to detect carriers and affected individuals. This paper shows a PRA-PRCD genetic test based on sequencing the nucleotides around the PRCD mutation, allowing the most accurate diagnosis. Oral swab samples from eighteen dogs (fifteen poodles and three cockers) clinically diagnosed with retinal atrophy were studied. The control group consisted of ten animals of the same breeds without ophthalmic diseases.

La atrofia progresiva de retina en los perros es una enfermedad causada por una mutación puntual en el gen PRCD que conduce en su estadio final a la ceguera. En Argentina el diagnóstico se realiza actualmente a través el examen clínico y la electroretinografía. Presenta herencia recesiva, con portadores asintomáticos capaces de trasmitir la mutación a sus crías, esto torna necesario el desarrollo de un test genético para realizar la detección temprana de portadores y afectados. En el siguiente trabajo se describe una técnica para la detección genética de APR-PRCD a través del método de secuenciación, que determina la sucesión de nucleótidos en la región de PRCD que contiene la mutación. Se emplearon muestras de hisopado bucal provenientes de dieciocho caninos (quince caniches y tres cockers) con atrofia de retina diagnosticada clínicamente y como control se estudiaron muestras de diez animales de las mismas razas sin enfermedad oftalmológica.

Atrofia progressiva de retina associada a mutação no gene PRCD - método de detecção genética em cães / Atrofia progesiva de retina asociada con la mutación en el gen PRCD-metodo de detección genética en los caninos / Progressive retinal atrophy caused by a PRCD gene mutation-genetic-based detection method in dogs

Nos cães, a atrofia progressiva de retina é uma doença causada por uma mutação pontual no gene PRCD, que leva à cegueira no seu estágio final. Na Argentina, o diagnóstico é realizado atualmente por meio de exame clínico e de eletrorretinografia. Essa enfermidade apresenta herança recessiva, com portadores assintomáticos capazes de transmitir a mutação para os seus filhotes, o que evidencia a necessidade de um diagnóstico por meio de teste genético, que permita a detecção precoce de portadores e doentes. No presente trabalho, descreve-se uma técnica para a detecção genética da APR-PRCD, por meio de método de sequenciamento, que determina a sucessão de nucleotídeos na região de PRCD onde se localiza a mutação. Foram utilizadas amostras de suabe bucal de dezoito cães (quinze poodles e três cockers) com atrofia de retina diagnosticada por exame clínico. Como controle foram utilizadas amostras de dez animais das mesmas raças, que não possuíam alterações oftalmológicas.(AU)

Canine progressive retinal atrophy is a disease caused by a mutation in the PRCD gene, which progresses toward end-stage blindness. In Argentina, the current method of diagnosis is by clinical examination and electroretinography. The fact that this condition is a recessive trait, with unaffected carriers that can transmit the mutation to their offspring, highlights the importance of a genetic screening procedure to detect carriers and affected individuals. This paper shows a PRA-PRCD genetic test based on sequencing the nucleotides around the PRCD mutation, allowing the most accurate diagnosis. Oral swab samples from eighteen dogs (fifteen poodles and three cockers) clinically diagnosed with retinal atrophy were studied. The control group consisted of ten animals of the same breeds without ophthalmic diseases.(AU)

La atrofia progresiva de retina en los perros es una enfermedad causada por una mutación puntual en el gen PRCD que conduce en su estadio final a la ceguera. En Argentina el diagnóstico se realiza actualmente a través el examen clínico y la electroretinografía. Presenta herencia recesiva, con portadores asintomáticos capaces de trasmitir la mutación a sus crías, esto torna necesario el desarrollo de un test genético para realizar la detección temprana de portadores y afectados. En el siguiente trabajo se describe una técnica para la detección genética de APR-PRCD a través del método de secuenciación, que determina la sucesión de nucleótidos en la región de PRCD que contiene la mutación. Se emplearon muestras de hisopado bucal provenientes de dieciocho caninos (quince caniches y tres cockers) con atrofia de retina diagnosticada clínicamente y como control se estudiaron muestras de diez animales de las mismas razas sin enfermedad oftalmológica.(AU)

Use of DNA markers for genomic diagnosis of domestic animals: 2. Detection of point mutation causing Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP) in Quarter horses / Utilização de marcadores de DNA para o diagnóstico genômico de animais domésticos: 2. Detecção da mutação pontual causadora da Paralisia Hipercalêmica Periódica (HYPP) em eqüinos da raça Quarto de Milha

Twelve Quarter horses, descendants from Impressive line, have been analyzed. DNAs, purified from leukocytes of those animals, were submitted to Polymerase Chain Reaction technique (PCR) and digested by Taq I restrictionenzyme. Accordingly the Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP) genomic diagnosis was established. The tests revealed that 9 animals were carrier heterozygotes (N/H) and 3 normal homozygotes (N/N). Since the development of PCR methodology, it has been possible to diagnose the problem and plan ways to control the spreading of this defective gene in the population, through detection of carrier and normal animals.

Analisaram-se 12 eqüinos da raça Quarto de Milha, descendentes da linhagem Impressive. Submeteram-se os DNAs, purificados a partir de leucócitos destes animais, à técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) e posterior digestão com a enzima de restrição Taq I. Estabeleceu-se, dessa maneira, o diagnóstico genômico da Paralisia Hipercalêmica Periódica (HYPP). Os exames revelaram que 9 animais eram portadores heterozigotos (N/H) e 3, normais homozigotos (N/N). A partir do desenvolvimento da metodologia de PCR tornou-se possível diagnosticar o problema e propor maneiras de controle do alastramento desse gene defectivo na população por meio da detecção de animais portadores e normais.

Use of DNA markers for genomic diagnosis of domestic animals: 1. Detection of point mutation causing Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) in Brazilian Holstein cattle / Utilização de marcadores de DNA para o diagnóstico genômico de animais domésticos: 1. Detecção da mutação pontual causadora da Deficiência de Adesão de Leucócitos Bovinos (BLAD) em gado Holandês no Brasil

Ten Holstein bovines, descendants from Ivanhoe line, have been analyzed. DNAs, purified from leukocytes of those animals, were submitted to Polymerase Chain Reaction technique (PCR) and digested by Hae III and Taq I restriction enzymes. Accordingly, the bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) genomic diagnosis was established. The tests revealed that 2 animals were carriers and 8 were normal. Since the development of PCR methodology, a fast, practical and efficient way to select bulls in Artificial Insemination Centers has been through detection of carrier and normal animals.

Analisaram-se 10 bovinos da raça Holandesa, descendentes da linhagem Ivanhoe. Submeteram-se os DNAs, purificados a partir de leucócitos destes animais, à técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) e posterior digestão com as enzimas de restrição Hae III e Taq I. Estabeleceu-se, desta maneira, o diagnóstico genômico da Deficiência de Adesão de Leucócitos Bovinos (BLAD). Os exames revelaram que 2 animais eram portadores e 8, normais. A partir do desenvolvimento da metodologia de PCR, tornou-se disponível um método rápido, prático e eficiente para a seleção de touros em Centrais de Inseminação Artificial, por meio da detecção de animais portadores e normais.