Risk factors associated with intramammary colonization with Mollicutes in dairy cattle from Southeast Brazil / Fatores de risco associados à colonização intramamária por Mollicutes em bovinos leiteiros do Sudeste brasileiro

Bacteria of Mollicutes Class are associated with intramammary infection and decrease in milk production. This study investigated the occurrence of Mollicutes and elucidated their risk factors in dairy herds from Southeast Brazil. For this, milk samples from 387 lactation cows from Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo States were subjected to the polymerase chain reaction (PCR) to detect Mollicutes. Species of Mycoplasma were investigated in Mollicutes positive samples by PCR, including Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini and A. laidlawii. An epidemiological questionnaire was applied to collect data on possible risk factors, which were assessed using Pearson's Chi-square test followed by odds ratio (P≤0.05). Mollicutes were reported in 21% (4/19) of the herds and 4% (16/387) of the animals, while 1% (5/387) were positive for M. bovis and 3% (11/387) for M. arginini. All samples were negative to the other agents. Herds with more than 150 animals [OR=3.51 (95% CI 1.11-11.08)], manual milking [OR=9.97 (95% CI 2.80-35.49)] and not-milking animals with mastitis last [OR=6.54 (95% CI 1.92-22.29)] were risk factors. The presence of these conditions may favor intramammary infection by Mollicutes in dairy herds from Southeast Brazil. This is the first report of M. bovis in Rio de Janeiro and M. arginini in the studied states.

Bactérias da Classe Mollicutes estão associadas à infecção intramamária e diminuição da produção leiteira. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de Mollicutes e elucidar seus fatores de risco em rebanhos leiteiros do sudeste brasileiro. Para isso, amostras de leite de 387 vacas em lactação dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar Mollicutes. Espécies de Mycoplasma foram investigadas nas amostras positivas por PCR, incluindo Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini e A. laidlawii. Foi aplicado um questionário epidemiológico para a coleta de dados sobre possíveis fatores de risco, que foram avaliados pelo teste de Qui-Quadrado de Pearson seguido de odds ratio (P≤0.05). Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4% (16/387) dos animais, enquanto 1% (5/387) destes foram positivos para m. bovis, 3% (11/387) para m. arginini, sendo todas as amostras negativas para os demais agentes. Rebanhos com mais de 150 animais [OR=3,51 (95% IC 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (95% IC 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (95% IC 1,92-22,29)] foram considerados fatores de risco. A presença dessas condições pode favorecer a infecção intramamária por Mollicutes em rebanhos leiteiros no sudeste do Brasil. Este é o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e M. arginini nos estados estudados.

Risk factors associated with intramammary colonization with Mollicutes in dairy cattle from Southeast Brazil / Fatores de risco associados à colonização intramamária por Mollicutes em bovinos leiteiros do Sudeste brasileiro

Bacteria of Mollicutes Class are associated with intramammary infection and decrease in milk production. This study investigated the occurrence of Mollicutes and elucidated their risk factors in dairy herds from Southeast Brazil. For this, milk samples from 387 lactation cows from Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo States were subjected to the polymerase chain reaction (PCR) to detect Mollicutes. Species of Mycoplasma were investigated in Mollicutes positive samples by PCR, including Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini and A. laidlawii. An epidemiological questionnaire was applied to collect data on possible risk factors, which were assessed using Pearson's Chi-square test followed by odds ratio (P≤0.05). Mollicutes were reported in 21% (4/19) of the herds and 4% (16/387) of the animals, while 1% (5/387) were positive for M. bovis and 3% (11/387) for M. arginini. All samples were negative to the other agents. Herds with more than 150 animals [OR=3.51 (95% CI 1.11-11.08)], manual milking [OR=9.97 (95% CI 2.80-35.49)] and not-milking animals with mastitis last [OR=6.54 (95% CI 1.92-22.29)] were risk factors. The presence of these conditions may favor intramammary infection by Mollicutes in dairy herds from Southeast Brazil. This is the first report of M. bovis in Rio de Janeiro and M. arginini in the studied states.(AU)

Bactérias da Classe Mollicutes estão associadas à infecção intramamária e diminuição da produção leiteira. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de Mollicutes e elucidar seus fatores de risco em rebanhos leiteiros do sudeste brasileiro. Para isso, amostras de leite de 387 vacas em lactação dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar Mollicutes. Espécies de Mycoplasma foram investigadas nas amostras positivas por PCR, incluindo Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini e A. laidlawii. Foi aplicado um questionário epidemiológico para a coleta de dados sobre possíveis fatores de risco, que foram avaliados pelo teste de Qui-Quadrado de Pearson seguido de odds ratio (P≤0.05). Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4% (16/387) dos animais, enquanto 1% (5/387) destes foram positivos para m. bovis, 3% (11/387) para m. arginini, sendo todas as amostras negativas para os demais agentes. Rebanhos com mais de 150 animais [OR=3,51 (95% IC 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (95% IC 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (95% IC 1,92-22,29)] foram considerados fatores de risco. A presença dessas condições pode favorecer a infecção intramamária por Mollicutes em rebanhos leiteiros no sudeste do Brasil. Este é o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e M. arginini nos estados estudados.(AU)

Risk factors associated with intramammary colonization with Mollicutes in dairy cattle from Southeast Brazil / Fatores de risco associados à colonização intramamária por Mollicutes em bovinos leiteiros do Sudeste brasileiro

ABSTRACT: Bacteria of Mollicutes Class are associated with intramammary infection and decrease in milk production. This study investigated the occurrence of Mollicutes and elucidated their risk factors in dairy herds from Southeast Brazil. For this, milk samples from 387 lactation cows from Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo States were subjected to the polymerase chain reaction (PCR) to detect Mollicutes. Species of Mycoplasma were investigated in Mollicutes positive samples by PCR, including Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini and A. laidlawii. An epidemiological questionnaire was applied to collect data on possible risk factors, which were assessed using Pearson's Chi-square test followed by odds ratio (P≤0.05). Mollicutes were reported in 21% (4/19) of the herds and 4% (16/387) of the animals, while 1% (5/387) were positive for M. bovis and 3% (11/387) for M. arginini. All samples were negative to the other agents. Herds with more than 150 animals [OR=3.51 (95% CI 1.11-11.08)], manual milking [OR=9.97 (95% CI 2.80-35.49)] and not-milking animals with mastitis last [OR=6.54 (95% CI 1.92-22.29)] were risk factors. The presence of these conditions may favor intramammary infection by Mollicutes in dairy herds from Southeast Brazil. This is the first report of M. bovis in Rio de Janeiro and M. arginini in the studied states.

RESUMO: Bactérias da Classe Mollicutes estão associadas à infecção intramamária e diminuição da produção leiteira. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de Mollicutes e elucidar seus fatores de risco em rebanhos leiteiros do sudeste brasileiro. Para isso, amostras de leite de 387 vacas em lactação dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar Mollicutes. Espécies de Mycoplasma foram investigadas nas amostras positivas por PCR, incluindo Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini e A. laidlawii. Foi aplicado um questionário epidemiológico para a coleta de dados sobre possíveis fatores de risco, que foram avaliados pelo teste de Qui-Quadrado de Pearson seguido de odds ratio (P≤0.05). Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4% (16/387) dos animais, enquanto 1% (5/387) destes foram positivos para m. bovis, 3% (11/387) para m. arginini, sendo todas as amostras negativas para os demais agentes. Rebanhos com mais de 150 animais [OR=3,51 (95% IC 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (95% IC 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (95% IC 1,92-22,29)] foram considerados fatores de risco. A presença dessas condições pode favorecer a infecção intramamária por Mollicutes em rebanhos leiteiros no sudeste do Brasil. Este é o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e M. arginini nos estados estudados.

Occurrence of Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum in dairy cattle from to Pernambuco state, Brazil / Ocorrência de Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em bovinos leiteiros do estado de Pernambuco, Brasil

The objective of this study was to conduct an investigation of Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum infections in cattle in the microregion of the Ipanema Valley, state of Pernambuco, Brazil. Vaginal swabs were collected from 355 breeding cows in reproductive age and were analyzed by multiplex PCR (mPCR) and culture. An epidemiological investigation of risk factors was performed for Mollicutes. mPCR analysis showed that, 9.29% (33/355) of the cows were positive for M. bovigenitalium and 21.69% (77/355) for U. diversum; coinfection was observed in 2.81% (10/355) of the cows. The microbiological isolation showed, 81.81% (27/33) of Mycoplasma spp. and 24.67% (19/77) of Ureaplasma spp.. The risk factors related to Mollicutes infection identified were semi-intensive breeding system (OR= 4.6), pasture rent (OR= 3.6), non-isolation of animals with reproductive disorders (OR= 3.2), and natural mounting and artificial insemination (OR= 3.5). There was a significant association between Mollicutes infection and abortions in the first gestational third (P= 0.001). This is the first record of M. bovigenitalium and U. diversum infection in cows in the semiarid region of the state of Pernambuco, Brazil. Preventive measures directed to the identified risk factors can decrease the occurrence of Mollicutes in these herds.(AU)

O objetivo deste estudo foi realizar uma investigação de Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em bovinos leiteiros da microrregião do Vale do Ipanema, estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletados suabes vaginais de 355 vacas em idade reprodutiva. As amostras foram analisadas por multiplex PCR (mPCR) e cultura. Foi realizada uma investigação dos fatores de risco para Mollicutes. Na mPCR, 9,29% (33/355) das vacas foram positivas para M. bovigenitalium e 21,69% (77/355) para U. diversum; coinfecção foi observada em 2,81% (10/355) das vacas. O isolamento microbiológico mostrou crescimento de Mycoplasma spp. em 81,81% (27/33) das amostras e em 24,67% (19/77) para Ureaplasma spp. Os fatores de risco relacionados à infecção por Mollicutes identificados foram sistema de produção semi-intensivo (OR= 4,6), aluguel de pastagem (OR= 3,6), não isolamento de animais com desordens reprodutivas (OR= 3,2) e monta natural e inseminação artificial (OR= 3,5). Houve uma associação significativa entre a infecção por Mollicutes e abortos no primeiro terço gestacional (P=0,001). Este é o primeiro relato da infecção por M. bovigenitalium e U. diversum em vacas na região semiárida do estado de Pernambuco, Brasil. As medidas preventivas direcionadas aos fatores de risco identificados podem diminuir a ocorrência de Mollicutes nesses rebanhos.(AU)

Occurrence of Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum in dairy cattle from to Pernambuco state, Brazil / Ocorrência de Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em bovinos leiteiros do estado de Pernambuco, Brasil

The objective of this study was to conduct an investigation of Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum infections in cattle in the microregion of the Ipanema Valley, state of Pernambuco, Brazil. Vaginal swabs were collected from 355 breeding cows in reproductive age and were analyzed by multiplex PCR (mPCR) and culture. An epidemiological investigation of risk factors was performed for Mollicutes. mPCR analysis showed that, 9.29% (33/355) of the cows were positive for M. bovigenitalium and 21.69% (77/355) for U. diversum; coinfection was observed in 2.81% (10/355) of the cows. The microbiological isolation showed, 81.81% (27/33) of Mycoplasma spp. and 24.67% (19/77) of Ureaplasma spp.. The risk factors related to Mollicutes infection identified were semi-intensive breeding system (OR= 4.6), pasture rent (OR= 3.6), non-isolation of animals with reproductive disorders (OR= 3.2), and natural mounting and artificial insemination (OR= 3.5). There was a significant association between Mollicutes infection and abortions in the first gestational third (P= 0.001). This is the first record of M. bovigenitalium and U. diversum infection in cows in the semiarid region of the state of Pernambuco, Brazil. Preventive measures directed to the identified risk factors can decrease the occurrence of Mollicutes in these herds.(AU)

O objetivo deste estudo foi realizar uma investigação de Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em bovinos leiteiros da microrregião do Vale do Ipanema, estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletados suabes vaginais de 355 vacas em idade reprodutiva. As amostras foram analisadas por multiplex PCR (mPCR) e cultura. Foi realizada uma investigação dos fatores de risco para Mollicutes. Na mPCR, 9,29% (33/355) das vacas foram positivas para M. bovigenitalium e 21,69% (77/355) para U. diversum; coinfecção foi observada em 2,81% (10/355) das vacas. O isolamento microbiológico mostrou crescimento de Mycoplasma spp. em 81,81% (27/33) das amostras e em 24,67% (19/77) para Ureaplasma spp. Os fatores de risco relacionados à infecção por Mollicutes identificados foram sistema de produção semi-intensivo (OR= 4,6), aluguel de pastagem (OR= 3,6), não isolamento de animais com desordens reprodutivas (OR= 3,2) e monta natural e inseminação artificial (OR= 3,5). Houve uma associação significativa entre a infecção por Mollicutes e abortos no primeiro terço gestacional (P=0,001). Este é o primeiro relato da infecção por M. bovigenitalium e U. diversum em vacas na região semiárida do estado de Pernambuco, Brasil. As medidas preventivas direcionadas aos fatores de risco identificados podem diminuir a ocorrência de Mollicutes nesses rebanhos.(AU)

Diferenciação de espécies de Mycoplasma spp isoladas de vacas com mastite clínica, e de tanques de expansão.

A mastite é a principal afecção que acomete o gado destinado à produção de leite, gera prejuízos ao produtor e a indústria pela perda na produção e menor rendimento no processamento industrial de derivados. Consiste em uma enfermidade com caráter multifatorial de etiologia múltipla incluindo micro-organismos como bactérias, vírus, fungos e algas. Entre os micro-organismos bacterianos com maior destaque estão Staphylococcus aureus e os não aureus, todos caracterizados como contagiosos, além de Corynebacterium bovis e Streptococcus agalactiae. Com elevada contagiosidade tem-se Mycoplasma spp., com destaque para M. bovis, M bovigenitalium e M. californicum patógenos considerados importantes em outros países, entretanto, menos estudados no Brasil. Pelo alto grau de contagiosidade do agente e os aspectos econômicos é importante monitorar a ocorrência de mastites causadas por Mycoplasma spp, bem como a diferenciação das espécies envolvidas para a adoção de medidas de prevenção e controle da enfermidade na propriedade. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de micoplasmas, bactérias do gênero Mollicutes, e realizar a diferenciação de espécies em amostras de leite de vacas com mastite clinica, e como triagem para amostras de leite de tanques de expansão (mastite subclínica), a partir de técnicas moleculares, cultivo microbiológico das amostras positivas ao PCR e sequenciamento genético. Das 993 amostras analisadas foram encontradas 136 amostras positivas para a classe Mollicutes utilizando a técnica de concentração por meio de centrifugação previamente a extração do DNA e, utilizando as mesmas amostras, apenas 80 foram positivas realizando a extração diretamente do leite, evidenciando a importância da implementação da técnica na rotina de análises moleculares de amostras de leite para investigação de bactérias da classe Mollicutes. Não foram encontradas amostras positivas para as espécies testadas, M. bovis, M, bovirhinis, M. bovigenitalium, M. californicum e M. alkalescens.

Mastitis is the main affection that affects cattle destined for milk production, it generates losses to the producer and the industry due to the loss in production and lower yield in the industrial processing of derivatives. It consists of a disease with a multifactorial character of multiple etiology including microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and algae. Among the most prominent bacterial microorganisms are Staphylococcus aureus and non-aureus, all characterized as contagious, in addition to Corynebacterium bovis and Streptococcus agalactiae. Mycoplasma spp. Is highly contagious, with emphasis on M. bovis, M bovigenitalium and M. californicum pathogens considered important in other countries, however, less studied in Brazil. Due to the high degree of contagiousness of the agent and the economic aspects, it is important to monitor the occurrence of mastitis caused by Mycoplasma spp, as well as the differentiation of the species involved for the adoption of disease prevention and control measures on the property. The objective of the present study was to investigate the presence of mycoplasmas, bacteria of the genus Mollicutes, and to differentiate species in milk samples from cows with clinical mastitis, and as a screening for milk samples from expansion tanks (subclinical mastitis), the from molecular techniques, microbiological culture of PCR positive samples and genetic sequencing. Of the 993 samples analyzed, 136 positive samples were found for the Mollicutes class using the concentration technique by means of centrifugation prior to DNA extraction and, using the same samples, only 80 were positive performing the extraction directly from milk, showing the importance of implementation of the technique in the routine of molecular analyzes of milk samples for investigation of bacteria of the Mollicutes class. No positive samples were found for the species tested, M. bovis, M, bovirhinis, M. bovigenitalium, M. californicum and M. alkalescens.

ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA DA INFECÇÃO POR MYCOPLASMA BOVIGENITALIUM E UREAPLASMA DIVERSUM EM BOVINOS DA MICRORREGIÃO DO VALE DO IPANEMA-PERNAMBUCO

Objetivou-se, com este estudo, realizar uma investigação epidemiológica da infecção por Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em bovinos na microrregião do Vale do Ipanema, estado de Pernambuco. Foram coletados suabes vaginais de 355 vacas em idade reprodutiva que foram submetidos à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e isolamento microbiológico. Um questionário investigativo foi utilizado para a análise dos fatores de risco associados à infecção por Mollicutes. Pela PCR, 9,29% (33/355) amostras foram positivas para Mycoplasma bovigenitalium e 21,69% (77/355) para Ureaplasma diversum. Observou-se coinfecção em 2,81% (10/355) das amostras. A partir do isolamento microbiológico das amostras positivas na PCR, houve crescimento no meio Hayflick de 81,81% (27/33) das amostras, sendo classificadas como Mycoplasma spp. e 24,67% (19/77) cresceram no meio UB, sendo classificadas como U. diversum. Foram considerados fatores de risco associados à infecção por Mollicutes: sistema de criação semi-intensivo (OR=4,6); aluguel de pastagens (OR=3,6); não isolamento dos animais com distúrbios reprodutivos (OR=3,2) e realização de monta natural mais inseminação artificial (OR=3,5). Este é o primeiro registro da infecção por Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum em rebanhos bovinos na região semiárida do estado de Pernambuco, Brasil. A partir dos resultados obtidos, medidas de prevenção direcionadas aos fatores de riscos identificados podem contribuir com a diminuição da ocorrência de Mollicutes nos rebanhos bovinos estudados.

This studys objective was to conduct a Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum infections epidemiological investigation in cattle in the Ipanema Valley microregion, Pernambuco state. Vaginal swabs were collected from 355 reproductive age cows and submitted to polymerase chain reaction (PCR) and microbiological isolation. An investigative questionnaire was used to risk factors analysis associated with Mollicutes infection. According to PCR, 9.29% (33/355) of the samples were positive for Mycoplasma bovigenitalium and 21.69% (77/355) for Ureaplasma diversum. Coinfection was observed in 2.81% (10/355) of the samples. According to isolation, there was growth on Hayflick medium of 81.81% (27/33) from the samples classified as Mycoplasma spp. and 24.67% (19/77) growth on UB medium, being classified as Ureaplasma diversum. Risk factors associated to Mollicutes infection were considered: semi-intensive breeding system (OR = 4.6), pasture rent (OR = 3.6), reproductive disorders nonisolated animals (OR = 3.2), and natural mating plus artificial insemination (OR = 3.5). This is the first record of Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversum infection in semiarid region cattle herds of Pernambuco state, Brazil. From this, preventive measures directed to the identified risk factors can contribute to Mollicutes occurrence decrease in the cattle herds studied.

Interação do Mycoplasma bovigenitalium com células do cumulus in vitro após o período de maturação oocitária bovina

The Mycoplasma is considered cosmopolitan and can be disseminated through international trade of animals, industrialized semen and embryo transfer products. The expansion of cumulus cells is used as a parameter for evaluating cattle oocytes cultivated in vitro, and their morphological changes are representative. The aim of the present study was to evaluate the interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells, after the in vitro maturation period. Cumulus complex oocytes (COCs) obtained through follicular puncture of ovaries from a cattle slaughterhouse were divided into two groups to be matured for 24 hours in the maturation medium (TCM 199 + hormones) in a climate controlled chamber at 38º C, 5% CO2, and 95% humidity. Subsequently, the oocytes were removed from the plates, which remained with only the cumulus cells attached. With the monostratum cell formed, one group was infected with 30 ºL (5 x 10(6) cells/mL) M. bovigenitalium, replicated in modified Hayflick medium at 37º C in a mycroaerofilic chamber, while the other was kept as a control. The results showed that with 24 hours of exposure to the pathogen, the cultures showed a small number of rounded and grainy cells, when compared to the controls. This effect persisted until the 7th day, when a process of cell detachment began. It can be concluded that a mycoplasma contamination may be imperceptible to the manipulations of FIV, because cells infected by this group of bacteria present no cloudiness in the culture field, and when they do not lyse the host cell, they make it more susceptible to environment and other infectious agents.

O Mycoplasma é considerado cosmopolita, podendo ser disseminado através do comércio internacional de animais, sêmen industrializado e de produtos de transferência de embriões. A expansão de células do cumulus é utilizada como parâmetro de avaliação de oócitos bovinos cultivados in vitro e suas alterações morfológicas são representativas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do Mycoplasma bovigenitalium, exposto experimentalmente à cultura primária de célula do cumulus, após o período de maturação. Complexos oócitos cumulus (COCs) obtidos através de punção folicular de ovários bovinos, provenientes de abatedouro, foram divididos em dois grupos para serem maturados durante 24h em meio de maturação (TCM199 + hormônios) em estufa a 38º C, 5% de CO2, 95% de umidade. Posteriormente, os oócitos foram retirados das placas, permanecendo somente com as células do cumulus aderidas. Com o monoestrato celular formado, um grupo foi infectado com 30 mL de M. bovigenitalium, replicado em meio Hayflick modificado a 37º C em estufa de microaerofilia, enquanto o outro foi mantido como controle. Os resultados mostraram que, com 24h de exposição ao patógeno, as culturas apresentaram um pequeno número de células arredondadas e granulosas, quando comparadas as dos controles. Esse efeito persistiu até o sétimo dia, onde se iniciou um processo de descolamento das células. Pode-se concluir que uma contaminação por micoplasma pode ser imperceptível às manipulações da FIV, pois células infectadas por esse grupo de bactérias não apresentam turvações no meio de cultura e, quando não lisam a célula hospedeira, tornam mais suscetível ao ambiente e outros agentes infecciosos.

Interação do Mycoplasma bovigenitalium com células do cumulus in vitro após o período de maturação oocitária bovina / Interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells after in vitro maturation period

O Mycoplasma é considerado cosmopolita, podendo ser disseminado através do comércio internacional de animais, sêmen industrializado e de produtos de transferência de embriões. A expansão de células do cumulus é utilizada como parâmetro de avaliação de oócitos bovinos cultivados in vitro e suas alterações morfológicas são representativas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do Mycoplasma bovigenitalium, exposto experimentalmente à cultura primária de célula do cumulus, após o período de maturação. Complexos oócitos cumulus (COCs) obtidos através de punção folicular de ovários bovinos, provenientes de abatedouro, foram divididos em dois grupos para serem maturados durante 24h em meio de maturação (TCM199 + hormônios) em estufa a 38º C, 5% de CO2, 95% de umidade. Posteriormente, os oócitos foram retirados das placas, permanecendo somente com as células do cumulus aderidas. Com o monoestrato celular formado, um grupo foi infectado com 30 mL de M. bovigenitalium, replicado em meio Hayflick modificado a 37º C em estufa de microaerofilia, enquanto o outro foi mantido como controle. Os resultados mostraram que, com 24h de exposição ao patógeno, as culturas apresentaram um pequeno número de células arredondadas e granulosas, quando comparadas as dos controles. Esse efeito persistiu até o sétimo dia, onde se iniciou um processo de descolamento das células. Pode-se concluir que uma contaminação por micoplasma pode ser imperceptível às manipulações da FIV, pois células infectadas por esse grupo de bactérias não apresentam turvações no meio de cultura e, quando não lisam a célula hospedeira, tornam mais suscetível ao ambiente e outros agentes infecciosos.(AU)

INTERACTION OF MYCOPLASMA BOVIGENITALIUM WITH PRIMARY-CULTURE CUMULUS CELLS AFTER IN VITRO MATURATION PERIOD. The Mycoplasma is considered cosmopolitan and can be disseminated through international trade of animals, industrialized semen and embryo transfer products. The expansion of cumulus cells is used as a parameter for evaluating cattle oocytes cultivated in vitro, and their morphological changes are representative. The aim of the present study was to evaluate the interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells, after the in vitro maturation period. Cumulus complex oocytes (COCs) obtained through follicular puncture of ovaries from a cattle slaughterhouse were divided into two groups to be matured for 24 hours in the maturation medium (TCM 199 + hormones) in a climate controlled chamber at 38° C, 5% CO2, and 95% humidity. Subsequently, the oocytes were removed from the plates, which remained with only the cumulus cells attached. With the monostratum cell formed, one group was infected with 30 mL (5 x 106 cells/mL) M. bovigenitalium, replicated in modified Hayflick medium at 37° C in a mycroaerofilic chamber, while the other was kept as a control. The results showed that with 24 hours of exposure to the pathogen, the cultures showed a small number of rounded and grainy cells, when compared to the controls. This effect persisted until the 7th day, when a process of cell detachment began. It can be concluded that a mycoplasma contamination may be imperceptible to the manipulations of FIV, because cells infected by this group of bacteria present no cloudiness in the culture field, and when they do not lyse the host cell, they make it more susceptible to environment and other infectious agents.(AU)

Interação do Mycoplasma bovigenitalium com células do cumulus in vitro após o período de maturação oocitária bovina / Interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells after in vitro maturation period

O Mycoplasma é considerado cosmopolita, podendo ser disseminado através do comércio internacional de animais, sêmen industrializado e de produtos de transferência de embriões. A expansão de células do cumulus é utilizada como parâmetro de avaliação de oócitos bovinos cultivados in vitro e suas alterações morfológicas são representativas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do Mycoplasma bovigenitalium, exposto experimentalmente à cultura primária de célula do cumulus, após o período de maturação. Complexos oócitos cumulus (COCs) obtidos através de punção folicular de ovários bovinos, provenientes de abatedouro, foram divididos em dois grupos para serem maturados durante 24h em meio de maturação (TCM199 + hormônios) em estufa a 38º C, 5% de CO2, 95% de umidade. Posteriormente, os oócitos foram retirados das placas, permanecendo somente com as células do cumulus aderidas. Com o monoestrato celular formado, um grupo foi infectado com 30 mL de M. bovigenitalium, replicado em meio Hayflick modificado a 37º C em estufa de microaerofilia, enquanto o outro foi mantido como controle. Os resultados mostraram que, com 24h de exposição ao patógeno, as culturas apresentaram um pequeno número de células arredondadas e granulosas, quando comparadas as dos controles. Esse efeito persistiu até o sétimo dia, onde se iniciou um processo de descolamento das células. Pode-se concluir que uma contaminação por micoplasma pode ser imperceptível às manipulações da FIV, pois células infectadas por esse grupo de bactérias não apresentam turvações no meio de cultura e, quando não lisam a célula hospedeira, tornam mais suscetível ao ambiente e outros agentes infecciosos.

INTERACTION OF MYCOPLASMA BOVIGENITALIUM WITH PRIMARY-CULTURE CUMULUS CELLS AFTER IN VITRO MATURATION PERIOD. The Mycoplasma is considered cosmopolitan and can be disseminated through international trade of animals, industrialized semen and embryo transfer products. The expansion of cumulus cells is used as a parameter for evaluating cattle oocytes cultivated in vitro, and their morphological changes are representative. The aim of the present study was to evaluate the interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells, after the in vitro maturation period. Cumulus complex oocytes (COCs) obtained through follicular puncture of ovaries from a cattle slaughterhouse were divided into two groups to be matured for 24 hours in the maturation medium (TCM 199 + hormones) in a climate controlled chamber at 38° C, 5% CO2, and 95% humidity. Subsequently, the oocytes were removed from the plates, which remained with only the cumulus cells attached. With the monostratum cell formed, one group was infected with 30 mL (5 x 106 cells/mL) M. bovigenitalium, replicated in modified Hayflick medium at 37° C in a mycroaerofilic chamber, while the other was kept as a control. The results showed that with 24 hours of exposure to the pathogen, the cultures showed a small number of rounded and grainy cells, when compared to the controls. This effect persisted until the 7th day, when a process of cell detachment began. It can be concluded that a mycoplasma contamination may be imperceptible to the manipulations of FIV, because cells infected by this group of bacteria present no cloudiness in the culture field, and when they do not lyse the host cell, they make it more susceptible to environment and other infectious agents.

Etiologic diagnosis of bovine infectious abortion by PCR

Infectious abortion is a significant cause of reproductive failure and economic losses in cattle. The goal of this study was to detect nucleic acids of several infectious agents known to cause abortion including Arcanobacterium pyogenes, Bovine Herpesvirus 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum, and Tritrichomonas foetus. Tissue homogenates from 42 fetuses and paraffin-embedded tissues from 28 fetuses and 14 placentas/endometrium were included in this study. Brucella abortus was detected in 14.2% (12/84) of the samples. Salmonella sp. DNA was amplified from 2 fetuses, and there was one positive for Neospora caninum, and another for Listeria monocytogenes. This PCR-based approach resulted in identification of the etiology in 19% of samples, or 20% if considered fetal tissues only.

Aborto infeccioso é uma causa significativa de falhas reprodutivas e perdas econômicas na bovinocultura. O objetivo deste estudo foi detectar ácidos nucleicos de vários agentes infecciosos reconhecidos como causadores de aborto, incluindo-se Arcanobacterium pyogenes, Herpesvirus bovino tipo 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum e Tritrichomonas foetus. Homogenados de tecidos de 42 fetos e tecidos incluídos em parafina de 28 fetos e 14 placentas/endométrio foram incluídos neste estudo. Brucella abortus foi detectada em 14,2% (12/84) das amostras. DNA de Salmonella sp. foi amplificado de dois fetos e houve um feto positivo para Neospora caninum e outro para Listeria monocytogenes. Essa metodologia baseada em PCR resultou na identificação da etiologia em 19% das amostras ou 20% se considerados somente os tecidos fetais.

Etiologic diagnosis of bovine infectious abortion by PCR

Infectious abortion is a significant cause of reproductive failure and economic losses in cattle. The goal of this study was to detect nucleic acids of several infectious agents known to cause abortion including Arcanobacterium pyogenes, Bovine Herpesvirus 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum, and Tritrichomonas foetus. Tissue homogenates from 42 fetuses and paraffin-embedded tissues from 28 fetuses and 14 placentas/endometrium were included in this study. Brucella abortus was detected in 14.2% (12/84) of the samples. Salmonella sp. DNA was amplified from 2 fetuses, and there was one positive for Neospora caninum, and another for Listeria monocytogenes. This PCR-based approach resulted in identification of the etiology in 19% of samples, or 20% if considered fetal tissues only.

Aborto infeccioso é uma causa significativa de falhas reprodutivas e perdas econômicas na bovinocultura. O objetivo deste estudo foi detectar ácidos nucleicos de vários agentes infecciosos reconhecidos como causadores de aborto, incluindo-se Arcanobacterium pyogenes, Herpesvirus bovino tipo 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum e Tritrichomonas foetus. Homogenados de tecidos de 42 fetos e tecidos incluídos em parafina de 28 fetos e 14 placentas/endométrio foram incluídos neste estudo. Brucella abortus foi detectada em 14,2% (12/84) das amostras. DNA de Salmonella sp. foi amplificado de dois fetos e houve um feto positivo para Neospora caninum e outro para Listeria monocytogenes. Essa metodologia baseada em PCR resultou na identificação da etiologia em 19% das amostras ou 20% se considerados somente os tecidos fetais.

Estudo comparativo entre técnicas de isolamento e pcr para detecção de mycoplasma e ureaplasma diversum em muco prepucial e sêmen in natura de touros de monta natural e central de inseminação artificial

ABSTRACT With the objective of improving the diagnostic methods in mycoplasmosis, a study was carried out using bovine prepucial mucus and fresh semen from natural breeding and one Artificial Insemination Center with the aim to reduce the time necessary for the emission of results and to increase the detection levels, assuming bacterial isolation, on technique that depends on microbial viability, as the gold standard test. One hundred and seventy-five prepucial mucus samples and 143 fresh semen samples were studied. By PCR (Polymerase Chain Reaction) technique, a previous screening using the MGSP/GPO-1 system was tested for Mollicutes detection. Species-specific primers for Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversumwere used subsequently. By isolation there were observed 45.1% (79/175) of positivity for Mollicutes and 66.5% (115/173) for U. diversum in prepucial mucus. Comparatively, PCR revealed 63.7% (109/171) of positive samples by MGSP/GPO-1, 42.6% (72/169) of positive samples for M. bovigenitalium and 72.9% (124/170) for U. diversum. The semen samples study presented 22.5% (32/142) of positivity for Mollicutes and 51.7% (74/143) for U. diversum, by isolation. By PCR, 24.1% of positive samples were detected (33/137) using the MGSP/GPO-1 system, 27.4% (34/124) of positive samples for M. bovigenitalium and 56.6% (73/129) for U. diversum. The McNemar test for the Mollicutes presence in prepucial mucus (p = 0.57) showed that theMGSP/GPO-1 system can have a considerable value when associated with specific detection of U. diversum, showing good sensitivity (75.2%), however lower specificity (58.9%). The statistical analysis showed that the screening by MGSP/GPO-1 system could substitute the preliminary isolation of Mycoplasma spp. in semen samples (p = 0.86).

RESUMO Com o objetivo de aprimorar os métodos diagnósticos em micoplasmoses foi realizado um estudo utilizando-se muco prepucial e sêmen innatura de touros de monta natural e de uma central de inseminação artificial com o objetivo de reduzir o tempo necessário para a emissão de resultados e aumentar os níveis de detecção, assumindo o isolamento bacteriano, técnica dependente da viabilidade microbiana, como teste gold standard. Cento e setenta e cinco amostras de muco prepucial e 143 amostras de sêmen fresco foram estudadas. Através da técnica de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), uma triagem prévia das amostras foi realizada para detecção de Mollicutes, utilizando-se o sistema MGSP/GPO-1. Primers espécie-específicos para Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum foram posteriormente utilizados. Ao isolamento, foram observados 45,1% (79/175) de positivos para Mollicutes e 66,5% (115/173) para U. diversum em muco de prepucial. Comparativamente, a PCR revelou 63,7% (109/171) de amostras positivas através de sistema de MGSP/GPO-1, 42,6% (72/169) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 72,9% (124/170) para U. diversum. O estudo das amostras de sêmen apresentou 22,5% (32/142) de positivos para Mollicutes e 51,7% (74/143) para U. diversum, através do isolamento. Pela PCR, foram detectadas 24,1% (33/137) de amostras positivas no sistema MGSP/GPO-1, 27,4% (34/124) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 56,6% (73/129) para U. diversum. O teste de McNemar para presença de Mollicutes em muco de prepucial (p = 0,57), mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 pode ter um valor considerável quando associado à detecção específica de U. diversum, apresentando uma boa sensibilidade (75,2%), porém baixa especificidade (58,9%). A análise estatística mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 de triagem poderia substituir o isolamento preliminar para Mycoplasma spp. em amostras de sêmen (p = 0,86).

Heifer mastitis by Mycoplasma Bovigenitalium / Mastite em novilha por Mycoplasma Bovigenitalium

In this paper was report for the first time in Brazil the isolation of Mycoplasma bovigenitalium in a heifer with clinical mastitis. Negative results were obtained on standard bacteriologyr but growth was observed on Haytisck medium. The colonies were characterizated by biochemical and direct immunofluorescence, as M. bovigenitalium.

Neste trabalho, relata-se pela primeira vez no Brasil, o isolamento de Mycoplasma bovigenitalium em uma novilha apresentando mastite clínica. Os resultados bacteriológicos de rotina apresentaram-se negativos, enquanto que as colônias observadas no meio de Hayflick, caracterizadas por provas bioquímicas e pela imunofluorescência direta, foram identificadas como M. bovigenitalium.

Heifer mastitis by Mycoplasma Bovigenitalium / Mastite em novilha por Mycoplasma Bovigenitalium.

In this paper was report for the first time in Brazil the isolation of Mycoplasma bovigenitalium in a heifer with clinical mastitis. Negative results were obtained on standard bacteriologyr but growth was observed on Haytisck medium. The colonies were characterizated by biochemical and direct immunofluorescence, as M. bovigenitalium.  

Neste trabalho, relata-se pela primeira vez no Brasil, o isolamento de Mycoplasma bovigenitalium em uma novilha apresentando mastite clínica. Os resultados bacteriológicos de rotina apresentaram-se negativos, enquanto que as colônias observadas no meio de Hayflick, caracterizadas por provas bioquímicas e pela imunofluorescência direta, foram identificadas como M. bovigenitalium.    

Etiologia das infecções intramamárias em vacas primíparas no período pós-parto

A total of 664 foremilk samples from 83 Holstein cows were cultured. Quarter samples were collected at parturition and 7 days post the first parturition. From 664 milk samples examined, 488 (73.50%) were bacteriologically negative and 176 (26.50%) were positive. A high incidence (20.48%) of clinical mastitis was observed. The most frequently encountered isolates were coagulase negative staphylococci (64.20%), coagulase positive staphylococci (8.52%), streptococci (7.96%), Actinomyces pyogenes (4.55%), Mycoplasma bovigenitalium (3.40%) and Escherichia coli (2.84%). The frequency of mastitis pathogen isolation was highest at parturition (17.62%) and decreased markedly during the first week (8.88%).

Foram analisadas 664 amostras de leite de 83 vacas primíparas da raça Holandesa. As amostras foram colhidas no primeiro e no sétimo dia após o parto. Das 664 amostras analisadas, 488 (73,50%) foram bacteriologicamente negativas e 176 (26,50%), positivas para microrganismos aeróbios. Foi observado um alto índice de mastite clínica (20,48%). Os agentes isolados com maior freqüência foram os Staphylococcus spp coagulase negativo (64,20%), Staphylococcus spp coagulase positivo (8,52%), Streptococcus spp (7,96%), Actinomyces pyogenes (4,55%), Mycoplasma bovigenitalium (3,40%) e Escherichia coli (2,84%). Foi observado um maior índice de isolamento de patógenos no primeiro dia (17,62%) em relação ao sétimo (8,88%).

Etiologia das infecções intramamárias em vacas primíparas no período pós-parto

A total of 664 foremilk samples from 83 Holstein cows were cultured. Quarter samples were collected at parturition and 7 days post the first parturition. From 664 milk samples examined, 488 (73.50%) were bacteriologically negative and 176 (26.50%) were positive. A high incidence (20.48%) of clinical mastitis was observed. The most frequently encountered isolates were coagulase negative staphylococci (64.20%), coagulase positive staphylococci (8.52%), streptococci (7.96%), Actinomyces pyogenes (4.55%), Mycoplasma bovigenitalium (3.40%) and Escherichia coli (2.84%). The frequency of mastitis pathogen isolation was highest at parturition (17.62%) and decreased markedly during the first week (8.88%).

Foram analisadas 664 amostras de leite de 83 vacas primíparas da raça Holandesa. As amostras foram colhidas no primeiro e no sétimo dia após o parto. Das 664 amostras analisadas, 488 (73,50%) foram bacteriologicamente negativas e 176 (26,50%), positivas para microrganismos aeróbios. Foi observado um alto índice de mastite clínica (20,48%). Os agentes isolados com maior freqüência foram os Staphylococcus spp coagulase negativo (64,20%), Staphylococcus spp coagulase positivo (8,52%), Streptococcus spp (7,96%), Actinomyces pyogenes (4,55%), Mycoplasma bovigenitalium (3,40%) e Escherichia coli (2,84%). Foi observado um maior índice de isolamento de patógenos no primeiro dia (17,62%) em relação ao sétimo (8,88%).

Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum em touros. Diagnóstico, impacto na reprodução e ensaio terapêutico / Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum in bulls. Comparison of diagnostics procedures, interference in reproductive performance and therapeutic assay

Foram analisadas, para fins de diagnóstico das micoplasmoses da reprodução, 105 amostras de muco prepucial e 80 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de quatro propriedades rurais e 70 amostras de muco prepucial e 63 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de uma central de inseminação artificial, localizadas no Estado de São Paulo. As amostras foram submetidas ao isolamento bacteriano e PCR, para demonstração de presença de Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum. Colheitas foram realizadas no período de 1999 à 2002, antes e após a implantação de dois métodos de antibioticoterapia, utilizando-se para tal, oxitetraciclina di-hidratada ou fumarato de hidrogênio de tiamulin. O Sistema MGSO/GPO-1 de detecção de Mycoplasmatales pela PCR foi testado frente ao isolamento bacteriano. A associação entre a idade e forma de manejo reprodutivo, além da qualidade seminal e a presença dos microrganismos foi analisada através da odds ratio. A eficiência dos métodos de tratamento sobre a qualidade seminal dos touros foi analisada estatisticamente pelos testes de Mann Whitney e Wilcoxon. As freqüências de detecção de Mycoplasma spp pelo isolamento e pela PCR nas amostras de muco prepucial, foram 45,1 e 63,7%, respectivamente. Nas amostras de sêmen, as freqüências foram 22,5% (isolamento) e 24,1 (PCR). O Sistema MGSO/GPO-1 mostrou-se pouco eficiente na detecção dos agentes. Análise estatística revelou que animais com menos de quatro anos têm de 1,39 (M. bovigenitalium) até 7,54 (U. diversum) vezes mais chance de serem portadores dos microrganismos. A odds ratio de 4,01 até 4,68 (muco prepucial) e de 1,71 até 18,29 (sêmen) mostrou a importância da higiene no manejo reprodutivo. Os animais da Central de Inseminação Artificial apresentaram resposta significativa sobre a motilidade espermática no tratamento com oxitetraciclina (p=0,033). As estimativas de risco, pós-tratamento, foram menores para os parâmetros motilidade e defeitos menores, associados à Mycoplasma spp e, motilidade e defeitos maiores, associados à U. diversum

Prepucial mucuses and fresh semen were collected from bulls under two kinds of reproductive management: a) natural breeding with cows in four farms, b) an Artificial Insemination Center. All of them located in São Paulo State, Brazil. The samples were collected from 1999 to 2002. In the farms it were collected 105 samples of prepucial mucuses and 80 samples of fresh semen and in the Artificial Insemination Center, 70 samples of prepucial mucuses and 63 of fresh semen. The laboratory tests applied for demonstration of Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium and Ureaplasma diversum were classical cultivation and polymerase chain reaction (PCR). The therapeutic assay were performed with oxytetracicline, 20 mg./kg. of body weight, IM, or tiamulin hydrogen fumarate, 15 mg./kg. of body weight, IM. Mycoplasma spp was demonstrated in 45,1% and 63,7% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 22,5% and 24,1% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. Ureaplasma diversum was demonstrated in 66,5% and 72,9% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 51,7% and 56,6% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. The MGSO/GPO-1 PCR System, was able for demonstration of Mycoplasma spp DNA in bovine semen and U. diversum in prepucial mucuses, with results in agreement with cultivation. Animals younger than four years of age presented a higher infection rate than older: odds ratio 1.39 (M. bovigenitalium) and up to 7.54 (U. diversum). Odds ratio from 4.01 to 4.68 (prepucial mucuses) and from 1.71 to 18.29 (semen) showed the importance of the hygienic status of the reproduction management. The animals from Insemination Center, showed better motility after the treatment with oxytetracicline (p=0,033). After therapeutic assay, the odds ratio was small for the motility and morphologic aspects of the semen associated to Mycoplasma spp and U. diversum contamination

CONSTRUÇÃO DE PRIMERS E OTIMIZAÇÃO DE ENSAIOS DE PCR E DE NESTED-PCR PARA A DETECÇÃO ESPECÍFICA DE Tritrichomonas foetus

A tricomonose bovina é uma doença venérea que causa infertilidade e aborto em bovinos. O agente etiológico é o protozoário Tritrichomonas foetus, cujo habitat é o trato genital destes animais. Os protocolos desenvolvidos até o presente para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou são incapazes de distinguir T. foetus de outras espécies do gênero. Com o objetivo de buscar maior especificidade no diagnóstico molecular desta enfermidade, os estudos foram conduzidos na tentativa de avaliar e otimizar ensaios de PCR e nested-PCR, empregando-se novos primers selecionados a partir do alinhamento das seqüências dos genes 18S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA e do primeiro e segundo espaços transcritos do rDNA (ITS1 e ITS2). As seqüências foram obtidas junto ao GenBank referentes ao gênero Tritrichomonas e outros organismos da família Trichomonadidae. Foi construído um par de primers para reação espécie-específica e outro para a amplificação gênero-específica. A análise pelo BLASTn (basic local alignment search tool nucleotide GenBank) indicou a especificidade para cada primer. A avaliação da especificidade foi complementada então pelos ensaios de PCR testando os seguintes DNAs genômicos: Bos taurus, Herpesvirus bovino tipo-1, seis espécies de Brucella, 24 sorovares de L. interrogans, Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovis, Listeria monocytogenes e Neospora caninum. Nenhuma reação cruzada foi observada nestas reações. No entanto, a reação de PCR espécie-específica, reconheceu, além do DNA genômico de T. foetus, o de Tritrichomonas suis. A sensibilidade dos ensaios de PCR e de nested-PCR apresentados neste estudo permitiram um limiar de detecção de até dois parasitos em meio de cultura para diagnóstico