Role of NO in arterial vascular function of intertidal fish (Girella laevifrons) and marine fish (Isacia conceptionis)

Abstract Previous studies performed in intertidal fish (Girella laevifrons),as well as marine fish (Isacia conceptionis), showed that acetylcholine (ACh) produced contractions mediated by cyclooxygenases that were dependent on the area and potency of contraction in several arterial vessels. Given that the role of nitric oxide is poorly understood in fish, the objective of our study was to evaluate the role of nitric oxide in branchial afferent (ABA), branchial efferent (ABE), dorsal (DA) and mesenteric (MA) arterial vessels from both Girella laevifrons and Isacia conceptionis. We studied afferent and efferent branchial, dorsal and mesenteric arteries that were dissected from 6 juvenile specimens. Isometric tension studies were done using dose response curves (DRC) for Ach (1013 to 103 M) and blockade with L-NAME (105 M), and DRC for sodium nitroprusside (SNP, a donor of NO). L-NAME produced an attenuation of the contractile response in the dorsal, afferent and efferent branchial arteries and a potentiation of the contraction in the MA. SNP caused 70% dilation in the mesenteric artery and 40% in the dorsal artery. Our results suggest that Ach promotes precarious dilatation in MA mediated by NO; data that is supported by the use of sodium nitroprusside. In contrast, in the vessels DA, ABA and EBA our results support that the pathway Ach-NO-relaxation is absent in both species.

Resumo Estudos anteriores, realizados no peixe intertidal (Girellalaevifrons) no peixe marinho (Isacia conceptionis), mostram que a acetilcolina (Ach) provoca contrações mediadas por ciclooxigenases que eram dependentes da área e potencia da contração em vários vasos arteriais. Tendo em conta que o papel do óxido nítrico é mal compreendido em peixes, o objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel do óxido nítrico em vasos arteriais de ambos os peixes Girella laevifrons e Isacia conceptionis. Nós estudamos os vasos aferente, branquial (ABA), eferente branquial (ABE), dorsal (DA) e mesentérica (MA), que foram dissecadas de seis espécimes juvenis. Estudos de tensão isométrica foram realizados utilizando as curvas de dose-resposta (DRC) para Ach (1013 a 103M) e bloqueio com L-NAME (105 M), e na DRC para o nitroprussiato de sódio (SNP, doador do NO). L- NAME produziu uma atenuação da resposta contrátil nas artérias dorsais, aferentes e eferentes branquial e uma potenciação da contração no MA. SNP causaram 70% da dilatação da artéria mesentérica e 40% na artéria dorsal. Nossos resultados sugerem que Ach promove dilatação precária em MA mediada por NO; dados que é suportada pela utlilização de nitroprussiato de sódio. Em contraste, nos vasos de DA, ABA e EBA nossos resultados suportam que a via de Ach-NO-relaxamento está ausente em ambas as espécies.

Role of NO in arterial vascular function of intertidal fish (Girella laevifrons) and marine fish (Isacia conceptionis) / Papel do NO na função vascular arterial de peixes entremarés (Girella laevifrons) e peixes marinhos (Isacia conceptionis)

Abstract Previous studies performed in intertidal fish (Girella laevifrons),as well as marine fish (Isacia conceptionis), showed that acetylcholine (ACh) produced contractions mediated by cyclooxygenases that were dependent on the area and potency of contraction in several arterial vessels. Given that the role of nitric oxide is poorly understood in fish, the objective of our study was to evaluate the role of nitric oxide in branchial afferent (ABA), branchial efferent (ABE), dorsal (DA) and mesenteric (MA) arterial vessels from both Girella laevifrons and Isacia conceptionis. We studied afferent and efferent branchial, dorsal and mesenteric arteries that were dissected from 6 juvenile specimens. Isometric tension studies were done using dose response curves (DRC) for Ach (1013 to 103 M) and blockade with L-NAME (105 M), and DRC for sodium nitroprusside (SNP, a donor of NO). L-NAME produced an attenuation of the contractile response in the dorsal, afferent and efferent branchial arteries and a potentiation of the contraction in the MA. SNP caused 70% dilation in the mesenteric artery and 40% in the dorsal artery. Our results suggest that Ach promotes precarious dilatation in MA mediated by NO; data that is supported by the use of sodium nitroprusside. In contrast, in the vessels DA, ABA and EBA our results support that the pathway Ach-NO-relaxation is absent in both species.(AU)

Resumo Estudos anteriores, realizados no peixe intertidal (Girellalaevifrons) no peixe marinho (Isacia conceptionis), mostram que a acetilcolina (Ach) provoca contrações mediadas por ciclooxigenases que eram dependentes da área e potencia da contração em vários vasos arteriais. Tendo em conta que o papel do óxido nítrico é mal compreendido em peixes, o objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel do óxido nítrico em vasos arteriais de ambos os peixes Girella laevifrons e Isacia conceptionis. Nós estudamos os vasos aferente, branquial (ABA), eferente branquial (ABE), dorsal (DA) e mesentérica (MA), que foram dissecadas de seis espécimes juvenis. Estudos de tensão isométrica foram realizados utilizando as curvas de dose-resposta (DRC) para Ach (1013 a 103M) e bloqueio com L-NAME (105 M), e na DRC para o nitroprussiato de sódio (SNP, doador do NO). L- NAME produziu uma atenuação da resposta contrátil nas artérias dorsais, aferentes e eferentes branquial e uma potenciação da contração no MA. SNP causaram 70% da dilatação da artéria mesentérica e 40% na artéria dorsal. Nossos resultados sugerem que Ach promove dilatação precária em MA mediada por NO; dados que é suportada pela utlilização de nitroprussiato de sódio. Em contraste, nos vasos de DA, ABA e EBA nossos resultados suportam que a via de Ach-NO-relaxamento está ausente em ambas as espécies.(AU)

Efeito de diferentes formas de cultivo na ação do óxido nítrico na maturação e na integridade da membrana plasmática de complexos cumulus-oócito em bovinos / Influence of different forms of culture on the nitric oxide action on maturation and membrane integrity on bovine cumulus-oocyte complex

O objetivo do presente estudo foi avaliar se diferentes formas de cultivo interferem no efeito do óxido nítrico (NO)sobre a maturação e a integridade da membrana plasmática do complexo cumulus-oócito de bovinos. Para tanto,realizou-se cultivo em gotas sob óleo mineral ou em placas de quatro poços com a adição de diferentes concentraçõesde nitroprussiato de sódio (SNP, doador de óxido nítrico). Não foi observada diferença (P > 0,05) entre as formas decultivo quando se avaliou a integridade de membrana plasmática e a expansão das células do cumulus (CC). Contudo,os oócitos dos grupos controle e os cultivados na presença de 10-3 M de SNP, ambos cultivados em placa, apresentarammaior porcentagem de membrana íntegra do que os mesmos tratamentos cultivados em óleo mineral (P < 0,05).Observou-se que a adição de 10-3 M de SNP diminuiu o grau de expansão das CC e de integridade da membranaplasmática dos oócitos, tanto no cultivo em gota sob óleo quanto em placa, diferindo dos outros grupos (P < 0,05).Semelhante à expansão, a forma de cultivo não interferiu na extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo que a adiçãode 10-3 M de SNP inibiu a extrusão em ambos os sistemas (P < 0,05). Houve um efeito dose-resposta na concentraçãode NO no meio de maturação em ambos os tipos de cultivo (P < 0,05), sendo que esta foi maior no meio de cultivo sobóleo, exceção feita quando se adicionou 10-3 M de SNP, tratamento no qual não houve diferença nos tipos de cultivoempregados. Estes dados mostram que o sistema de cultivo não interferiu na ação do NO na maturação in vitro de COCbovinos, mas interfere na integridade da membrana plasmática do oócito.(AU)

The aim of the present study was to evaluate the influence of different forms of in vitro culture on the nitric oxide actionin maturation and membrane integrity on bovine cumulus-oocyte complex. No significant effect was observed betweendifferent forms of culture (mineral oil vs plate; P > 0.05), as much for membrane integrity as for expansion of the CC.However, it was observed that oocytes of the groups control and 10-3 M of SNP, cultivated in plate, had presented greaterpercentage of cell with maintenance of membrane integrity than same treatments cultivated in drop. The addition of10-3 M of SNP showed an inhibitory effect on the expansion and membrane integrity of CC and oocytes in both, culturein drops under oil and plate (P < 0.05). The culture form did not intervene with the extrusion of the first polar corpuscleand the addition of 10-3 M of SNP inhibited this extrusion in the both systems (P < 0.05). There was a dose-responseeffect on the concentration of NO in the maturation medium in both types of cultivation (P < 0,05), and this was higherin the culture medium under oil, except when added 10-3 M of SNP, treatment in which there was no difference in thetypes of cultivation employed. (P<0.05). These data demonstrate that the culture system did not intervene with theaction of the NO in the maturation in vitro of bovine COC, but intervened with the integrity of the plasmatic membrane of the oocyte.(AU)

Efeito da inibição da óxido nítrico sintase induzível na capacitação in vitro de espermatozoides bovinos / Effect of inhibition of inducible nitric oxide synthase on in vitro capacitation of bovine spermatozoa

Avaliaram-se o papel do óxido nítrico (NO) por meio da inibição da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), após a adição da aminoguanidina (AG), na motilidade, no vigor e na integridade da membrana plasmática nos tempos de 15, 60, 120, 180, 240 e 300min e a atividade mitocondrial e a capacitação de espermatozoides bovinos após 300min de cultivo. Adicionaram-se diferentes concentrações (0,001, 0,01 e 0,1M) de AG durante a capacitação induzida pela heparina e 500μM de nitroprussiato de sódio (SNP, doador de NO) à concentração deletéria. A adição de 0,1M de AG diminuiu a motilidade e o vigor espermático e a integridade da membrana (P<0,05). A adição de SNP ao meio de cultivo com 0,1M de AG somente reverteu a integridade da membrana após 300min. A inibição da síntese de NO pela adição de AG não alterou a atividade mitocondrial. A percentagem de oócitos penetrados com espermatozoides tratados com 0,01 e 0,1M de AG diminuiu 20,3 e 100 por cento, respectivamente, em relação aos não tratados (controle) (P<0,05), contudo houve aumento de 15 por cento na percentagem de oócitos desnudados penetrados com espermatozoides capacitados em presença de 0,1M de AG. Conclui-se que a inibição da síntese de NO pela AG diminuiu a qualidade espermática durante a capacitação de espermatozoides bovinos in vitro, exceto a atividade mitocondrial. Somente a integridade da membrana foi revertida após adição de NO, sugerindo diferentes vias de ação do NO na qualidade espermática ao longo da capacitação in vitro de espermatozoides bovinos.(AU)

The role of nitric oxide (NO) was evaluated by inhibition of inducible nitric oxide synthase (iNOS), with aminoguanidine (AG) on motility, vigor, and plasmatic membrane integrity of bovine spermatozoa culture after 15, 60, 120, 180, 240, and 300min and on mitochondrial activity and capacitation after 300min, respectively. Different concentrations, 0.001, 0.01, and 0.1M of AG were added during the heparin induced capacitation and sodium nitroprusside (SNP, NO donor-500μM) to the deleterious concentration. The addition of 0.1M of AG diminished progressive motility, spermatic vigor, and membrane integrity (P<0.05). SNP addition to the 0.1M of AG did revert only plasmatic membrane integrity after 300min. Mitochondrial activity was not influenced by addition of AG. Percentage of penetrated oocytes after addition of 0.01 and 0.1M of AG diminished, 20.3 and 100 percent, respectively, in relation to the control oocytes (P<0.05). However, an increase of 15 percent was observed when denuded oocytes were used with 0.1M AG treated sperm (P<0.05). It was concluded that the inhibition of NO synthesis with aminoguanidine diminished sperm quality during in vitro capacitation of bovine spermatozoa, except the mitochondrial activity. Only membrane integrity was reverted with the addition of NO to culture medium, suggesting different pathways of NO action on bovine sperm quality during in vitro capacitation.(AU)

NO- induced neuromuscular facilitation in the phrenic nerve diaphragm preparation of rats is Ca++ dependent - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528 / O efeito facilitatório do óxido nítrico sobre a transmissão neuromuscular de preparações nervo frênico- diafragma isolado de ratos é Ca++ dependente - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528

The research was carried out to verify whether the neuromuscular effects induced by nitric oxide (NO) might depend on extracellular level of Ca++. The donor of NO, sodium nitroprusside (SNP), and the analogue of cGMP, 8-Br-cGMP, increased the muscular contraction amplitude (MCA) in preparations indirectly stimulated at 0.2 Hz, but did not produce any effect when the nutrient solution was exchanged by Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. SNP and 8-Br-cGMP reduced the MCA in preparations directly stimulated. Such effect was not recorded in Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. Data suggest that the neuromuscular effects induced by NO or cGMP depend on extracellular level of Ca++

A pesquisa foi conduzida para verificar se os efeitos neuromusculares induzidos por óxido nítrico (NO) poderiam depender dos níveis extracelulares de Ca++. O doador de NO, nitroprussiato de sódio (NPS), e o análogo de GMPc, 8-Br-cGMP, aumentaram a amplitude das contrações musculares (ACM) em preparações indiretamente estimuladas a 0.2 Hz, mas não produziram efeitos quando a solução nutriente (Krebs normal) foi trocada por Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. NPS e 8-Br-cGMP reduziram a ACM quando as preparações foram diretamente estimuladas, mas tal efeito não foi observado com o uso de Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. Dados sugerem que os efeitos neuromusculares induzidos por NO dependem dos níveis extracelulares de Ca++

Dinâmica do nitroprussiato de sódio sobre a pressão arterial, pressão venosa e parâmetros eletrocardigráficos de cães saudáveis / Dynamics of sodium nitroprusside on the arterial pressure, venous pressure, and electrocardiographic parameters in healthy dogs

Embora inúmeras opções terapêuticas para o manejo da hipertensão encontra-se disponíveis, a rápida redução da pressão arterial é altamente desejável na crise hipertensiva. Por ser um potente vasodilatador e, assim, representar uma alternativa para o manejo agudo da crise hipertensiva, existe grande variação nas recomendações vigentes para uso do nitroprussiato de sódio. Dessa forma, este estudo teve como objetivo avaliar as variações nas pressões arteriais e venosa, bem como as alterações no traçado eletrocardiográfico verificadas durante a infusão de doses variadas de tal fármaco. Constatou-se redução das pressões, ainda que de maneira pouco acentuada, assim como ausência de alterações das pressões importantes nas variáveis extraídas do traçado eletrocardiográfico. Aventou-se a possibilidade da elevação BA freqüência cardíaca ter mascarado o efeito hipotemsor do fármaco, especialmente ao se empregar as maiores taxas de infusão

Although several therapeutic options are available for the management of hypertension, a rapid reduction in arterial blood pressure is highly wanted during the hypertensive crisis. Because of its potent vasodilatative effect, thus representing an alternative for the acute control of the hypertensive crisis, there is a large variation in the current recommendations regarding the dose of sodium nitroprusside. Therefore, this study was aimed t evaluating the variations of arterial oressure and venous pressure, as well as the alterations in the electrocardiogram promoted by the infusion of varyng doses of that drug. Although not so sharp, a reduction in blood pressure was observed. Also, no important changes were seen in the electricardiographic tracings. The increase in heart rate was believed to have overcome the hypotensive effect of the drug especially ehen higher doses of nitroprusside were infused

Dinâmica do nitroprussiato de sódio sobre a pressão arterial, pressão venosa e parâmetros eletrocardigráficos de cães saudáveis / Dynamics of sodium nitroprusside on the arterial pressure, venous pressure, and electrocardiographic parameters in healthy dogs

Embora inúmeras opções terapêuticas para o manejo da hipertensão encontra-se disponíveis, a rápida redução da pressão arterial é altamente desejável na crise hipertensiva. Por ser um potente vasodilatador e, assim, representar uma alternativa para o manejo agudo da crise hipertensiva, existe grande variação nas recomendações vigentes para uso do nitroprussiato de sódio. Dessa forma, este estudo teve como objetivo avaliar as variações nas pressões arteriais e venosa, bem como as alterações no traçado eletrocardiográfico verificadas durante a infusão de doses variadas de tal fármaco. Constatou-se redução das pressões, ainda que de maneira pouco acentuada, assim como ausência de alterações das pressões importantes nas variáveis extraídas do traçado eletrocardiográfico. Aventou-se a possibilidade da elevação BA freqüência cardíaca ter mascarado o efeito hipotemsor do fármaco, especialmente ao se empregar as maiores taxas de infusão(AU)

Although several therapeutic options are available for the management of hypertension, a rapid reduction in arterial blood pressure is highly wanted during the hypertensive crisis. Because of its potent vasodilatative effect, thus representing an alternative for the acute control of the hypertensive crisis, there is a large variation in the current recommendations regarding the dose of sodium nitroprusside. Therefore, this study was aimed t evaluating the variations of arterial oressure and venous pressure, as well as the alterations in the electrocardiogram promoted by the infusion of varyng doses of that drug. Although not so sharp, a reduction in blood pressure was observed. Also, no important changes were seen in the electricardiographic tracings. The increase in heart rate was believed to have overcome the hypotensive effect of the drug especially ehen higher doses of nitroprusside were infused(AU)

NO- induced neuromuscular facilitation in the phrenic nerve diaphragm preparation of rats is Ca++ dependent - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528 / O efeito facilitatório do óxido nítrico sobre a transmissão neuromuscular de preparações nervo frênico- diafragma isolado de ratos é Ca++ dependente - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528

The research was carried out to verify whether the neuromuscular effects induced by nitric oxide (NO) might depend on extracellular level of Ca++. The donor of NO, sodium nitroprusside (SNP), and the analogue of cGMP, 8-Br-cGMP, increased the muscular contraction amplitude (MCA) in preparations indirectly stimulated at 0.2 Hz, but did not produce any effect when the nutrient solution was exchanged by Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. SNP and 8-Br-cGMP reduced the MCA in preparations directly stimulated. Such effect was not recorded in Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. Data suggest that the neuromuscular effects induced by NO or cGMP depend on extracellular level of Ca++

A pesquisa foi conduzida para verificar se os efeitos neuromusculares induzidos por óxido nítrico (NO) poderiam depender dos níveis extracelulares de Ca++. O doador de NO, nitroprussiato de sódio (NPS), e o análogo de GMPc, 8-Br-cGMP, aumentaram a amplitude das contrações musculares (ACM) em preparações indiretamente estimuladas a 0.2 Hz, mas não produziram efeitos quando a solução nutriente (Krebs normal) foi trocada por Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. NPS e 8-Br-cGMP reduziram a ACM quando as preparações foram diretamente estimuladas, mas tal efeito não foi observado com o uso de Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. Dados sugerem que os efeitos neuromusculares induzidos por NO dependem dos níveis extracelulares de Ca++

NO- induced neuromuscular facilitation in the phrenic nerve diaphragm preparation of rats is Ca++ dependent - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528 / O efeito facilitatório do óxido nítrico sobre a transmissão neuromuscular de preparações nervo frênico- diafragma isolado de ratos é Ca++ dependente - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1528

The research was carried out to verify whether the neuromuscular effects induced by nitric oxide (NO) might depend on extracellular level of Ca++. The donor of NO, sodium nitroprusside (SNP), and the analogue of cGMP, 8-Br-cGMP, increased the muscular contraction amplitude (MCA) in preparations indirectly stimulated at 0.2 Hz, but did not produce any effect when the nutrient solution was exchanged by Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. SNP and 8-Br-cGMP reduced the MCA in preparations directly stimulated. Such effect was not recorded in Krebs buffer low Ca++/ high Mg++. Data suggest that the neuromuscular effects induced by NO or cGMP depend on extracellular level of Ca++

A pesquisa foi conduzida para verificar se os efeitos neuromusculares induzidos por óxido nítrico (NO) poderiam depender dos níveis extracelulares de Ca++. O doador de NO, nitroprussiato de sódio (NPS), e o análogo de GMPc, 8-Br-cGMP, aumentaram a amplitude das contrações musculares (ACM) em preparações indiretamente estimuladas a 0.2 Hz, mas não produziram efeitos quando a solução nutriente (Krebs normal) foi trocada por Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. NPS e 8-Br-cGMP reduziram a ACM quando as preparações foram diretamente estimuladas, mas tal efeito não foi observado com o uso de Krebs com baixo Ca++/ alto Mg++. Dados sugerem que os efeitos neuromusculares induzidos por NO dependem dos níveis extracelulares de Ca++

Influência da pentoxifilina no desenvolvimento testicular neonatal e no processo espermatogênico de ratos wistar adultos

Objetivou-se estudar a influência da pentoxifilina no desenvolvimento testicular durante o período neonatal e no processo espermatogênico de ratos Wistar adultos. Foram utilizados 37 ratos neonatos Wistar, os quais foram submetidos aos diversos tratamentos, durante os primeiros 21 dias de vida, de acordo com o grupo experimental: controle (n=10), 1mg/kg (n=10), 5mg/kg (n=9) e 10mg/kg (n=8) de pentoxifilina. Para o segundo experimento, foram utilizados 39 ratos Wistar adultos, os quais foram submetidos aos diversos tratamentos, entre 90 e 150 dias de vida, de acordo com o grupo experimental: controle (n=9), 15mg/kg (n=10), 30mg/kg (n=10) e 60mg/kg (n=10) de pentoxifilina. A pesagem dos animais foi realizada diariamente, nos grupos controle e tratados de cada experimento. Para a realização das análises histológicas e histométricas, os ratos de cada experimento foram submetidos à heparinização e anestesia e, posteriormente, submetidos à perfusão intracardíaca com solução fisiológica de NaCl a 0,9%, acrescida de heparina sódica e nitroprussiato. Após a lavagem do sistema vascular, os animais foram perfundidos com solução fixadora de glutaraldeído a 4%, em tampão fosfato de sódio, pH 7,2 e 0,01M. Posteriormente, os testículos, epidídimos e vesícula seminal foram removidos e pesados. Os testículos foram seccionados em fragmentos de 2mm e refixados na mesma solução de perfusão. Para os estudos ao microscópio de luz, os fragmentos foram processados rotineiramente para inclusão em resina plástica à base de glicol metacrilato. Cortes histológicos de 4 ?m de espessura foram corados em azul de toluidina/borato de sódio a 1% e analisados. Em relação ao primeiro experimento, o peso testicular dos animais tratados com 5mg/kg foi maior 13,3% do que o observado nos animais tratados com a maior dose. O número de células de Sertoli por secção transversal sofreu redução significativa nos grupos tratados com 5mg/kg e 10mg/kg em relação aos grupos controle e tratado com 1mg/kg. O índice de célula de Sertoli (ICS) aumentou significativamente nos animais tratados com 5mg/kg em comparação ao grupo controle. Em se tratando do segundo experimento, as maiores doses de pentoxifilina promoveram redução no volume do parênquima testicular alocado no lume dos túbulos seminíferos e aumentaram a túnica própria destes túbulos. A volumetria das células de Leydig aumentou nos grupos tratados com as doses de 30 e 60mg/kg de pentoxifilina quando comparada com os animais tratados com a menor dose. Conclui-se que a utilização da pentoxifilina durante o período crítico do desenvolvimento testicular neonatal em ratos Wistar não foi capaz de induzir aumento na população das células de Sertoli, assim como a utilização da pentoxifilina durante 60 dias em ratos Wistar adultos não foi capaz de aumentar o rendimento intrínseco da espermatogênese e produção espermática

Efeito da adição de óxido nítrico na maturação in vitro de oócitos bovinos

O óxido nítrico (NO) é um radical livre altamente reativo, que está envolvido na sinalização intra e intercelular de várias etapas da reprodução. O objetivo do presente estudo foi de avaliar o efeito da adição de nitroprussiato de sódio (SNP), um doador de NO, na maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Ovários de vacas mestiças cíclicas foram obtidos em matadouros da região. Os complexos cumulus-oócito (COCs) foram aspirados de folículos com 3 a 5 mm. Os COCs foram classificados de acordo com a transparência, número das camadas de células e aspecto compacto do cumulus. Concentrações crescentes de SNP foram adicionadas ao meio de maturação (10-9,10-7, 10-5, 10-3 M de SNP). A maturação nuclear foi avaliada pela coloração com orceína acética a 2% e a maturação citoplasmática, pela observação da migração dos grânulos corticais (coloração com FITC-lectina) e pela taxa de desenvolvimento embrionário in vitro. Foi realizada análise de variância e as máedias foram comparadas pelo teste t a 5% de probabilidade. Concentrações baixas de SNP (10-7 e 10-9 M) não tiveram efeito significativo na maturação nuclear, contudo, quando foi adicionada concentração alta de SNP (10-3 M) no meio, ocorreu retardo/inibição da maturação nuclear (P<0,05), onde os oócitos permaneceram em metáfase I (MI) após 24 h de cultivo. Para se avaliar se este efeito era reversível e se havia ocorrido um retardo ou inibição da progressão de MI para MII, oócitos foram maturados em presença de 10-3 M de SNP por 48 h com mudança de meio (sem SNP) ou não. Foi observado que mesmo após 48h, os oócitos permaneceram em MI quando se mudou o meio as 24 h sem SNP ou não. Foi realizada a cinética da maturação nuclear para se avaliar se houve ou não retardo na progressão da meiose com a cencentração de 10-3 M de SNP. Observou-se que esta concentração retardou o rompimento da vesícula germinativa às 8 h de cultivo (P<0,05) e as 12 h., não houve diferença significativa entre o controle e o tratamento. Os oócitos tratados com as concentrações que não apresentaram alteração na maturação nuclear, foram avaliados quanto a maturação citoplasmática. A concentração 10-5 M melhorou a percentagem de migração total dos grânulos corticais (P<0,05), mas não teve efeito significativo na percentagem de clivagem e produção de blastocistos. Estes resultados mostram que o óxido nítrico pode ter tanto um efeito inibitório quanto estimulatório na maturação de oócitos bovinos in vitro, dependendo da sua concentração

Efeito do óxido nítrico na proliferação celular e esteirodogênese das células da granulosa antrais em bovinos em meio de cultura quimicamente definido

O óxido nítrico (NO), um radical livre altamente reativo, sintetizado a partir da L-arginina em L-citrulina e NO, e vem sendo demonstrado com inibidor da síntese de esteróides e apoptose das células da granulosa (CGS) luteinizadas de bovinos. O presente experimento utilizou o sistema de cultivo quimicamente definido constituído de DMEM/Ham`s F12 com hepes, bicarbonato, insulina, transferrina, selenito de sódio e PVA no qual as CGs foram cultivadas com e sem FSH (experimento I) e livres de hemácias e macrófagos. O experimento I teve como objetivo padronizar a cultura e utilizar o modelo de cultivo que permitisse maior síntese de esteróides e nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) ao longo do tempo. As CGs antrais de folículos pequenos de 3-5 mm foram puncionadas e centrifugadas. Posteriormente, as CGs foram tratadas com cloreto de amônio para retirada de hemácias e cultivadas por 2 horas para retiradas de macrófagos. Em seguida, 5 x 105 células/ml foram semeadas em placas de 24 poços por 24, 48, 72, 96 e 120 horas. No final de cada período de cultura, a viabilidade celular foi mensurada pela habilidade das células vivas reduzirem o sal tetrazolium 3-?4,5-dimetiltrazol-2yl?-2,5 -brometo de difeniltetrazolium em azul de formazan (MTT). Enquanto, as amostras de CGs foram coletadas para análise do ciclo celular por citometria de fluxo e do meio de cultivo, para mensuração das concentrações de 17?-estradiol (E2) e progesterona (P4) por quimiluminescência e de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelo método Griess. O sistema de cultivo aumentou (P<0,05) a síntese de esteróides ao longo do tempo e manteve as características morfológicas das CGs esteroidogênicamente ativas. O FSH aumentou (P<0,05) a proliferação no final de 48 horas a viabilidade celular no final de 72 horas a viabilidade celular, que foi mantida até 120 horas de cultivo não diferindo (P>0,05) do controle. As CGs mantiveram características morfológicas de células esteroidogênica condizentes com a literatura. O FSH estimulou a síntese de 17 ? estradiol (E2) no final de 24 horas cultivo comparado ao controle, e posteriormente diminuiu e permaneceu menor que a síntese de E2 pelas CGs cultivadas sem FSH durante todo o período de cultivo. Não houve variação na síntese de progesterona (P4) pelas CGs cultivadas com FSH ao longo do tempo. Além disso, a síntese de P4 estimulada pelo FSH foi menor no final dos períodos de 72 e 96 horas em relação ao controle. A síntese de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelas CGs não variou sem e com FSH ao longo do tempo entre e não houve diferença na síntese de (NO3-/NO2-) pelo FSH comparado ao controle. Tendo em vista que o sistema de cultivo sem FSH, somente com insulina manteve a síntese de esteróides até o final do cultivo sem variação na síntese NO3-/NO2-. Este sistema foi utilizado para os experimentos II e III. No experimento II o mesmo procedimento foi adotado para CGs, desde a obtenção das CGs até o cultivo, obtenção das amostras de meio e CGs e análises das mesmas. O experimento II objetivou verificar o efeito do nitroprussíato de sódio (SNP) nas concentrações 10-9, 10-7 e 10-5 M na viabilidade, apoptose e esteroidogênse das CGs. A viabilidade celular aumentou (P<0,05) no final de 120 horas de cultivo para todos os tratamentos com SNP em relação ao controle. Todas as concentrações de SNP aumentaram a % de células da granulosa na fase S e G2 do ciclo celular com 48 e 72 horas de cultivo comparado ao controle. A síntese de E2 foi estimulada (P<0,05), enquanto, a de P4