Ozonioterapia no tratamento auxiliar de éguas inférteis: Potencial angiogênico e antimicrobiano / Ozone therapy in the supporting treatment of infertile mares: Angiogenic and antimicrobial actions

A endometrite infecciosa é considerada uma das principais causas de infertilidade em éguas. Por sua vez, alterações degenerativas endometriais interferem diretamente na hemodinâmica uterina, podendo comprometer a fertilização e a manutenção da gestação. Por serem poderosos agentes oxidantes nãoespecíficos, o gás ozônio (O3) e os óleos vegetais ozonizados tem sido utilizados como alternativas às terapias antimicrobianas convencionais. Além de apresentar ação germicida frente a forma livre de fungos e bactérias, a ozonioterapia possui marcante potencial antibiofilme. Adicionalmente, o preenchimento da cavidade uterina de éguas com gás O3 estimula a angiogênese local sem apresentar efeitos deletérios ao endométrio. Dessa forma, os potencias antimicrobianos e angiogênicos fazem da ozonioterapia uma promissora alterativa para o tratamento adjuvante de endometrites crônicas em éguas.

Infectious endometritis is considered one of the main causes of infertility in mares. Similarly, endometrial degenerative changes directly affect the uterine hemodynamics, compromising the fertilization and the maintenance of pregnancy. Based on their powerful non-specific oxidizing action, ozone (O3) and ozonized vegetable oils have been used as alternatives to conventional antimicrobial therapies. In addition to the germicidal effect against the free-living cells of fungi and bacteria, O3 therapy has showed unspecific anti-biofilm potential. Additionally, the insufflation of the uterine cavity of mares with O3 stimulates local angiogenesis without inducing deleterious effects on the endometrium. Therefore, the antimicrobial and angiogenic potentials make O3 therapy a promising alternative for the adjuvant treatment of persistent endometritis in mares.

Uterine nitric oxide levels and isofluopredone treatment effect in mares susceptible to persistent post-breeding endometritis

Transient endometritis is a normal consequence of breeding and results from uterine contamination with both semen and bacteria. The modulation of the inflammatory response with the use of isoflupredone has been proposed as efficient for the treatment of endometritis by increasing pregnancy rates. The aim of the current study was to determine the effects of isoflupredone on nitric oxide (NO) levels in uterine samples from mares susceptible to persistent postbreeding endometritis, presenting or not the infectious process. Seven consecutive estrous cycles were induced in 11 mares, being the first one used as control (no treatment). All mares were submitted to the following four treatments: treatment 1: control, treatment 2: glucocorticoid (GC) treatment (20 mg isoflupredone acetate) every 12 h, for three consecutive days, treatment 3: infected treatment (intrauterine infusion of 1x109 CFU/ml Streptococcus equi subsp. zooepidemicus), treatment 4: combination of GC + infected treatment (infusion of bacteria 24 h after the first GC treatment). At 12 h after the end of each treatment, uterine samples were collected by flushing and NO was determined. After nitrate reduction, total nitrite was determined by spectrophotometer. No significant differences on nitric oxide concentration were verified by analysis of variance in the different experimental groups. It is concluded that the use of isoflupredone did not alter the nitric oxide concentration in uterine flushing’s from susceptible mares 12 h after treatment.

Uterine nitric oxide levels and isofluopredone treatment effect in mares susceptible to persistent post-breeding endometritis

Transient endometritis is a normal consequence of breeding and results from uterine contamination with both semen and bacteria. The modulation of the inflammatory response with the use of isoflupredone has been proposed as efficient for the treatment of endometritis by increasing pregnancy rates. The aim of the current study was to determine the effects of isoflupredone on nitric oxide (NO) levels in uterine samples from mares susceptible to persistent postbreeding endometritis, presenting or not the infectious process. Seven consecutive estrous cycles were induced in 11 mares, being the first one used as control (no treatment). All mares were submitted to the following four treatments: treatment 1: control, treatment 2: glucocorticoid (GC) treatment (20 mg isoflupredone acetate) every 12 h, for three consecutive days, treatment 3: infected treatment (intrauterine infusion of 1x109 CFU/ml Streptococcus equi subsp. zooepidemicus), treatment 4: combination of GC + infected treatment (infusion of bacteria 24 h after the first GC treatment). At 12 h after the end of each treatment, uterine samples were collected by flushing and NO was determined. After nitrate reduction, total nitrite was determined by spectrophotometer. No significant differences on nitric oxide concentration were verified by analysis of variance in the different experimental groups. It is concluded that the use of isoflupredone did not alter the nitric oxide concentration in uterine flushings from susceptible mares 12 h after treatment.(AU)

Modulação da resposta inflamatória no útero de éguas tratadas com plasma rico em plaquetas

A endometrite é a causa mais comum de subfertilidade em éguas. Todas as éguas apresentam uma inflamação endometrial fisiológica pós-cobertura; entretanto, 15-20% das éguas têm endometrite persistente pós-cobertura (EPPC). Recentemente, o plasma rico em plaquetas (PRP) vêm se tornando popular no manejo reprodutivo de éguas susceptíveis a EPPC. Atualmente, não existe uma padronização dos métodos de preparação do PRP para uso intrauterino em éguas. Desta forma, este estudo teve como objetivo comparar três métodos de preparação de PRP para infusão intrauterina em éguas e avaliar a resposta inflamatória pós-cobertura, cultura endometrial e recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC tratadas com PRP. No primeiro estudo, o PRP foi produzido por três métodos. Método 1, o sangue foi coletado em bolsa de transfusão, transferido para tubos Falcon e duplamente centrifugadas; Método 2, sangue foi coletado em tubos vacutainer e centrifugado uma única vez; Método 3 sangue foi coletado em uma seringa de 60 mL contendo anticoagulante, a qual foi mantida em posição vertical para sedimentar por 4h. Após o processamento, a contagem de células e a viabilidade plaquetária foram avaliadas. Em um subgrupo de éguas (n = 6), o PRP foi avaliado 6 e 24h pós-refrigeração a 5 °C. No estudo 2, éguas (n = 12) suscetíveis a EPPC tiveram três ciclos atribuídos aleatoriamente para receber infusões intrauterinas de LRS (controle), ou PRP autólogo ou plasma pobre em plaquetas (PPP) antes (48 e 24h) e após a inseminação artificial (IA) (6 e 24h). Tanto o PRP quanto o PPP foram obtidos pelo Método 1 no experimento 2. As éguas foram inseminadas com sêmen fresco de um garanhão com fertilidade conhecida. O acúmulo de líquido intrauterino (IUF) e as células polimorfonucleares endometriais (PMNs) foram avaliados a cada 24h até 96h pós-inseminação. Citocinas uterinas (Il, IL6, CXCL8 e IL10) foram avaliadas antes (0h), 6 e 24h após IA, e cultura endometrial três e nove dias após IA. A lavagem do embrião foi realizada 8 dias após a ovulação. Os dados foram analisados com modelo misto, teste post-hoc de Tukeys e regressão multivariada. No estudo 1, o Método 1 resultou no maior e o método 3 nas menores concentrações de plaquetas, e o último teve maior concentração de leucócitos que os outros (P<0,05). A viabilidade das plaquetas foi semelhante entre os tratamentos. O resfriamento por 24h não afetou a contagem de plaquetas. No entanto, a viabilidade plaquetária foi reduzida após o resfriamento do PRP produzido pelo método 3. Estudo 2, o tratamento com PRP reduziu os PMNs endometriais, IUF pós-reprodução e citocinas pró-inflamatórias quando comparados aos ciclos atribuídos pelo controle, mas não significativamente diferente do PPP. Os controles tiveram uma porcentagem significativamente maior de culturas bacterianas positivas (33%) em comparação com os ciclos atribuídos a PRP (0%), enquanto os ciclos tratados com PPP não foram significativamente diferentes dos outros grupos (25%). Os ciclos atribuídos ao PRP tiveram taxas de recuperação embrionária significativamente maiores (83%) do que o controle (33%), embora não significativamente diferente do PPP (60%). Em conclusão, o Método 1 resultou nas maiores concentrações de plaquetas, enquanto o método 3 resultou em maiores contagens de leucócitos. O resfriamento afetou a viabilidade das plaquetas no PRP obtido com o método 3. Resta determinar se os diferentes métodos e o resfriamento afetariam a eficácia clínica do PRP. A infusão de plasma reduziu a duração e intensidade da resposta inflamatória pós-IA e melhorou a recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC. As plaquetas parecem ter uma propriedade antimicrobiana e anti-inflamatória dependente da dose

Endometritis is the most common cause of subfertility in mares. All mares display a physiological post-breeding endometrial inflammation; however, 15-20% of mares have persistent breeding-induced endometritis (PBIE). Recently, platelet-rich plasma (PRP) is becoming popular in mare practice to mitigate post-breeding induced endometritis and improve fertility. Currently, there is no standardization of methods to prepare PRP for intrauterine use in mares. This study aimed to compare three methods to prepare PRP for intrauterine infusion in mares and to assess the post-breeding inflammatory response, endometrial culture and embryo recovery in mares susceptible to PBIE treated with PRP. In the first study, PRP was produce by three methods. Method 1, blood was collected in blood transfusion bag, transferred to Falcon tubes and double centrifuged; Method 2, blood was collected in vacutainer tubes and centrifuged once; Method 3, blood was collected in a syringe containing anticoagulant, which was kept in an upright-position to sediment for 4h. After processing, cell counts and platelet viability were assessed. In a subset of mares (n=6), PRP was evaluated at 6 and 24h post-cooling at 5°C. In study 2, mares (n=12) susceptible to PBIE had three cycles randomly assigned in a crossover design to receive intrauterine infusions of LRS (control), or autologous PRP or platelet-poor plasma (PPP) pre- (48 and 24h) and post-breeding (6 and 24h). Both PRP and PPP were obtained by Method 1. Mares were bred with fresh semen from one stallion. Intrauterine fluid accumulation (IUF) and endometrial polymorphonuclear cells (PMNs) were assessed every 24h up to 96h post-breeding. Uterine cytokines (Il, IL6, CXCL8 and IL10) were evaluated before (0h), 6 and 24h post-breeding, and endometrial culture three and nine-days after breed. Embryo flushing was performed 8d post-ovulation. Data were analyzed with mixed model, Tukeys post-hoc test, and multivariate regression. In study 1, Method 1 resulted in the greatest and method 3 in the fewest platelet concentrations, and the latter had greater WBC than the others (P<0.05). Platelet viability was similar across treatments. Cooling for 24h did not affect platelet counts. However, platelet viability was reduced after cooling PRP produced by method 3. Study 2, PRP treatment reduced endometrial PMNs, post-breeding IUF and pro-inflammatory cytokines when compared to control-assigned cycles, but not significantly different than PPP. Controls had a significantly higher percentage of positive bacterial cultures (33%) in comparison to PRP-assigned cycles (0%), whereas cycles treated with PPP were not significantly different from the other groups (25%). The PRP-assigned cycles had significantly higher embryo recovery rates (83%) than the control (33%), though not significantly different than PPP (60%). In conclusion, Method 1 resulted in the greatest platelet concentrations, while method 3 resulted had greater WBC counts. Cooling affected platelet viability in PRP obtained with method 3. It remains to be determined whether the different methods and cooling would affect PRP's clinical efficacy. Plasma infusion reduced the duration and intensity of the post-breeding inflammatory response and improved embryo recovery in mares susceptible to PBIE. Platelets incrementally downregulate PBIE and appear to have a dose-dependent antimicrobial property.

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA UTILIZAÇÃO DE LAVAGEM UTERINA COM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA OZONIZADA EM ÉGUAS

Diante da prevalência e importância das endometrites nos sistemas de reprodução de equinos, as alternativas para tratamento desta patologia são muito estudadas. Este estudo foi conduzido para avaliar o efeito antiinflamatório da lavagem uterina com solução fisiológica ozonizada no endométrio. Trinta e três éguas com baixo escore reprodutivo foram submetidas aos exames de citologia e histologia endometrial, previamente e três dias após os tratamentos que consistiam em lavagem uterina com solução fisiológica (n=10) como tratamento controle (TC) ou com solução fisiológica ozonizada (n=23) (TO). O grau de inflamação foi determinado pela alteração na contagem de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs). Comparando-se os dados obtidos nos exames de citologia endometrial pré e pós tratamento, não houve diferença entre os tratamentos (p=0,3301), no tratamento TC 50% dos animais apresentaram melhora no quadro e no TO 47,83%. Entretanto, de acordo com a avaliação histológica, constatou-se que as éguas tratadas com solução salina ozonizada obtiveram diminuição (p<0,0001) da contagem média de PMNs (1,16 ±0,45) quando comparadas com as éguas que receberam TC (3,54±1,29). Portanto, esta modalidade de tratamento pode ser utilizada em animais portadores de endometrite clínica e subclínica, e na rotina de doadoras de embrião susceptíveis a endometrite pós cobertura persistente, diminuindo assim o uso de antimicrobianos.

In view of the prevalence and importance of endometritis in equine breeding systems, the alternatives for treating this pathology are widely studied. This study was conducted to evaluate the anti-inflammatory effect of uterine lavage with ozonized saline solution on the endometrium. Thirty-three mares with low reproductive score were submitted to cytology and endometrial histology exams, previously and three days after treatments that consisted of uterine lavage with saline solution (n = 10) as a control treatment (TC) or with ozonized saline solution ( n = 23) (TO). The degree of inflammation was determined by the change in the count of polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Comparing the data obtained in the endometrial cytology exams before and after treatment, there was no difference between treatments (p = 0.3301), in the TC treatment 50% of the animals showed improvement in the condition and in the TO 47.83%. However, according to the histological evaluation, it was found that the mares treated with ozonated saline obtained a decrease (p <0.0001) in the mean PMN count (1.16 ± 0.45) when compared to the mares that received CT (3.54 ± 1.29). In conclusion, this treatment modality can be used in animals with clinical and subclinical endometritis, and in the routine of embryo donors susceptible to persistent mating induced endometritis, decreasing the use of antimicrobials.

EFEITO DA ADIÇÃO DE MEIO CONDICIONADO POR CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NA VIABILIDADE ESPEMÁTICA E RESPOSTA INFLAMATÓRIA UTERINA PÓS INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM EQUINOS

A endometrite persistente pós cobertura (EPPC) é uma das principais causas de infertilidade na égua devido uma inflamação exacerbada uterina pós cobertura/Inseminação Artificial (IA) diminuindo os índices de fertilidade. O uso do meio condicionado por células tronco mesenquimais demonstra grande efetividade na modulação inflamatória, podendo ser uma alternativa no tratamento e EPPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar pela primeira vez diferentes concentrações de meio condicionado (MC) por células tronco mesenquimais equinas sobre a cinética espermática equina e capacidade imunomodulatória do MC na inflamação uterina pós IA em éguas resistentes e susceptíveis assim como sua fertilidade. Foram realizados 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de MC sobre a cinética e integridade espermática equina. No Experimento 2 foi avaliado in vivo a capacidade moduladora do MC sobre o processo inflamatório endometrial de éguas resistentes e susceptíveis após inseminação artificial. O MC alterou o VCL (P<0,05) porém não alterou o restante dos parâmetros da cinética espermática (P>0,05). A integridade de membrana plasmática do sêmen equino não foi alterada (P<0,05). O MC reduziu a porcentagem de células polimorfonucleares (PMN) em éguas resistentes 6 horas após a inseminação artificial (P<0,05). Nas éguas susceptíveis o MC diminuiu as porcentagens de PMN e fluido intrauterino 6 e 24 horas após IA (p<0,05), com incremento na fertilidade; Controle 42,86%, IA-MC 57,14%, PRÉ-MC 85,71% (P>0,05). Conclui-se que o MC equino pode ser utilizado com segurança tanto antes como no momento da inseminação artificial juntamente com o sêmen. Além disso o MC possui efeito positivo na modulação da resposta inflamatória uterina pós IA, sendo o primeiro relato do seu uso para tratamento de EPPC.

Persistent mating-induce endometritis (PMIE) is a major cause of subfertility in the mare due to exacerbated uterine inflammation post breeding, so therapies have been studied to immunomodulate the inflammatory response. The objective of this work was to evaluate different concentrations of conditioned medium (MC) by equine mesenchymal stem cells on equine sperm kinetics and MC immunomodulatory capacity in uterine inflammation after breeding in resistant and susceptible mares as well as their fertility. Two experiments were performed. In experiment 1 the effect of the addition of different MC concentrations on the equine sperm kinetics and integrity was evaluated. In Experiment 2, the modulatory capacity of MC on the endometrial inflammatory process of resistant and susceptible mares after artificial insemination was evaluated, as well as its effect on conception rates. The MC did not significantly alter sperm kinetics and plasma membrane integrity of equine semen. Even in resistant mares MC reduced the percentage of neutrophils 6 hours after artificial insemination (p <0.05), not negatively interfering with fertility. In susceptible mares, MC decreased the percentages of neutrophils and intrauterine fluid 6 and 24 hours after AI (p <0.05). It was concluded that equine MC does not negatively affect the quality of equine semen or its fertility, modulating the inflammatory response after coverage in resistant and susceptible mares.

Uso do ozônio no tratamento da endometritis em éguas: relato de casos / Use of ozone therapy as treatment of endometritis in mares: case report / Utilizacion de ozono en el tratamiento de endometritis en yeguas: reporte de casos

A endometrite persistente é uma das principais causas de subfertilidade nas éguas, interferindo negativamente na reprodução equina. Muitas vezes, a endometrite ocorre como consequência de uma falha nos mecanismos de defesa uterina, gerando problemas na eliminação de antígenos e produtos inflamatórios presentes no ambiente uterino. A ozonioterapia é uma das terapias existentes para o tratamento desta doença, e seu uso tem aumentado em medicina veterinária. O presente estudo avaliou oito éguas em período cíclico, com endometrite persistente. Um tratamento com ozônio intrauterino persistiu por dois dias. A partir dos dados obtidos no presente estudo, a terapia com ozônio parece ser uma técnica efetiva e promissora na reprodução equina, atuando de maneira efetiva em infecções bacterianas uterinas e condições inflamatórias.

Persistent endometritis is one of the major causes of subfertility in mares, negatively interfering with equine reproduction. Many times, endometritis occurs as consequence of a failure in the uterine defense mechanisms, generating problems in the elimination of antigens and inflammatory products present in the uterine environment. Ozone therapy is one of the existing therapies for the treatment of this disease, and its use has increased in veterinary medicine. The present study evaluated eight cycling mares, with persistent endometritis. An intrauterine ozone treatment for two days was chosen. From the data obtained in the present study, ozone therapy appear to be an effective and promising technique in equine reproduction, acting effectively in uterine bacterial infections and inflammatory conditions.

La endometritis persistente es una de las causas principales de la subfertilidad en las yeguas, interfiriendo negativamente con la reproducción equina. Muchas veces, la endometritis ocurre como consecuencia de un fracaso en los mecanismos de defensa uterinos, generando problemas en la eliminación de antígenos y productos inflamatorios presentes en el mediouterino. La ozonoterapia es una de las terapias existentes para el tratamiento de esta enfermedad, y su uso ha aumentado en la medicina veterinaria. El presente estudio evaluó ocho yeguas con el cicloestral normal, con endometritis persistente. Un tratamiento intrauterino con ozono por dos días fue elegido. A partir de los datos obtenidos en el presente estudio, la ozonoterapia parece ser una técnica efectiva y prometedora en la reproducción equina, actuando eficazmente en las infecciones bacterianas uterinas y en las condiciones inflamatorias.

Uso do ozônio no tratamento da endometritis em éguas: relato de casos / Use of ozone therapy as treatment of endometritis in mares: case report / Utilizacion de ozono en el tratamiento de endometritis en yeguas: reporte de casos

A endometrite persistente é uma das principais causas de subfertilidade nas éguas, interferindo negativamente na reprodução equina. Muitas vezes, a endometrite ocorre como consequência de uma falha nos mecanismos de defesa uterina, gerando problemas na eliminação de antígenos e produtos inflamatórios presentes no ambiente uterino. A ozonioterapia é uma das terapias existentes para o tratamento desta doença, e seu uso tem aumentado em medicina veterinária. O presente estudo avaliou oito éguas em período cíclico, com endometrite persistente. Um tratamento com ozônio intrauterino persistiu por dois dias. A partir dos dados obtidos no presente estudo, a terapia com ozônio parece ser uma técnica efetiva e promissora na reprodução equina, atuando de maneira efetiva em infecções bacterianas uterinas e condições inflamatórias.(AU)

Persistent endometritis is one of the major causes of subfertility in mares, negatively interfering with equine reproduction. Many times, endometritis occurs as consequence of a failure in the uterine defense mechanisms, generating problems in the elimination of antigens and inflammatory products present in the uterine environment. Ozone therapy is one of the existing therapies for the treatment of this disease, and its use has increased in veterinary medicine. The present study evaluated eight cycling mares, with persistent endometritis. An intrauterine ozone treatment for two days was chosen. From the data obtained in the present study, ozone therapy appear to be an effective and promising technique in equine reproduction, acting effectively in uterine bacterial infections and inflammatory conditions.(AU)

La endometritis persistente es una de las causas principales de la subfertilidad en las yeguas, interfiriendo negativamente con la reproducción equina. Muchas veces, la endometritis ocurre como consecuencia de un fracaso en los mecanismos de defensa uterinos, generando problemas en la eliminación de antígenos y productos inflamatorios presentes en el mediouterino. La ozonoterapia es una de las terapias existentes para el tratamiento de esta enfermedad, y su uso ha aumentado en la medicina veterinaria. El presente estudio evaluó ocho yeguas con el cicloestral normal, con endometritis persistente. Un tratamiento intrauterino con ozono por dos días fue elegido. A partir de los datos obtenidos en el presente estudio, la ozonoterapia parece ser una técnica efectiva y prometedora en la reproducción equina, actuando eficazmente en las infecciones bacterianas uterinas y en las condiciones inflamatorias.(AU)

NANOCÁPSULAS DE NÚCLEO LIPÍDICO CONTENDO INDOMETACINA ADICIONADAS AO DILUENTE DE SÊMEN EQUINO RESFRIADO

Na cadeia produtiva de equinos, um dos pontos onde mais se investe é o melhoramento genético e a biotecnologia da reprodução. No Brasil, a biotécnica mais utilizada atualmente é a inseminação artificial com sêmen fresco ou resfriado. Em algumas éguas, a presença do sêmen pode causar reação inflamatória além da fisiológica, causando endometrite persistente pós cobertura o que torna o ambiente uterino incompatível com a gestação. Com a adição de algum anti-inflamatório ao diluente, poderia o mesmo ser carreado na inseminação. A indometacina é um potente anti-inflamatório, inibidor não seletivo das COX 1 e 2; a apresentação nanoparticulada de diferentes princípios ativos propicia uma melhor disponibilidade do fármaco, a diminuição das doses e consequentemente dos efeitos adversos. A utilização dessa forma de anti-inflamatório no sêmen pode ser útil em diminuir a endometrite causada pela exposição do endométrio ao sêmen. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da utilização de nanocápsulas de núcleo lipídico com indometacina (IndOHLNC), na motilidade, funcionalidade e integridade de membrana do sêmen equino. O sêmen foi diluído pelo padrão de 50 milhões de espermatozoides por mililitro e as nanocápsulas foram acrescidas na concentração de 0,1% com polaridades neutra e positiva. A viabilidade do produto foi testada quanto à motilidade pelo CASA (computer analysis sistem assay), funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico (HOST) e integridade de membrana por teste de fluorescência. As amostras foram examinadas no momento da coleta e pós 24 horas. O teste ANOVA para uma variável (fator), nas comparações realizadas, em nenhuma situação revelou diferença estatística (=0,05), concluindo-se que o sêmen equino tolera a presença de indometacina nanoencapsulada na proporção utilizada neste estudo.

In the equine productive chain, one of the most invested is the genetic improvement and the biotechnology of reproduction. In Brazil, the most commonly used biotechnology is artificial insemination with fresh or cooled semen. In some mares, the presence of semen may cause inflammatory reaction beyond the physiological, causing persistent post mating endometritis, which makes the uterine environment incompatible with gestation. With the addition of some anti-inflammatory to the diluent, it could be carried at insemination. Indomethacin is a potent anti-inflammatory, nonselective inhibitor of COX 1 and 2; the nanoparticulate presentation of different active principles leads to better drug availability, decreased dosages and consequently adverse effects. The use of this form of anti-inflammatory in semen may be useful in reducing endometritis caused by exposure of the endometrium to semen. This work aimed at the effects of the use of lipid core nanocapsules with Indomethacin (IndOHLNC) on the motility, functionality and membrane integrity of equine semen. Semen was diluted by the standard 50 million spermatozoa (sptz) per milliliter and the nanocapsules were added at a concentration of 0.1% with neutral and positive polarities. The viability of the product was tested for motility by the CASA (computer analysis system assay), membrane functionality by hyposmotic test (HOST) and membrane integrity by fluorescence test. The samples were examined at the time of collection and after 24 hours. The ANOVA test for a variable (factor), in the comparisons made; did not reveal any statistical difference ( = 0.05), and it was concluded that equine semen tolerates the presence of nanoencapsulated indomethacin in the proportion used in this study.

EFEITO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS PRÉ OU PÓS-INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA E ÍNDICE DE FERTILIDADE EM ÉGUAS SUSCEPTÍVEIS A ENDOMETRITE PERSISTENTE PÓS- COBERTURA

A endometrite persistente pós-cobertura (EPPC) é a principal causa de redução da fertilidade nas éguas, causando impactos importantes dentro do mercado do cavalo. Os tratamentos comumente utilizados para EPPC visam apenas minimizar os fatores predisponentes a sua instalação, não atuando diretamente no processo inflamatório. Com o intuito de reduzir a resposta inflamatória, estudos recentes têm demonstrado um aumento da fertilidade de animais acometidos por EPPC, quando se utiliza agentes imunomoduladores. O PRP é modulador da resposta inflamatória que está sendo largamente utilizado na medicina veterinária. Este concentrado de plaquetas contém diversos fatores de crescimento que atuam diretamente nos mediadores inflamatórios, reduzindo o processo e promovendo reparação tecidual. O PRP é benéfico no tratamento de inflamações tendíneas e osteoarticulares, modulando a inflamação e acelerando a regeneração do tecido lesionado. Mais recentemente alguns pesquisadores demonstraram o efeito benéfico do PRP em tratamentos intrauterinos de éguas. Desta forma o presente estudo tem por objetivo revisar os aspectos relacionados a EPPC assim como ao PRP e seu mecanismo de ação.

The persistent breeding-induced endometritis (PBIE) is the main cause of decrease fertility in the horses, thereby causing significant impact in the horses market. The treatments commonly used for PBIE view only minimize the predisposing factors and do not act directly in the inflammatory process. Aiming to reduce the inflammatory response, recent studies have shown an increase in fertility of animals with PBIE when used immunomodulatory agents. A modulator of the inflammatory response that has been largely used in veterinary medicine is the platelet-rich plasma (PRP). This platelet concentrate contains many growth factors which act directly on inflammatory mediators, reducing process and promoting tissue repair. Several studies have shown that PRP is beneficial in the treatment of osteoarticular and tendon inflammations, modulating inflammation and accelerates the regeneration of injured tissue. More recently some researchers have demonstrated the beneficial effect of PRP in intrauterine treatment of mares. Thus, the present study aimed to do a literature review on the aspects related to PBIE, as well as the PRP and its mechanism of action. ¨¨

Efeitos da pentoxifilina sobre a qualidade espermática e hemodinâmica uterina em equinos / Effects of Pentoxifylline on sperm quality and uterine hemodinamics in equine

A resposta inflamatória uterina pós-cobertura ocorre para remoção de espermatozoides e contaminantes; todavia, o atraso em debelar este processo têm sido identificado, em equinos, como a principal causa de endometrite persistente pós-cobertura. A pentoxifilina atua como um inibidor da fosfodiesterase e aumenta as características de motilidade espermática, ainda tem sido relatada sua participação como agente reológico, aumentando o fluxo sanguíneo de tecidos comprometidos, e como agente imunomodulador. O propósito deste estudo foi examinar os efeitos da pentoxifilina adicionada ao diluidor seminal pós-descongelação, sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e integridade de cromatina, bem como sobre a resposta inflamatória uterina após a inseminação artificial de éguas. Dez partidas de sêmen de um único garanhão foram criopreservadas (100x106 espermatozoides/palheta 0,5 mL) em sistema automatizado (TK 3000) e mantidas em botijão criogênico, sendo posteriormente utilizadas para análises laboratoriais e inseminação artificial. [...] A adição de pentoxifilina não exerceu efeito sobre a motilidade progressiva, porém, a pentoxifilina aumentou velocidade de trajeto, velocidade progressiva e velocidade curvilinear quando comparada ao controle. Não houve diferença significativa na porcentagem de células apresentando membrana plasmática intacta, acrossoma intacto e alto potencial mitocondrial (PIAIC). Nenhuma diferença estatística foi encontrada no fluxo sanguíneo uterino de éguas após os tratamentos. Porém, a citologia endometrial demonstrou maior resposta inflamatória em grupos contendo pentoxifilina quando comparado aos controles. Concluiu-se que a pentoxifilina exerce efeito positivo sobre parâmetros de velocidade, mas não influencia as membranas celulares e a cromatina. No entanto, quando as éguas são inseminadas com sêmen contendo pentoxifilina, uma resposta inflamatória mais intensa é observada

The post breeding uterine inflammatory response occurs due to remove spermatozoa and contaminants; however, delayed uterine clearance has been identified, in equines, as the underlying cause of persistent post breeding endometritis. Pentoxifylline acts as a phosphodiesterase inhibitor and increases sperm motion characteristics, and it has been reported to participate as a rheologic agent, improving blood flow to compromised tissues, and as an immunomodulatory agent. The purpose of this study was to examine the effects of pentoxifylline added to the seminal extender after thawing, on sperm motion, plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes and chromatin integrities, as well as the uterine inflammatory response on mares after artificial insemination. Ten batches of a unique stallion were cryopreserved (100x106 spermatozoa/0.5 mL straws), in an automated system (TK 3000) and storaged in cryogenic cylinder for posterior use for laboratory analysis and artificial insemination. [...] Pentoxifylline addition did not exert effect on progressive motility, however, pentoxifylline increased path velocity, progressive velocity and curvilinear velocity when compared to controls. There were no significant differences on the percentage of cells presenting intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). No statistical difference was found on uterine blood flow of mares after treatments. However, endometrial cytology showed a major inflammatory response on groups containing Pentoxifylline when compared to controls. In conclusion, pentoxifylline exerted a positive effect on velocity parameters, but do not influence cellular membranes and chromatin. Furthermore, when mares were inseminated with semen containing pentoxifylline, an intense inflammatory response was observed

Efeitos da pentoxifilina sobre a qualidade espermática e hemodinâmica uterina em equinos / Effects of Pentoxifylline on sperm quality and uterine hemodinamics in equine

A resposta inflamatória uterina pós-cobertura ocorre para remoção de espermatozoides e contaminantes; todavia, o atraso em debelar este processo têm sido identificado, em equinos, como a principal causa de endometrite persistente pós-cobertura. A pentoxifilina atua como um inibidor da fosfodiesterase e aumenta as características de motilidade espermática, ainda tem sido relatada sua participação como agente reológico, aumentando o fluxo sanguíneo de tecidos comprometidos, e como agente imunomodulador. O propósito deste estudo foi examinar os efeitos da pentoxifilina adicionada ao diluidor seminal pós-descongelação, sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e integridade de cromatina, bem como sobre a resposta inflamatória uterina após a inseminação artificial de éguas. Dez partidas de sêmen de um único garanhão foram criopreservadas (100x106 espermatozoides/palheta 0,5 mL) em sistema automatizado (TK 3000) e mantidas em botijão criogênico, sendo posteriormente utilizadas para análises laboratoriais e inseminação artificial. [...] A adição de pentoxifilina não exerceu efeito sobre a motilidade progressiva, porém, a pentoxifilina aumentou velocidade de trajeto, velocidade progressiva e velocidade curvilinear quando comparada ao controle. Não houve diferença significativa na porcentagem de células apresentando membrana plasmática intacta, acrossoma intacto e alto potencial mitocondrial (PIAIC). Nenhuma diferença estatística foi encontrada no fluxo sanguíneo uterino de éguas após os tratamentos. Porém, a citologia endometrial demonstrou maior resposta inflamatória em grupos contendo pentoxifilina quando comparado aos controles. Concluiu-se que a pentoxifilina exerce efeito positivo sobre parâmetros de velocidade, mas não influencia as membranas celulares e a cromatina. No entanto, quando as éguas são inseminadas com sêmen contendo pentoxifilina, uma resposta inflamatória mais intensa é observada(AU)

The post breeding uterine inflammatory response occurs due to remove spermatozoa and contaminants; however, delayed uterine clearance has been identified, in equines, as the underlying cause of persistent post breeding endometritis. Pentoxifylline acts as a phosphodiesterase inhibitor and increases sperm motion characteristics, and it has been reported to participate as a rheologic agent, improving blood flow to compromised tissues, and as an immunomodulatory agent. The purpose of this study was to examine the effects of pentoxifylline added to the seminal extender after thawing, on sperm motion, plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes and chromatin integrities, as well as the uterine inflammatory response on mares after artificial insemination. Ten batches of a unique stallion were cryopreserved (100x106 spermatozoa/0.5 mL straws), in an automated system (TK 3000) and storaged in cryogenic cylinder for posterior use for laboratory analysis and artificial insemination. [...] Pentoxifylline addition did not exert effect on progressive motility, however, pentoxifylline increased path velocity, progressive velocity and curvilinear velocity when compared to controls. There were no significant differences on the percentage of cells presenting intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). No statistical difference was found on uterine blood flow of mares after treatments. However, endometrial cytology showed a major inflammatory response on groups containing Pentoxifylline when compared to controls. In conclusion, pentoxifylline exerted a positive effect on velocity parameters, but do not influence cellular membranes and chromatin. Furthermore, when mares were inseminated with semen containing pentoxifylline, an intense inflammatory response was observed(AU)

Estudo das catelicidinas no plasma seminal de garanhões e das interleucinas na resposta inflamatória pós-iseminação artificial em éguas

A expressão das interleucinas no útero e das catelicidinas no plasma seminal podem ser responsáveis pela magnitude e persistência da resposta inflamatória uterina. Os objetivos desse estudo foram verificar a presença das catelicidinas no plasma seminal e caracterizar a resposta imune uterina pela expressão de interleucinas inflamatórias. O plasma seminal foi obtido por coleta de sêmen de 15 garanhões e submetido ao SDSPAGE e DOT-blotting. As éguas foram submetidas a um ciclo estral sem desafio uterino (T1), com infusão de plasma seminal (T2) e inseminação artificial (T3). Exame ultrassonográfico, citologia exfoliativa uterina e colheita de células para a expressão do RNAm das interleucinas por qPCR foram realizados durante 3 ciclos consecutivos aleatoriamente, 24 (M1), 48 (M2) e 72 horas (M3) após a indução da ovulação. A expressão do RNAm no endométrio das éguas resistentes e susceptíveis foi verificada para as interleucinas IL-1?, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-?. A concentração total de proteínas no plasma seminal dos garanhões variou de 6,3 a 25,6 mg/mL. O SDS-PAGE revelou a existência de 3 bandas protéicas dentro do intervalo de peso molecular previamente citado na literatura para as catelicidinas equinas. Os garanhões avaliados mostraram quantidades de eCATH1 < 339,6ng, eCATH2 < 141,3ng e eCATH3 < 283,4ng. No momento M2 não foi possível diferenciar as éguas resistentes das susceptíveis pela citologia ou ultrassonografia independente da infusão com plasma seminal, inseminação artificial ou da ovulação, mas quando há presença de espermatozoides no útero a resposta inflamatória é mais intensa. Durante o momento M3, as éguas susceptíveis apresentaram maior volume de fluido uterino acumulado em todos os tratamentos com menor capacidade de limpeza uterina. Foi verificada maior expressão do RNAm das interleucinas pró-inflamatórias nas éguas susceptíveis e a expressão do RNAm da interleucina-10 é

In the equine species, uterine interleukin expression and seminal plasma cathelicidins can modulate the magnitude and persistence of the post-breeding inflammatory reaction. The objectives were to verify the presence of cathelicidins in the stallion seminal plasma and characterize the uterine immune response by pro and anti-inflammatory interleukins. Seminal plasma was obtained by semen collection of 15 stallions and submitted to SDS-PAGE and DOT-blotting tests. Three experiments were designed to study interleukin expression during baseline (T1), after seminal plasma infusion (T2) and artificial insemination (T3). Endometrial cytology and cell collection as well as ultrassonographic evaluations were performed to access interleukin mRNA through qPCR during three randomly assigned consecutive estrous cycles, 24 (M1), 48 (M2) and 72 hours (M3) after an ovulation was induced. Endometrial mRNA expression in mares resistant and susceptible to persistent post-breeding endometritis was identified for the following pro-inflammatory cytokines: IL-1?, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-?. Total seminal plasma protein concentrations ranged from 6.3 to 25.6 mg/mL. SDS-PAGE analysis identified the existence of three proteic bands with molecular weight similar to what was previously reported for equine cathelicidins. Evaluated stallions showed values < 339.6 ng for eCATH1, < 141.3 ng for eCATH2 and < 283.4 for eCATH3. At M2, resistant and susceptible mares could not be separated through cytology or ultrassonography, even though the presence of sperm strongly stimulates uterine inflammatory reaction. At M3, susceptible mares showed higher uterine fluid accumulation and lower uterine clearance. Pró-inflammatory mRNA expression was higher in susceptible mares and interleukin-10 mRNA expression was similar between resistant and susceptible mares

Avaliação morfológica-funcional da recuperação do endométrio eqüino através da infusão de neutrófilos imunocompetentes criopreservados baseado em um modelo experimental definido / Morphological and functional recuperation from the equine endometrium through the infusion of frozen immunocompetent neutrophils

A endometrite é uma importante causa de subfertilidade na égua. Infecções uterinas repetidas ou persistentes poderiam levar ao desenvolvimento de fibrose periglandular. Os objetivos deste trabalho foram avaliar se os processos degenerativos do endométrio são influenciados por infecções bacterianas experimentais sucessivas; realizar uma avaliação histopatológica das biópsias endometriais para documentar os efeitos de diferentes tratamentos sobre o endométrio após infecções experimentais. Foram utilizadas vinte éguas resistentes, com histórico reprodutivo desconhecido, e cinco éguas susceptíveis, com histórico de endometrites recorrentes e subfertilidade. As vinte e cinco éguas foram classificadas nos seguintes grupos, de acordo com o grau de endometrite e endometrose: GI (n=4), GIIA (n=10), GIIB (n=8) e GIII (n=3). Após o primeiro exame histopatológico (amostra pré-infecção), as éguas foram sincronizadas com prostaglandina. Na fase estral, as éguas foram infectadas com 1 x 109 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Constatada a presença de sinais clínicos de endometrite, os grupos de éguas foram distribuídos entre cinco diferentes tratamentos: leucócitos frescos, leucócitos congelados, leucócitos lisados, Interleucina-8 (Il-8) e grupo controle.As éguas foram tratadas diariamente, por, no máximo, quatro dias, ou até que o exame bacteriológico não evidenciasse o crescimento de Streptococcus. No quinto dia, as éguas eram submetidas a novo exame histopatológico (amostra pós-infecção) e no sétimo dia, todas as éguas eram tratadas com penicilina, independentemente de terem eliminado a infecção ou não. Sete dias após, as éguas eram novamente submetidas a exame histopatológico e sincronizadaspara realizar uma nova infecção e novo tratamento. As biópsias foram avaliadas quanto à endometrose e endometrite. Não se observaram diferenças significativas entre os graus de endometrose observados antes e no quinto dia após as cinco infecções experimentais. Da mesma forma, não foram observadas variações no grau de endometrose entre as biópsias realizadas antes das infecções, bem como entre as biópsias coletadas no quinto dia após a infecção. Não houve influência dos tratamentos sobre os graus de endometrose durante as 5 infecções experimentais. Entretanto, verificou-se variação significativa entre as diferentes éguas no grau de endometrose das biópsias uterinas coletadas antes e após a infecção experimental. Observou-se, nas éguas resistentes, neutrofilia e eosinofilia significativas nas biópsias do 5º dia pós-infecção, quando comparadas com as biópsias pré-infecção. Nas éguas susceptíveis, somente foi detectada eosinofilia, não se observando aumento do número de neutrófilos. Não houve aumento do número de linfócitos e plasmócitos nas biópsias pós-infecção, quando comparadas às pré- infecção, nas éguas susceptíveis e resistentes. Os tratamentos não influenciaram, nas éguas resistentes e susceptíveis, a migração de neutrófilos no quinto dia, quando comparada com a observada antes da infecção. Conclui-se que infecções experimentais sucessivas durante 13 meses não influenciaram o grau médio de endometrose, apesar da variabilidade ocorrida entre as éguas. Esta variação provavelmente se deva a uma baixa representatividade de uma única amostra de biópsia na avaliação somente do grau de degeneração endometrial. Conclui-se, também, que éguas susceptíveis à endometrite, com presença de Streptococcus no útero, não apresentam neutrofilia cinco dias após a infecção. Provavelmente, o menor tempo de eliminação bacteriana observada nos tratamentos com leucócitos frescos e congelados deva-se a outros fatores que não o efeito quimioatraente leucocitário

Endometritis is an important cause of subfertility in the mare. Repetitive or persistent uterine infections could lead to the development of periglandular fibrosis. The objectives of this study were: - to evaluate if degenerative endometrial diseases are influenced by repetitive experimental bacterial infections; - to determine the effect of different treatments on the endometrium after experimental infections by means of histopathological evaluation of endometrial biopsies. Twenty resistant mares, with unknown reproductive history, and five susceptible mares, with history of recurrent endometritis and subfertility, were used. Mares were classified, according to the degree of endometritis and endometrosis, within the following groups: GI (n=4), GIIA (n=10), GIIB (n=8) and GIII (n=3). Cycles were synchronized with prostaglandin after the first histopathological examination (pre-infection sample). During estrus, mares were infected with 1 x 109 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Twenty four hours after the inoculation, clinical, bacteriological and cytological examinations were performed. When endometritis clinical signs were detected, the groups of mares were distributed into five different treatments: fresh leukocytes, frozen leucocytes, lysed leucocytes, Interleukin-8 (Il-8) and control group. Mares were treated on a daily basis for no more than four days, or until there was no Streptococcus growth in bacteriological examination. On the fifth day, mares were submitted to a new histopathological examination (post-infection sample) and, on the seventh day, all the mares were treated with penicillin, independently of having eliminated infection, or not. Seven days after, mares were submitted to a new histopathological examination and synchronized in order to proceed to a new infection and a new treatment. Biopsies were evaluated for endometritis and endometrosis. Therewas no significant difference regarding the degree of endometrosis before and on the fifth day after the five infections. Similarly, there was no difference regarding the degree of endometrosis among biopsies performed before infections and among biopsies performed on the fifth day after infections. Treatments did not influence the degree of endometrosis during the five experimental infections. Anyway, there was a significant variation between different mares, according to the degree of endometrosis, in biopsies collected before, as well as in biopsies collected after experimental infection. Resistant mares showed significant neutrophilia and eosinophilia in biopsies collected on the fifth day after infection, compared to pre-infection samples. Susceptible mares showed eosinophilia, but no growth in neutrophil number. There was no growth in lymphocyte and plasma cell number in post-infection biopsies, if compared to pre-infection biopsies, either in susceptible, or in resistant mares. In the same way, treatments did not influence neutrophil migration on the fifth day post-infection, if compared to pre-infection, either in susceptible, or in resistant mares. It was concluded that repetitive experimental infections do not influence the average degree of endometrosis, in spite of the variability between mares. This variability is probably due to the low representation of one single biopsy sample in the evaluation of the degree of endometrial degeneration. It was also concluded that susceptible mares showing Streptococcus in uterus do not present with neutrophil growth five days after infection. The shorter time required for bacterial elimination when fresh and frozen leukocytes were used is probably due to other factors than leukocyte chemoattractive effect