Desafios técnicos e biológicos na produção in vitro de embriões de búfalo / Desafíos técnicos y biológicos en la producción in vitro de embriones de búfalo

O elevado número de búfalos, junto com seus atributos produtivos, tem convertido a Amazônia brasileira em uma das regiões mais importantes na produção de animais desta espécie fora da Ásia. O uso de biotecnologias reprodutivas tem permitido importantes avanços no melhoramento genético, no entanto, a resposta dos búfalos às diferentes técnicas de reprodução assistida é variável. Atualmente, a produção in vitro de embriões nesta espécie, embora represente uma técnica com resultados promissores, ainda se depara com desafios relacionados com as particularidades estruturais e metabólicas dos gametas e embriões, assim como com as características morfofisiológicas próprias da reprodução dos búfalos. Conjuntamente, essas características compõem os fatores biológicos e técnicos que majoritariamente reduzem a eficiência dos resultados e que obrigam a adaptação dos sistemas e das metodologias utilizadas ao longo do processo de produção de embriões no laboratório. Nesse sentido, representam os pontos chaves que merecem ser analisados em profundidade na procura de melhorar os resultados e alcançar a maior eficiência da técnica quando aplicada à espécie bubalina.

El elevado número de búfalos, junto con sus atributos productivos, han convertido a la Amazonia brasilera en una de las regiones más importantes para la producción de animales de esta especie fuera del continente asiático. La implementación de biotecnologías reproductivas ha permitido importantes avances en el mejoramiento genético, sin embargo, la respuesta de los búfalos a las diferentes técnicas de reproducción asistida es variable. En la actualidad, la producción in vitro de embriones en esta especie, aun cuando representa una técnica con resultados promisorios, enfrenta desafíos relacionados con las particularidades estructurales y metabólicas de los gametos y embriones, así como, con las características morfofisiológicas propias de la reproducción de los búfalos. Conjuntamente, esas características componen los factores de orden técnico y biológico que en mayor medida reducen la eficiencia de los resultados, y que obligan a la adaptación de los sistemas y las metodologías utilizadas a lo largo de la producción de embriones en el laboratorio, por lo tanto, representan los puntos clave que merecen ser analizados a profundidad, en la búsqueda de mejorar los resultados, y de alcanzar la plena eficiencia de la técnica, cuando se implementa en la especie bufalina.

Maturação Oocitária Em Bovinos: Efeito Dos Ácidos Graxos Poli-Insaturados / Oocyte Maturation In Cattle: The Effect Of Polyunsaturated Fatty Acids / Maturación Oocitaria En Bovinos: Efecto De Los Ácidos Graxos Poliinsaturados

Objetivou-se com a presente revisão descrever os eventos que compõe a maturação de oócitos bovinos, pois esta é uma fase crucial da produção in vitro de embriões (PIVE) e o efeito da adição de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) nos meios de cultivo ou na alimentação de bovinos. Dentre os diversos, o ácido linolênico (C18:3; ômega-3) e linoléico (C18:2; ômega-6) são os mais importantes no contexto reprodutivo. A PIVE é uma biotécnica reprodutiva em que todo o processo ocorre mediante etapas sincrônicas, sendo maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo de embriões in vitro (CIV) e para que todo o processo obtenha sucesso é necessária que haja interação e sincronismo entre as etapas cuja maturação oocitária é uma fase essencial e limitante para a PIVE, visto que é através da maturação nuclear e citoplasmática que ocorre o controle sistêmico de todo potencial de desenvolvimento oocitário e, consequentemente garantia do desenvolvimento embrionário.(AU)

The objective of this review was to describe the events that compose the maturation of bovine oocytes, as this is a crucial phase of in vitro embryo production (IVP) and the effect of the addition of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on culture media or in feed for cattle. Among them, linolenic acid (C18: 3; omega-3) and linoleic acid (C18: 2; omega-6) are the most important in the reproductive context. IVP is a reproductive biotechnology in which the whole process takes place through synchronic stages, being in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and in vitro embryo culture (IVC) and for the whole process to be successful it is necessary that there is interaction and synchronism between the stages whose oocyte maturation is the essential and limiting phase for IVP since it is through nuclear and cytoplasmic maturation that the systemic control of any oocyte development potential occurs and consequently warranty of embryonic development.(AU)

En el presente trabajo se describen los eventos que componen la maduración de ovocitos bovinos, pues esta es una fase crucial de la producción in vitro de embriones (PIVE) y el efecto de la adición de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en los medios de cultivo o En la alimentación de bovinos. Entre los diversos, el ácido linolénico (C18: 3, omega-3) y linoleico (C18: 2, omega-6) son los más importantes en el contexto reproductivo. La PIVE es una biotécnica reproductiva en que todo el proceso ocurre mediante etapas sincrónicas, siendo maduración in vitro (MIV), fertilización in vitro (FIV) y cultivo de embriones in vitro (CIV) y para que todo el proceso obtenga éxito es necesario que haya interacción y sincronismo entre las etapas cuya maduración oocitaria es la fase esencial y limitante para la PIVE, ya que es a través de la maduración nuclear y citoplasmática que ocurre el control sistémico de todo potencial de desarrollo oocitario y por consiguiente, garantía del desarrollo embrionario.(AU)

Maturação Oocitária Em Bovinos: Efeito Dos Ácidos Graxos Poli-Insaturados / Oocyte Maturation In Cattle: The Effect Of Polyunsaturated Fatty Acids / Maturación Oocitaria En Bovinos: Efecto De Los Ácidos Graxos Poliinsaturados

Objetivou-se com a presente revisão descrever os eventos que compõe a maturação de oócitos bovinos, pois esta é uma fase crucial da produção in vitro de embriões (PIVE) e o efeito da adição de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) nos meios de cultivo ou na alimentação de bovinos. Dentre os diversos, o ácido linolênico (C18:3; ômega-3) e linoléico (C18:2; ômega-6) são os mais importantes no contexto reprodutivo. A PIVE é uma biotécnica reprodutiva em que todo o processo ocorre mediante etapas sincrônicas, sendo maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo de embriões in vitro (CIV) e para que todo o processo obtenha sucesso é necessária que haja interação e sincronismo entre as etapas cuja maturação oocitária é uma fase essencial e limitante para a PIVE, visto que é através da maturação nuclear e citoplasmática que ocorre o controle sistêmico de todo potencial de desenvolvimento oocitário e, consequentemente garantia do desenvolvimento embrionário.

The objective of this review was to describe the events that compose the maturation of bovine oocytes, as this is a crucial phase of in vitro embryo production (IVP) and the effect of the addition of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on culture media or in feed for cattle. Among them, linolenic acid (C18: 3; omega-3) and linoleic acid (C18: 2; omega-6) are the most important in the reproductive context. IVP is a reproductive biotechnology in which the whole process takes place through synchronic stages, being in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and in vitro embryo culture (IVC) and for the whole process to be successful it is necessary that there is interaction and synchronism between the stages whose oocyte maturation is the essential and limiting phase for IVP since it is through nuclear and cytoplasmic maturation that the systemic control of any oocyte development potential occurs and consequently warranty of embryonic development.

En el presente trabajo se describen los eventos que componen la maduración de ovocitos bovinos, pues esta es una fase crucial de la producción in vitro de embriones (PIVE) y el efecto de la adición de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en los medios de cultivo o En la alimentación de bovinos. Entre los diversos, el ácido linolénico (C18: 3, omega-3) y linoleico (C18: 2, omega-6) son los más importantes en el contexto reproductivo. La PIVE es una biotécnica reproductiva en que todo el proceso ocurre mediante etapas sincrónicas, siendo maduración in vitro (MIV), fertilización in vitro (FIV) y cultivo de embriones in vitro (CIV) y para que todo el proceso obtenga éxito es necesario que haya interacción y sincronismo entre las etapas cuya maduración oocitaria es la fase esencial y limitante para la PIVE, ya que es a través de la maduración nuclear y citoplasmática que ocurre el control sistémico de todo potencial de desarrollo oocitario y por consiguiente, garantía del desarrollo embrionario.

A substituição do meio TCM pelo meio BARC, suplementado com SFB, BSA ou PVA, para a maturação de oócitos bovinos in vitro, não incrementa a subsequente produção de blastocistos / Replacing TCM with BARC medium supplemented with FCS, BSA or PVA for in vitro oocyte maturation did not support subsequent blastocyst production / Sustitución de TCM por BARC, enriquecido con SFB, BSA o PVA, para la maduración de ovocitos bovinos in vitro no incrementa la producción posterior de blastocistos

O presente trabalho teve como objetivo verificar a influência do meio de cultivo de embriões bovinos "Beltsville Agriculture Research Center" (BARC), suplementado com SFB, BSA e PVA, separadamente, sobre a maturação de oócitos in vitro, evidenciada pela taxa de clivagem e formação de blastocistos em diferentes estágios de desenvolvimento. Três experimentos foram efetuados, de acordo com o seguinte delineamento experimental: exp.1: SFB foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 5 e 10%; exp. 2: BSA foi adicionada ao meio BARC nas concentrações de 0, 4 e 8 mg/mL; exp. 3: PVA foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 0,5 e 1 mg/mL. O meio de cultura TCM 199, acrescido de bicarbonato, piruvato, gentamicina, FSH, LH e SFB, foi utilizado como grupo controle. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas destinadas ao abate comercial, foram selecionados em meio PBS e, a seguir, maturados em meio BARC acrescido de FSH, LH, gentamicina e as respectivas macromoléculas. A seleção espermática foi realizada em gradiente de Percoll, utilizando o meio TALP para a FIV. O cultivo in vitro dos embriões foi em meio SOF modificado; todas as etapas foram realizadas em incubadora a 5% de CO2 em ar, a 38,7 °C, atmosfera úmida. O número de oócitos que clivou e atingiu os estágios de blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido foi registrado, respectivamente, as 72 e 168 horas pós-inseminação. ANOVA e teste t de Bonferroni foram empregados para a análise estatística, com P<0,05 sendo considerado significativo. Maior porcentagem (P<0,05) de oócitos que clivaram foi observada no grupo TCM + SFB do que nos grupos maturados em meio BARC com SFB ou BSA, independentemente da concentração adotada. Contudo, a taxa de fertilização foi similar entre os grupos BARC + PVA com 1 mg/mL (85,7%) e TCM + SFB (90,8%). Diferença significativa (P<0,05) foi constatada entre os grupos para o desenvolvimento de blastocistos, com o grupo TCM + SFB produzindo um maior número de blastocistos, em diferentes estágios (resultados variando de 47,4 a 51,4%) em comparação com os grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) e PVA (5,7 a 10,6%). Concluindo, o meio BARC suplementado com diferentes fontes de macromoléculas não foi eficiente em promover adequada maturação dos oócitos bovinos in vitro, resultando em uma baixa taxa de fertilização e de produção de blastocistos, em comparação com o meio TCM + SFB.

This study was carried out to assess the influence of bovine embryo culture medium Beltsville Agriculture Research Center (BARC), supplemented with FCS, BSA or PVA, on the in vitro oocyte maturation, evidenced by cleavage rate and blastocysts production at different developmental stages. Three experiments were performed, as follows: exp.1: addition of FCS to BARC medium at concentrations of 0, 5 and 10%; exp. 2: addition of BSA to BARC medium at concentrations of 0, 4 and 8 mg/ml; exp. 3: addition of PVA to BARC medium at concentrations of 0, 0.5 and 1.0 mg/ml. TCM 199 supplemented with bicarbonate, pyruvate, gentamicin sulfate, FSH, LH and FCS was used as control group. Oocytes obtained from cow ovaries at slaughterhouse were selected in PBS, and then matured in BARC medium supplemented with FSH, LH and gentamicin sulfate, according to the experimental design. Percoll gradient was used for sperm selection and TALP medium for IVF. In vitro embryo culture was in SOF-m medium; a humidified atmosphere with 5% CO2, in air, at 38.7°C was used for all steps. The number of oocytes reaching blastocyst, expanded blastocyst, and hatched blastocyt stages was recorded, respectively at 72 and 168 h post-insemination. ANOVA and Bonferroni t test were used to determine differences among groups. Differences of P<0.05 were taken as significant. Higher percentage (P<0.05) of cleaved oocytes was observed in group TCM + FCS than for the other groups matured in BARC supplemented with FCS or BSA, regardless the concentration used. However, the cleavage rate was similar between groups BARC plus PVA with 1 mg/ml (85.7%) and TCM + FCS (90.8%). Significant difference was found among groups for the production of blastocysts, with the control group yielding a higher number of blastocysts (results ranging from 47.4 to 51.4%, in comparison with groups using BARC + FCS (4.1 to 19.7%), BSA (1.4 to 5.6%) and PVA (5.7 to 10.6%). In conclusion, BARC medium supplemented with different macromolecules did not promote a beneficial effect on in vitro oocyte maturation, resulting in lower rate of cleavage and blastocyst production when compared with TCM + FCS medium.

El presente trabajo tuvo como objetivo verificar la influencia del medio de cultivo de embriones bovinos "Beltsville Agriculture Research Center" (BARC), complementado con SFB, BSA o PVA, en la maduración in vitro de ovocitos, evidenciado a través de la tasa de fecundación y formación de blastocistos en diferentes etapas de desarrollo. Se realizaron tres experimentos, a saber: EXP 1: SFB añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 5 y 10%; EXP 2: BSA añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 4 y 8 mg/ml; EXP. 3: PVA se utilizó en el medio BARC en concentraciones de 0, 0.5 y 1 mg/ml. El medio de cultivo TCM 199 con piruvato, gentamicina, FSH, LH y SFB se utilizó como grupo control. Los ovocitos, obtenidos de ovarios de vacas enviadas al matadero, se seleccionaron en medio PBS y luego fueron madurados en medio BARC con FSH, LH, gentamicina y distintas macromoléculas. La selección del esperma se hizo con gradiente de Percoll, utilizando el medio TALP para la fecundación in vitro. Los embriones fueron cultivados en medio SOF modificado; ovocitos yembriones fueron incubados a 38,7°C, 5% de CO2 en aire y atmosfera húmeda. El número de ovocitos que fertilizaron y alcanzaron los estadios de blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, respectivamente, se registraron 72 y 168 horas post inseminación. Análisis de varianza y la prueba t de Bonferroni se utilizaron para el análisis estadístico, con P<0.05. Porcentaje más alto (P<0.05) de ovocitos que clivaram fue observada en el grupo TCM+ SFB que en los grupos madurados en medio BARC con SFB o BSA, independientemente de la concentración utilizada. Sin embargo, la tasa de fecundación fue similar entre grupos BARC + PVA con 1 mg/ml (85,7%) y TCM + SFB (90,8%). Diferencia significativa (P<0.05) se encontró entre los grupos para el desarrollo de blastocistos, con el grupo TCM + SFB produciendo un mayor número de blastocistos, en diferentes estadios (resultados que van desde 47,4 a 51,4%) en comparación con los grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) y PVA (5,7 a 10,6%). En conclusión, el medio BARC complementado con diferentes macromoléculas no fue eficiente en la promoción de una adecuada maduración de ovocitos bovinos in vitro, resultando en una tasa de fecundación y producción de blastocistos baja, en comparación con el medio TCM con SFB.

Fatores que interferem na eficiência reprodutiva de receptoras de embrião bovino / Fators affecting the reproductive efficiency of bovine embryo recipients / Factores que interfieren en la eficacia reproductiva de receptoras de emvriones bovinos

As receptoras de embriões utilizadas no Brasil, normalmente, são animais mestiços (Bos taurus x Bos indicus), o que as tornam mais susceptíveis às variações ambientais devido ao componente genético taurino. O objetivo dessa revisão é identificar os fatores intrínsecos (corpo lúteo, progesterona, sincronia doadora vs. receptora, protocolos de sincronização, qualidade do embrião, dificuldade na inovulação e ordem da inovulação) e os extrínsecos (nutricionais, manejo e ambiente, raça e categoria animal) que interferem na eficiência reprodutiva das receptoras de embrião. As receptoras precisam estar aptas a receberem o embrião no dia da inovulação, para assim levar a gestação a termo. O manejo nutricional deve ser um aliado, mantendo o escore de condição corporal da receptora sempre adequada entre 2,75 a 4 (escala de 1 a 5). O manejo dos animais deve ter uma visão multidisciplinar, observando as possibilidades de minimizar o estresse sofrido pelas fêmeas, de acordo com as condições de cada propriedade. O estresse térmico por calor interfere nos resultados dos programas de transferência de embrião. Medidas simples como manter as receptoras em ambiente sombreado, com água e comida enquanto aguardam a inovulação podem melhorar a taxa de prenhez. A transferência deve ser feita de preferência nos horários de clima mais ameno.(AU)

The embryo recipients utilized in Brazil are often crossbred (Bos taurus x Bos indicus), making them more susceptible to climatic variations due to the taurean genetic component. The aim of this review is to identify the intrinsic factors (corpus luteum, progesterone, synchronization between donor and recipient, synchronization protocols, embryo quality,difficulty in inovulation and inovulation order) as well as extrinsic factors (nutritional, handling and environment, breed and animal category) affecting the reproductive efficiency of embryo recipients. The recipients need to be ready to receive theembryo on the inovulation day in order to carry pregnancies to term. Nutritional management can be an ally, maintaining the body condition score of the recipients always adequate, between 2.75 and 4 (in a range from 1-5). The handling of animals must have a multidisciplinary approach, verifying the possible opportunities to minimize the stress experienced by females, according to the conditions of each property. The heat stress interferes in the results of embryo transfer programs. Simple actions such as keeping the recipients under shade, with food and water while waiting for inovulation might improve the pregnancy rate. The transfer must be made preferably during the cooler periods of the day. KEYWORDS: Bovine. In vitro embryo production. Animal reproduction. Pregnancy rates.(AU)

Las receptoras de embriones, utilizadas en Brasil, normalmente, son animales mestizos (Bos taurus x Bos indicus), lo que las hacen más susceptibles a las variaciones ambientales debido al componente genético taurino. El objetivo de esta revisión es identificar los factores intrínsecos (cuerpo lúteo, progesterona, sincronía donante vs. receptora, protocolos de sincronización, calidad del embrión, dificultad en la inovulación y orden de la inovulación) y los extrínsecos (nutricionales, manejo, ambiente, raza y categoría animal), que interfieren en la eficacia reproductiva de las receptoras de embrión. Las receptoras necesitan estar aptas a recibir el embrión en el día de la inovulación, para llevar el embarazo a término. El manejo nutricional debe ser un aliado, manteniendo el escore de condición corporal de la receptora, siempre adecuado entre 2,75 a 4 (escala de 1 a 5). El manejo de los animales debe tener una visión multidisciplinar, observando las posibilidades de minimizar el estrés sufrido por las hembras, de acuerdo con las condiciones de cada propiedad. El estrés térmico, por calor, interfiere en los resultados de los programas de transferencia de embrión. Medidas sencillas como mantener las receptoras en ambiente con sombra, agua y comida, mientras aguardan la inovulación, pueden mejorar la taza de preñez. La transferencia debe ser hecha, de preferencia, en los horarios de clima más ameno.(AU)

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO: ESTRESSE OXIDATIVO E ANTIOXIDANTES. / IN VITRO EMBRYO PRODUCTION: OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANTS. / PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO: EL ESTRÉS OXIDATIVO Y LOS ANTIOXIDANTES.

RESUMO A produção contínua e excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs) associada à depleção da concentração intracelular de glutationa (GSH) são as principais causas da baixa eficiência da produção in vitro de embriões (PIV) em diversas espécies animais. Isto se deve às condições de cultivo in vitro e à ausência do sistema de defesa antioxidante materno. Dentre os efeitos deletérios do estresse oxidativo, a peroxidação lipídica tem sido relacionada com o bloqueio do desenvolvimento e redução da viabilidade oocitária e embrionária. Neste contexto, a suplementação dos meios de cultivo in vitro com compostos tióis tem sido proposta com intuito de reduzir as perdas decorrentes do estresse oxidativo. Sendo assim, dada a relevância do tema, esta revisão visa proporcionar melhor compreensão dos eventos bioquímicos envolvidos na formação das EROs, na peroxidação lipídica e no sistema de defesa antioxidante glutationa redutase/peroxidase, com enfoque aos oócitos e embriões, e discutir alternativas para melhorar a eficiência da PIV. Palavras-chave: oócito, embrião, glutationa, compostos tióis, lipoperoxidação IN VITRO EMBRYO PRODUCTION: OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANTS ABSTRACT The continuous and excessive production of reactive oxygen species (EROs) associated with the depletion of intracellular concentration of glutathione (GSH) are the main cause of low efficiency

Produção de embriões in vitro: estresse oxidativo e antioxidantes. / in vitro embryo production: oxidative stress and antioxidants. / producción de embriones in vitro: el estrés oxidativo y los antioxidantes

RESUMO A produção contínua e excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs) associada à depleção da concentração intracelular de glutationa (GSH) são as principais causas da baixa eficiência da produção in vitro de embriões (PIV) em diversas espécies animais. Isto se deve às condições de cultivo in vitro e à ausência do sistema de defesa antioxidante materno. Dentre os efeitos deletérios do estresse oxidativo, a peroxidação lipídica tem sido relacionada com o bloqueio do desenvolvimento e redução da viabilidade oocitária e embrionária. Neste contexto, a suplementação dos meios de cultivo in vitro com compostos tióis tem sido proposta com intuito de reduzir as perdas decorrentes do estresse oxidativo. Sendo assim, dada a relevância do tema, esta revisão visa proporcionar melhor compreensão dos eventos bioquímicos envolvidos na formação das EROs, na peroxidação lipídica e no sistema de defesa antioxidante glutationa redutase/peroxidase, com enfoque aos oócitos e embriões, e discutir alternativas para melhorar a eficiência da PIV. Palavras-chave: oócito, embrião, glutationa, compostos tióis, lipoperoxidação IN VITRO EMBRYO PRODUCTION: OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANTS ABSTRACT The continuous and excessive production of reactive oxygen species (EROs) associated with the depletion of intracellular concentration of glutathione (GSH) are the main cause of low efficiency