Production of mycelial biomass, proteases and protease inhibitors by Ganoderma lucidum under different submerged fermentation conditions / Produção de biomassa micelial, proteases e inibidores de proteases por Ganoderma lucidum cultivado sob diferentes condições de fermentação submersa

Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom widely recognized as a source of biomolecules with pharmacological properties, however, little is known about the factors that influence the synthesis of bioactive proteins by this fungus when cultivated under submerged fermentation. The objective of this work was to evaluate the production of mycelial biomass and intracellular proteases and protease inhibitors by G. lucidum cultivated under different submerged fermentation conditions. The cultivation was carried out in a medium composed of glucose (10 or 20 g.L-1), soy peptone (2.5 or 5 g.L-1) and yeast extract (5 g.L-1), with incubation under agitation (120 rpm) and non-agitation, totaling 8 experimental conditions. Biomass production was determined from the dry weight, while glucose consumption was estimated by quantification of reducing sugars. The proteins were extracted in NaCl (0.15 M), and the protein extracts were submitted to protein quantification by the Bradford method, total proteolytic activity using azocasein, caseinolytic and fibrinolytic activity in Petri dishes, activity of serine (trypsin and chymotrypsin) and cysteine (papain) protease inhibitors. Cultivation in agitated condition showed higher biomass production with a maximum value of 7 g.L-1, in addition to higher activities of trypsin, chymotrypsin and papain inhibitors, with 154 IU.mg-1, 153 IU.mg-1 e 343 IU.mg-1 of protein, respectively. The non-agitated condition showed a greater potential for obtaining proteins, total proteases, caseinolytic and fibrinolytic enzymes, with maximum values of 433 mg.g-1 of extract, 71 U.mL-1 of extract, 63.62 mm2 and 50.27 mm2, respectively. Thus, a medium composed of soy peptone, yest extract and glucose in a 1:2:4 proportion is recommended, under agitation to produce protease inhibitors, and the non-agitated condition when the target is, mainly caseinolytic and fibrinolytic enzymes.

Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal amplamente reconhecido como fonte de biomoléculas com propriedades farmacológicas, entretanto, pouco se conhece acerca dos fatores que influenciam a síntese de proteínas bioativas por esse fungo, quando cultivado sob fermentação submersa. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de biomassa micelial e de proteases e inibidores de proteases intracelulares por G. lucidum cultivado em diferentes condições de fermentação submersa. O cultivo foi realizado em meio contendo glicose (10 ou 20 g.L-1), peptona de soja (2,5 ou 5 g.L-1) e extrato de levedura (5 g.L-1), com incubação sob agitação (120 rpm) ou não-agitado, totalizando 8 condições experimentais. A produção de biomassa foi determinada a partir do peso seco e o consumo de glicose a partir da quantificação de açúcares redutores. As proteínas foram extraídas em NaCl (0,15 M) e os extratos proteicos foram submetidos à quantificação de proteínas pelo método de Bradford, atividade proteolítica total usando azocaseína, atividade caseinolítica e fibrinolítica em placa de Petri, atividade de inibidores de serino-proteases (tripsina e quimotripsina) e cisteíno-protease (papaína). O cultivo em condição agitada apresentou maior produção de biomassa com valor máximo de 7g.L-1, além de maiores atividades de inibidores de tripsina, quimotripsina e papaína, com 154 UI.mg-1, 153 UI.mg-1 e 343 UI.mg-1 de proteína, respectivamente. A condição não-agitada demonstrou maior potencial para a obtenção de proteínas, proteases totais, enzimas caseinolíticas e fibrinolíticas, com valores máximos de 433 mg.g-1 de extrato, 71 U.mL-1 de extrato, 63,62 mm2 e 50,27 mm2, respectivamente. Assim, recomenda-se o meio composto de peptona de soja, extrato de levedura e glicose na proporção 1:2:4, em condição agitada para a produção de inibidores de proteases, e a condição não-agitada para a síntese de proteases, principalmente enzimas caseinolíticas e fibrinolíticas.

Effect of time and temperature of refrigeration in the development of psychrotrophic microrganisms in cooled raw milk collected in the macroregion of goiânia go / Efeito do tempo e da temperatura de refrigeração no desenvolvimento de microrganismos psicrotróficos em leite cru refrigerado coletado na macrorregião de goiânia go

The objective of the research were evaluated the effect of storage time and of refrigeration temperature under the counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics in refrigerated raw milk samples. In the period of August the September of 2005 34 refrigerated raw milk samples were collected of refrigeration tanks, being 29 individuals and five collectives. Milk was proceeding from bovine flocks. For the collection of the samples followed a route determined for the industry located in the macroregion of Goiânia GO, Brazil. For the microbiological evaluation was carried the standard plate count method of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics. For the determination and quantification of the glycomacropeptide (GMP) were adopted methodology proposal in Brazil (1991). The counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics increased with the storage time of refrigerated bovine milk. Were observed the inadequate tanks were observed e presence of GMP for the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was not evidenced.KEY WORDS: Proteolysis, Pseudomonas spp, raw milk.

O objetivo da pesquisa foi avaliar o efeito do tempo de estocagem e da temperatura de refrigeração sob a contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos pro­teolíticos em amostras de leite cru refrigerado. No período de agosto a setembro de 2005 coletaram-se 34 amostras de leite cru refrigerado de tanques de expansão, sendo 29 individuais e cinco coletivos. Para a coleta das amostras seguiu-se uma rota determinada pela indústria localizada na macrorregião de Goiânia, GO. Para a avaliação microbiológica, foi rea­lizada a contagem-padrão em placas de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos. Para a determinação e quantificação do caseinomacropeptídeo (CMP), adotou-se a metodologia proposta em BRASIL (1991). A contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos aumentou com o tempo de estocagem do leite cru refrigerado. Observou-se o funcionamento inadequado do termostato dos tanques de expansão, podendo ocasionar prejuízos principalmente ao produtor de leite. Não foi constatada a presença de CMP pela cromatografia líquida de alta eficiência.PALAVRAS-CHAVES: Leite in natura, proteólise, Pseudomonas spp.

EFFECT OF TIME AND TEMPERATURE OF REFRIGERATION IN THE DEVELOPMENT OF PSYCHROTROPHIC MICRORGANISMS IN COOLED RAW MILK COLLECTED IN THE MACROREGION OF GOIÂNIA GO / EFEITO DO TEMPO E DA TEMPERATURA DE REFRIGERAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU REFRIGERADO COLETADO NA MACRORREGIÃO DE GOIÂNIA GO

The objective of the research were evaluated the effect of storage time and of refrigeration temperature under the counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics in refrigerated raw milk samples. In the period of August the September of 2005 34 refrigerated raw milk samples were collected of refrigeration tanks, being 29 individuals and five collectives. Milk was proceeding from bovine flocks. For the collection of the samples followed a route determined for the industry located in the macroregion of Goiânia GO, Brazil. For the microbiological evaluation was carried the standard plate count method of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics. For the determination and quantification of the glycomacropeptide (GMP) were adopted methodology proposal in Brazil (1991). The counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics increased with the storage time of refrigerated bovine milk. Were observed the inadequate tanks were observed e presence of GMP for the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was not evidenced.KEY WORDS: Proteolysis, Pseudomonas spp, raw milk.

O objetivo da pesquisa foi avaliar o efeito do tempo de estocagem e da temperatura de refrigeração sob a contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos pro­teolíticos em amostras de leite cru refrigerado. No período de agosto a setembro de 2005 coletaram-se 34 amostras de leite cru refrigerado de tanques de expansão, sendo 29 individuais e cinco coletivos. Para a coleta das amostras seguiu-se uma rota determinada pela indústria localizada na macrorregião de Goiânia, GO. Para a avaliação microbiológica, foi rea­lizada a contagem-padrão em placas de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos. Para a determinação e quantificação do caseinomacropeptídeo (CMP), adotou-se a metodologia proposta em BRASIL (1991). A contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos aumentou com o tempo de estocagem do leite cru refrigerado. Observou-se o funcionamento inadequado do termostato dos tanques de expansão, podendo ocasionar prejuízos principalmente ao produtor de leite. Não foi constatada a presença de CMP pela cromatografia líquida de alta eficiência.PALAVRAS-CHAVES: Leite in natura, proteólise, Pseudomonas spp.

Milk contamination in different points of the dairy process. ii) mesophilic, psychrotrophic and proteolytic microorganisms / Contaminação do leite em diferentes pontos da produção leiteira: ii) microrganismos mesófilos, psicrotróficos e proteolíticos

Psychrotrophics microorganisms are able to multiply under refrigeration temperatures. They can produce heat-resistant extracellular enzymes that cause organoleptic and structural changes in milk and dairy products. With the objective of determining the frequency of microorganisms in the dairy process, four farms were evaluated in Londrina city Brazil and different points were assessed. Mesophilic (48hs at 35oC), psychrotrophic (25hs at 21oC) and proteolytic (72hs at 22oC) microorganisms were researched, and the proteolytic predominant microflora were determined by using the Gram stain technique. The main psychrotrophic contamination points were the residual water on milk cans, on bulk tank and bad cleaned teats, and milk cans and teats were the most important sources of proteolytics. Gram negative bacilli represented 69% of the microorganisms in the refrigerated milk that means 45% of the total proteolytics microorganisms in the dairy process. Gram negative bacilli is most frequent on bad cleaned teats, teatcups, residual water in milk cans and bulk tank. The psychrotroph count in the refrigerated milk was more than the mesophilic count, showing that that psychrotrophics are the best indicatator for refrigerated milk contamination. The psycrotrophics count at all points assessed were greater than the ideal limit (10% of the mesophilic count). Thus as refrigeration at 4oC is n

Os psicrotróficos são microrganismos que têm capacidade de multiplicação em temperaturas de refrigeração. Produzem enzimas termorresistentes como proteases e lipases que promovem alterações organolépticas no leite e comprometem a produção de derivados. Com o objetivo de determinar a freqüência desses microrganismos a produção do leite, foram estudadas 04 propriedades da região de Londrina, PR, analisando diversos pontos do processo. Determinou-se a contagem de microrganismos aeróbios mesófilos (48hs a 35ºC), psicrotróficos (25hs a 21ºC), psicrotróficos proteolíticos (72 hs a 22ºC) e as características morfotintoriais da microbiota psicrotrófica proteolítica predominante. Os principais pontos de contaminação por psicrotróficos foram a água residual de latões, tanques de expansão e tetos higienizados inadequadamente, sendo que os psicrotróficos proteolíticos predominam nos latões e tetos. Bacilos Gram negativos representaram 45% da microbiota proteolítica de todo o processo de produção, no leite refrigerado corresponderam a 69% dos psicrotróficos proteolíticos encontrados e ainda predominaram nos tetos higienizados, teteiras, água residual de latões e tanques de expansão. As contagens de psicrotróficos superaram as de mesófilos em leite refrigerado, mostrando que a pesquisa de psicrotróficos é ideal para avaliar a real carga microbiana do leite refrigerado. Como a refrigeração a

Milk contamination in different points of the dairy process. ii) mesophilic, psychrotrophic and proteolytic microorganisms / Contaminação do leite em diferentes pontos da produção leiteira: ii) microrganismos mesófilos, psicrotróficos e proteolíticos

Psychrotrophics microorganisms are able to multiply under refrigeration temperatures. They can produce heat-resistant extracellular enzymes that cause organoleptic and structural changes in milk and dairy products. With the objective of determining the frequency of microorganisms in the dairy process, four farms were evaluated in Londrina city Brazil and different points were assessed. Mesophilic (48hs at 35oC), psychrotrophic (25hs at 21oC) and proteolytic (72hs at 22oC) microorganisms were researched, and the proteolytic predominant microflora were determined by using the Gram stain technique. The main psychrotrophic contamination points were the residual water on milk cans, on bulk tank and bad cleaned teats, and milk cans and teats were the most important sources of proteolytics. Gram negative bacilli represented 69% of the microorganisms in the refrigerated milk that means 45% of the total proteolytics microorganisms in the dairy process. Gram negative bacilli is most frequent on bad cleaned teats, teatcups, residual water in milk cans and bulk tank. The psychrotroph count in the refrigerated milk was more than the mesophilic count, showing that that psychrotrophics are the best indicatator for refrigerated milk contamination. The psycrotrophics count at all points assessed were greater than the ideal limit (10% of the mesophilic count). Thus as refrigeration at 4oC is n

Os psicrotróficos são microrganismos que têm capacidade de multiplicação em temperaturas de refrigeração. Produzem enzimas termorresistentes como proteases e lipases que promovem alterações organolépticas no leite e comprometem a produção de derivados. Com o objetivo de determinar a freqüência desses microrganismos a produção do leite, foram estudadas 04 propriedades da região de Londrina, PR, analisando diversos pontos do processo. Determinou-se a contagem de microrganismos aeróbios mesófilos (48hs a 35ºC), psicrotróficos (25hs a 21ºC), psicrotróficos proteolíticos (72 hs a 22ºC) e as características morfotintoriais da microbiota psicrotrófica proteolítica predominante. Os principais pontos de contaminação por psicrotróficos foram a água residual de latões, tanques de expansão e tetos higienizados inadequadamente, sendo que os psicrotróficos proteolíticos predominam nos latões e tetos. Bacilos Gram negativos representaram 45% da microbiota proteolítica de todo o processo de produção, no leite refrigerado corresponderam a 69% dos psicrotróficos proteolíticos encontrados e ainda predominaram nos tetos higienizados, teteiras, água residual de latões e tanques de expansão. As contagens de psicrotróficos superaram as de mesófilos em leite refrigerado, mostrando que a pesquisa de psicrotróficos é ideal para avaliar a real carga microbiana do leite refrigerado. Como a refrigeração a