Biofilm formation by Prototheca zopfii isolated from clinical and subclinical bovine mastitis in distinct growth conditions under different dyes / Formação de biofilme por Prototheca zopfii isolados de mastite bovina clínica e subclínica em distintas condições de crescimento sob diferentes corantes

Prototheca spp. have been reported as an emergent environmental mastitis pathogen in several countries. Biofilm formation is a significant factor associated with different degrees of virulence developed by many microorganisms, including Prototheca spp. The present study aimed to compare two growth conditions and two staining dyes to determine which combination was more appropriate to evaluate qualitatively and quantitatively the production of biofilm by P. zopfii. Biofilm formation was evaluated in polystyrene microplates under static and dynamic growth conditions and staining with crystal violet or cotton blue dye. All P. zopfii isolates from cows with mastitis were classified as biofilm-producers in all growth conditions and staining. The cotton blue dye proved to be more appropriate method to classify the intensity of P. zopfii biofilm production.(AU)

Prototheca spp. tem sido relatado como um patógeno ambiental causador de mastite bovina em vários países. A formação de biofilme é um fator associado a diferentes graus de virulência desenvolvidos por muitos microrganismos, incluindo Prototheca zopfii. O presente estudo teve como objetivo comparar duas condições de crescimento e dois corantes para determinar a combinação mais adequada para avaliar qualitativa e quantitativamente a produção de biofilme por P. zopfii. A formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno sob condições estáticas e dinâmicas de crescimento e coloração com cristal violeta ou azul de algodão. Todos os isolados de P. zopfii de vacas com mastite foram caracterizados como produtores de biofilme, independentemente das condições de crescimento e coloração. O corante azul de algodão demonstrou ser o método mais adequado para classificar a intensidade de produção de biofilme de P. zopfii.(AU)

Activity of Serbian Aronia prunifolia against Prototheca wickerhamii and Prototheca zopfii

Background: Beneficial effects of berries have been known from 16th century, but their antimicrobial effects have been explained scientifically only recently. The two most common aronia species are black chokeberry, Aronia melanocarpa [Michx.] Elliot and red chokeberry, Aronia arbutifolia [L.] Elliot. Purple chokeberry (Aronia prunifolia) is a hybrid of these two species. Protothecosis is a disease caused by achlorophyllous algae Prototheca species. Infections with Prototheca species are more common in veterinary medicine. The purpose of this study was to investigate the activity of Aronia prunifolia berries against Prototheca zopfii (P. zopfii) and Prototheca wickerhamii (P. wickerhamii).Materials, Methods & Results: Purple chokeberry juice was made by squeezing the fruits and evaporated to dryness. Extracts of purple aronia were obtained by maceration with ethanol 80 % (v/v) for 24 h. Prototheca zopfii was obtained from udder of cow with mastitis and Prototheca wickerhamii was isolated from human oral cavity. Total phenolic and flavonoid contents were analized using spectrophotometric methods. The chemical composition of the tested substances was determined by a high performance liquid chromatography (HPLC) method. The examination was conducted by a micro-dilution method according to the guidelines of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Microsoft Excel pro

Mastite bovina por Prototheca zopfii na região oeste do Paraná: Relato de casos / Bovine mastitis by Prototheca zopfii in western Paraná: Case reports / Mastitis bovina por Prototheca zopfii en la región oeste de Paraná: Relato de casos

Relatam-se três casos de mastite clínica em vacas da raça Jersey de uma propriedade localizada na região Oeste do estado do Paraná, refratários ao tratamento com antimicrobianos. Após realização de cultura das amostras de leite, foi identificada Prototheca zopfii, uma alga aclorofilada, unicelular, presente em matéria orgânica e resistente a antimicrobianos. Foi indicado o descarte dos animais positivos e, como medida de profilaxia, a higienização de caixas de abastecimento de água e bebedouros, uma vez que o manejo da ordenha e higienização da ordenhadeira era realizada de maneira adequada na propriedade. De acordo com a literatura consultada, este é o primeiro relato de mastite por Prototheca zopfii na região Oeste do Paraná, salientando a importância da realização da cultura de amostras de leite de vacas portadoras de mastite, especialmente em casos refratários ao tratamento.(AU)

Three cases of clinical mastitis were reported in Jersey cows at a farm located in western Parana, with a history of refractory treatment with antimicrobials. Milk sample cultures presented Prototheca zopfii, an aclorophylated, unicellular algae, present in organic matter and resistant to antimicrobial treatment. The disposal of positive animals was indicated, and the prophylactic measure of cleaning the water storage and drinking containers were encouraged, since the milking and cleaning of the milking machine were properly performed at the farm. According to the literature, this is the first report of mastitis by Prototheca zopfii in western Parana, thus emphasizing the importance of performing cultures to the milk samples of cows presenting mastitis, especially in cases that are refractory to treatment.(AU)

Tres casos de mastitis clínica se ha relatado en vacas de la raza Jersey, de una propiedad ubicada en la región Oeste del Estado de Paraná, resistentes al tratamiento con antimicrobianos. Después de la realización de cultura de las muestras de leche, se identificó Prototheca zopfii, un alga aclorofilada, unicelular, presente en materia orgánica y resistente a antimicrobianos. Se aconsejó el descarte de los animales positivos y, como medida de profilaxis, la higienización de las cajas de abastecimiento de agua y bebederos, una vez que el manejo de ordeña e higienización de la ordeñadera era realizada de forma adecuada en la propiedad. De acuerdo con la literatura consultada, este es el primer relato de mastitis por Prototheca zopfii en la región Oeste de Paraná, resaltando la importancia de realización de cultura de las muestras de leche de vacas portadoras de mastitis, especialmente en casos resistentes al tratamiento.(AU)

Mastite bovina por Prototheca zopfii na região oeste do Paraná: Relato de casos / Bovine mastitis by Prototheca zopfii in western Paraná: Case reports / Mastitis bovina por Prototheca zopfii en la región oeste de Paraná: Relato de casos

Relatam-se três casos de mastite clínica em vacas da raça Jersey de uma propriedade localizada na região Oeste do estado do Paraná, refratários ao tratamento com antimicrobianos. Após realização de cultura das amostras de leite, foi identificada Prototheca zopfii, uma alga aclorofilada, unicelular, presente em matéria orgânica e resistente a antimicrobianos. Foi indicado o descarte dos animais positivos e, como medida de profilaxia, a higienização de caixas de abastecimento de água e bebedouros, uma vez que o manejo da ordenha e higienização da ordenhadeira era realizada de maneira adequada na propriedade. De acordo com a literatura consultada, este é o primeiro relato de mastite por Prototheca zopfii na região Oeste do Paraná, salientando a importância da realização da cultura de amostras de leite de vacas portadoras de mastite, especialmente em casos refratários ao tratamento.(AU)

Three cases of clinical mastitis were reported in Jersey cows at a farm located in western Parana, with a history of refractory treatment with antimicrobials. Milk sample cultures presented Prototheca zopfii, an aclorophylated, unicellular algae, present in organic matter and resistant to antimicrobial treatment. The disposal of positive animals was indicated, and the prophylactic measure of cleaning the water storage and drinking containers were encouraged, since the milking and cleaning of the milking machine were properly performed at the farm. According to the literature, this is the first report of mastitis by Prototheca zopfii in western Parana, thus emphasizing the importance of performing cultures to the milk samples of cows presenting mastitis, especially in cases that are refractory to treatment.(AU)

Tres casos de mastitis clínica se ha relatado en vacas de la raza Jersey, de una propiedad ubicada en la región Oeste del Estado de Paraná, resistentes al tratamiento con antimicrobianos. Después de la realización de cultura de las muestras de leche, se identificó Prototheca zopfii, un alga aclorofilada, unicelular, presente en materia orgánica y resistente a antimicrobianos. Se aconsejó el descarte de los animales positivos y, como medida de profilaxis, la higienización de las cajas de abastecimiento de agua y bebederos, una vez que el manejo de ordeña e higienización de la ordeñadera era realizada de forma adecuada en la propiedad. De acuerdo con la literatura consultada, este es el primer relato de mastitis por Prototheca zopfii en la región Oeste de Paraná, resaltando la importancia de realización de cultura de las muestras de leche de vacas portadoras de mastitis, especialmente en casos resistentes al tratamiento.(AU)

Prototheca zopfii genotype 2 disseminated infection in a dog with neurological signs

ABSTRACT: Prototheca zopfii is an alga that can cause disease in animals and humans. Here, we reported a case of systemic protothecosis in a 2-year-old female Boxer. The animal exhibited tetraparesis and vertical nystagmus. It died two weeks after the onset of clinical signs and was necropsied. At gross examination, whitish areas were identified in the heart. Oval or round structures were observed by microscopic examination, some of which formed morula-like structures compatible with algae in the heart, skeletal muscle, and brain. Growth of Prototheca sp. was observed in the heart after culture at 37°C on Sabouraud agar medium with chloramphenicol. Immunohistochemical analysis of the heart and brain using an anti-Prototheca zopfii polyclonal antibody yielded positive results. Genotyping of the cultured agent from brain and heart samples was performed by restriction fragment length polymorphism of a specific 18S rDNA fragment. P. zopfii genotype 2 was reported to be the cause of disseminated protothecosis in this dog with manifestation in the brain, heart, and skeletal muscle.

RESUMO: A prototecose é uma infecção causada por algas, causadora de doenças em animais e seres humanos. O presente trabalho tem por objetivo relatar um caso de prototecose sistêmica em um canino fêmea, da raça Boxer de dois anos de idade. O animal apresentava tetraparesia e nistagmo vertical. O animal morreu duas semanas após o início dos sinais clínicos e foi realizado o exame de necropsia. Os achados macroscópicos se caracterizavam principalmente por áreas esbranquiçadas no miocárdio. Na histologia observou-se estruturas ovais ou redondas, algumas apresentando estruturas como mórulas compatíveis com Prototheca no coração, músculo esquelético e encéfalo. No cultivo do miocárdio em meio Agar Sabouraud com Chloramphenicol a 37oC foi observado o crescimento de Prototheca sp. No teste imuno-histoquímico do coração, cérebro e cerebelo com anticorpo policlonal anti-P. zopffi, foi observada marcação positiva. Teste de PCR a partir da cultura do agente usando uma sequência de 18S rDNA foi realizado para a tipificação do genótipo. P. zopfii genótipo 2 foi encontrado como causa de prototecose disseminada no encéfalo, coração e músculo esquelético nesse cão.

Prototheca zopfii genotype 2 disseminated infection in a dog with neurological signs

ABSTRACT: Prototheca zopfii is an alga that can cause disease in animals and humans. Here, we reported a case of systemic protothecosis in a 2-year-old female Boxer. The animal exhibited tetraparesis and vertical nystagmus. It died two weeks after the onset of clinical signs and was necropsied. At gross examination, whitish areas were identified in the heart. Oval or round structures were observed by microscopic examination, some of which formed morula-like structures compatible with algae in the heart, skeletal muscle, and brain. Growth of Prototheca sp. was observed in the heart after culture at 37°C on Sabouraud agar medium with chloramphenicol. Immunohistochemical analysis of the heart and brain using an anti-Prototheca zopfii polyclonal antibody yielded positive results. Genotyping of the cultured agent from brain and heart samples was performed by restriction fragment length polymorphism of a specific 18S rDNA fragment. P. zopfii genotype 2 was reported to be the cause of disseminated protothecosis in this dog with manifestation in the brain, heart, and skeletal muscle.(AU)

RESUMO: A prototecose é uma infecção causada por algas, causadora de doenças em animais e seres humanos. O presente trabalho tem por objetivo relatar um caso de prototecose sistêmica em um canino fêmea, da raça Boxer de dois anos de idade. O animal apresentava tetraparesia e nistagmo vertical. O animal morreu duas semanas após o início dos sinais clínicos e foi realizado o exame de necropsia. Os achados macroscópicos se caracterizavam principalmente por áreas esbranquiçadas no miocárdio. Na histologia observou-se estruturas ovais ou redondas, algumas apresentando estruturas como mórulas compatíveis com Prototheca no coração, músculo esquelético e encéfalo. No cultivo do miocárdio em meio Agar Sabouraud com Chloramphenicol a 37oC foi observado o crescimento de Prototheca sp. No teste imuno-histoquímico do coração, cérebro e cerebelo com anticorpo policlonal anti-P. zopffi, foi observada marcação positiva. Teste de PCR a partir da cultura do agente usando uma sequência de 18S rDNA foi realizado para a tipificação do genótipo. P. zopfii genótipo 2 foi encontrado como causa de prototecose disseminada no encéfalo, coração e músculo esquelético nesse cão.(AU)

Activity of Serbian Aronia prunifolia against Prototheca wickerhamii and Prototheca zopfii

Background: Beneficial effects of berries have been known from 16th century, but their antimicrobial effects have been explained scientifically only recently. The two most common aronia species are black chokeberry, Aronia melanocarpa[Michx.] Elliot and red chokeberry, Aronia arbutifolia [L.] Elliot. Purple chokeberry (Aronia prunifolia) is a hybrid of these two species. Protothecosis is a disease caused by achlorophyllous algae Prototheca species. Infections with Prototheca species are more common in veterinary medicine. The purpose of this study was to investigate the activity of Aronia prunifolia berries against Prototheca zopfii (P. zopfii) and Prototheca wickerhamii (P. wickerhamii).Materials, Methods & Results:Purple chokeberry juice was made by squeezing the fruits and evaporated to dryness. Extracts of purple aronia were obtained by maceration with ethanol 80 % (v/v) for 24 h. Prototheca zopfiiwas obtained from udder of cow with mastitis and Prototheca wickerhamiiwas isolated from human oral cavity. Total phenolic and flavonoid contents were analized using spectrophotometric methods. The chemical composition of the tested substances was determined by a high performance liquid chromatography (HPLC) method. The examination was conducted by a micro-dilution method according to the guidelines of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Microsoft Excel program 2007 was used for statistical analysis. The antialgal activity was expressed as minimal inhibitory concentrations MIC99, MIC90and MIC80, the lowest concentration which kills 99%, 90% and 80% of organisms, respectively. Furthermore, minimal algaecide concentration (MAC), the lowest concentration which kills 99.9% of organisms is determined, as well as break point, the lowest concentration at which there is no algal growth.[...]

Activity of Serbian Aronia prunifolia against Prototheca wickerhamii and Prototheca zopfii

Background: Beneficial effects of berries have been known from 16th century, but their antimicrobial effects have been explained scientifically only recently. The two most common aronia species are black chokeberry, Aronia melanocarpa[Michx.] Elliot and red chokeberry, Aronia arbutifolia [L.] Elliot. Purple chokeberry (Aronia prunifolia) is a hybrid of these two species. Protothecosis is a disease caused by achlorophyllous algae Prototheca species. Infections with Prototheca species are more common in veterinary medicine. The purpose of this study was to investigate the activity of Aronia prunifolia berries against Prototheca zopfii (P. zopfii) and Prototheca wickerhamii (P. wickerhamii).Materials, Methods & Results:Purple chokeberry juice was made by squeezing the fruits and evaporated to dryness. Extracts of purple aronia were obtained by maceration with ethanol 80 % (v/v) for 24 h. Prototheca zopfiiwas obtained from udder of cow with mastitis and Prototheca wickerhamiiwas isolated from human oral cavity. Total phenolic and flavonoid contents were analized using spectrophotometric methods. The chemical composition of the tested substances was determined by a high performance liquid chromatography (HPLC) method. The examination was conducted by a micro-dilution method according to the guidelines of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Microsoft Excel program 2007 was used for statistical analysis. The antialgal activity was expressed as minimal inhibitory concentrations MIC99, MIC90and MIC80, the lowest concentration which kills 99%, 90% and 80% of organisms, respectively. Furthermore, minimal algaecide concentration (MAC), the lowest concentration which kills 99.9% of organisms is determined, as well as break point, the lowest concentration at which there is no algal growth.[...](AU)

Formação de biofilme e avaliação de uma molécula de polipirrol para tratamento de mastite por Prototheca bovis

Há um acréscimo considerável nos registros de casos de mastite ocasionados por agentes eucariontes, como os fungos e as algas. As algas do gênero Prototheca são organismos unicelulares, microscópicas, aclorofiladas e de ocorrência livre na natureza, tendo preferência por locais úmidos e com presença de matéria orgânica. Algas do gênero Prototheca estão presentes em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais e temperadas. Prototheca spp. foram amplamente isoladas de bovinos em casos de mastite clínica e subclínica. Além disso, infecções pelo agente foram relatadas em cães envolvendo múltiplos tecidos, especialmente na forma gastrintestinal, oftálmica, urinária ou, ainda, neurológica. Ainda, em humanos também há um aumento nos relatos de infecções, principalmente relacionadas aos pacientes imunocomprometidos A mastite é uma enfermidade importante, no ponto de vista higiênico-sanitário bem como econômico e, dependendo do agente etiológico envolvido, a gravidade da infecção pode ser aumentada nos rebanhos leiteiros. Quando Prototheca (P.) bovis (P. zopfii genótipo 2) ou P. blaschkeae são os agentes causadores da enfermidade, as vacas leiteiras de alta produção são os principais animais acometidos, gerando prejuízos econômicos e sanitários nesses rebanhos, incluindo a diminuição na qualidade e quantidade do leite produzido, resultando no descarte dos animais infectados. O tratamento dos animais acometidos normalmente não é efetivo, devido à resistência aos antibacterianos e antifúngicos geralmente empregados em Medicina Veterinária. Adicionalmente, a capacidade de formação de biofilme por Prototheca spp. facilita sua transmissão entre os animais e dificulta a sua eliminação dos ambientes e das lesões. Devido à dificuldade de tratamento e a ausência de fármacos efetivos no tratamento das prototecoses, os estudos que compõem esta tese objetivaram demonstrar a formação de biofilme por 32 isolados de Prototheca spp. comparando diferentes condições de crescimento e de coloração, a fim de demonstrar o protocolo mais adequado para avaliar qualitativa e quantitativamente a produção de biofilme nestas algas. Adicionalmente, pesquisou-se novas alternativas para o tratamento destes agentes infecciosos, avaliando o potencial antimicrobiano e a toxicidade celular de uma molécula altamente solúvel de polipirrol através de testes in vitro e in vivo. Além disso, almejou-se desenvolver um protocolo terapêutico para tratamento de mastites causada por P. bovis (P. zopfii genótipo 2), em um protocolo experimental de infecção intramamária, em cabras, e empregando como tratamento uma molécula altamente solúvel de polipirrol (Ppy). A partir destes estudos, foi comprovada a capacidade de formar biofilme por isolados de Prototheca spp. oriundos de mastite bovina e foi demonstrado que condições de crescimento estático, incubação a 37°C/24 horas e coloração com azul algodão 0,05% foram mais adequadas para avaliar a formação e classificar os isolados quanto à capacidade de produzir biofilmes. Em adição, foi demonstrada a atividade algicida do Ppy frente a Prototheca spp. tanto in vitro como in vivo, bem como foi demonstrada a utilização de cabras como modelo experimental para a infecção intramamária por P. bovis. Os resultados obtidos reforçam Prototheca sp. como potente formador de biofilme e destacam o polipirrol como uma molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos com a finalidade de tratamento da prototecose.

There is a considerable increase in the records of cases of mastitis caused by eukaryotic agents, such as fungi and algae. Algae of the genus Prototheca are unicellular, microscopic, achlorophyllous organisms that occur freely in nature, preferring moist places and with the presence of organic matter. Algae of the Prototheca genus are present all over the world, mainly in tropical and temperate areas. Prototheca spp. have been widely isolated from cattle in cases of clinical and subclinical mastitis. Furthermore, infections by the agent have been reported in dogs involving multiple tissues, especially in the gastrointestinal, ophthalmic, urinary or neurological form. Furthermore, in humans there is also an increase in the reports of infections, mainly related to immunocompromised patients. Mastitis is an important disease, from a hygienic-sanitary as well as an economic point of view and, depending on the etiological agent involved, the severity of the infection can be increased in dairy herds. When Prototheca (P.) bovis (P. zopfii genotype 2) or P. blaschkeae are the causative agents of the disease, high-production dairy cows are the main animals affected, causing economic and health losses in these herds, including a decrease in quality and quantity of milk produced, resulting in the disposal of infected animals. The treatment of affected animals is usually not effective, due to resistance to antibacterial and antifungal agents commonly used in Veterinary Medicine. Additionally, the biofilm-forming ability of Prototheca spp. facilitates its transmission between animals and hinders its elimination from environments and injuries. Due to the difficulty of treatment and the absence of effective drugs in the treatment of protothecoses, the studies that make up this thesis aimed to demonstrate the formation of biofilms by 32 isolates of Prototheca spp. comparing different growth and staining conditions in order to demonstrate the most appropriate protocol to qualitatively and quantitatively assess biofilm production in these algae. Additionally, new alternatives for the treatment of these infectious agents were researched, evaluating the antimicrobial potential and cellular toxicity of a highly soluble polypyrrole molecule through in vitro and in vivo tests. Furthermore, the aim was to develop a therapeutic protocol for the treatment of mastitis caused by P. bovis (P. zopfii genotype 2), in an experimental protocol of intramammary infection in goats, and using a highly soluble polypyrrole molecule (Ppy) as a treatment. From these studies, the ability to form biofilms by isolates of Prototheca spp. from bovine mastitis and it was demonstrated that conditions of static growth, incubation at 37°C/24 hours and staining with 0.05% cotton blue were more adequate to evaluate the formation and classify the isolates in terms of their ability to produce biofilms. In addition, the algaecide activity of Ppy against Prototheca spp. both in vitro and in vivo, as well as the use of goats as an experimental model for intramammary infection by P. bovis has been demonstrated. The results obtained reinforce Prototheca sp. as a potent biofilm former and highlight polypyrrole as a promising molecule for the development of drugs for the treatment of protothecosis.

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E CONCENTRAÇÃO ALGICIDA MÍNIMA "IN VITRO" DA GUANIDINA EM LINHAGENS DE Prototheca zopfii ISOLADAS DE VACAS COM MASTITE CLÍNICA E SUBCLÍNICA

As infecções mamárias por Prototheca têm sido registradas, de modo crescente, em todo o mundo, como um dos agentes mais patogênicos de origem ambiental na mastite bovina. Estas algas provocam lesões graves no tecido mamário e, até o momento, não existe protocolo efetivo de tratamento. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito algicida in vitro da guanidina em 75 isolados de Prototheca zopfii identificados de 60 casos de mastite clínica bovina (80,0%), 14 (18,7%) casos de mastite subclínica e um (1,3%) caso sem o diagnóstico de mastite clínica ou subclínica. Os 75 isolados foram submetidas a testes fenotípicos convencionais e caracterização genotípica por PCR multiplex, permitindo a identificação de todas as estirpes como P. zopfii genótipo 2. O efeito in vitro da guanidina revelou que todas os isolados mostraram variações na concentração algicida mínima que variaram de 0,001% a 0,035%. A guanidina tem alto efeito microbicida e é considerado um antisséptico/desinfetante da nova geração de microbicidas. O composto não é tóxico para as membranas mucosas e conjuntivas de humanos em baixas concentrações. É utilizado como desinfetante de piscinas e na desinfecção de superfícies, bem como antisséptico em feridas humanas. A ação algicida da guanidina em baixas concentrações indica que poderia ser usada na higienização de ambiente, utensílios e equipamentos de ordenha, no pré e pós-dipping em propriedades com casos de prototecose mamária, assim como na ablação química de quartos mamários acometidos por P. zopfii. Dentre a literatura consultada, relata-se pela primeira vez o efeito algicida in vitro da guanidina em isolados de P. zopfii de origem animal.

Prototheca species have increasingly been reported as the most common opportunistic pathogens causing mastitis worldwide. The protothecal mastitis poses a major health and economic problem in dairy herds. To date, there is any effective therapy against protothecal mastitis. The aim of the present study was to investigate in vitro algaecide effect of guanidine on 75 Prototheca zopfii genotype 2 strains isolated from 75 cases of clinical and subclinical bovine mastitis cases. In vitro effect of guanidine revealed that all strains were susceptible to the compound with minimal algaecide concentration ranging from 0.001% to 0.035%. Guanidine has high microbicidal effect and is considered a new-generation microbicidal compound. It is non-toxic to human mucous membranes and conjunctivas at low concentrations; it has been used as a disinfectant of surfaces and in swimming pools, as well as antiseptic on human wounds. The algaecide action of guanidine at low concentrations indicates that it could be an alternative disinfectant or antiseptic to clean the environment and milking dairy equipment, in pre- and post-dipping solutions, in the chemical dry therapy of bovine teats, and even in intramammary therapy of P. zopfii infections. This is the first report of the in vitro algaecide effect of guanidine on P. zopfii strains from animal origin.

Atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistentes, fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário

Bentivoglio ECRO. Atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistentes, fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Infecções microbianas podem ser causadas por bactérias, fungos, vírus, parasitas e algas. O presente estudo avaliou a atividade in vitro de formulações de lípides catiônicos contra bactérias multirresistêntes (MRs), fungos e microalgas de interesse médico humano e veterinário. A atividade biocida de bicelas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DBB) foi avaliada contra bactérias gram-negativas produtoras de -lactamases de amplo espectro e carbapenemases mundialmente disseminadas. Para fungos (Candida albicans, Trichophyton rubrum) e microalgas (Prototheca zopfii), a atividade biocida de DBB, sem e com a associação a drogas antifúngicas (ex., miconazol, terbinafina e anfotericina B), foi avaliada determinando-se adicionalmente a atividade sinérgica. Nanodispersões catiônicas de DBB exibiram atividade bactericida, fungicida e algicida, mesmo para patógenos MRs, sendo que a sua associação com outros antimicrobianos resultou em uma atividade sinérgica que poderia favorecer a produção de formulações com potencial para aplicação clínica humana e veterinária.

Microbial infections can be caused by bactérias, fungi, virus, parasites and algae. This study evaluated in vitro activity from cationic lipds formulations against multiresistant bacterias (MRs), fungi and e microalgae from human and veterinary. The Biocidal activity from bromide dioctadecildimetilammonium biceles (DBB) was evaluated against gram-negative bactérias lactamases producers and carbapenemases from broad spectrum with wide spread dissemination. For fungi (Candida albicans, Trichophyton rubrum) and microalgae (Prototheca zopfii), the biocidal activity from DBB wuth and without antifungal drugs (ex., miconazole, terbinafine e amphotericin B), was also evaluated by synergistic activity. Cationic nanodispertions of DBB has shown bactericidal, fungicidal and algicidal activity, even for MRs patogens, thus , the association with the others antimicrobials resulted in a synergistic activity wich could foment the production of the formulations with a potential application in human and veterinary medicine.

Mastite clínica em bovino causada por Prototheca zopfii no estado do Ceará / Clinical mastitis in a dairy cow caused by Prototheca zopfii in Ceará state, Brazil

Relata-se um caso de mastite clinica causada por Prototheca zopfii (alga unicelular), no município de Iguatu, Ceará. O animal, da raça Holandesa, com peso de 500 Kg e 4 anos idade apresentava produção diária de 18 litros de leite, e era criado sob sistema intensivo de confinamento. Observou-se a presença dos sinais clínicos no quarto anterior direito, com queda acentuada da produção de leite e ainda grumos na caneca de fundo preto. Logo em seguida foram coletadas duas amostras de leite do animal e enviada ao Laboratório de Microbiologia Veterinária da UFERSA. Para a análise microbiológica as amostras foram semeadas em ágar Sabouraud e cultivadas em estufa microbiológica sob condição de aerofilia a uma temperatura de 37ºC por um período de 48 horas, onde se observou o crescimento das colônias, que se apresentaram com diâmetro variável entre 3 e 6 mm e bordas irregularmente onduladas com elevação central. Realizou-se também o teste de susceptibilidade a antimicrobianos. O antibiograma demonstrou resistência a todos os antibióticos testados: getamicina (10mg), clorafenicol (30mg), ceftriaxona (30mg), cefoxitina (30mg), vancomicina (30mg), polimixina (300mg), novobicina (30mg), estreptomicina (10mg) e cefalotina (30mg).

We report a case of clinical mastitis caused by Prototheca zopfii (unicellular algae) in the municipality of Iguatu, Ceará. A Holstein cow weighted 500 kg and was 4 years old, with dairy milk production of 18 liters, and was created under intensive system. The main clinical signs observed in the front right quarter, with drop in milk production and presence of flocks in the wired cup test. Two samples of milk were collected from the animals and sent to Laboratório de Microbiologia Veterinária at UFERSA. The samples were streaked on Sabouraud agar and incubated under aerobic conditions for 48 hours at 37 º C. After 72 hours the colonies had presented a diameter varying between 3 and 6 mm and irregular edges with central elevation. An antibiogram was also performed, and revealed resistance to all antibiotics tested: getamicin (10mg), chloramphenicol (30 mg), ceftriaxone (30 mg), cefoxitin (30 mg), vancomycin (30 mg), polymyxin (300mg), novobicin (30mg), streptomycin (10mg) and cephalothin (30mg).

Prototecose: uma doença emergente / Protothecosis: an emergent disease

Prototecose, causada por Prototheca zopfii ou P. wickerhamii, é uma doença emergente em animais e humanos. Em bovinos, P. zopfii é uma importante causa de mastite ambiental. Em cães e gatos, a prototecose é causada principalmente por P. zopfii. Em cães, causa infecção cutânea ou uma forma sistêmica envolvendo diversos órgãos. Em gatos, predominam as lesões tegumentares na região da face e plano nasal. No homem, a prototecose, causada principalmente por P. wickerhamii, manifesta-se sob três formas: cutânea, articular com bursite do olécrano e sistêmica. Pode ocorrer em indivíduos imunocompetentes, os quais podem apresentar bursite e/ou infecções cutâneas localizadas, ou em indivíduos imunossuprimidos, nos quais a enfermidade pode ser disseminada e/ou com envolvimento visceral. A prototecose causada por P. wickerhamii foi descrita recentemente em caprinos como causa de rinite afetando o vestíbulo nasal, união mucocutânea, pele da face e orelha. Nesta revisão são abordadas as características microbiologias e susceptibilidade a antimicrobianos do agente, e a epidemiologia, sinais clínicos, patologia, diagnóstico, tratamento e controle da prototecose em animais domésticos e no homem.(AU)

Protothecosis, caused by Prototheca zopfii or P. wickerhamii, is an emergent disease of human and animals. In cattle, P. zopfii is an important cause of environmental mastitis. In dogs and cats protothecosis is caused mainly by P. zopfii, causing cutaneous infections or a systemic form affecting many organs in dogs, and cutaneous infection affecting mainly the skin of the face and nose in cats. In humans, protothecosis, caused mainly by P. wickerhamii, occurs in three forms: cutaneous; olecran bursitis; and disseminated. The lesion is usually localized in the site of inoculation in immunocompetent individuals; however, in immunocompromised patients, it can become widespread. Protothecosis caused by P. wickerhamii was recently reported in goats causing rhinitis and dermatitis of the face and pinna. This paper reviews microbiologic characteristics and susceptibility to antimicrobials of Prototheca spp., and the epidemiology, clinical signs, pathology, diagnosis, treatment and control of protothecosis.(AU)

Prototecose em animais de companhia e aspectos da doença no homem

Etiology, epidemiology, pathogeny, clinical signs, diagnosis, therapeutic, control and preventive measures in protothecosis in dogs and cats were reviewed, besides aspects of disease in human and bovines.

Foram revisados dados de etiologia, epidemiologia, patogenia, sinais clínicos, procedimentos diagnósticos, conduta terapêutica e ações de controle e profilaxia da prototecose em cães e gatos, além de aspectos da doença no homem e em bovinos.

Prototecose em animais de companhia e aspectos da doença no homem

Etiology, epidemiology, pathogeny, clinical signs, diagnosis, therapeutic, control and preventive measures in protothecosis in dogs and cats were reviewed, besides aspects of disease in human and bovines.

Foram revisados dados de etiologia, epidemiologia, patogenia, sinais clínicos, procedimentos diagnósticos, conduta terapêutica e ações de controle e profilaxia da prototecose em cães e gatos, além de aspectos da doença no homem e em bovinos.

Fatores de risco associados à mastite bovina causada por Prototheca zopfii / Risk factors associated with bovine mastitis caused by Prototheca zopfii

Este trabalho teve como objetivo o estudo de fatores de risco associados à mastite bovina causada por Prototheca zopfii. Foram analisadas 13 propriedades leiteiras dos Estados do Paraná e de São Paulo, segundo os seguintes critérios de seleção: confirmação prévia de casos de mastite por Prototheca spp., triagem pela pesquisa de Prototheca spp. em tanques de expansão e latões e rebanhos com contagem de células somáticas acima de 5x105cel mL-1. As amostras coletadas consistiram de: leite, água, solo, fezes e swab de teteiras. Prototheca spp. foi isolada de amostras de leite dos quartos mamários com mastite clínica ou subclínica em uma propriedade e de amostras de leite e do ambiente em quatro propriedades, nas quais foi isolada em amostras de: água de bebedouro, abastecimento, esgoto, empoçada no piso de estábulo e sala de ordenha, solo de piquete e pasto, teteiras, fezes de bezerros e suínos. Do total de 383 vacas examinadas, Prototheca spp. foi isolada em 20 (5,2 por cento) vacas, sendo caracterizada como P. zopfii em 18. Os fatores de risco associados à mastite causada por P. zopfii foram: criação das vacas a pasto, alimentação dos animais com pasto e silagem, realização de ordenha mecânica em estábulo, permanência das vacas após ordenha em piquete sem alimento, criação de suínos próxima às instalações dos bovinos, existência de cães, gatos e roedores, falta de higienização dos tetos com água, pré-imersão dos tetos em aplicador com retorno e sem a troca do anti-séptico, alimentação dos bezerros com leite de vacas com mastite clínica e serem as vacas da raça holandesa.(AU)

This research had as objective the study of risk factors associated with bovine mastitis caused by Prototheca zopfii. Thirteen dairy herds in Paraná and São Paulo states were analyzed and selected according to the following criteria: previous confirmation of Prototheca spp. mastitis cases, screening of Prototheca spp. in bulk tanks and milk cans, and herds with somatic cells count over 5x105cel mL-1. The samples collected consisted of: milk, water, soil, manure and swabs of teat cup rubbers. Prototheca spp. was isolated from mammary quarters with clinical and subclinical mastitis of milk samples in one herd and from the environment and cows in four herds. Out of 383 cows examined, Prototheca spp. was isolated in 20 (5.2 percent) cows with mastitis, and 18 of them were characterized as P. zopfii. In four herds when Prototheca spp. was identified from mammary quarters and environment the agent was isolated from the following samples: water in the waterers, puddled water in the stalls and the milking parlour, supply, sewage, cow pen and pasture soil, teat cup rubbers and manure from calves and swines. The risk factors associated with P. zopfii mastitis consisted of: pasture system, pasture and silage feeding, use of milking machine in stalls, cow pen without fresh feed after milking, raising of swines near bovine housing, existence of dogs, cats and rodents, absence of teats hygienization with water, use of pre-immersion devices with return and without change of antiseptic, calves fed with milk of clinical mastitis cases and the Holstein breed.(AU)

Prototheca zopfii: importante patógeno na etiologia da mastite bovina no brasil

A alga Prototheca zopfii destaca-se entre os agentes ambientais da mastite bovina em virtude dos prejuízos decorrentes do comprometimento da qualidade e produção de leite. Além disso, apresenta elevada resistência antimicrobiana e potencial zoonótico, fatores que levam ao descarte dos animais infectados. Esse patógeno foi identificado recentemente em Goiás e acredita-se que possa estar presente em outros rebanhos do Estado. O presente estudo visa revisar a literatura referente às características do agente, aspectos econômicos e de saúde pública, epidemiologia, clínicos e patológicos, bem como os procedimentos para diagnóstico, controle e prevenção dessa forma de mastite. PALAVRAS-CHAVE: Controle de mastite, epidemiologia, Prototheca zopfii.

Estudo da interação da alga Prototheca zopfii com neutrófilos recuperados de leite bovino e ação do sistema AIA/HRP sobre este patógeno / Study of the interaction of the algae Prototheca zopfii with neutrophils recovered from bovine milk and action of the IAA/HRP on this pathogen

Estudos têm mostrado a incidência de mastite bovina associada à alga Prototheca zopfii. O objetivo deste trabalho foi estudar a interação da P. zopfii com neutrófilos recuperados de leite bovino e avaliar o efeito do sistema ácido indol-3-acético/peroxidase de raiz forte (AIA/HRP) sobre a viabilidade deste microrganismo em experimentos in vitro. A P. zopfii foi recuperada de vacas com mastite clínica e, no laboratório, foram realizadas a caracterização molecular, morfológica e crescimento exponencial do microrganismo. Em seguida, neutrófilos recuperados de leite bovino foram incubados na ausência e na presença de P. zopfii opsonizada e foram avaliadas a produção de peróxido de hidrogênio, enzimas antioxidantes dos neutrófilos e microrganismo, e a capacidade fagocitária. Em outro estudo, a P. zopfii foi incubada com o sistema AIA/HRP e foram avaliadas a viabilidade por unidades formadoras de colônias (UFC), atividade de enzimas antioxidantes, integridade de membrana por exclusão com azul de Trypan e integridade do DNA. Os resultados foram analisados pela análise de variância com significância de 5% usando o teste Tukey. Foram observados diversos tamanhos celulares da P. zopfii, presença de autofluorescência, crescimento exponencial ao longo do tempo de incubação em que não foi possível determinar o início da fase de morte. Ainda, foram encontrados os genótipos 1, 2 e 3 nos isolados em estudo. A produção de peróxido de hidrogênio pelos neutrófilos na presença da alga foi estimulada 5 vezes em relação ao controle, estimulou a atividade das enzimas catalase (CAT) em 21% e glutationa redutase (GR) em 27% e não houve diferença significativa quanto à atividade de CAT, GR e superóxido dismutase (SOD) produzido pela P. zopfii. Também foi verificado que a P. zopfii não foi englobada pelo neutrófilo. O sistema AIA/HRP inibiu o crescimento do microrganismo em 45, 82 e 88% nos tempos de 4, 6 e 9 horas de incubação; a atividade da SOD, CAT, Glutationa Peroxidase (GPx) e GR aumentou respectivamente em 90, 120, 150% e 3,4 vezes; houve redução da viabilidade da P. zopfii em 10, 15, 20, 25 e 32% após os tempos de 4, 6, 8, 10 e 12 horas de incubação; e não afetou a integridade do DNA após 6 horas de incubação. Conclui-se que a P. zopfii é altamente resistente frente aos neutrófilos e demonstrou ser susceptível quanto ao efeito microbicida do sistema AIA/HRP

Studies have shown the incidence of bovine mastitis associated with the algae Prototheca zopfii. The objective of this work was to study the interaction of P. zopfii with neutrophils recovered from bovine milk and to evaluate the effect of system indole-3-acetic acid/horseradish peroxidase (IAA/HRP) on the viability of this microorganism in vitro experiment. P. zopfii was recovered from cows with clinical mastitis and both the molecular and morphological characterization were performed besides the evaluation of exponential growth of the microorganism in the laboratory. Next, neutrophils recovered from bovine milk were incubated in the absence and presence of opsonized P. zopfii and were evaluated the production of hydrogen peroxide, antioxidant enzymes on neutrophils and microorganism, and phagocytic capacity. In another study, P. zopfii was incubated with the system IAA/HRP and the viability assessed by colony forming units (CFU), antioxidant enzymes activity, membrane integrity by exclusion with Trypan blue and DNA integrity. The results were analyzed by analysis of variance with a 5% significance using the Tukey test. Results from P. zopfii characterization showed various cellular sizes, presence of autofluorescence, exponential microorganism growth throughout the incubation time and was not possible to determine the beginning of the death. Moreover it was found genotypes 1, 2 and 3 in the isolates in study. The production of hydrogen peroxide by neutrophils in the presence of algae was stimulated 5 times compared to the control, increase the activity of catalase (CAT) in 21% and glutathione reductase (GR) in 27% was seen in neutrophils; and there was no significant difference in CAT, GR and superoxide dismutase (SOD) activity produced by P. zopfii. P. zopfii was not engulfment by neutrophils. The system IAA/HRP inhibited the growth of the microorganism in 45, 82 and 88% in the times of 4, 6 and 9 hours of incubation, the activity of SOD, CAT, glutathione peroxidase (GPx) and GR increased respectively by 90, 120, 150%, and 3.4 times, decreased the viability of P. zopfii 10, 15, 20, 25 and 32% after the times of 4, 6, 8, 10 and 12 hours of incubation, and did not affect the integrity of DNA after 6 hours of incubation. As a conclusion, P. zopfii is highly resistant to the neutrophils and demonstrated to be susceptible to the effect microbicidal of system IAA/HRP

Prevalência da mastite bovina causada por Prototheca zopfii em rebanhos leiteiros, na região norte do Paraná

Prototheca has been reported as an etiological agent in the occurrence of bovine mastitis, although no case has been noticed in Paraná. The aim of this work was to determine the prevalence of this algae as an etiological agent of the bovine mastitis in dairy cattle in north Paraná. Clinical exams and CMT (California Mastitis Test) were done in all lactation animals raised in 20 dairy farms. The algae Prototheca zopfii was found in two animals of one farm. All the Prototheca zopfii strains were resistent against the antimicrobial agents tested.

Algas do gênero Prototheca têm sido relacionadas como agente etiológico na ocorrência de mastite bovina, entretanto, nenhum caso foi relatado no estado do Paraná. O presente trabalho objetivou determinar a prevalência desta alga, enquanto agente etiológico nas mastites bovinas, em rebanhos leiteiros, na região norte do Paraná. Foram visitadas 20 propriedades produtoras de leite e realizados exames clínicos e teste do CMT (California Mastitis Test) em todos os animais em lactação. A alga Prototheca zopfii foi isolada de dois animais de uma das propriedades. Todas as cepas isoladas de Prototheca zopfii mostraram-se resistentes aos antimicrobianos testados.

Prevalência da mastite bovina causada por Prototheca zopfii em rebanhos leiteiros, na região norte do Paraná

Prototheca has been reported as an etiological agent in the occurrence of bovine mastitis, although no case has been noticed in Paraná. The aim of this work was to determine the prevalence of this algae as an etiological agent of the bovine mastitis in dairy cattle in north Paraná. Clinical exams and CMT (California Mastitis Test) were done in all lactation animals raised in 20 dairy farms. The algae Prototheca zopfii was found in two animals of one farm. All the Prototheca zopfii strains were resistent against the antimicrobial agents tested.

Algas do gênero Prototheca têm sido relacionadas como agente etiológico na ocorrência de mastite bovina, entretanto, nenhum caso foi relatado no estado do Paraná. O presente trabalho objetivou determinar a prevalência desta alga, enquanto agente etiológico nas mastites bovinas, em rebanhos leiteiros, na região norte do Paraná. Foram visitadas 20 propriedades produtoras de leite e realizados exames clínicos e teste do CMT (California Mastitis Test) em todos os animais em lactação. A alga Prototheca zopfii foi isolada de dois animais de uma das propriedades. Todas as cepas isoladas de Prototheca zopfii mostraram-se resistentes aos antimicrobianos testados.