Performance of the tetra-primer PCR technique compared to PCR-RFLP in the search for rs12979860 (C/T) and rs8099917 (T/G) single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IFNL4 gene / Desempenho da técnica tetra-primer PCR em relação a PCR-RFLP na pesquisa de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) rs12979860 (C/T) e rs8099917 (T/G) no gene IFNL4

Single nucleotide polymorphisms (SNPs, rs12979860 e rs8099917) in the Interferon Lambda 4 gene (IFNL4, formerly IFNL3and/or IL28B) has been associated with failure in the innate immune response, sustained virological response in hepatitis C, and HTLV-1-associated myelopathy (HAM) development. To search for these polymorphisms several methodologies can be employed, such as sequencing, real-time or quantitative polymerase chain reaction (qPCR), restriction fragment length polymorphism analysis in PCR products (PCR-RFLP), and tetra-primer PCR. The present study compared the performance of the tetra-primer PCR in relation to the PCR-RFLP, both optimized in the Research HTLV Laboratory of the Center of Immunology of Instituto Adolfo Lutz in São Paulo. One hundred DNA samples obtained from patients of STD/Aids Reference Centre in São Paulo, previously analyzed for IL28B SNPs by PCR-RFLP were selected for analysis, after confirming that they represent all IL28B SNPs patterns described in the literature. The results obtained showed concordance between the PCR-RFLP and the tetra-primer PCR SNPs results, and because of the low cost, easy to perform, and minor employment of biological specimen and reagents, the tetra-primer PCR is of choice to be used in routine. (AU)

Polimorfismos de nucleotídeos únicos (single nucleotide polymorphisms, SNPs rs12979860 e rs8099917) no gene que codifica o Interferon Lambda 4 (IFNL4, antigamente IFNL3 e/ou IL28B) têm sido associados às falhas na resposta imune inata e resposta virológica sustentada na hepatite C, e a mielopatia associada ao HTLV-1 (HTLV-1-associated myelopathy, HAM). A pesquisa destes polimorfismos pode empregar diversas metodologias: sequenciamento, reação em cadeia da polimerase em tempo real ou quantitativa (quantitative polymerase chain reaction, qPCR), análise de fragmentos de restrição enzimática em produtos de PCR (restriction fragment length polymorphism in PCR products, PCR-RFLP) e a tetra-primer PCR. Este estudo comparou o desempenho da tetra-primer PCR em relação a PCR-RFLP, ambas otimizadas no Laboratório de Pesquisa em HTLV do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo. Foram selecionadas 100 amostras de DNA obtidas de pacientes do Centro de Referência e Treinamento em DST/Aids de São Paulo cujos SNPs na IL28B foram anteriormente determinados por PCR-RFLP e representaram todos os perfis descritos em literatura. Os resultados obtidos mostraram concordância entre elas, e pelo fato da tetra-primer PCR ter menor custo, ser de fácil execução, empregar menos tempo, insumos e material biológico, é a técnica de escolha para uso em rotina. (AU)

Phenotypic and genotypic characterization of Brucella abortus biovar 4 isolates from cattle in Brazil / Caracterização fenotípica e genotípica de isolados de Brucella abortus biovar 4 em bovinos no Brasil

ABSTRACT: The aim of the present study was to characterize (phenotypically and genotypically) two strains of Brucella abortus identified as belonging to biovar 4 isolated from cattle in Brazil. The strains were isolated from cervical bursitis from cattle in the states of Pará and Rio Grande do Sul, respectively. In the phenotypic identification, the isolates were positive in CO2 requirement, produced H2S, were resistant to basic fuchsin (20 µg / mL) and sensitive to thionin (20 µg / mL and 40 µg / mL) and presented M surface antigen, but A surface antigen is absent. The isolates were positive in the PCR for the bcsp31 gene (genus-specific) and in the AMOS-enhanced PCR, both isolates showed a band profile consistent with B. abortus biovar 1, 2 or 4. Moreover, both isolates also showed restriction patterns identical to the reference strain when tested by the omp2b PCR-RFLP. In genotyping using Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Analysis - MLVA (MLVA16), the isolates showed differences in several loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 and Bruce30); by Multiple Locus Sequence Typing (MLST), they also exhibited differences in sequence type (ST), strain 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) and strain 128/11 ST (22-1-1 -8-9-3-1-1-1). The extensive typing of B. abortus strains isolated from cattle in Brazil using different approaches confirmed the occurrence of rare B. abortus biovar 4 in the country.

RESUMO: O objetivo do presente estudo foi caracterizar (fenotipicamente e genotipicamente) duas cepas de Brucella abortus identificadas como pertencentes ao biovar 4 isolada de bovinos no Brasil. As cepas foram isoladas de bursite cervical de bovinos dos estados do Pará e Rio Grande do Sul, respectivamente. Na identificação fenotípica, os isolados foram positivos na exigência de CO2, produziram H2S, foram resistentes à fucsina básica (20 µg / mL) e sensíveis à tionina (20 µg / mL e 40 µg / mL) e apresentaram antígeno de superfície M, mas o antígeno de superfície A foi ausente. Os isolados foram positivos na PCR para o gene bcsp31 (gênero específico) e na PCR - AMOS, ambos os isolados apresentaram perfil de banda consistente com B. abortus biovar 1, 2 ou 4. Além disso, ambos os isolados também apresentaram padrões de restrição idêntica à cepa de referência quando testada pelo omp2b PCR-RFLP. Na genotipagem usando Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) - MLVA (MLVA16), os isolados apresentaram diferenças em vários loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 e Bruce30); no Multiple Locus Sequence Typing (MLST), os isolados também exibiram diferenças na sequência tipo (ST), amostra 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) e amostra 128/11 ST (22-1-1-8-9-3-1-1-1). A extensa tipagem de cepas de B. abortus isoladas de bovinos no Brasil por diferentes abordagens confirmou a rara ocorrência de B. abortus biovar 4 no país.

Molecular detection of Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Sarcocystis spp in tissues of Sus scrofa slaughtered in southern Brazil / Detecção molecular de Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Sarcocystis spp. em tecidos de Sus scrofa abatidos no Sul do Brasil

The aim of this study was to determine the presence of deoxyribonucleic acid (DNA) from Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp. and Neospora caninum, in tissues of wild boars slaughtered in southern Brazil. A total of 156 samples were collected from different organs of 25 wild boars, and DNA from at least one of the protozoa investigated was detected in 79 samples. To differentiate between infectious agents, restriction fragment length polymorphism was performed using the restriction enzymes DdeI and HpaII. For N. caninum, conventional PCR was performed with specific primers. The DNA of at least one of the studied pathogens was detected in each animal: 26.58% for T. gondii, 68.36% for Sarcocystis spp. and 5.06% for N. caninum. Coinfection between T. gondii and Sarcocystis spp. occurred in 14 animals, between T. gondii and N. caninum in only one male animal, between Sarcocystis spp. and N. caninum in a female, while co-infection with the three agents was equally observed in only one male animal. Considering the high frequency of detection and its zoonotic risk, especially T. gondii, it appears that wild boars can be potential sources of transmission of infectious agents and the adoption of monitoring measures in these populations should be prioritized.(AU)

O objetivo deste estudo foi determinar a presença de ácido desoxirribonucléico (DNA) de Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp. e Neospora caninum, em tecidos de javalis abatidos no sul do Brasil. Foram coletadas 156 amostras de diferentes órgãos de 25 javalis, sendo detectado o DNA de pelo menos um dos protozoários pesquisados em 79 amostras. Para diferenciar entre os agentes infecciosos, o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição, foi realizado usando-se as enzimas de restrição DdeI e HpaII. Para N. caninum, a PCR convencional foi realizada com "primers" específicos. O DNA de pelo menos um dos patógenos estudados foi detectado em cada animal: 26,58% para T. gondii, 68,36% para Sarcocystis spp. e 5,06% para N. caninum. Coinfecção entre T. gondii e Sarcocystis spp. ocorreu em 14 animais; entre T. gondii e N. caninum em apenas um animal macho; entre Sarcocystis spp. e N. caninum em uma fêmea, enquanto a coinfecção com os três agentes foi observada igualmente em apenas um animal macho. Considerando-se a alta frequência de detecção e seu risco zoonótico, especialmente T. gondii, constata-se que os javalis podem ser potenciais fontes de transmissão de agentes infecciosos, e a adoção de medidas de monitoramento nessas populações devem ser priorizadas.(AU)

Association of Kappa casein gene polymorphism with milk production traits in crossbred dairy cows / Associação do polimorfismo do gene Kappa-caseína com características de produção de leite em vacas leiteiras mestiças

Milk's qualitative and technological properties are greatly affected by genetic polymorphisms in the kappa-casein gene, and their polymorphisms may serve as informative markers of yield and composition. Thus, the objective of this study was to detect kappa-casein (kappa-CN) gene polymorphisms and their association with milk production traits in crossbred dairy cows. One hundred healthy crossbred (Friesian x Jenoubi) dairy animals between three and five years old were sampled for blood and milk during their first lactation. The genomic DNA was extracted from whole blood, and restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) was used to determine the genotype of the kappa-CN gene. As a consequence of the restriction digestion of this fragment with Hind III, it showed three different restriction patterns: BB (453 base pairs uncut), AB (453, 206, and 225 base pairs), and AA (206 and 225 base pairs). Based on genetic diversity, the AB genotype was the most predominant (n = 67), with a frequency of 0.67. A variant genotype of the kappa-CN gene was associated with milk production traits in crossbred dairy cows. Animals with the AA variant produced a higher milk yield and a higher percentage of fat, casein, protein, and solids not fat (SNF) (P≤0.05) (1.397kg, 0.75%, 0.31%, 0.27%, and 0.68%, respectively) than those with the BB variant. A logistic regression analysis confirmed that the kappa-CN genotypes increase milk yield and casein content. Therefore, genetic variants of the kappa-CN gene could be used as genetic markers for improving milk production traits in dairy cattle.(AU)

As propriedades qualitativas e tecnológicas do leite são muito afetadas por polimorfismos genéticos no gene kappa-caseína e esses polimorfismos podem servir como marcadores informativos de rendimento e composição. Assim, o objetivo deste estudo foi detectar polimorfismos do gene kappa-caseína (kappa-CN) e sua associação com características de produção de leite em vacas leiteiras mestiças. Cem animais mestiços (Freisian x Jenoubi) saudáveis, entre três e cinco anos de idade, foram amostrados durante a primeira lactação para sangue e leite. O DNA genômico foi extraído do sangue total e o polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA genômico (RFLP-PCR) foi usado para determinar o genótipo do gene kappa-CN. Em consequência da digestão de restrição deste fragmento com Hind III, ele apresentou três padrões de restrição diferentes: BB (453 pares de bases não cortadas), AB (453,206 e 225 pares de bases) eAA (206 e 225 pares de bases). Com base na diversidade genética, o genótipo AB foi o mais predominante (n = 67), com frequência de 0,67. Genótipo variante do gene kappa-CN foi associado com características de produção de leite em vacas leiteiras mestiças. Animais com a variante AA tiveram maior produção de leite e maior percentual de gordura, caseína, proteína e sólidos não gordurosos (SNG) (P≤0,05) (l,397kg, 0,75%, 0,31%, 0,27% e 0,68%, respectivamente) do que aqueles com variante BB. Uma análise de regressão logística confirmou que os genótipos kappa-CN aumentam a produção de leite e o teor de caseína. Portanto, variantes genéticas do gene kappa-CN podem ser usadas como marcadores genéticos para melhorar as características de produção de leite em bovinos leiteiros.(AU)

Phenotypic and genotypic characterization of Brucella abortus biovar 4 isolates from cattle in Brazi / Caracterização fenotípica e genotípica de isolados de Brucella abortus biovar 4 em bovinos no Brasil

The aim of the present study was to characterize (phenotypically and genotypically) two strains of Brucella abortus identified as belonging to biovar 4 isolated from cattle in Brazil. The strains were isolated from cervical bursitis from cattle in the states of Pará and Rio Grande do Sul, respectively. In the phenotypic identification, the isolates were positive in CO2 requirement, produced H2S, were resistant to basic fuchsin (20 µg / mL) and sensitive to thionin (20 µg / mL and 40 µg / mL) and presented M surface antigen, but A surface antigen is absent. The isolates were positive in the PCR for the bcsp31 gene (genus-specific) and in the AMOS-enhanced PCR, both isolates showed a band profile consistent with B. abortus biovar 1, 2 or 4. Moreover, both isolates also showed restriction patterns identical to the reference strain when tested by the omp2b PCR-RFLP. In genotyping using Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Analysis - MLVA (MLVA16), the isolates showed differences in several loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 and Bruce30); by Multiple Locus Sequence Typing (MLST), they also exhibited differences in sequence type (ST), strain 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) and strain 128/11 ST (22-1-1 -8-9-3-1-1-1). The extensive typing of B. abortus strains isolated from cattle in Brazil using different approaches confirmed the occurrence of rare B. abortus biovar 4 in the country.

O objetivo do presente estudo foi caracterizar (fenotipicamente e genotipicamente) duas cepas de Brucella abortus identificadas como pertencentes ao biovar 4 isolada de bovinos no Brasil. As cepas foram isoladas de bursite cervical de bovinos dos estados do Pará e Rio Grande do Sul, respectivamente. Na identificação fenotípica, os isolados foram positivos na exigência de CO2, produziram H2S, foram resistentes à fucsina básica (20 µg / mL) e sensíveis à tionina (20 µg / mL e 40 µg / mL) e apresentaram antígeno de superfície M, mas o antígeno de superfície A foi ausente. Os isolados foram positivos na PCR para o gene bcsp31 (gênero específico) e na PCR - AMOS, ambos os isolados apresentaram perfil de banda consistente com B. abortus biovar 1, 2 ou 4. Além disso, ambos os isolados também apresentaram padrões de restrição idêntica à cepa de referência quando testada pelo omp2b PCR-RFLP. Na genotipagem usando Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) - MLVA (MLVA16), os isolados apresentaram diferenças em vários loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 e Bruce30); no Multiple Locus Sequence Typing (MLST), os isolados também exibiram diferenças na sequência tipo (ST), amostra 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) e amostra 128/11 ST (22-1-1-8-9-3-1-1-1). A extensa tipagem de cepas de B. abortus isoladas de bovinos no Brasil por diferentes abordagens confirmou a rara ocorrência de B. abortus biovar 4 no país.

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan

Abstract Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3 and Pvmsp-3genes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3 and Pvmsp3 genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp-3 genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3genes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3 and Pvmsp-3 genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and showed a remarkable level of genetic diversity in the studied genes of circulating parasites in the study area. The results of this study will contribute in future studies about the genetic structure of parasite and vaccine development against the malaria.

Resumo O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3 e Pvmsp-3, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3 e Pvmsp3, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp-3, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3genes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3. Os genes Pvmsp-3 de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados de parasitas circulantes na área de estudo. Os resultados desse estudo contribuirão em estudos futuros sobre a estrutura genética do parasita e o desenvolvimento de vacinas contra a malária.

PCR-RLFP characterization of Leishmania spp. in domestic animals from the south-western border of Brazil / Caracterização de Leishmania spp. pela técnica de PCR-RFLP em animais domésticos da fronteira Oeste do Brasil

The aim of this study was to characterize Leishmania spp. from canine and feline samples using Polymerase Chain Reaction (PCR)- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). It was conducted in the southern region of Brazil, located at border crossings to Argentina and Uruguay. Samples were collected from 116 dogs (Canis lupus familiaris) and 89 cats (Felis catus). The PCR was performed to screen for an LT1 fragment from kinetoplast DNA (kDNA) target gene, and positive samples were subjected to a second PCR for an internal transcribed spacers (ITS1) region from ribosomal DNA (rDNA) target. RFLP was performed using the Haemophilus aegyptius (HAE III) restriction endonuclease (Fermentas ®). Positive samples by PCR ITS1 were sequenced and deposited in NCBI GenBank, and a phylogenetic analysis was developed. We found that 12.9% (15/116) of the samples from dogs were positive. All the 89 cat samples were negative. Positive samples were tested against Leishmania reference strains presenting different patterns in PCR-RFLP, and these samples showed bands denoting similarity to the standard species of Leishmania infantum, proven through sequencing and phylogenetic analysis. The RFLP technique, alone, was shown to be feasible for practical application and confirmation of the involved Leishmania spp.(AU)

O objetivo deste trabalho foi caracterizar espécies de Leishmania em amostras de caninos e felinos, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR)- polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). O estudo foi realizado na região de fronteira no sul do Brasil, divisa com Argentina e Uruguai. Amostras foram coletadas de 116 cães (Canis lupus familiaris) e 89 gatos (Felis catus). A PCR foi realizada com o gene alvo do fragmento LT1 do DNA do cinetoplasto (kDNA) para triagem e, as amostras positivas foram submetidas a uma segunda PCR com alvo ITS1 no DNA ribossomal (rDNA). O RFLP foi realizado com a endonuclease de restrição Haemophilus aegyptius (HAE III) (Fermentas ®). As sequências positivas no PCR-ITS1 foram depositadas no NCBI GenBank, além disso, a análise filogenética foi realizada. Foram detectadas 12,9% (15/116) amostras positivas em cães. Das 89 amostras de gatos todas foram negativas. Cepas de referência de Leishmania, com padrões diferentes na PCR-RFLP, e amostras positivas apresentaram similaridade das bandas com as espécies padrão de Leishmania infantum, o que foi comprovado no sequenciamento e análise filogenética. A técnica de RFLP, sozinha, demonstrou viabilidade para a aplicação prática e a confirmação das espécies de Leishmania spp. envolvidas.(AU)

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR-RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3ßgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3ß genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3ßgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3ß genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and showed a remarkable level of genetic diversity in the studied genes of circulating parasites in the study area. The results of this study will contribute in future studies about the genetic structure of parasite and vaccine development against the malaria.

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3ß, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3ß, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3ßgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3ß de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados de parasitas circulantes na área de estudo. Os resultados desse estudo contribuirão em estudos futuros sobre a estrutura genética do parasita e o desenvolvimento de vacinas contra a malária.

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3βgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3β genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp 3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3βgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3β genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and [...].

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3β, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3β, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp 3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3βgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3β de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados [...].

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3βgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3β genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp 3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3βgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3β genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and [...].(AU)

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3β, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3β, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp 3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3βgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3β de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados [...].(AU)

Standardization of molecular techniques for the detection and characterization of intestinal protozoa and other pathogens in humans

Background: The intrinsic sensitivity limitations of basic parasitological methods, along with the particular biological characteristics of parasites, make these methods ineffective to differentiate morphologically indistinguishable species. Molecular detection and characterization techniques could be used to overcome these problems. The purpose of this work was to standardize molecular polymerase chain reaction (PCR) techniques, described in the literature, for the detection and molecular characterization of intestinal protozoa and other pathogens in humans. Methods: DNA was extracted from human or animal feces, previously washed or cultured in Boeck Drbohlav's Modified Medium. DNA extraction was performed with Machery-Nagel extraction kits. The standardization of the PCR, nested-PCR or RFLP techniques was carried out according to the literature. For each molecular technique performed, the sensitivity of the test was determined based on the minimun quantity required of DNA (sensitivity A) and the minimum quantity of life forms that the test detected (sensitivity B). Results: Sensitivity A was 10 fg for G. duodenalis, 12.5 pg for Entamoeba histolytica or Entamoeba dispar, 50 fg for Cryptosporidium spp., 225 pg for Cyclospora spp. and 800 fg or 8 fg for Blastocystis spp. after performing a 1780 bp PCR or 310 bp nested PCR, respectively. The sensitivity B was 100 cysts for G. duodenalis, 500 cysts for E. histolytica or E. dispar, 1000 oocysts for Cyclospora spp. and 3600 or four vegetatives forms for PCR or nested PCR of Blastocystis spp., respectively. Conclusions: The molecular detection of protozoa and chromist was achieved and the molecular characterization allowed the genotyping of some of the parasites such as Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp., and Blastocystis spp. This study summarizes the molecular techniques for epidemiological studies in humans and animals, and helps in the investigation of their transmission sources in countries where intestinal parasites are a public health problem.(AU)

Outbreak of toxoplasmosis associated with muscular lesions in finishing pigs caused by an atypical Toxoplasma gondii genotype / Surto de toxoplasmose associado a lesões musculares em suínos de terminação causado por um genótipo atípico de T. gondii

Toxoplasma gondii infections are usually asymptomatic in pigs, and an acute clinical disease is rare in this host. This study aimed to determine the pathological and molecular aspects of an outbreak of fatal systemic toxoplasmosis in finishing pigs in Brazil. The outbreak occurred on a commercial finishing pig farm in the state of Santa Catarina in southern Brazil. The farm had 1500 pigs and 3.8% of mortality rate during the outbreak. The pigs had fever, anorexia, apathy, and locomotor deficits. Seven pigs were necropsied. Gross findings included multifocal to coalescent pale areas in skeletal muscles, lymphadenomegaly, hepatosplenomegaly, and non-colapsed lungs. The histological findings included granulomatous lymphadenitis, hepatitis and splenitis, necrotizing myositis, and lymphoplasmacytic interstitial pneumonia. Lung and liver lesions were occasionally accompanied by T. gondii parasitic structures. Positive immunolabeling for T. gondii tachyzoites and encysted bradyzoites was detected in all examined pigs. PCR-RFLP (11 markers) and microsatellite analysis (15 markers) identified the non-archetypal genotype #278 in pigs. This is the first report of systemic toxoplasmosis in pigs with muscle lesions and additionally shows the diversity of disease-causing T. gondii genotypes circulating in animals in Brazil.(AU)

As infecções por Toxoplasma gondii são geralmente assintomáticas em suínos, e uma doença clínica aguda é rara nessa espécie. Este estudo teve como objetivo determinar os aspectos patológicos e moleculares de um surto de toxoplasmose sistêmica fatal em suínos em terminação no Brasil. O surto ocorreu em uma granja comercial de suínos em terminação no estado de Santa Catarina, no sul do Brasil. A granja tinha 1500 suínos e a taxa de mortalidade durante o surto foi de 3,8%. Os suínos apresentaram febre, anorexia, apatia e déficits locomotores. Sete suínos foram necropsiados. Os achados macroscópicos incluíram áreas pálidas multifocais a coalescentes nos músculos esqueléticos, linfadenomegalia, hepatoesplenomegalia e pulmões não colapsados. Os achados histológicos incluíram linfadenite, hepatite, esplenite granulomatosa e miosite necrosante, assim como pneumonia intersticial linfoplasmocítica. Lesões pulmonares e hepáticas foram ocasionalmente acompanhadas por estruturas parasitárias de T. gondii. A imunomarcação positiva para taquizoítos e bradizoítos encistados de T. gondii foi observada em todos os suínos examinados. PCR-RFLP (11 marcadores) e análise de microssatélites (15 marcadores) identificaram o genótipo não arquetípico #278 em suínos. Este é o primeiro relato de toxoplasmose sistêmica em suínos com lesões musculares e, adicionalmente, demonstra a diversidade de genótipos de T. gondii causadores de doenças circulantes em animais no Brasil.(AU)

Técnicas biomoleculares aplicadas em hospedeiros intermediários da esquistossomose / Biomolecular techniques applied to intermediate hosts of Schistosomiasis

A esquistossomose é uma doença parasitária acometida por milhões de pessoas no mundo. Essa parasitose é transmitida por caramujos que servem de hospedeiros intermediários de helmintos digenéticos. A identificação correta das espécies transmissoras pode auxiliar no conhecimento epidemiológico da doença. Contudo, métodos convencionais de classificação podem ter resultado duvidoso, devido à variação intraespecífica entre os espécimes. Em virtude disso, esta revisão teve como objetivo descrever as principais técnicas moleculares que podem ser aplicadas, assim como o aprimoramento dos métodos ao longo do tempo. A PCR é uma técnica desenvolvida através da polimerização de DNA em cadeia realizada in vitro, onde se amplifica o DNA em múltiplas cópias, por replicação enzimática, sem necessidade de um organismo vivo. Na PCR, em tempo real, as fases de amplificação, detecção e quantificação são totalmente automatizadas, ocorrendo em simultâneo. Com a evolução da técnica convencional, foi surgindo a Proteína C Reativa ­ Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (PCR-RFLP), os microssatélites, e a PCR-RAPD. Através dessas variantes foi possível classificar, com precisão, as espécies transmissoras, fazer as análises da variabilidade genética intraespecífica e ampliar os estudos filogenéticos das populações. O conhecimento da aplicação de técnicas moleculares pode auxiliar em pesquisas relacionadas à epidemiologia e ao controle populacional dos vetores transmissores da esquistossomose mansônica.

Schistosomiasis is a parasitic disease that affects millions of people worldwide. This parasitosis is transmitted by snails that serve as intermediate hosts for digenetic helminths. The correct identification of the transmitting species can help in the epidemiological knowledge of the disease. However, conventional methods of classification may present questionable results due to intraspecific variation between specimens. As a result, this review aimed to describe the main molecular techniques that can be applied, as well as describe the improvement of the methods over time. PCR is a technique developed through the polymerization of DNA strands carried out in vitro, where it amplifies the DNA in multiple copies by enzymatic replication, without needing a living organism. In real-time PCR, amplification, detection and quantification phases are fully automated, occurring simultaneous. The evolution of the conventional technique resulted in the advent of Protein C Reactive - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP), microsatellites, and Protein C Reactive ­ Random Amplification of Polymorphic DNA (PCR-RAPD). Through these variants it was possible to accurately classify the transmitting species, perform the analysis of intraspecific genetic variability and expand the phylogenetic studies of the populations. Knowledge of the application of molecular techniques can assist in research related to the epidemiology and population control of these vectors that transmit schistosomiasis mansoni.

Acerola shoot proliferation induced by a phytoplasma enclosed in the subgroup 16SrIII-F

Acerola bushes were observed showing symptoms of shoot proliferation, generalized stunting, yellowing and decline. Since these symptoms are typically induced by phytoplasmas, this survey was carried out with the aim of detecting, identifying and classifying the supposed phytoplasma present in symptomatic bushes. Total DNA was extracted from symptomatic and asymptomatic samples and used in nested PCR conducted by the primer pairs R16mF2/mR1 followed by R16F2n/R2. Amplifications of expected genomic fragments of 1.2 kb revealed the presence of phytoplasma in 73 % of the symptomatic samples. Molecular analyses, using computer-simulated RFLP patterns, similarity coefficient calculation and phylogenetic analysis allowed for classifying the bacterium as a 'Candidatus Phytoplasma pruni' - related strain (subgroup 16SrIII-F). The phytoplasma induced the same symptoms in healthy acerola plants inoculated by grafting and showed molecular identity with the strain identified in naturally infected bushes. Although various strains belonging to distinct subgroups within the 16SrIII group have been previously identified in Brazil, this is the first report of the presence of a representative of the 16SrIII-F subgroup in the Brazilian agroecosystem. Considering that phytoplasmas can be systemically distributed throughout the plant and acerola plants are vegetatively propagated, it is recommended that propagation material be obtained from mother plants free of the pathogen.

Phytoplasma of 16SrVII-B subgroup associated to shoot proliferation in Physalis peruviana plants

Physalis is an herbaceous species native to the Andes region. Currently, it is cultivated in various Brazilian states due to the economic interest of growers for this new fruit. Physalis plants grown in the field showed symptoms of shoot proliferation, leaf malformation, and chlorosis. Since these symptoms are commonly induced by phytoplasmas, this study investigated to confirm the presence of these prokaryotes in symptomatic plants. After DNA extraction from symptomatic and asymptomatic plants, phytoplasmas were found in all affected plants through the nested PCR. Examination by transmission electron microscopy (TEM) using appropriately prepared segments of leaf veins allowed the visualization of typical pleomorphic cells of phytoplasmas in the phloem of symptomatic plants. The computer-simulated RFLP patterns and the phylogenetic analysis allowed identifying the detected phytoplasmas as a 'Candidatus Phytoplasma fraxini'-related strain belonging to the 16SrVII-B subgroup. Moreover, physalis was identified as an additional host species for phytoplasmas in the 16SrVII group, expanding the current knowledge on the host range of phytoplasmas in this group.

Molecular characterization of Kappa-casein and beta-lactoglobulin genes in Anatolian Black cattle and Holstein breeds / [Caracterização molecular dos genes Kappa-casein e beta-lactoglobulina em gado negro anatoliano e raças Holstein]

κ-Cn and ß-lactoglobulin are important candidate genes associated with milk yield and milk protein content. The present investigation is carried out to determine the polymorphisms status of κ-Cn and ß-lactoglobulin genes in Anatolian Black cattle and Holstein breeds. PCR-RFLP technique was used to determine Kappa-Casein and ß-lactoglobulin polymorphisms in both cattle breeds. The allele frequency of Anatolian Black cattle in terms of κ-Cn and ß-lactoglobulin genes were 0.50 (A) 0.50 (B) and 0.20 (A) 0.80 (B) respectively, whereas in Holstein were 0.29 (A) 0.71 (B) and 0.44 (A) 0.56 (B) respectively. The chi-square test showed that each cattle breed was in Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05).

κ-Cn e ß-lactoglobulina são importantes genes candidatos associados à produção de leite e ao teor de proteína do leite. A presente investigação é realizada para determinar o status de polimorfismos dos genes κ-Cn e ß-lactoglobulina nas raças Anatolian Black cattle e Holstein. A técnica PCR-RFLP foi utilizada para determinar os polimorfismos Kappa-Casein e ß-lactoglobulina em ambas as raças de gado. A freqüência dos alelos do gado negro anatólio em termos de κ-Cn e ß-lactoglobulina foi de 0,50 (A) 0,50 (B) e 0,20 (A) 0,80 (B) respectivamente, enquanto que em Holstein foi de 0,29 (A) 0,71 (B) e 0,44 (A) 0,56 (B) respectivamente. O teste do qui-quadrado mostrou que cada raça bovina estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg (P>0,05).

Molecular characterization and association of lactoferrin gene to subclinical mastitis in goats (Capra hircus)

The study characterized the lactoferrin (Lf) mRNA gene in different goat breeds in the Philippines and determined its association with subclinical mastitis (SCM). The study involved collection of milk at second week of lactation (n=75) and blood samples (n=5) to obtain extracted RNA and using cDNA to amplify Lf gene through polymerase chain reaction. The nucleotide and amino acid sequences were determined and used as reference in the evaluation of phylogenetic relationship. Amplified products were utilized for RFLP analysis before determining the association of the gene with SCM. Results of the study demonstrated that Lf gene in goats registered a molecular weight of 2135. Nucleotide and amino acid sequence of Lf gene revealed high similarity (99%) in Saanen, Anglo-Nubian and Philippine native goats with that of Capra hircus (U53857) Lf gene submitted to GenBank. Phylogenetic studies showed that Lf gene of Anglo-Nubian, Saanen and Native goats clade together with Lf gene of C. hircus (U53857). Three genotypes in goats were documented using the restriction enzymes AluI and HaeIII. Based on the Statistical analysis, association (comp 5.65, p = 0.0308) has been established between the Lf genes of goats with genotype BB to SCM using HaeIII restriction enzyme.(AU)

Molecular characterization of Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp. in raw kibbeh and other meat samples commercialized in Botucatu, Southeastern Brazil / Caracterização molecular de Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp. em amostras de quibe cru e de outras carnes comercializadas em Botucatu, Região Sudeste do Brasil

Abstract Toxoplasmosis occurs worldwide causing economic losses to the animal production and problems to the public health. The study aimed to detect Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp.in 141 meat products from commercial meat cuts of pork, beef, and kibbeh sold in commercial markets from Botucatu, SP, Brazil. Samples were bioassayed in mice to isolate the parasite, and the parasite DNA detected by PCR targeting the 529 base pairs repeat element region (PCR-529-bp). All samples resulted negative on bioassay, whereas PCR positive for 9 (6,38%), distributed as 5/48 beef, 3/49 pork, and 1/44 kibbeh. PCR-positive were investigated for the the parasite genotype using multiplex-, nested-, and RFLP-PCR for 11 markers (SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, B-TUB, GRA6, L358, c22-8, c29-6, PK1, Apico). Complete genotype was determined on just one PCR-positive sample that matched MAS, TgCkBr89 and TgCkBr147 isolates already identified. In addition, nested- and RFLP-PCR targeting 18S rRNA was run for all PCR-positive samples and, the products, sequenced and aligned to the GenBank at NCBI website. Four samples showed 100% homology with T. gondii (GenBank #L37415.1), three with Sarcocystis hominis (GenBank #AF006471.1), two Sarcocystis cruzi (GenBank #AF176934.1), and one Sarcocystis hirsuta (GenBank #AF006469.1), indicating the circulation of T. gondii and Sarcocystis spp.

Resumo A toxoplasmose está mundialmente distribuída e causa perdas na produção animal e problemas de saúde pública. Objetivou-se detectar Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp. em 141 produtos cárneos de origem suína (49), bovina (48) e de quibe cru (44), comercializados em mercados de Botucatu, SP, Brazil. Realizou-se bioensaio das amostras em camundongos para isolamento do parasita, e detecção do DNA pela reação em cadeia pela polimerase, tendo como alvo a região do elemento repetitivo de 529 pares de bases (PCR-529-bp). Todas as amostras foram negativas ao bioensaio e 9 (6,38%) positivas à PCR, sendo 5/48 bovinas, 3/49 suínas e 1/44 quibe. Determinou-se a genotipagem das amostras positivas pela multiplex-, nested- e RFLP-PCR com 11 marcadores (SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, B-TUB, GRA6, L358, c22-8, c29-6, PK1, Apico). Obteve-se genótipo completo em uma amostra, semelhante a outros já identificados (MAS, TgCkBr89 e TgCkBr147). Nested- e RFLP-PCR do gene 18S rRNA das amostras positivas à PCR foram realizadas, e os produtos da nested-PCR, sequenciados e alinhados com dados do GenBank no NCBI. Quatro apresentaram 100% de homologia com T. gondii (L37415.1), duas Sarcocystis hominis (AF006471.1), duas Sarcocystis cruzi (AF176934.1), uma Sarcocystis hirsuta (AF006469.1), indicando a circulação de T. gondii e Sarcocystis spp.

Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa isolated from lower respiratory tract of ICU patients / Epidemiologia molecular de Pseudomonas aeruginosa isolada em pacientes com infecções do trato respiratório inferior admitidos em UTI

Lower respiratory tract infections (LRTIs) caused by Pseudomonas aeruginosa are the most common infection among hospitalized patients, associated with increased levels of morbidity, mortality and attributable health care costs. Increased resistant Pseudomonas worldwide has been quite meaningful to patients, especially in intensive care unit (ICUs). Different species of Pseudomonas exhibit different genetic profile and varied drug resistance. The present study determines the molecular epidemiology through DNA fingerprinting method and drug resistance of P. aeruginosa isolated from patients with LTRIs admitted in ICU. A total of 79 P. aeruginosa isolated from patients with LRTIs admitted in ICU were characterized by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Repetitive Extrapalindromic PCR (REP-PCR). Antibiotic resistance was determined by minimum inhibitory concentration (MIC) assay while MDR genes, viz, blaTEM, blaOXA, blaVIM, blaCTX-M-15 were detected by polymerase chain reaction (PCR). Of the 137 Pseudomonas sp isolated from ICU patients, 57.7% of the isolates were reported to be P. aeruginosa. The overall prevalence of P. aeruginosa among the all included patients was 34.5%. The RAPD analysis yielded 45 different patterns with 72 clusters with 57% to 100% similarity level. The RFLP analysis yielded 8 different patterns with 14 clusters with 76% to 100% similarity level. The REP PCR analysis yielded 37 different patterns with 65 clusters with 56% to 100% similarity level. There was no correlation among the different DNA patterns observed between the three different methods. Predominant of the isolates (46.8%) were resistant to amikacin. Of the 79 isolates, 60.8% were positive for blaTEM gene and 39.2% were positive for blaOXA gene. P. aeruginosa was predominantly isolated from patients with LRTIs admitted in ICU. The difference in the similarity level observed between the three DNA fingerprinting methods indicates that there is high inter-strain variability. The high genetic variability and resistance patterns indicates that we should continuously monitor the trend in the prevalence and antibiotic resistance of P. aeruginosa especially in patients with LRTIs admitted in ICU.(AU)

Infecções do trato respiratório inferior (ITRIs) são as infecções mais comuns entre pacientes internados em unidade de terapia intensiva (UTI). Pseudomonas aeruginosa é a causa mais comum de ITRIs e está associada ao aumento da mortalidade. Diferentes espécies de Pseudomonas exibem diferentes perfis genéticos e resistência variada as drogas. O presente estudo determina a epidemiologia molecular através do método de fingerprinting de DNA e resistência as drogas de P. aeruginosa isoladas de pacientes com LTRIs internados em UTI. Um total de 79 P. aeruginosa isoladas de pacientes com ITRIs internados em UTI foram caracterizados por Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP), DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD) e PCR Extrapalindrômico Repetitivo (REP-PCR). A resistência aos antibióticos foram determinadas pelos ensaios de concentrações inibitória mínima (MIC), enquanto os genes MDR, blaTEM, blaOXA, blaVIM, blaCTX-M-15 foram detectados pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Das 137 Pseudomonas sp isoladas de pacientes de UTI, 57,7% dos isolados foram relatados como P. aeruginosa. A prevalência geral de P. aeruginosa entre os pacientes incluídos foram de 34,5%. A análise RAPD renderam 45 padrões diferentes com 72 clusters com nível de similaridade de 57% a 100%. A análise RFLP renderam 8 padrões diferentes com 14 clusters com 76% a 100% de similaridade. A análise de PCR do REP produziram 37 padrões diferentes com 65 clusters com nível de similaridade de 56% a 100%. Não houveram correlações entre os diferentes padrões de DNA observados entre os três diferentes métodos. Predominantes dos isolados (46,8%) eram resistentes à amicacina. Dos 79 isolados, 60,8% foram positivos para o gene blaTEM e 39,2% foram positivos para o gene blaOXA. P. aeruginosa foi predominantemente isolado de pacientes com ITRIs internados em UTI. A diferença no nível de similaridade observado entre os três métodos de fingerprinting do DNA indica que há alta variabilidade inter-strain. A alta variabilidade genética e os padrões de resistência indicam que devemos monitorar continuamente a tendência na prevalência e resistência a antibióticos de P. aeruginosa, especialmente em pacientes com ITRIs internados em UTI.(AU)

Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa isolated from lower respiratory tract of ICU patients / Epidemiologia molecular de Pseudomonas aeruginosa isolada em pacientes com infecções do trato respiratório inferior admitidos em UTI

Lower respiratory tract infections (LRTIs) caused by Pseudomonas aeruginosa are the most common infection among hospitalized patients, associated with increased levels of morbidity, mortality and attributable health care costs. Increased resistant Pseudomonas worldwide has been quite meaningful to patients, especially in intensive care unit (ICUs). Different species of Pseudomonas exhibit different genetic profile and varied drug resistance. The present study determines the molecular epidemiology through DNA fingerprinting method and drug resistance of P. aeruginosa isolated from patients with LTRIs admitted in ICU. A total of 79 P. aeruginosa isolated from patients with LRTIs admitted in ICU were characterized by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Repetitive Extrapalindromic PCR (REP-PCR). Antibiotic resistance was determined by minimum inhibitory concentration (MIC) assay while MDR genes, viz, blaTEM, blaOXA, blaVIM, blaCTX-M-15 were detected by polymerase chain reaction (PCR). Of the 137 Pseudomonas sp isolated from ICU patients, 57.7% of the isolates were reported to be P. aeruginosa. The overall prevalence of P. aeruginosa among the all included patients was 34.5%. The RAPD analysis yielded 45 different patterns with 72 clusters with 57% to 100% similarity level. The RFLP analysis yielded 8 different patterns with 14 clusters with 76% to 100% similarity level. The REP PCR analysis yielded 37 different patterns with 65 clusters with 56% to 100% similarity level. There was no correlation among the different DNA patterns observed between the three different methods. Predominant of the isolates (46.8%) were resistant to amikacin. Of the 79 isolates, 60.8% were positive for blaTEM gene and 39.2% were positive for blaOXA gene. P. aeruginosa was predominantly isolated from patients with LRTIs admitted in ICU. The difference in the similarity level observed between the three DNA fingerprinting methods indicates that there is high inter-strain variability. The high genetic variability and resistance patterns indicates that we should continuously monitor the trend in the prevalence and antibiotic resistance of P. aeruginosa especially in patients with LRTIs admitted in ICU.

Infecções do trato respiratório inferior (ITRIs) são as infecções mais comuns entre pacientes internados em unidade de terapia intensiva (UTI). Pseudomonas aeruginosa é a causa mais comum de ITRIs e está associada ao aumento da mortalidade. Diferentes espécies de Pseudomonas exibem diferentes perfis genéticos e resistência variada as drogas. O presente estudo determina a epidemiologia molecular através do método de fingerprinting de DNA e resistência as drogas de P. aeruginosa isoladas de pacientes com LTRIs internados em UTI. Um total de 79 P. aeruginosa isoladas de pacientes com ITRIs internados em UTI foram caracterizados por Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP), DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD) e PCR Extrapalindrômico Repetitivo (REP-PCR). A resistência aos antibióticos foram determinadas pelos ensaios de concentrações inibitória mínima (MIC), enquanto os genes MDR, blaTEM, blaOXA, blaVIM, blaCTX-M-15 foram detectados pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Das 137 Pseudomonas sp isoladas de pacientes de UTI, 57,7% dos isolados foram relatados como P. aeruginosa. A prevalência geral de P. aeruginosa entre os pacientes incluídos foram de 34,5%. A análise RAPD renderam 45 padrões diferentes com 72 clusters com nível de similaridade de 57% a 100%. A análise RFLP renderam 8 padrões diferentes com 14 clusters com 76% a 100% de similaridade. A análise de PCR do REP produziram 37 padrões diferentes com 65 clusters com nível de similaridade de 56% a 100%. Não houveram correlações entre os diferentes padrões de DNA observados entre os três diferentes métodos. Predominantes dos isolados (46,8%) eram resistentes à amicacina. Dos 79 isolados, 60,8% foram positivos para o gene blaTEM e 39,2% foram positivos para o gene blaOXA. P. aeruginosa foi predominantemente isolado de pacientes com ITRIs internados em UTI. A diferença no nível de similaridade observado entre os três métodos de fingerprinting do DNA indica que há alta variabilidade inter-strain. A alta variabilidade genética e os padrões de resistência indicam que devemos monitorar continuamente a tendência na prevalência e resistência a antibióticos de P. aeruginosa, especialmente em pacientes com ITRIs internados em UTI.