Experimental Frog Virus 3 infection using Brazilian strain: amphibians susceptibility / Infecção experimental utilizando estirpe brasileira de Frog Virus 3: suceptibilidade de anfíbios

An alarming number of global warnings concerning amphibian mortality outbreaks have been released in recent years. Emerging diseases stand out as the main potential causes. Ranavirus is a worldwide-spread highly infectious disease capable of affecting even other ectothermic animals such as fish and reptiles. One major issue regarding this pathology is the lack of clinical signs before it leads up to death. Aiming at having a better understanding of anurans susceptibility, this study analyzed bullfrog (Lithobates catesbeianus) survival rate, when challenged with three doses of a Brazilian strain of Frog Virus 3 (FV3). The qPCR analysis indicated a low infectivity rate in these animals both as larvae and as adults. To elucidate the results, the following hypothesis was performed: 1) The amount of inoculum used on the frogs was insufficient to trigger an infection; 2) For the FV3 to produce clinical signs in this species, there is the need for a cofactor; 3) The animals did undergo FV3 infection but recovered in the course of the experiment, and 4) The inoculum utilized might have been low-virulence. Finally, the presence of actual clinical signs of ranavirus is discussed, with the more likely hypothesis.(AU)

Um número alarmante de notificações globais sobre surtos de mortalidade de anfíbios tem sido realizado nos últimos anos. As doenças emergentes destacam-se como as principais causas potenciais. O ranavírus é uma doença altamente infecciosa disseminada em todo o mundo, capaz de afetar até outros animais ectotérmicos como peixes e répteis. Uma questão importante em relação a essa patologia é a falta de sinais clínicos antes de levar à morte. Com o objetivo de compreender melhor a suscetibilidade dos anuros, o presente trabalho analisou a taxa de sobrevivência de rãs-touro (Lithobates catesbeianus), desafiadas com três doses de uma estirpe brasileira do Frog virus 3 (FV3). A análise de qPCR indicou baixa taxa de infectividade nesses animais, tanto como larvas quanto como adultos. Procurando esclarecer os resultados, foram formuladas as seguintes hipóteses: 1) A quantidade de inóculo aplicada nas rãs foi insuficiente para desencadear uma infecção; 2) Para que o FV3 dê sinais clínicos nesta espécie, é necessário um cofator; 3) Os animais sofreram infecção por FV3, mas se recuperaram no decorrer do experimento, e 4) O inóculo utilizado pode ter sido de baixa virulência. Finalmente, foi discutida a presença de sinais clínicos reais de ranavírus e levantada a hipótese mais provável(AU)

Experimental Frog Virus 3 infection using Brazilian strain: amphibians susceptibility / Infecção experimental utilizando estirpe brasileira de Frog Virus 3: suceptibilidade de anfíbios

An alarming number of global warnings concerning amphibian mortality outbreaks have been released in recent years. Emerging diseases stand out as the main potential causes. Ranavirus is a worldwide-spread highly infectious disease capable of affecting even other ectothermic animals such as fish and reptiles. One major issue regarding this pathology is the lack of clinical signs before it leads up to death. Aiming at having a better understanding of anurans susceptibility, this study analyzed bullfrog (Lithobates catesbeianus) survival rate, when challenged with three doses of a Brazilian strain of Frog Virus 3 (FV3). The qPCR analysis indicated a low infectivity rate in these animals both as larvae and as adults. To elucidate the results, the following hypothesis was performed: 1) The amount of inoculum used on the frogs was insufficient to trigger an infection; 2) For the FV3 to produce clinical signs in this species, there is the need for a cofactor; 3) The animals did undergo FV3 infection but recovered in the course of the experiment, and 4) The inoculum utilized might have been low-virulence. Finally, the presence of actual clinical signs of ranavirus is discussed, with the more likely hypothesis.(AU)

Um número alarmante de notificações globais sobre surtos de mortalidade de anfíbios tem sido realizado nos últimos anos. As doenças emergentes destacam-se como as principais causas potenciais. O ranavírus é uma doença altamente infecciosa disseminada em todo o mundo, capaz de afetar até outros animais ectotérmicos como peixes e répteis. Uma questão importante em relação a essa patologia é a falta de sinais clínicos antes de levar à morte. Com o objetivo de compreender melhor a suscetibilidade dos anuros, o presente trabalho analisou a taxa de sobrevivência de rãs-touro (Lithobates catesbeianus), desafiadas com três doses de uma estirpe brasileira do Frog virus 3 (FV3). A análise de qPCR indicou baixa taxa de infectividade nesses animais, tanto como larvas quanto como adultos. Procurando esclarecer os resultados, foram formuladas as seguintes hipóteses: 1) A quantidade de inóculo aplicada nas rãs foi insuficiente para desencadear uma infecção; 2) Para que o FV3 dê sinais clínicos nesta espécie, é necessário um cofator; 3) Os animais sofreram infecção por FV3, mas se recuperaram no decorrer do experimento, e 4) O inóculo utilizado pode ter sido de baixa virulência. Finalmente, foi discutida a presença de sinais clínicos reais de ranavírus e levantada a hipótese mais provável(AU)

Utilização da rã-touro americana (Lithobates catesbeianus) como modelo experimental para infecção por ranavírus

Os anfíbios figuram entre um dos grupos mais diversos e de importância ecológica para o meio em que habitam porém, a redução da diversidade em nível global e a ameaça de extinção de diversas espécies os trouxe a mais uma preocupante posição de destaque. Nas últimas décadas, diversos fatores foram listados como os possíveis agentes para o declínio, em especial as causas de origem antrópica, porém as doenças emergentes, como a quitridiomicose e a ranavirose, se mostraram fortes pressões negativas a esta comunidade. A ranavirose é o termo dado a doença provocada pelos vírus do gênero ranavírus, em especial a espécie Frog virus 3 (FV3) que é a mais estudada. Sua pluralidade de hospedeiros ectotérmicos (peixes, répteis e anfíbios), distribuição geográfica abrangente e altas taxas de infectividade e letalidade tornaram a doença de notificação obrigatória por órgãos reguladores nacionais e internacionais. No país ainda existe uma incipiência de estudos a qual dificulta estimar qual a real situação de disseminação viral. Apesar de reportes de casos no país desde 2003 a única espécie atualmente afetada é a Lithobates castebeianus, popularmente conhecida como rã-touro Americana. Em nosso estudo a utilizamos como um modelo experimental para avaliar o processo de infecção que acomete os animais e tentar compreender sua evolução clínica. Para isso utilizamos um controle negativo, sem a presença viral, e três tratamentos com diferentes concentrações virais (T1: 1,9 x 10¹ p.f.u./0,05mL; T2: 1,9x 103 p.f.u/0,05mL e T3:3,1 x 105 p.f.u/0,05mL). Durante 21 dias os animais foram observados buscando manifestação de sinais clínicos. Análises moleculares de PCR convencional e Tempo-Real foram utilizadas para confirmar e quantificar a presença viral nos animais infectados, assim como análises histológicas buscaram correlacionar e avaliar as lesões observadas . Neste estudo demonstramos a suscetibilidade da rã-touro pode como um modelo apropriado para esta patologia, em especial quando relacionada a aquicultura.

Amphibians are among one of the most diverse and ecologically important groups in the environment they inhabit, but the reduction of diversity on a global level and the threat of extinction of several species has brought them to another worrying position. In recent decades, several factors were listed as potential agents for the decline, especially the causes of anthropogenic origin, but emerging diseases such as chytridmicosis and ranavirose, have shown strong negative contributions to this community. Ranavirose is the term given to the disease caused by viruses of the genus ranavirus, especially the Frog virus 3 (FV3) species that is the most studied. His plurality of ectothermic hosts (fish, reptiles and amphibians), wide geographic distribution and high rates of infectivity and lethality made a notifiable disease required by national and international regulatory bodies. In the country there is still incipient studies which makes it difficult to estimate what the actual viral spread situation. Although case reports in the country since 2003 the only species currently affected is Lithobates castebeianus, popularly known as the American bullfrog. In our study we used it as an experimental model to evaluate the infection process that affects the animals and try to understand their clinical evolution. For this we used a negative control, without viral presence, and three treatments with different viral concentrations (T1: 1,9 x 10¹ p.f.u./0,05mL; T2: 1,9x 103 p.f.u/0,05mL e T3:3,1 x 105 p.f.u/0,05mL). For 21 days the animals were observed seeking manifestation of clinical signs. Molecular analyzes of conventional and real-time PCR were used to confirm and quanitify viral presence on infected animals, as well as correlate the histological tissue damage were observed. In this study we show whether bullfrog can be used as an appropriate model for this pathology, especially when related to aquaculture

Detecção molecular de Ranavirus em espécies de anfíbios anuros selvagens da região centro-leste do estado de São Paulo

O objetivo do trabalho foi realizar investigação sobre ocorrência de ranavirose, infecção causada por vírus do gênero Ranavirus, família Iridoviridiae, em anfíbios anuros silvestres nos municípios de Porto Ferreira e Pirassununga, cidades da região centro-leste do estado de São Paulo, Brasil, utilizando diagnóstico molecular. Ao todo, 40 anuros adultos silvestres da espécie Leptodactylus fuscus foram capturados nos municípios citados, sendo coletados três órgãos alvos (fígado, baço e rins) de replicação viral, com registro de eventuais alterações macroscópicas nesses órgãos, e dos quais extraiu-se DNA. Na sequencia, fez-se a reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para o gene MCP (major capsid protein) de Frog Virus 3 (FV3), ranavírus circulante no Brasil, com isolado de FV3 pertencente ao biobanco do Laboratório de Higiene Zootécnica da FZEA-USP empregado como controle positivo e água livre de nuclease como controle negativo. Como resultados, em relação às alterações macroscópicas, somente um espécime apresentou hepatoesplenomegalia e hipopigmentação do coração. No entanto, ao diagnóstico molecular, nenhum dos 40 animais amostrados foi positivo à ranavirose. Tal resultado pode estar associado tanto a fatores intrínsecos (espécie, idade, resposta imune) como extrínsecos ao hospedeiro (alterações ambientais, patogenicidade viral). Em paralelo, em rãs de criação comercial, surtos por FV3 já foram detectados em vários ranários do país; contudo, essa é a primeira vez que uma prospecção para ranavirose é realizada especificamente com representantes da espécie Leptodactylus fuscus, em municípios da região centro-leste do estado de São Paulo. Assim, são necessárias mais pesquisas com espécies silvestres de rãs, particularmente no entorno de ranários com histórico de animais positivos para FV3, para melhor conhecimento da epidemiologia e dinâmica de transmissão da ranavirose entre rãs silvestres.

The objective of this study was to investigate the occurrence of ranavirus infection caused by virus belonging to genus Ranavirus, Iridoviridiae family, in wild anuran amphibians from Porto Ferreira and Pirassununga municipalities, located in the central-eastern region of the state of São Paulo, Brazil, using molecular diagnostics. In all, 40 wild adult anurans of the species Leptodactylus fuscus were captured in the mentioned municipalities, and three target organs (liver, spleen and kidneys) of the viral replication were collected, being possible macroscopic changes in these organs recorded, and from which DNA was extracted. In the sequence, the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using primers specific for the MCP (major capsid protein) gene of Frog Virus 3 (FV3), a circulating ranavirus in Brazil, with a FV3 isolate belonging to the biobank of the Laboratory of Zootechnical Hygiene of FZEA-USP employed as positive control and nuclease-free water as negative control. As a result, in relation to macroscopic alterations, only one specimen showed hepatosplenomegaly and heart hypopigmentation. However, for molecular diagnostics, none of the 40 animals sampled were positive for ranavirus. This result may be associated to both intrinsic (species, age, immune response) and extrinsic (environmental changes, viral pathogenicity) factors to the host. In parallel, FV3 outbreaks have already been detected in several frog farms in the country. However, this is the first time that a prospection for ranavirus infection is performed specifically with specimens of the Leptodactylus fuscus from municipalities in the central-eastern region of the state of São Paulo. Thus, more studies on wild-type frogs are needed, particularly in the settings of frog farms with positive animal history for FV3, to better understand the epidemiology and dynamics of ranavirus transmission among wild frogs.

Rastreamento e caracterização molecular de Ranavírus em rãs-touro provenientes de ranários na região Centro-Sul do Brasil

As populações de anfíbios estão em declínio mundial e as doenças emergentes vem acelerando esse processo. O FV3, espécie de DNA vírus, pertencente a família Iridoviridae e gênero Ranavírus é uma doença emergente responsável por surtos de mortalidade em anfíbios silvestres e cativos e já alcançou cinco continentes. No Brasil a ranicultura teve início na década de 1930 e a espécie cultivada desde então para fins comerciais é a Lithobates catesbeianus, popularmente denominada rã-touro. A ranicultura é uma atividade consolidada no país, mas alguns produtores enfrentam problemas com a disseminação de patógenos dentro da sua propriedade, principalmente nos sistemas atuais de criação onde a densidade é elevada. Existem ocorrências antecedentes de ranavirose em rãs cativas nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil mas nenhum registro em ambiente natural. Nesse estudo oito ranários da Região Centro-Sul do Brasil foram submetidos a testes a fim de detectar a presença de FV3 e, para tal 235 animais divididos entre adultos e girinos foram submetidos a PCR convencional com três pares de primers MCP1, MCP2 e MCPRV2. Das oito instalações uma foi Ranavírus positiva. Nesta mesma propriedade, em dois períodos de coleta diferente, houve a manifestação em forma assintomática e a outra em forma virulenta, ocasionando 90% de mortalidade no ranário. As amostras foram encaminhadas para sequenciamento no método Sanger com posterior alinhamento no Bioedit e construção de filogenia por máxima verossimilhança no software IQ-tree por modelo de substituição TPM2+G4 com 1000 replicatas. A árvore confeccionada caracterizou as linhagens virais encontradas como FV3 e ambas se incorporaram ao clado das demais sequências já detectadas no Brasil. Os diferentes perfis infecciosos e o agrupamento de todas as sequências brasileiras indica que o vírus se estabeleceu no país e sofreu leves alterações genéticas conforme seu afastamento geográfico.

Amphibian populations are declining worldwide and emerging diseases have been accelerating this process. FV3, a species of DNAvirus, belonging to the family Iridoviridae and genus Ranavirus is an emerging disease responsible for mortality outbreaks in wild and captive amphibians and has reached five continents. In Brazil, raniculture began in the 1930s and the species cultivated since then for commercial purposes is Lithobates catesbeianus, popularly known as bullfrog. Ranching is a consolidated activity in the country but some producers face problems with the spread of pathogens within their property, especially in current breeding systems where density is high. There are antecedent occurrences of ranavirose in captive frogs in the Center-West and Southeast regions of Brazil but no record in a natural environment. In this study, eight ranks from the Center-South Region of Brazil were submitted to tests to detect the presence of FV3 and for that 235 animals divided between adults and tadpoles were submitted to conventional PCR with three pairs of primers MCP1, MCP2 and MCPRV2. Of the eight facilities one was Ranavirus positive. In same farm, in two different periods of collection, the manifestation was asymptomatic and the other in a virulent form, causing 90% mortality in the frogculture.The samples forwarded for sequencing in the Sanger method with later alignment in the Bioedit and construction of phylogeny by maximum likelihood in the software IQ-tree by model of substitution TPM2 + G4 with 1000 replicates. The prepared tree characterized the viral strains found as FV3 and both were incorporated into the clade of the other sequences already detected in Brazil. The different infectious profiles and the grouping of all the Brazilian sequences indicates that the virus was established in the country and suffered slight genetic alterations according to its geographic distance.