NANOEMULSÃO DE GOMA DO CAJUEIRO (Anacardium occidentale) E ÓLEO ESSENCIAL DE MANJERICÃO-CRAVO (Ocimum gratissimum) NA INIBIÇÃO DE MELANOSE E QUALIDADE DE CAMARÃO BRANCO DO PACIFICO (Litopenaeus vannamei)

O camarão é um alimento com alto valor nutricional, consumido em diversas partes do mundo. Entretanto, apresenta rápida degradação com surgimento da melanose que leva a rejeição do produto e grandes perdas para a carnicultura. A nanotecnologia tem-se mostrado promissora para o desenvolvimento de carreadores de compostos naturais em alimentos. Diante disto, buscou-se o desenvolvimento de um sistema nanoestruturado utilizando compostos naturais para a inibição do surgimento da melanose e preservação da qualidade de camarões refrigerados. Neste estudo, nanoemulsões de óleo essencial (OE) de Ocimum gratissimum foram produzidas usando técnicas de baixa e alta energia, e goma do cajueiro (Anacardium occidentale) (GC) como co-surfactante. Os principais constituintes do OE foram determinados por Cromatografia e a presença dos mesmos no OE e nas formulações foi verificada nos espectros de Infravermelho com Transformada de Fourier. O diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersão, o potencial zeta e a eficiência de encapsulação (EE%) foram utilizados na avaliação da estabilidade coloidal durante o armazenamento. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e Microscopia do Força Atômica (AFM) foram utilizados para a determinação da distribuição de tamanhos das micelas e análise morfológica das mesmas, respectivamente. Métodos computacionais de dinâmica molecular determinaram a interação entre os constituintes do sistema na formação da nanoemulsão. Determinou-se a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) para as espécies patogênicas Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Salmonella entérica. A AFM evidenciou a ação da nanoemulsão por meio de imagens da morfologia celular de S. enterica. A atividade antioxidante foi avaliada contra os radicais ABTS e DPPH. O OE e a nanoemulsão foram utilizados para manter o frescor e qualidade em Litopenaneus vannamei armazenados por 16 dias a 4 ± 0,5 ºC, os parâmetros avaliados consistiram no aparecimento de melanose, crescimento de bactérias psicrotróficas, pH, Nitrogênio das Bases Voláteis Totais (N-BVT) e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (SRATB). As nanoemulsões apresentaram diâmetro médio de 108 - 180 nm, EE% de 88,81 - 94,19%. As nanoemulsões apresentaram melhores resultados de CIM e CBM em relação ao OE para S. aureus e E. coli, para a S. entérica a ação bactericida foi potencializada. A antioxidante das nanoemulsões também apresentaram melhores resultados. Observou-se que é possível a utilização de baixa energia com equipamentos de baixo custo, capaz de manter o teor de OE estável no sistema, melhorando e preservando sua atividade antibacteriana e antioxidante. Os camarões tratados com a nanoemulsão apresentaram maior inibição da melanose do que os tratados com OE e sem tratamento (controle), o pH apresentou aumento gradativo e sem diferença (p <0,05) entre os tratamentos, a análise de bactérias psicrotróficas, N-BVT e SRATB, apresentaram melhores resultados para o OE e a nanoemulsão, não diferindo entre si (p >0,05), demonstrando que ambos podem atuar na prevenção da oxidação lipídica, melhorando os parâmetros físico-químicos e proporcionando maior vida útil em relação a camarões in natura sem tratamento, entretanto, a nanoemulsão apresenta-se promissora devido ao seu melhor desempenho contra bactérias patógenas vinculadas ao consumo de pescado, contribuindo para a segurança deste alimento.

Shrimp is a food with high nutritional value, consumed in different parts of the world. However, it presents rapid degradation with the appearance of melanosis, which leads to product rejection and great losses to the meat industry. Nanotechnology has shown promise for the development of carriers of natural compounds in foods. In view of this, we sought to develop a nanostructured system using natural compounds to inhibit the emergence of melanosis and preserve the quality of refrigerated shrimp. In this study, essential oil (EO) nanoemulsions of Ocimum gratissimum were produced using low and high energy techniques, and cashew tree gum (Anacardium occidentale) (GC) as co-surfactant. The main constituents of the EO were determined by Chromatography and their presence in the EO and in the formulations was verified in the Fourier Transform Infrared spectra. The hydrodynamic diameter, the polydispersity index, the zeta potential and the encapsulation efficiency (EE%) were used to evaluate the colloidal stability during storage. Nanoparticle tracking analysis (NTA) and Atomic Force Microscopy (AFM) were used to determine micelle size distribution and morphological analysis, respectively. Computational methods of molecular dynamics determined the interaction between the constituents of the system in the formation of the nanoemulsion. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) were determined for the pathogenic species Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Salmonella enterica. The AFM evidenced the action of the nanoemulsion through images of the cellular morphology of S. enterica. Antioxidant activity was evaluated against ABTS and DPPH radicals. The EO and the nanoemulsion were used to maintain freshness and quality in Litopenaneus vannamei stored for 16 days at 4 ± 0.5 ºC, the evaluated parameters consisted of the appearance of melanosis, growth of psychrotrophic bacteria, pH, Total Volatile Bases Nitrogen ( N-BVT) and Thiobarbituric Acid Reactive Substances (SRATB). The nanoemulsions had an average diameter of 108 - 180 nm, EE% of 88.81 - 94.19%.The nanoemulsions showed better results for MIC and CBM in relation to EO for S. aureus and E. coli, for S. enterica the bactericidal action was potentiated. The antioxidant of the nanoemulsions also showed better results. It was observed that it is possible to use low energy with low cost equipment, capable of keeping the EO content stable in the system, improving and preserving its antibacterial and antioxidant activity. Shrimp treated with the nanoemulsion showed greater inhibition of melanose than those treated with EO and without treatment (control), pH showed a gradual increase and no difference (p <0.05) between treatments, the analysis of psychrotrophic bacteria, N -BVT and SRATB, showed better results for EO and nanoemulsion, not differing from each other (p >0.05), demonstrating that both can act in the prevention of lipid oxidation, improving the physicochemical parameters and providing longer shelf life in In relation to untreated fresh shrimp, however, the nanoemulsion is promising due to its better performance against pathogenic bacteria linked to fish consumption, contributing to the safety of this food.

Estrutura e estabilidade das micelas de caseína do leite bovino / Structure and stability of the casein micelles of bovine milk

Milk proteinsarenatural vehicles, which provides essential micronutrients, amino acids, and componentsof the immune system, in addition, possess propertiescharacteristicof fundamentalimportance inmanydairy products.The caseinsare the majormilk proteinscomprise about80%of milk proteinandconsistsoffourmajor proteins: αs1-, αs2-, β-and κ-casein, which have high thermal stability, which provides industriesdairymilkperform the treatmentat elevated temperatures, such as milk UltraHigh Temperature(UHT). However, certainfactors such as theenzymatic hydrolysis ofkcasein, temperature, pH, excessive addition ofCa2+ andethanolaffectthe stability of theseproteins, whicharelargelypresent in milkin the form ofcolloidal particles, known as micelles. The internal structure ofthe caseinmicelleconsists predominantly ofαs1-, αs2-, β-casein, nanoparticlecolloidalcalcium phosphate, whereas κ-casein ispreferably locatedon the surfaceof the micelle, assuming an important role inmicellestability. Interest in micellar casein remains constant over the years, and research on the subject continue to be made, so the relevance of understanding the structure and the factors that affect the micellar stability.

As proteínas do leite são veículos naturais, que fornecem micronutrientes essenciais, aminoácidos, assim como componentes do sistema imune, além disso, possuem propriedades de fundamental importância nas características de muitos produtos lácteos. As caseínas são as principais proteínas do leite, compreendem cerca de 80% das proteínas do leite e consistem de quatro proteínas principais: αs1-, αs2-, β- e κ-caseína, as quais possuem elevada estabilidade térmica, o que proporciona às indústrias de laticínio realizar o tratamento do leite a temperaturas elevadas, como o leite Ultra Alta Temperatura (UAT). No entanto, alguns fatores como a hidrólise enzimática da k-caseína, temperatura, pH, excesso de Ca2+ e adição de etanol afetam a estabilidade dessas proteínas, que estão em grande parte presentes no leite na forma de partículas coloidais, conhecidas como micelas. A estrutura interna da micela de caseína é constituída predominantemente por αs1-, αs2-, β-caseína e de nanopartículas de fosfato de cálcio coloidal, enquanto que a κ-caseína está localizada preferencialmente na superfície da micela, assumindo importante papel na estabilidade micelar. O interesse na caseína micelar mantém-se constante ao longo dos anos, e pesquisas sobre o assunto continuam a ser realizadas, por isso a relevância de se entender a estrutura e os fatores que afetam a estabilidade micelar.

Estrutura e estabilidade das micelas de caseína do leite bovino / Structure and stability of the casein micelles of bovine milk

Milk proteinsarenatural vehicles, which provides essential micronutrients, amino acids, and componentsof the immune system, in addition, possess propertiescharacteristicof fundamentalimportance inmanydairy products.The caseinsare the majormilk proteinscomprise about80%of milk proteinandconsistsoffourmajor proteins: αs1-, αs2-, β-and κ-casein, which have high thermal stability, which provides industriesdairymilkperform the treatmentat elevated temperatures, such as milk UltraHigh Temperature(UHT). However, certainfactors such as theenzymatic hydrolysis ofkcasein, temperature, pH, excessive addition ofCa2+ andethanolaffectthe stability of theseproteins, whicharelargelypresent in milkin the form ofcolloidal particles, known as micelles. The internal structure ofthe caseinmicelleconsists predominantly ofαs1-, αs2-, β-casein, nanoparticlecolloidalcalcium phosphate, whereas κ-casein ispreferably locatedon the surfaceof the micelle, assuming an important role inmicellestability. Interest in micellar casein remains constant over the years, and research on the subject continue to be made, so the relevance of understanding the structure and the factors that affect the micellar stability.(AU)

As proteínas do leite são veículos naturais, que fornecem micronutrientes essenciais, aminoácidos, assim como componentes do sistema imune, além disso, possuem propriedades de fundamental importância nas características de muitos produtos lácteos. As caseínas são as principais proteínas do leite, compreendem cerca de 80% das proteínas do leite e consistem de quatro proteínas principais: αs1-, αs2-, β- e κ-caseína, as quais possuem elevada estabilidade térmica, o que proporciona às indústrias de laticínio realizar o tratamento do leite a temperaturas elevadas, como o leite Ultra Alta Temperatura (UAT). No entanto, alguns fatores como a hidrólise enzimática da k-caseína, temperatura, pH, excesso de Ca2+ e adição de etanol afetam a estabilidade dessas proteínas, que estão em grande parte presentes no leite na forma de partículas coloidais, conhecidas como micelas. A estrutura interna da micela de caseína é constituída predominantemente por αs1-, αs2-, β-caseína e de nanopartículas de fosfato de cálcio coloidal, enquanto que a κ-caseína está localizada preferencialmente na superfície da micela, assumindo importante papel na estabilidade micelar. O interesse na caseína micelar mantém-se constante ao longo dos anos, e pesquisas sobre o assunto continuam a ser realizadas, por isso a relevância de se entender a estrutura e os fatores que afetam a estabilidade micelar.(AU)

Desenvolvimento e avaliação da estabilidade de emulsões alimentícias contendo óleo de pequi

Diversos alimentos são sistemas emulsionados, como a maionese, uma emulsão óleo em água que apresenta 70 a 80% de óleo. Devido à busca crescente do mercado consumidor por produtos mais saudáveis e nutritivos, diversos estudos têm sido realizados com o intuito de substituir e/ou reduzir o teor de alguns ingredientes na formulação de alimentos, em especial a gordura. Diante disso, o objetivo do presente estudo foi desenvolver e avaliar a estabilidade de emulsões tipo maionese contendo óleo de pequi (Caryocar brasiliense), fruto nativo do Cerrado rico em carotenóides, com diferentes concentrações de óleo (65, 45 e 25% mim). Para as duas formulações com menor teor de óleo foram adicionados, separadamente, agentes espessantes (gomas guar ou xantana). As emulsões obtidas foram avaliadas em termos de sua microestrutura, pH, cor e estabilidade após 5 dias de armazenamento. sob refrigeração ou à temperatura ambiente. Verificou-se que as emulsões obtidas apresentaram gotículas de óleo esféricas. Maior número de gotas foi observado na formulação com maior teor de óleo e maior polidispersidade foi percebida nas formulações com menor o teor de óleo. As emulsões apresentaram pH levemente ácido (4,14 a 4,22), sem diferença significativa entre as formulações. As formulações com goma e teor reduzido de óleo apresentaram maior luminosidade (L *) do que a formulação com 65% de óleo de pequi e sem goma. Resultado contrário foi observado para o parâmetro de cor a* (tonalidade de vermelho), o qual foi maior quanto maior o teor de óleo de pequi na formulação. Nenhuma diferença foi observada quanto o parâmetro b*. Não foram observadas alterações visuais nas formulações armazenadas à temperatura ambiente ou sob refrigeração por 5 dias, indicando a estabilidade das emulsões no período e condições avaliadas, exceto para emulsão com menor teor de óleo e presença de goma guar, que apresentou separação de fases após armazenamento à temperatura ambiente.(AU)

Several foods are emulsified systems, such as mayonnaise, an oil-in water emulsion that has 70-80% oil. Due to the growing consumer market for healthier and more nutritious products, several studies have been carried out to replace and/or reduce the content of some ingredients in the formulation in food formulation, especially oil. The objective of the present study was to develop and evaluate the stability of emulsions like mayonnaise containing pequi oil (Caryocar brasiliense), a native fruit of the Cerrado rich in carotenoids, with different oil concentrations (65, 45 and 25%). For the two formulations with lower oil content, thickening agents (guar or xanthan gums) were added separately. The obtained emulsions were evaluated in terms of their microstructure, pH, color and stability after 5 days of storage under refrigeration or at room temperature. The emulsions were found to have spherical oil droplets. Higher number of drops was observed in the formulation with higher oil content, and higher polydispersity was observed in formulations with lower oil content. The emulsions showed slightly acid pH (4.14 to 4.22), with no significant difference between the formulations. The formulations with gum and reduced oil content showed higher brightness (L *) than the formulation with 65% pequi oil and without gum. The opposite result was observed for the color parameter a", which was higher the higher the pequi oil content in the formulation. No difference was observed for the b* parameter. No visual changes were observed in the formulations stored at room temperature or under refrigeration after 5 days, indicating the stability of the emulsions in the period and conditions evaluated, except for emulsion with lower oil content and presence of guar gum, which presented phase separation after storage at room temperature.(AU)

Tecnologias aplicadas à identificação do papel dos lipídios durante a organogênese em mamíferos (modelos suíno e canino)

O desenvolvimento embrionário encontra-se dividido em três etapas nas quais podem ser distinguidas as três estruturas: ovo, embrião e feto. Durante o desenvolvimento ocorrem eventos distintos e alterações morfológicas que dão inicio à vida. Os lipídios desempenham um papel importante no processo de formação, pois tem uma participação específica no desenvolvimento embrionário. A utilização de um conjunto de técnicas poderia auxiliar e decrever melhor os processos de formação e a sinalização molecular do desenvolvimento. Porém, o objetivo proposto neste trabalho foi caracterizar de forma aprimorada (mediante tecnologias apropriadas) o desenvolvimento embrionário de mamíferos, em relação à identificação de grupos lipídios. Para isso, foram estudados 28 fetos e embriões de cães, com idades compreendidas entre os 22 e 55 dias de gestação, obtidos em campanha de castração, além de um feto de suíno de 50 dias de gestação, procedente de um fornecedor comercial (Animal Technologies, Inc.). Foram analisados fígado, coração, cérebro, rins e pulmões de embriões e fetos, valendo-se de tecnologias de imagem (Microscopia Eletrônica de Varredura, Tomografia Computadorizada, Raios-X), e técnicas histológicas (colorações de Hematoxilina e Eosina, Tricrômio de Masson, Ferro Coloidal, Sudan Black) em cães. No suíno realizou-se além das citadas técnicas, a análise lipidômica relizada pela técnica de Electroespraiamento por Dispersão- Imageamento por Espectrometria (DESI-MS Imagem) e, posteriormente, coloração com Hematoxilina e Eosina. As principais conclusões relacionam-se ao emprego de várias tecnologias para descrever o desenvolvimento embrionário e fetal, caracterizando bem o desenvolvimento de estruturas, tais como: os arcos braquiais e as vesículas ópticas e óticas nos embriões, cordas tendíneas no coração, lobos hepáticos e mineralização do tecido ósseo. A vinculação dos lipídios à essas tecnologias permitiu associá-las aos processos de contração miocárdica, formação de surfactante pulmonar e trânsito de metabólitos das células epiteliais. Além disso, permitiram ainda demostrar as distribuições lipídicas em órgãos: N-acetilglutamina no coração, ST (ht22: 0) nos intestinos, AG dímeros no fígado e um amplo número de lipídios PS no sistema nervoso. Conclui-se que, de modo geral, existe grande variabilidade na interação do papel dos lipídios com o desenvolvimento embrionário.

Embryonic development is divided into three stages in which the three structures can be distinguished; egg, embryo and fetus. During development occur distinct events, and morphological changes that start life. Lipids play an important role in the formation process because they have a specific participation in embryonic development. The use of a set of techniques could help and improve the processes of formation and the molecular sign of embryonic development. However, the objective of this work was to characterize the embryonic development of mammals in an improved way (through appropriate technologies), in relation to the identification of lipid groups. For this, 28 fetuses and embryos of dogs, aged between 22 and 55 days of gestation, obtained in a castration campaign, in addition to a fetus of 50 days' gestation from a commercial supplier (Animal Technologies, Inc.). The liver, heart, brain, kidneys and lungs of embryos and fetuses were analyzed using imaging technologies (Scanning Electron Microscopy, Computed Tomography, X-rays) and histological techniques (Hematoxylin and Eosin stains, Masson's Tricomial , Colloidal Iron, Sudan Black) in dogs. In the pig, all the techniques were performed, the lipid analysis revealed by the technique of Dispersion Electrospray - Spectrometry Imaging (DESI-MS Image) and subsequently staining with Hematoxylin and Eosin. The main conclusions are related to the use of several technologies to describe embryonic and fetal development, characterizing well the development of structures such as brachial arches and optic and optical vesicles in embryos, chordae tendineae in the heart, hepatic lobes and tissue mineralization bone. The lipid binding to these technologies has been associated with the processes of myocardial contraction, formation of pulmonary surfactant and transit of epithelial cell metabolites. In addition, they allowed to demonstrate the lipid distributions in organs: specific distributions were shown in organs: N-acetylglutamine in the heart, ST (ht22: 0) in the intestines, AG dimers in the liver, and a large number of PS lipids in the nervous system. We conclude that in general there is great variability in the interaction of the role of lipids with embryonic development.

NANOTUBOS DE CARBONO E ÁCIDO HÚMICO: MODIFICAÇÃO MECANOQUÍMICA, CARACTERIZAÇÃO E ECOTOXICIDADE AQUÁTICA

Nanomateriais de carbono são materiais promissores para diversas aplicações industriais, médicas e ambientais, visto que apresentam inéditas propriedades físico-químicas. Todavia, a superfície hidrofóbica destes materiais impede sua dispersão em meios aquosos e interação com sistemas biológicos, dificultando sua aplicação. Neste sentido, procedimentos de oxidação química são comumente aplicados a estes materiais a fim de reduzir sua hidrofobicidade. Todavia, nestes processos são utilizados reagentes químicos oxidantes fortes e altas temperaturas, potencializando a ocorrência de acidentes ocupacionais e ambientais. Neste trabalho, um método mecanoquímico ecologicamente amigável foi proposto para modificar nanotubos de carbono de paredes múltiplas (NTCPM) com ácido húmico (AH), com o intuito de produzir um material híbrido promissor (AH-NTCPM) para aplicações ambientais. As propriedades físico-químicas do AHNTCPM foram estudadas e seu potencial de aplicação para remediação ambiental foi testado em experimentos de adsorção de íons Cu(II). Ademais, uma vez que a toxicidade dos nanomateriais é um aspecto crítico, ensaios ecotoxicológicos foram realizados com organismos aquáticos (Hydra attenuata, Daphnia magna e embriões de Danio rerio). A partir dos resultados obtidos, destaca-se que o método aplicado foi eficiente em produzir modificações estruturais, morfológicas e químicas nos NTCPM, as quais resultaram em um revestimento de ácido húmico estável sobre estes. Este revestimento foi crucial para diminuir a hidrofobicidade dos NTCPM, proporcionando-lhes estabilidade coloidal em água deionizada e alta capacidade de adsorção de metais a partir de soluções aquosas. Ademais, até a máxima concentração testada (10 mg L-1 ), nenhum efeito de ecotoxicidade aguda foi observado. Desta forma, nossos resultados sugerem que o híbrido produzido é um sistema funcional e promissor para tecnologias ambientais.

Carbon nanomaterials are promising materials for industrial, medical and environmental applications, since they present unreleased physicochemical properties. However, the hydrophobic surface of these materials hinders their dispersion in aqueous media and compatibility with biological systems. In this sense, chemical oxidation procedures are commonly applied to those materials in order to reduce their hydrophobicity. Nonetheless, in these procedures are used corrosive chemical reagents (e.g. H2SO4 and HNO3) and high temperatures, potentiating the occurrence of environmental and occupational accidents. In this work, an eco-friendly mechanochemical process was proposed to modify multiwalled carbon nanotubes (MWCNT) with humic acid (HA), in order to produce a promising hybrid material (HA-MWCNT) for environmental applications. The physicochemical properties of HA-MWCNT was studied and their potential for environmental remediation was tested in Cu(II) adsorption experiments. Finally, since nanomaterials toxicity to biological organisms is a critical aspect, ecotoxicological assays were performed with aquatic organisms (Hydra attenuata, Daphnia magna and Danio rerio embryos). Regarding the obtained results, we highlight that the method applied was efficient to create structural, morphological and chemical modifications on the MWCNT, which resulting in a humic acid coating on the MWCNTs. This coating was crucial to decrease the CNTs hydrophobicity, providing to them colloidal stability in deionized water and high adsorption capacity of metal from aqueous solution. Besides that, until the highest tested concentration (10 mg L-1 ) no effect of acute ecotoxicity was observed. Therefore, our results suggest that the hybrid produced is a functional and promising system for environmental technologies.

PROTEÔMICA DO PLASMA SEMINAL E EXPRESSÃO GÊNICA E LOCALIZAÇÃO DA NGF E SEUS RECEPTORES (TRK1 E NGFR) NO SISTEMA GENITAL DE COELHOS

Os objetivos deste estudo foram (i) mapear e identificar as proteínas do plasma seminal de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, utilizando as técnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa e estimar associações entre essas proteínas com os parâmetros espermáticos e (ii) caracterizar a expressão do fator de crescimento nervoso, poliptido beta ( -NGF), e os seus receptores cognatos neurotróficos da tirosina-quinase de tipo 1 (NTRK1) e receptor fator de crescimento nervoso (NGFR) nas gônadas e glândulas sexuais de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, bem como as concentrações de NGF no plasma seminal de animais sexualmente maduros, utilizando as técnicas de RT - PCR e imunohistoquímica. Também foi dosada a concentração da NGF no sangue e no plasma seminal através da técnica de ELISA. O estudo 1 foi realizado na Universidade Federal do Ceará, na cidade de Fortaleza-Ce. Foram coletados amostras de sêmen de 18 coelhos adultos, utilizando- se uma vagina artificial. Após a coleta procedeu-se a avaliação dos parâmetros qualidade seminal: motilidade, vigor, concentração espermática, morfologia espermática e os testes funcionais: integridade de membrana, integridade acrossomal e vitalidade. O plasma seminal foi obtido pela centrifugação do sêmen, e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos géis, digeridos com tripsina, e submetidos à identificação por espectrometria de massa (ESI- QUAD-TOF). Os resultados obtidos foram submetidos a avaliação estatística para verificar a existência de associações entre entre a presença e/ou intensidade dos spots presentes nos mapas protéicos do plasma seminal com os parâmetros de qualidade seminal. As associações entre os parâmetros dos espermatozoides ejaculados e a expressão das proteínas do plasma seminal dos coelhos foram estimadas por modelos de regressão múltipla usando o procedimento REG do aplicativo estatístico SAS (v.9.0, 2002) com a seleção STEPWISE. Foram detectados 232 ± 69,5 spots protéicos por gel, com 34 spots presentes consistentemente em todos os géis. Esses 34 spots corresponderam a 15 % do total do número de spots, representando 32 % da intensidade óptica de todos os spots. A espectometria de massa identicou aproximadamente 95% dos spots detectados (220 spots de um total de 232), que corresponderam a 87 proteínas diferentes. As proteínas mais abundantes foram as anexinas, zeta-globina, lipocalinas, proteina FAM 115 e um grupamento de serpinas. Outras proteínas também foram identificadas, tais como: transferrina, heat shock protein, glutationa transferase, entre outras. Também foi identificada apresença da proteína fator de crescimento nervoso (NGF) que tem sido relatada em outras espécies como fator de indução à ovulação. As 87 proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos participam principalmente dos processos biológicos associados a processos celulares (65,25 %), regulação (64,25 %) e resposta a estímulos (22,9 %). Foram observadas associações significativas entre as proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos com os parâmetros espermáticos avaliados,tais como vigor, número de células viáveis, morfologia espermática e células com membranas funcionais foram associados com proteínas específicas. Foram observadas associações de várias proteínas com um mesmo parâmetro espermático. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parâmetros seminais. O conhecimento dessas proteínas contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação do plasma seminal sobre a função espermática em coelhos. O estudo 2 foi conduzido na Università Degli Studi di Perugia, na cidade de Perugia-Pe, Itália. Foi avaliada a expressão da proteína NGF que foi previamente identificada no estudo 1. A imunorreatividade e a expressão gênica da NGF e os seus receptores cognatos foram detectados nos testículos, próstata e vesícula seminal. Os níveis mais elevados de NGF e NTRK1 transcritos foram encontrados na próstata, enquanto expressões intermediárias foram encontradas no testículo. NGFR transcritos foram expressos nos mesmos níveis em ambos os testículos e da próstata e eram mais abundantes do que nas vesículas seminais. A distribuição generalizada de NGF em todas as células glandulares da próstata, juntamente com a sua abundância de RNAm relativo, confirmam que a próstata é das principais fontes desta neurotrofina em coelhos. Em conclusão, os presentes dados sugerem que o sistema NGF está envolvido no desenvolvimento testicular e espermatogênese de coelhos e que o NGF pode atuar como um potencial fator de indução à ovulação, sendo abundantemente presentes no plasma seminal.

The aim this study were (i) to map and identify proteins in seminal plasma of New Zealand white rabbits strain, using the techniques of two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and to estimate associations between these proteins with sperm parameters and (ii) characterize expression of the nerve growth factor polypeptide beta ( -NGF) and its cognate neurotrophic receptor tyrosine kinase type 1 (NTRK1), and nerve growth factor receptor (NGFR) at gonads and sex glands in adult New Zealand white rabbits as well as the NGF concentration in seminal plasma of sexually mature animals, using RT - PCR and immunohistochemistry. Also was measured the NGF concentration in the blood and seminal plasma by ELISA. Study 1 was performed at Federal University of Ceará, in Fortaleza-Ce. Semen samples were collected from 18 adult rabbits, using an artificial vagina. After collecting proceeded to the evaluation of semen quality parameters: total motility, individual progressive motility, sperm concentration, sperm morphology and functional tests: membrane integrity (HOST), acrosomal integrity and vitality. The seminal plasma was obtained by centrifugation of semen, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed in PDQuest application. The individual spots were excised from the gels, digested with trypsin, and submitted to mass spectrometry (ESI-QUAD-TOF) to identification. The results were subjected to statistical analysis to verify the existence of associations between the presence and / or intensity of the spots present in the protein maps of seminal plasma with the semen quality parameters. The associations between the parameters of ejaculated sperm and the expression of seminal plasma proteins of rabbits were estimated by multiple regression models using the REG procedure of SAS statistical application (v.9.0, 2002) with STEPWISE selection. 232 ± 69.5 spots/gel were detected with 34 spots consistently present in all gels. These 34 spots corresponded to 15% of the total number of spots, representing 32% of the optical intensity of all the spots. Mass spectrometry identified approximately 95% of the detected spots (identified: 220 spots; analyzed: 232 spots), which corresponded to 87 different proteins. The most abundant proteins were the annexins, zeta-globin, lipocalin, FAM 115 protein and a serpins cluster. Other proteins also have been identified, such as transferrin, heat shock protein, glutathione transferase and others. The NGF (protein nerve growth factor) presence also has been identified which has been reported in other species such as ovulation induction factor. This 87 proteins identified in seminal plasma of rabbits participate mainly of biological processes associated with cellular processes (65.25%), regulation (64.25%) and response to stimuli (22.9%). Significant associations were observed between the proteins identified in seminal plasma of rabbits with sperm evaluated parameters such as individual progressive motility, sperm viability, cells with morphology and functional membranes have been associated with specific proteins. Associations were observed for several proteins with the same sperm parameter. According to literature, this is first report about the proteome of seminal plasma of rabbits and its role on the seminal parameters. Knowledge of these proteins contributes to a better understanding of the regulatory mechanisms of seminal plasma on sperm function in rabbits. Study 2 was conducted at Università Degli Studi di Perugia in the city of Perugia-Pe, Italy. It was evaluated the expression of NGF protein that was previously identified during study 1. The immunoreactivity and gene expression of NGF and cognate receptors were detected in testis, prostate and seminal vesicle. The highest levels of NGF and NTRK1 transcripts were found in prostate, while intermediate expressions were found in testis. NGFR transcripts were expressed at the same level on both the testis and prostate, and were more abundant than in seminal vesicles. The widespread distribution of NGF in all glandular cells of the prostate, coupled with its high abundance of mRNA on confirm that the prostate is a major source of this neurotrophin in rabbits. In conclusion, the present data suggest that NGF is involved in developmental system and spermatogenesis of testis rabbits and that NGF can act as a potential factor for induction of ovulation, being abundantly present in seminal plasma.

Vascularização arterial da região do nó sinoatrial em corações suínos: origem, distribuição e quantificação / Arterial vascularization of the sinoatrial node in swine hearts: origin, distribution and quantification

O nó sinoatrial, por se encontrar topograficamente instalado como componente inicial do sistema de condução, é responsável pela geração dos impulsos nervosos determinantes da contração cardíaca. Estudos relacionados à morfologia do nó, visando conhecer a origem, trajeto e distribuição dos vasos neste tecido são conhecidos, contudo, no que diz respeito a estes aspectos e aos dados quantitativos da irrigação nodal, no que se refere ao comportamento vascular arterial e a densidade vascular arterial desta região, a literatura é escassa. Com este objetivo foram utilizados 30 corações de suínos SRD, sendo 27 injetados com resina vinílica corada, para análise da origem e trajeto da ANSA (artéria do nó sinoatrial) e 3 corações injetados com solução aquosa de carvão coloidal (tinta nanquim) para proceder à análise estereológica. As artérias atriais originaram-se tanto da artéria coronária direita quanto da esquerda, com predominância da primeira (66,66 por cento e 33,33 por cento, respectivamente). Quando originada da coronária direita, a irrigação ocorreu pelo ramo AADAM (artéria atrial direita cranial medial) em 14 casos e pelos ramos AADAI (artéria atrial direita cranial medial) em 2 casos e AADAL (artéria atrial direita cranial lateral) em 2 casos. Em 9 casos (33,33 por cento) originou-se pela artéria coronária esquerda: quatro pelo ramo AASPL (artéria atrial esquerda caudal lateral), dois pelo ramo AASAI (artéria atrial esquerda cranial intermédia) e três pelo ramo AASAM (artéria atrial esquerda cranial medial). Anastomoses interarteriais, com participação dos vasos responsáveis pela irrigação do território do nó sinoatrial foram observadas na maioria dos casos (25 corações). O Volume do órgão ou Volume Referência (V(ref)) foi de 35,32x10(4)µm³. Para as variáveis estereológicas analisadas, a estimação da densidade de comprimento do vaso (Lv) foi de 766; o comprimento do vaso (L) - mm - foi de 27,06x10(5)µm; a densidade de superfície de área...(AU)

The sinoatrial node, for being topographically installed as the initial component of the conduction system, is responsible for the production of the nervous impulses, which determines the cardiac contraction. There have been made studies related to the node's morphology in order to know the origin, distribution and quantification of the vases in this tissue, however, in spite of the results and quantitative data of the nodal irrigation - arterial vascular conduct and arterial vascular density, at the nodal level - the literature is scarce. With this objective 27 SRD swine hearts, injected with colored resin for macroscopic analysis of the origin and distribution of ANSA (sinoatrial node artery), 3 others injected with watery solution of colloidal coal (dyed nanquim) were used, to mark the route of the vases on the node level for stereological analysis. The atrial arteries originated as well from the right coronary artery as from the left one, with predominance of the first (66.66 percent and 33.33 percent, respectively). When originated from the right coronary artery, there existed the following branches: AADAM (right cranial medial atrial artery) in 14 cases, AADAI (right cranial intermedial atrial artery) in 2 cases, and AADAL (right cranial lateral atrial artery) in 2 cases. In 9 cases (33.33 percent) the following branches originated from the left coronary artery: 4 through branch AASPL (left caudal lateral atrial artery), 2 through branch AASAI (left cranial intermedial atrial artery) and 3 through branch AASAM (left cranial medial atrial artery). Interarterial anastomoses with vessels responsible for irrigation of the sinoatrial node area were observed in most of the cases (25 hearts). The Volume or Reference Volume (V(ref)) of the hearts were 35.32x10(4)µm³. For the stereological variables analyzed, the estimate density of the vessel length (Lv) was 766; the vessel length (L) - mm - was 27.06x10(5)µm; the area's surface density...(AU)

Avaliação da especificidade do anticorpo \"mouse anti-mouse-uNK clone 1\" e a localização da molécula antigênica correspondente nas células uNK de camundongos / Evaluation of the antibody \"mouse anti-mouse-uNK clone 1\", specificity and localization of the correspondent epitopes in mice uNK cells

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK) , cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de \"mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)\" obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular

In the pregnant uterus of animals developing hemochorial type placentation occurs a transient migration and accumulation of natural killer lymphocytes (NK) which activity in the pregnancy has not been fully elucidated. These NK cells from uterine environment (uNK) present a distinct behavior from those found in the peripheral circulating blood (cNK), composing a subset of NK cells with specific gene expression that is regulated by pregnant uterus. Actually, these cells isolated from pregnant mice uteri were inoculated in the male mice of same strains, they induced immune response with production of antibodies reactivity specifically to uNK cells. In the present work it was used one of these mouse anti-mouse uterine natural killer cells clone 1 (mam-uNK1) monoclonal antibody that was obtained previously in our laboratory, in the aim to evaluate the specificity of this antibody and localization of corresponding antigenic molecule. It was used histological sections of uteri on 9º gestational day, lymphoid organs (spleen, thymus and lymph node), brain, liver and heart processed for immunocytochemistry with mam-uNK antibody at light microscopy and immunoelectron microscopy for uNK cells in pregnant uterus and cardiac muscle cells. Tissue homogenates from the same organs that were evaluated by immunocytochemistry were obtained to perform SDS-PAGE and Western-blot primary to identify the proteins fractions reactive with mam-uNK antibody and possible homology among the tissues. The immunolabeling pattern using mam-uNK both, in histological sections and Western-blot were compared with pattern of Dolichos biflorus (DBA) lectin reactions. The results showed diffuse positive reaction distributed in the cytoplasm with higher intensity on perimeter of uNK cells and diffuse labeling in the cytoplasm of decidual cells and, in smooth muscle cells of miometrium. Positive reaction was also found in the cytoplasm of cardiac muscle cells, reticular cells of lymphoid organs, hepatocytes and in the axon bundles of the brain. By immunelectron microscopy, were observed higher number of gold particles in the cytoplasm of microvillous-like cell processes and in the marginal cytoplasm near the plasma membrane of uNK cells. In the cardiac muscle cells the most conspicuous labeling was seen in the cytoplasm of muscle cells at the end portions, that is, where the myofibrills were less organized and anchoring to plasma membrane. The Western-blot identified two bands with 52 and 54 kDa reactive do mam-uNK constantly found in all organs analyzed. These data show that the molecule that is recognized by mam-uNK1 antibody is widely distributed in several cell types, not specific for mouse uNK cells, but has a very peculiar localization in these cells and in the cardiac muscle cells. To the localization pattern that was identified by immunelectron microscopy it was suggested that, these molecules were associated to the modulation of the cytoskeleton in many activities that these structural component potentially could carry out in the cells, being particularly attractive those related to cell motility

Avaliação da especificidade do anticorpo mouse anti-mouse-uNK clone 1 e a localização da molécula antigênica correspondente nas células uNK de camundongos

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK), cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de “mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)” obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular