Culture, characterization and differentiation of neural precursors from the central nervous system of guinea pigs (Cavia porcellus Linnaeus, 1758) / Cultura, caracterização e diferenciação de precursores neurais do sistema nervoso central de porquinho-da-índia (Cavia porcellus Linnaeus, 1758)

Potentially neurogenic areas were initially identified by incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU) in cells underlying the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles wall, hippocampus and olfactory bulbs of newborn guinea pigs. Neural precursors from the SVZ were cultured in suspension, generating neurospheres (NSFs), which, upon dissociation were able to generate new NSFs. Upon culture in the absence of growth factors, cells dissociated from NSFs displayed evidence for neural differentiation, giving rise to cells from neural lineage. Flow cytometry analysis for of NSFs-derived cells after differentiation revealed approximately 13.3% nestin positive, 5.5% Beta-III-tubulin positive, 9% GFAP positive and 7.8% mGalC positive. Functional assays by measurement of calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli, revealed stimulation in differentiated cells, an indicator of neuronal differentiation. The ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising for research and towards a future use of neural stem cells in the therapy of neurological disorders.(AU)

Áreas potencialmente neurogênicas foram identificadas por incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, hipocampo e bulbos olfatórios de cobaias neonatos. Precursores neurais provenientes da SVZ foram cultivados em suspensão, resultando na geração de neuroesferas (NSFs), que quando dissociadas foram capazes de proliferar e gerar novas NSFs. Quando cultivadas na ausência de fatores de crescimento, as células provenientes de NSFs dissociadas apresentaram evidências de diferenciação neuronal, dando origem a células da linhagem neural. Citometria de fluxo em células das NSFs após a diferenciação revelou aproximadamente 13,3% positivas para nestina, 5,5% positivas para Beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Testes de funcionalidade pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato revelaram a estimulação de células diferenciadas, um indicador de função neuronal. A capacidade de células da SVZ de fetos de cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora para a pesquisa e eventual uso terapêutico de células tronco em disordens do sistema nervoso.(AU)

Culture, characterization and differentiation of neural precursors from the central nervous system of guinea pigs (Cavia porcellus Linnaeus, 1758) / Cultura, caracterização e diferenciação de precursores neurais do sistema nervoso central de porquinho-da-índia (Cavia porcellus Linnaeus, 1758)

Potentially neurogenic areas were initially identified by incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU) in cells underlying the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles wall, hippocampus and olfactory bulbs of newborn guinea pigs. Neural precursors from the SVZ were cultured in suspension, generating neurospheres (NSFs), which, upon dissociation were able to generate new NSFs. Upon culture in the absence of growth factors, cells dissociated from NSFs displayed evidence for neural differentiation, giving rise to cells from neural lineage. Flow cytometry analysis for of NSFs-derived cells after differentiation revealed approximately 13.3% nestin positive, 5.5% Beta-III-tubulin positive, 9% GFAP positive and 7.8% mGalC positive. Functional assays by measurement of calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli, revealed stimulation in differentiated cells, an indicator of neuronal differentiation. The ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising for research and towards a future use of neural stem cells in the therapy of neurological disorders.(AU)

Áreas potencialmente neurogênicas foram identificadas por incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, hipocampo e bulbos olfatórios de cobaias neonatos. Precursores neurais provenientes da SVZ foram cultivados em suspensão, resultando na geração de neuroesferas (NSFs), que quando dissociadas foram capazes de proliferar e gerar novas NSFs. Quando cultivadas na ausência de fatores de crescimento, as células provenientes de NSFs dissociadas apresentaram evidências de diferenciação neuronal, dando origem a células da linhagem neural. Citometria de fluxo em células das NSFs após a diferenciação revelou aproximadamente 13,3% positivas para nestina, 5,5% positivas para Beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Testes de funcionalidade pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato revelaram a estimulação de células diferenciadas, um indicador de função neuronal. A capacidade de células da SVZ de fetos de cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora para a pesquisa e eventual uso terapêutico de células tronco em disordens do sistema nervoso.(AU)

ESTUDO DA PROLIFERAÇÃO, MIGRAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS PRECURSORES NEURAIS DO SISTEMA NERVOSO PÓS-NATAL DE CAMUNDONGOS (Mus musculus)

No final dos anos 60, os experimentos em proliferação celular anunciaram a neurogênese adulta em mamíferos. Três décadas depois a relação entre neurogênese e células-tronco neurais (NSCs) foi estabelecida. Atualmente, as NSCs são objeto de pesquisas na medicina como modelo de estudo de múltiplos estados anormais e distúrbios orgânicos, além de se propor como uma estratégia em condições com poucas alternativas terapêuticas. Contudo o desenvolvimento destas terapias depende do entendimento dos mecanismos moleculares, celulares e biológicos que controlam a neurogênese e as NSCs. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estudo das teorias no funcionamento dos nichos neurogênicos e as NSCs com ênfase na proliferação, migração e diferenciação, além da descrição dos aspectos celulares in vitro dos precursores neurais (NPCs) dos nichos neurogênicos dos mamíferos. Os nichos são regiões do sistema nervoso adulto que apresentam neurogênese pela presença das NSCs e um microambiente celular apropriado. Nos mamíferos existem pelo menos dois nichos, a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular (SGZ) do hipocampo. Os estudos revisados demostram que existem diferenças e semelhanças no comportamento das NSCs nos nichos neurogênicos adultos, levando a que a proliferação, migração e diferenciação seja menos efetiva quando comparada com o desenvolvimento embrionário. Para finalizar, se descreveu o protocolo para isolamento e cultivo dos NPCs e seus aspectos celulares. Os NPCs proliferaram como populações heterogêneas multipotentes. Após a diferenciação, as células migraram e apresentaram características morfológicas e imunofenotípicas de células neurais imaturas, com o predomínio de células gliais. Em conjunto, os NPCs in vitro mimetizam os aspectos gerais da neurogênese.

In the late 60`s, the experiments on cell proliferation announced adult neurogenesis in mammals. Three decades later, the link between neurogenesis and neural stem cells (NSCs) was recognized. Currently, NSCs are the matter of research in human and veterinary medicine as a model of multiple abnormal states and organic disorders, in addition to be proposed as a strategy for diseases and conditions with few therapeutic alternatives. However, the successful development of these therapies depends on the understanding of molecular, cellular and biological mechanisms that control neurogenesis and NSCs. Therefore, the aim of this work was the study of the theories on neurogenic niches and NSCs with focus in proliferation, migration and differentiation, beyond the description of the cellular aspects of in vitro neural precursors cells (NPCs) of the neurogenic niches of the mammals. The neurogenic niches are regions of the adult nervous system which display complete neurogenesis because of the presence of NSCs and an appropriate cell microenvironment. In mammals, there are at least two neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular zone (SGZ) of the hippocampus. The reviewed studies showed that exists differences and similarities in the behavior of the adult NSCs in the neurogenic niches that lead to less effective proliferation, migration and differentiation; when compared with the embryonic development. Finally, was described the protocol for isolation and cultivation of NPCs and their cellular aspects. NPCs proliferated as heterogeneous multipotent populations. Differentiation analyses showed that cells migrated and showed morphological and immunophenotypical characteristics of immature cells with the predominance of glial cells. Overall, NPCs effectively reproduce the general aspects of neurogenesis.

Caracterização morfológica e celular da zona subventricular e da corrente rostral migratória em encéfalos de fetos caninos

Precursores neurais originados na zona subventricular (ZSV) de algumas espécies animais possuem uma rota de migração neuronal destinada ao bulbo olfatório principal (BOP), onde os neuroblastos migrantes se diferenciam em interneurônios. Esta corrente migratória é mantida na idade adulta. A compreensão de como se organiza na idade fetal é essencial para a compreensão geral e estabelecimento de novas terapias celulares. O objetivo deste estudo é caracterizar a composição celular e organização morfológica da ZSV e da corrente rostral migratória (CRM) em encéfalos de fetos caninos. A ZSV, CRM e BOP foram obtidos de fetos caninos de aproximadamente 57 dias de idade gestacional. O tecido foi analisado através de coloração de Nissl, método de imunohistoquímica de dupla marcação com duplacortina (DCX), fator de transcrição SOX2, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), calbindina (CALB), calretinina (CALR) e tirosina-hidroxilase (TH). Foram feitas a análise relativa da expressão da imunorreatividade e análise quantitativa de colocalização celular, além do método de microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados mostram que a ZSV dorsal possui células imunorreativas (ir) para o DCX ao longo da parede ventricular, dispostas tangencialmente e fileiras de células SOX2-ir foram encontradas na mesma orientação. A imunorreatividade de GFAP foi mais forte na ZSV dorsal e as células possuem fibras dirigidas tangencialmente adjacentes ao ventrículo lateral e fibras orientadas radialmente em direção ao córtex. A CRM de feto de cão tem início na ZSV anterior e segue caudalmente ao redor da cabeça do núcleo caudado e desce na vertical até se curvar rostralmente em direção ao BOP onde termina na camada de células granulares (CCG). A CRM tem aparência homogênea e densa e possui células positivas para o DCX nas porções iniciais e para SOX2 e GFAP por toda a extensão. Não houve células positivas para CALB, CALR e TH em nenhuma região da ZSV e CRM. No BOP, os resultados mostraram que a camada glomerular (CG) possui células imunorreativas a CALR, TH, SOX2 e GFAP. Na camada plexiforme externa (CPE) houve células imunorreativas a CALB, CALR, SOX2 e GFAP e na CCG, houve células imunorreativas a CALR, SOX2 e GFAP. Na análise de colocalização, foram encontrados na CG neurônios CALR que colocalizam com células SOX2 e uma baixa colocalização de neurônios TH e células SOX2. Na CPE, foi observado um baixo número de colocalização de neurônios CALR e CALB e na CCG, as células SOX2 colocalizam com os neurônios CALR. As conclusões mostram que o feto de cão possui uma CRM em direção BOP, com imunorreatividade celular para DCX, SOX2 e GFAP na ZSV e CRM e para CALB, CALR, TH, SOX2 e GFAP nas principais camadas do BOP.

Neural precursors originated in the subventricular zone (SVZ) of some animal species have a migration route destined for main olfactory bulb (MOB), where migrants neuroblasts differentiate into olfactory interneurons. This migratory stream is maintained in adulthood. Understanding how it is organized in fetal age is essential for general understanding and establishment of new cell therapies. The aim of this study is characterize the cellular composition and morphological organization of the SVZ and rostral migratory stream (RMS) of brains of canine fetuses. The SVZ, RMS and MOB was obtained from canine fetuses of the approximately 57 gestacional days-old. The tissue was analyzed by Nissl staining and by immunohistochemical methods for double labelling with doublecortin (DCX), transcription factor SOX2, glial fibrillary acid protein (GFAP), calbindin (CALB), calretinin (CALR) and tyrosinehydroxylase (TH). Semiquantitative analysis of immunoreactivity and quantitative analysis of colocalization were realized, besides ultrastructural analysis by electron microscopy. The results show that in dorsal SVZ, DCX immunoreactive cells were found along the ventricular wall, arranged tangentially and lines of SOX2 cells were also found in the same orientation. The GFAP immunostaining is stronger in dorsal SVZ with tangentially directed fibers near the lateral ventricle and radially oriented fibers toward the cortex. The RMS of dog fetus begins at anterior SVZ and follows caudally around the head of the caudate nucleus and vertically descends to bend rostrally into the MOB, where it ends in the granular cell layer (GCL).The RMS have SOX2 positive cells on entire length, showing a homogeneous appearance and high cell density. There is no positive CALB cells or CALR in any region of the SVZ and RMS. The results of the MOB show that the glomerular layer (GL) there were cells immunoreactive to CALR, TH, SOX2 and GFAP. In the external plexiforme layer (EPL) there were immunoreactive cells for CALR, CALB, SOX2 and GFAP and, the GCL, the prevalence is higher for CALR neurons, SOX2-ir and GFAP-ir cells. In colocalization analysis, they were found a some CALR positive neurons in GL that colabeled with SOX2 cells and a low colocalization of TH neurons and SOX2 cells. In EPL, was observed a low colocalization number of CALR and CALB neurons and in GCL, SOX2 cells colabeled with CALR neurons. The conclusions show that the dog fetus has a RMS directed to the MOB, with cellular immunoreactivity for DCX, SOX2 and GFAP in the ZSV and RMS and cellular immunoreactivity for SOX2 CALB, CALR, TH and GFAP in main olfactory bulb layers.

Identificação de áreas neurogênicas no sistema nervoso central de cobaias (Cavia porcellus, Linnaeus 1758): cultura, caracterização e diferenciação de precursores neurais / Identification of neurogenic areas in the central nervous system of guinea pigs (Cavia porcellus, Linnaeus 1758): culture, characterization and differentiation of neural precursors

O presente trabalho relata a identificação de áreas neurogênicas, o cultivo, identificação e caracterização de precursores neurais obtidos do encéfalo de fetos de cobaias. Áreas potencialmente neurogênicas no encéfalo de neonatos foram identificadas por imunohistoquímica para a bromodeoxiuridina (BrdU), após inoculação da droga. A incorporação de BrdU foi detectada principalmente em células das áreas subjacentes ao ventrículo lateral, hipocampo e bulbo olfatório, indicando proliferação celular e sugerindo o potencial neurogênico dessas áreas. A seguir, realizou-se o cultivo de precursores neurais a partir da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais. Após aproximadamente uma semana de cultivo, as células da SVZ em multiplicação ativa originaram abundantes massas celulares (neuroesferas, NSFs). Células dissociadas a partir das NSFs primárias foram capazes de gerar novas neuroesferas após alguns dias de cultivo. As NSFs proliferaram em número e em tamanho, podendo ser subcultivadas por até 5-6 passagens, com intervalos de uma semana, permanecendo viáveis por até 60 dias. [...] Células diferenciadas foram então submetidas a teste de funcionalidade, pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato. A adição de GABA e glutamato resultou em estimulação de algumas células diferenciadas, que foi observado por meio do aumento da fluorescência das mesmas. Portanto, células cultivadas e diferenciadas in vitro a partir da SVZ de fetos de cobaias apresentam indicadores funcionais de neurônios. A capacidade das células da SVZ de fetos cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora no sentido de aprofundar as pesquisas e viabilizar o uso terapêutico de células-tronco em disordens do sistema nervoso

The present study concerns the identification of neurogenic areas, culture, identification and characterization of neural precursors obtained from the brain of guinea pigs. Potentially neurogenic areas in the brain of neonates were identified by immunohistochemistry for bromodeoxyuridine (BrdU), following administration of the drug. BrdU incorporation was detected mainly in cells underlying the lateral ventricle, in hippocampus and olfactory bulbs, indicating cell proliferation and suggesting a neurogenic potential for these areas. Subsequently, neural precursors were cultured from cells obtained from the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. After approximately one week culture, SVZ cells in active multiplication originated abundant cellular masses (neurospheres, NSFs). Cells dissociated from primary NSFs were capable of originating new NSFs after a few days of culture. NSFs proliferated in number and size, allowing 5-6 weekly subculturings and maintaining growth and viability for up to 60 days. [...] Differentiated cells were then submitted to a functional test, by measuring calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli. GABA and glutamate stimulated some differentiated cells. Thus, cells cultured and differentiated from guinea pig SVZ present physiological indicators of neuronal physiology. Thus, the ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising towards further studies and potential therapeutic use of neural stem cells in disorders of the nervous system

Identificação de áreas neurogênicas no sistema nervoso central de cobaias (Cavia porcellus, Linnaeus 1758): cultura, caracterização e diferenciação de precursores neurais / Identification of neurogenic areas in the central nervous system of guinea pigs (Cavia porcellus, Linnaeus 1758): culture, characterization and differentiation of neural precursors

O presente trabalho relata a identificação de áreas neurogênicas, o cultivo, identificação e caracterização de precursores neurais obtidos do encéfalo de fetos de cobaias. Áreas potencialmente neurogênicas no encéfalo de neonatos foram identificadas por imunohistoquímica para a bromodeoxiuridina (BrdU), após inoculação da droga. A incorporação de BrdU foi detectada principalmente em células das áreas subjacentes ao ventrículo lateral, hipocampo e bulbo olfatório, indicando proliferação celular e sugerindo o potencial neurogênico dessas áreas. A seguir, realizou-se o cultivo de precursores neurais a partir da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais. Após aproximadamente uma semana de cultivo, as células da SVZ em multiplicação ativa originaram abundantes massas celulares (neuroesferas, NSFs). Células dissociadas a partir das NSFs primárias foram capazes de gerar novas neuroesferas após alguns dias de cultivo. As NSFs proliferaram em número e em tamanho, podendo ser subcultivadas por até 5-6 passagens, com intervalos de uma semana, permanecendo viáveis por até 60 dias. [...] Células diferenciadas foram então submetidas a teste de funcionalidade, pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato. A adição de GABA e glutamato resultou em estimulação de algumas células diferenciadas, que foi observado por meio do aumento da fluorescência das mesmas. Portanto, células cultivadas e diferenciadas in vitro a partir da SVZ de fetos de cobaias apresentam indicadores funcionais de neurônios. A capacidade das células da SVZ de fetos cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora no sentido de aprofundar as pesquisas e viabilizar o uso terapêutico de células-tronco em disordens do sistema nervoso (AU)

The present study concerns the identification of neurogenic areas, culture, identification and characterization of neural precursors obtained from the brain of guinea pigs. Potentially neurogenic areas in the brain of neonates were identified by immunohistochemistry for bromodeoxyuridine (BrdU), following administration of the drug. BrdU incorporation was detected mainly in cells underlying the lateral ventricle, in hippocampus and olfactory bulbs, indicating cell proliferation and suggesting a neurogenic potential for these areas. Subsequently, neural precursors were cultured from cells obtained from the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. After approximately one week culture, SVZ cells in active multiplication originated abundant cellular masses (neurospheres, NSFs). Cells dissociated from primary NSFs were capable of originating new NSFs after a few days of culture. NSFs proliferated in number and size, allowing 5-6 weekly subculturings and maintaining growth and viability for up to 60 days. [...] Differentiated cells were then submitted to a functional test, by measuring calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli. GABA and glutamate stimulated some differentiated cells. Thus, cells cultured and differentiated from guinea pig SVZ present physiological indicators of neuronal physiology. Thus, the ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising towards further studies and potential therapeutic use of neural stem cells in disorders of the nervous system (AU)