Bovine abortion associated with Staphylococcus aureus infection: characterization of S. aureus strain isolated from fetal tissues / Aborto bovino associado à infecção por Staphylococcus aureus: caracterização da cepa de S. aureus isolada a partir de tecidos fetais

Staphylococcus aureus is a gram-positive bacterium, commonly found colonizing the skin and mucous membranes of humans and animals. This report describes a case of fetal loss associated with S. aureus infection in a cow. A six-month old, crossbred male bovine fetus from a beef farm was submitted for necropsy. At gross examination fibrinous pleuropneumonia was observed. Histologically, lesions were restricted to the lungs and consisted of marked multifocal to coalescing areas of inflammatory infiltrate of neutrophils, abundant fibrin exudation, necrosis of bronchiolar epithelium and numerous aggregates of coccoid bacteria. Lung and abomasal fluid bacterial culture yielded pure culture of S. aureus, which was characterized as a multidrug resistant strain. Molecular analysis indicated that the studied strain presented several genes of virulence factors including toxic shock syndrome toxin-1 (tst), staphylococcal enterotoxin type A (sea), Panton-Valentine leukocidin (pvl), alpha-hemolysin (hla) and delta-hemolysin (hld). This report documents an infrequent case of fetal loss in cattle due to infection with a highly virulent S. aureus strain.(AU)

Staphylococcus aureus é uma bactéria gram-positiva, comumente encontrada colonizando a pele e as membranas mucosas de humanos e animais. O presente relato descreve um caso de aborto bovino associado à infecção por S. aureus. Um feto bovino, macho, cruzado, com seis meses de idade gestacional proveniente de uma fazenda de gado de corte foi submetido para a necropsia. Pleuropneumonia supurativa foi observada na avaliação macroscópica. Histologicamente as lesões encontravam-se restritas aos pulmões e eram representadas por infiltrado inflamatório acentuado, multifocal a coalescente de neutrófilos, acentuada exsudação de fibrina, necrose do epitélio bronquiolar e numerosos agregados bacterianos cocoides. A cultura bacteriana de fragmento de pulmão e líquido do abomaso revelou o crescimento puro de S. aureus, que foi caracterizado como uma cepa multirresistente a drogas. Análises moleculares indicaram que a cepa estudada apresentava vários fatores de virulência, incluindo toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), enterotoxina estafilocócica tipo A (sea), leucocidina Panton-Valentine (pvl), hemolisina alfa (hla) e hemolisina delta (hld). O presente relato documenta um caso infrequente de aborto bovino devido à infecção por uma cepa altamente virulenta de S. aureus.(AU)

Catarrhal mastitis by Staphylococcus simulans in a nulliparous goat / Mastite catarral causada por Staphylococcus simulans em uma cabra nulipara

The present paper is a case report of a one-year old nulliparous Alpine Goat belonging to a dairy goat farm in semi-arid region of Brazil. Both glands were naturally infected by -hemolytic Staphylococcus simulans and evolved similar clinical signs. The mammary glands presented an acute catarrhal mastitis with systemic clinical signs that responded positively to treatment with gentamicin associated with amoxicillin. The present report suggests the importance of the pathogenic potential of non-aureus Staphylococci strains (NAS) as a cause of clinical mastitis also in nulliparous animals. The isolate showed resistance to tetracycline and contained staphylococcal toxin production genes (sec, sec and TSST-1). Moreover, it has been reported that Staphylococcus simulans is an emerging pathogen in humans causing cutaneous and osteoarticular infections, mainly in those in close contact with farm animals. To the best of our knowledge, this is the first report of a clinical mastitis in a nulliparous goat caused by Staphylococcus simulans.

O presente trabalho é o relato do caso de uma cabra nulípara da raça Parda Alpina, de um ano de idade, pertencente ao Setor de Caprinocultura da Universidade Federal da Paraíba Bananeiras - Brasil. Ambas as glândulas foram naturalmente infectadas por Staphylococcus simulans -hemolítico. As glândulas mamárias apresentaram mastite aguda catarral com envolvimento sistêmico, respondendo positivamente ao tratamento sistêmico com gentamicina associada a amoxicilina. O presente relato sugere a importância do potencial patogênico de Staphylococcus não-aureus (SNA) como causador de mastite clínica também em animais nulíparos. O isolado mostrou resistência a tetraciclina e continha genes de produção de toxinas estafilocócicas (sec, seg e TSST-1). Além disso, tem sido relatado que Staphylococcus simulans é um patógeno emergente em seres humanos causando infecções cutâneas e osteoarticulares, principalmente naqueles que têm contato íntimo com animais de fazenda. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de uma mastite clínica em uma cabra nulípara causada por Staphylococcus simulans.

Catarrhal mastitis by Staphylococcus simulans in a nulliparous goat / Mastite catarral causada por Staphylococcus simulans em uma cabra nulipara

The present paper is a case report of a one-year old nulliparous Alpine Goat belonging to a dairy goat farm in semi-arid region of Brazil. Both glands were naturally infected by α-hemolytic Staphylococcus simulans and evolved similar clinical signs. The mammary glands presented an acute catarrhal mastitis with systemic clinical signs that responded positively to treatment with gentamicin associated with amoxicillin. The present report suggests the importance of the pathogenic potential of non-aureus Staphylococci strains (NAS) as a cause of clinical mastitis also in nulliparous animals. The isolate showed resistance to tetracycline and contained staphylococcal toxin production genes (sec, sec and TSST-1). Moreover, it has been reported that Staphylococcus simulans is an emerging pathogen in humans causing cutaneous and osteoarticular infections, mainly in those in close contact with farm animals. To the best of our knowledge, this is the first report of a clinical mastitis in a nulliparous goat caused by Staphylococcus simulans(AU)

O presente trabalho é o relato do caso de uma cabra nulípara da raça Parda Alpina, de um ano de idade, pertencente ao Setor de Caprinocultura da Universidade Federal da Paraíba ­ Bananeiras - Brasil. Ambas as glândulas foram naturalmente infectadas por Staphylococcus simulans α-hemolítico. As glândulas mamárias apresentaram mastite aguda catarral com envolvimento sistêmico, respondendo positivamente ao tratamento sistêmico com gentamicina associada a amoxicilina. O presente relato sugere a importância do potencial patogênico de Staphylococcus não-aureus (SNA) como causador de mastite clínica também em animais nulíparos. O isolado mostrou resistência a tetraciclina e continha genes de produção de toxinas estafilocócicas (sec, seg e TSST-1). Além disso, tem sido relatado que Staphylococcus simulans é um patógeno emergente em seres humanos causando infecções cutâneas e osteoarticulares, principalmente naqueles que têm contato íntimo com animais de fazenda. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de uma mastite clínica em uma cabra nulípara causada por Staphylococcus simulans.(AU)

Catarrhal mastitis by Staphylococcus simulans in a nulliparous goat / Mastite catarral causada por Staphylococcus simulans em uma cabra nulipara

The present paper is a case report of a one-year old nulliparous Alpine Goat belonging to a dairy goat farm in semi-arid region of Brazil. Both glands were naturally infected by α-hemolytic Staphylococcus simulans and evolved similar clinical signs. The mammary glands presented an acute catarrhal mastitis with systemic clinical signs that responded positively to treatment with gentamicin associated with amoxicillin. The present report suggests the importance of the pathogenic potential of non-aureus Staphylococci strains (NAS) as a cause of clinical mastitis also in nulliparous animals. The isolate showed resistance to tetracycline and contained staphylococcal toxin production genes (sec, sec and TSST-1). Moreover, it has been reported that Staphylococcus simulans is an emerging pathogen in humans causing cutaneous and osteoarticular infections, mainly in those in close contact with farm animals. To the best of our knowledge, this is the first report of a clinical mastitis in a nulliparous goat caused by Staphylococcus simulans(AU)

O presente trabalho é o relato do caso de uma cabra nulípara da raça Parda Alpina, de um ano de idade, pertencente ao Setor de Caprinocultura da Universidade Federal da Paraíba ­ Bananeiras - Brasil. Ambas as glândulas foram naturalmente infectadas por Staphylococcus simulans α-hemolítico. As glândulas mamárias apresentaram mastite aguda catarral com envolvimento sistêmico, respondendo positivamente ao tratamento sistêmico com gentamicina associada a amoxicilina. O presente relato sugere a importância do potencial patogênico de Staphylococcus não-aureus (SNA) como causador de mastite clínica também em animais nulíparos. O isolado mostrou resistência a tetraciclina e continha genes de produção de toxinas estafilocócicas (sec, seg e TSST-1). Além disso, tem sido relatado que Staphylococcus simulans é um patógeno emergente em seres humanos causando infecções cutâneas e osteoarticulares, principalmente naqueles que têm contato íntimo com animais de fazenda. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de uma mastite clínica em uma cabra nulípara causada por Staphylococcus simulans.(AU)

Molecular characterization of Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis isolates of intramammary infections of dairy cows

A mastite bovina é a doença mais frequente em vacas leiteiras, o que resulta em significativas perdas econômicas. Staphyloccoccus aureus e Streptococcus uberis estão entre as principais causas de mastite clínica (MC) e subclínica (MSC), pois são de difícil controle por medidas convencionais, já que ambos possuem mecanismos de evasão do sistema imune, aderência e internalização nos tecidos mamários. Sendo assim, esta tese foi organizada em três experimentos: 1) Caracterização genotípica de S. aureus isolados de mastite de rebanhos brasileiros e de outros países; 2) Caracterização genotípica e sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de S. aureus identificados antes e após o tratamento de MSC durante a lactação e 3) Diversidade genotípica e fatores de virulência de S. uberis cepas de infecções intramamárias de vacas leiteiras no Brasil. No experimento 1, 70 isolados de S. aureus (35 de MC e 35 de MSC) foram isoladas de amostras de leite de quartos mamários de vacas em 16 rebanhos do Brasil. Estes isolados foram agrupados à isolados provenientes da Argentina, Colômbia, Alemanha, Itália, EUA, África do Sul e Tunísia para genotipagem por RS-PCR, baseada na amplificação do espaço intergênico 16S-23S rRNA e investigados em relação a 26 fatores de virulência. No experimento 2, 79 isolados de S. aureus foram genotipados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e avaliados quanto à concentração inibitória mínima (CIM) para determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. No experimento 3, 44 isolados de S. uberis foram avaliados por hibridização de DNA através da metodologia dot blot para determinação da diversidade genotípica. Os resultados do experimento 1 indicaram alta variabilidade genotípica de S. aureus de acordo com os países avaliados, e prevalência de genes relacionados à invasão ao organismo do hospedeiro (clfA, nuc, lukE, lukE-lukD, lukS/F-P, scn, chp, fmtB, sak, cna) e genes associados à evasão da resposta imune (tsst, eta, etb, sea, sec, sed, seg, seh, sei, sej, sel, mecA). Além disso, foi demonstrado que o padrão genotípico de isolados de S. aureus foi específico para cada país, sugerindo que as estratégias de controle devem ser formuladas de acordo com a região em questão e com a virulência das cepas envolvidas na infecção. No experimento 2, foi identificada alta similaridade entre os isolados de um mesmo rebanho indicando especificidade genotípica dentro de uma mesma região, mesmo após os tratamentos durante a lactação. Além disso, grande porcentagem dos isolados se mostrou suscetível à gentamicina, enrofloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina, embora alta resistência para a amoxicilina e cefalexina tenha sido também observada. No experimento 3, foram observados nove padrões de dot blot, indicando alta heterogeneidade dos isolados de S. uberis. Foi possível observar alta prevalência dos genes reguladores de fatores de virulência, como sua e gapC, responsáveis pela aderência e internalização de S. uberis nos tecidos da glândula mamária. Assim, após a conclusão dos três experimentos desta tese, foi possível concluir que há alta diversidade genotípica em S. aureus e S. uberis isolados de infecções intramamárias no Brasil e em outros países. Além disso, foi confirmado que estas duas espécies apresentam inúmeros fatores de virulência que contribuem para sua permanência na glândula mamária e dificultam o controle da mastite por meio de medidas convencionais. As técnicas moleculares são eficientes na identificação e caracterização genética de isolados bacterianos e são ferramentas auxiliares no diagnóstico e epidemiologia da mastite.

The bovine mastitis is the disease more frequent of dairy cows, which results in significant economic losses. Staphyloccoccus aureus and Streptococcus uberis are among the main causes of clinical (CM) and subclinical (MSC) mastitis, because they are difficult to control by conventional measures, since both have mechanisms of immune system evasion, adherence and internalization in the mammary tissues. Therefore, this thesis was organized in three experiments: 1) Genotypic characterization of S. aureus isolated from mastitis from Brazilian herds and from other countries; 2) Genotypic characterization and antimicrobial sensitivity of S. aureus isolates identified before and after treatment of MSC during lactation; and 3) Genotypic diversity and virulence factors of S. uberis isolated from intramammary infections of dairy cows in Brazil. In experiment 1, 70 S. aureus isolates (35 from MC and 35 from MSC) were identified in milk samples from cows' mammary quarters in 16 herds in Brazil. These isolates were grouped with isolates from Argentina, Colombia, Germany, Italy, USA, South Africa and Tunisia for genotyping by RS-PCR, based on the amplification of the 16S-23S rRNA intergenic space and investigated in relation to 26 virulence factors. In experiment 2, 79 S. aureus isolates were genotyped by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) to assess antimicrobial resitance profiles. In experiment 3, 44 isolates of S. uberis were evaluated by DNA hybridization using the dot blot methodology, to determine the genotypic diversity. The results of experiment 1 indicated high genotypic variability of S. aureus according to the countries evaluated, prevalence of genes related to invasion to the host organism (clfA, nuc, lukE, lukE-lukD, lukS / FP, scn, chp, fmtB, sak, cna) and presence of genes associated to the evasion of the immune response (tsst, eta, etb, sea, sec, sed, sec, seh, sei, sej, sel, mecA). In addition, it was shown that the genotype pattern os S. aureus isolates were specific to each country, suggesting that control strategies should be formulated according to the region in question and the virulence of the strains involved in the infection. In experiment 2, a high similarity was identified between the isolates of the same herd, indicating genotypic specificity within the same region, even after treatments during lactation. In addition, a large percentage of the isolates were susceptible to gentamicin, enrofloxacin, ciprofloxacin and tetracycline, although high resistance to amoxicillin and cephalexin has also been observed. In experiment 3, nine dot blot patterns were observed, indicating high heterogeneity of S. uberis isolates. It was possible to observe a high prevalence of genes regulating virulence factors, such as sua and gapC, responsible for the adherence and internalization of S. uberis in the mammary gland tissues. Thus, after the conclusion of the three experiments in this thesis, it was possible to conclude that there is a high genotypic diversity in S. aureus and S. uberis isolated from intramammary infections in Brazil and other countries. In addition, it has been confirmed that these two species have numerous virulence factors that contribute to their permanence in the mammary gland and that hinder the conventional mastitis control measures. The molecular techniques are efficient in the identification and genetic characterization of bacterial isolates and are auxiliary tools in the diagnosis and epidemiology of mastitis.

FATORES DE PATOGENICIDADE DE Staphylococcus spp. EM LEITE DE VACAS COM TRATAMENTO NÃO CONVENCIONAL DA MASTITE

Objetivou-se caracterizar e comparar a formação de biofilme, suscetibilidade a antimicrobianos in vitro, presença e distribuição de genes de virulência e de resistência antimicrobiana, além de determinar a diversidade clonal de estirpes de Staphylococcus spp. isoladas em leite de vacas tratadas e não tratadas com homeopatia. Os isolados de Staphylococcus spp. foram identificados por reação em cadeia da polimerase-espaço transcrito interno (ITS-PCR) e foram investigados quanto a presença dos genes sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, pvl e eta codificadores de toxinas, dos genes icaABCD, bap, aap, atlE e bhp relacionados com a produção de biofilme e dos genes blaZ e mecA associados com a resistência antimicrobiana. Amostras mecA positivas foram tipadas para o tipo SCCmec por Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR Multiplex), enquanto a pesquisa de produção in vitro de bioflme ocorreu pelo método de aderência em placas de poliestireno. O perfil de resistência antimicrobiana foi determinado pelo método de disco-difusão em ágar e o perfil de restrição enzimática por Pulsed-Field Gel Electroforesis (PFGE). Clusters de S. aureus e S. epidermidis com três ou mais isolados tiveram uma linhagem selecionada para tipagem por Multilocus Sequence Typing (MLST), cujas sequências foram analisadas por banco de dados (http://www.mlst.net). Verificou-se prevalência de S. aureus (50,5%), que apresentou distribuição semelhante nos dois grupos, enquanto Staphylococcus spp. coagulase-negativos (CoNS) (70,8%) foram frequentes em vacas tratadas (p=0,036). O gene sec ocorreu apenas em S. chromogenes, com maior frequência em animais tratados (p=0,004) e o gene pvl foi encontrado em 66,7% de S. aureus. O operon icaADBC e os genes icaA e icaD associados prevaleceram em S. aureus, porém o gene icaD foi predominante no grupo de vacas tratadas (p=0,012). Os genes atlE e aap foram carreados apenas por S. epidermidis. Entre as estirpes com produção de biofilme in vitro, 76,8% continham pelo menos um gene relacionado com esta característica. Os genes mecA e Blaz apresentaram distribuição similar em vacas tratadas e não tratadas, porém mecA foi identificado apenas em S. epidermidis (12,1%), todos tipados como SCCmec tipo I. A susceptibilidade antimicrobiana revelou um perfil de multirresistência em 29,3% das estirpes. Houve predominância de um cluster majoritário em S. epidermidis e S. chromogenes, o que não ocorreu para S. aureus. A sequência do tipo (ST) 81 foi predominante em S. epidermidis, enquanto as STs 1, 5 e 126 em S. aureus. A presença de genes de toxinas, resistência antimicrobiana e biofilme, bem como a produção in vitro deste fator de patogenicidade, aliados à persistência de perfis clonais bacterianos, demonstram que sistemas em transição para manejos orgânicos podem representar risco à saúde pública pela circulação de patógenos zoonóticos em leite bovino. Medidas eficazes devem ser tomadas no controle dos produtos lácteos e manejo dos animais.

The present study aimed to characterize and compare biofilm formation, in vitro antimicrobial susceptibility, and the presence and distribution of virulence and antimicrobial resistance genes, as well as to determine the clonal diversity of Staphylococcus spp. strains isolated in milk from cows treated or not with homeopathy. The Staphylococcus spp. isolates were identified by polymerase chain reaction targeting the internal transcribed spacer (ITS-PCR) and were investigated regarding the presence of the sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, pvl, and eta toxin-encoding genes, the icaABCD, bap, aap, atlE, and bhp genes, related to the production of biofilm, and the blaZ and mecA genes, which are associated with antimicrobial resistance. mecA-positive samples were typed for SCCmec by Multiplex Polymerase Chain Reaction (Multiplex PCR), while the assessment of in vitro biofilm production was carried out using the polystyrene plate adhesion method. The antimicrobial resistance profile was determined using the agar disc diffusion method, and the enzyme restriction profile, by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Clusters of S. aureus and S. epidermidis with three or more isolates had one strain selected for typing by Multilocus Sequence Typing (MLST), and the sequences were analyzed on an online database (http://www.mlst.net). A 50.5% prevalence of S. aureus was observed, with similar distribution in both groups, while coagulase-negative Staphylococcus spp. (CoNS) were frequent (70.8%) in treated cows (p=0.036). The sec gene was found only in S. chromogenes and more frequently in treated animals (p=0.004), while the pvl gene was observed in 66.7% of the S. aureus. The icaADBC operon and the associated icaA and icaD genes prevailed in S. aureus, although the icaD gene was predominant in the treated cows group (p=0.012). The atlE and aap genes were carried only by S. epidermidis. Among the strains presenting in vitro biofilm production, 76.8% had at least one gene related to this trait. The mecA and Blaz genes exhibited similar distribution in treated and untreated cows, although mecA was identified only in S. epidermidis (12.1%), all of which were typed as SCCmec type I. The antimicrobial susceptibility assay revealed a multiresistance profile in 29.3% of the strains. There was a predominance of a major cluster in S. epidermidis and S. chromogenes, which did not occur for S. aureus. Sequence type (ST) 81 was predominant in S. epidermidis, while STs 1, 5, and 126 were prevalent in S. aureus. The presence of genes related to toxin production, antimicrobial resistance, and biofilm formation, as well as the in vitro production of this pathogenicity factor, combined with the persistence of bacterial clonal profiles, demonstrate that systems in transition to organic management can represent a risk to public health due to the circulation of zoonotic pathogens in bovine milk. Effective measures must be taken to control dairy products and animal management.

Fatores de patogenicidade, perfil de resistência a antimicrobianos e diversidade clonal de Staphylococcus aureus isolados de leite cru, soro-fermento, manipuladores e Queijo Minas artesanal da região de Campo das Vertentes, Brasil.

Staphylococcus aureus é um dos principais agentes patogênicos encontrados em queijos produzidos com leite cru no mundo, incluindo o queijo Minas artesanal produzido no Brasil. No entanto, informações sobre S. aureus isolados de queijos artesanais e de fontes de produção em queijarias de pequena escala são muito limitadas. Nós objetivamos caracterizar os aspectos de patogenicidade e a diversidade clonal de S. aureus isolados de queijo Minas artesanal, leite cru, soro-fermento e manipuladores saudáveis da Região de Campo das Vertentes, MG, Brasil. As amostras foram identificadas usando MALDI-TOF MS e para a avaliação de produção de biofilme o Agar Vermelho Congo (AVC) e placas de poliestireno. PCR foi utilizada para detectar icaA, icaB, icaC, sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, agr e mecA. A expressão dos genes das toxinas estafilocócicas em amostras positivas na PCR foi avaliada por qRT-PCR e a produção dessas toxinas bem como a atividade hemolítica foram avaliadas in vitro. Também avaliamos o perfil de resistência antimicrobiana das amostras. Para análises estatísticas foram utilizados cluster, teste qui-quadrado e correspondência. O estudo da diversidade clonal das amostras foi realizado pela aplicação das técnicas de spa typing, rep-PCR ((GTG)5) e MALDI-TOF MS, sendo realizada a avaliação do poder discriminatório, da tipabilidade e da concordância entre as técnicas de tipificação supramencionadas. Foram analisadas 76 amostras de Staphylococcus aureus. Na PCR, 18,42%, 18,42%, 2,63% e 77,63% das amostras foram positivos para sea, tsst-1, sec e agr, respectivamente. Os genes das toxinas estafilocócicas foram de baixa expressão na qRT-PCR e apenas duas amostras foram produtoras de TSST. A maior parte das amostras (61,84%) apresentou atividade hemolítica e foram formadoras de biofilme em CRA (69,73%) e em placas de poliestireno (81,58%). Nenhuma das amostras possuia mecA nem apresentou padrão de multirresistência, sendo as maiores resistências observadas para Penicilina G (67,11%) e Tetraciclina (27,63%). O genótipo de maior frequência no estudo foi o t605 (27%), seguido pelos tipos t002 (10,8%) e t521 (9,5%). Spa typing e (GTG)5 apresentaram alto poder discriminatório, em contrapartida ao MALDI-TOF MS que apresentou baixo poder 11 discriminatório e baixa concordância com as técnicas genômicas de tipificação. Em conclusão, as amostras apresentaram potencial toxigênico, com maior prevalência de sea e tsst-1. Nós constatamos que a produção de biofilme foi o principal fator de patogenicidade das amostras. Foram formados seis clusters cujas frequências de distribuição diferiram para atividade hemolítica, formação de biofilme (análises qualitativa e quantitativa) e resistência à Penicilina, Tetracilina e Eritromicina (P<0,05). As amostras de Staphylococcus aureus apresentaram alta diversidade genética, e há indícios de que a presença desse micro-organismo no produto final seja fruto da contaminação cruzada do leite cru, do soro-fermento (pingo) e dos manipuladores assintomáticos desse agente bacteriano. Nossos achados enfatizam a necessidade de medidas efetivas que previnam a intoxicação alimentar estafilocócica, limitando o crescimento de S. aureus e a formação de enterotoxinas, bem como reforçam a importância da implementação das boas práticas de fabricação para reduzir o risco de transmissão de bactérias potencialmente patogênicas ao longo da cadeia de produção do queijo Minas artesanal.

Staphylococcus aureus is one of the main pathogens found in cheeses produced with raw milk, including Minas artisanal cheese from Brazil. However, information on S. aureus isolated from artisanal cheeses and its sources of production in small-scale dairies is very limited. We aimed to characterize the virulence aspects and clonal diversity of S. aureus isolated from Minas artisanal cheese, raw milk, endogenous starter culture and handlers from the region of Campo das Vertentes, Minas Gerais State, Brazil. The samples were identified by MALDI-TOF MS. Biofilm production was evaluated on Congo Red Agar (CRA) and polystyrene plates. PCR was used to detect icaA, icaB, icaC, sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, agr and mecA. Expression of staphylococcal toxin genes in PCR positive samples was evaluated by qRT-PCR and the production of these toxins as well as hemolytic activity were in vitro evaluated. We also evaluated the antimicrobial resistance profile of the samples. For statistical analysis, cluster, chi-square test and correspondence were used. The study of the clonal diversity of the samples was performed by the spa typing, rep-PCR ((GTG)5) and MALDI-TOF MS techniques. The discriminatory power, the typability and the concordance between the typing techniques were evaluated. A total of 76 Staphylococcus aureus samples were analyzed. In the PCR, 18.42%, 18.42%, 2.63% and 77.63% of the samples were positive for sea, tsst-1, sec and agr, respectively. Staphylococcal toxin genes were of low expression in qRT-PCR and only two samples were TSST-producing. Most of the samples (61.84%) had hemolytic activity and were biofilm forming in CRA (69.73%) and in polystyrene plates (81.58%). None of the samples presented mecA neither presented a multiresistance pattern, with the highest resistance observed for Penicillin G (67.11%) and Tetracycline (27.63%). The most frequent genotype in the study was t605 (27%), followed by t002 (10.8%) and t521 (9.5%). Spa typing and (GTG)5 presented high discriminatory power, in contrast to MALDI-TOF MS, which presented low discriminatory power and low concordance with typification genomic techniques. In conclusion, the samples presented toxigenic potential, with a higher prevalence of sea and tsst-1. We found that the 13 biofilm production was the main virulence factor of the samples. Six clusters were formed whose distribution frequencies differed for hemolytic activity, biofilm formation (qualitative and quantitative analyses) and resistance to Penicillin, Tetracillin and Erythromycin (P <0.05). Staphylococcus aureus samples showed high genetic diversity, and there are evidences that the presence of this microorganism in the final product is the result of cross-contamination of raw milk, serum-yeast (pingo) and asymptomatic manipulators of this bacterial agent. These findings emphasize the need for effective measures to prevent staphylococcal food poisoning by limiting S. aureus growth and enterotoxin formation, , as well as reinforcing the importance of implementing good manufacturing practices to reduce the risk of transmission of potentially pathogenic bacteria along the cheesemaking chain.

Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in non-outbreak skin infections

The aim of this study was to determine the prevalence of Staphylococcus aureus and risk factors for the acquisition of MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) as the main cause of skin and soft tissue infections. S. aureus were characterized for the presence of PVL, TSST-1 and mecA genes. SCCmec typing was carried out in mecA positive strains and PFGE was performed only in these strains. During the study period, 127 outpatients attending a dermatology clinical the Botucatu Medical School, a regional tertiary hospital in Botucatu, Sao Paulo, Brazil, were diagnosed with active skin infections. A total 66 (56.9%) S. aureus strains were isolated. The methicillin resistance gene mecA was detected in seven (10.6%) S. aureus strains. The SCCmec types detected in the seven mecA-positive S. aureus strains were type Ia in one, type II in three, and type IV in three. The PVL gene was detected in 10 (15.1%) in sensitive strains. Pulsed field gel electrophoresis revealed non-clonal diversity among the isolates. The risk factors associated with MRSA acquisition in this study were previous ciprofloxacin use and working in a healthcare environment. The risk factors indicate plausible routes of CA-MRSA transmission among the subjects studied.

Ocorrência do gene da toxina da síndrome do choque tóxico em Staphylococcus spp. isolados de leite de vacas com mastite e de leite cru refrigerado / Occurrence of the toxic shock syndrome toxin gene in Staphylococcus spp.isolated from bovine mastitis milk and refrigerated raw milk

Avaliou-se a presença do gene (tst-1) para Toxina da Síndrome do Choque Tóxico-1 (TSST-1), utilizando-se a técnica de Reaçãoem Cadeia da Polimerase (PCR) em um total de 264 Staphylococcus spp. isolados de leite. Desses, 221 eram Staphylococcusaureus, 33 Staphylococcus coagulase negativo (SCN) e 10 Staphylococcus coagulase positivo (SCP). As amostras eram oriundasde vacas com mastite (n=96) e de leite cru refrigerado (n=168), coletadas de 46 e 22 propriedades, respectivamente. As amostrasforam coletadas de rebanhos localizados em diferentes regiões dos Estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro. Observou-seproduto de amplificação (250 pares de base-pb) na reação de PCR para tst-1 em sete amostras (2,6%), sendo todas as estirpesidentificadas como Staphylococcus aureus isoladas de leite cru refrigerado. Embora a detecção do gene não indique a produçãoda toxina, o monitoramento de estirpes bacterianas potencialmente produtoras torna-se importante como forma de realizar umlevantamento epidemiológico e controle dos rebanhos leiteiros brasileiros, uma vez que esse gene está associado aos elementosgenéticos móveis, representando um risco à possível transferência horizontal de genes para outras bactérias. Além disso, a presençadesses genes tem sido associada à presença de genes para enterotoxinas estafilocócicas, o que pode implicar o aumento dapatogenicidade dos isolados bacterianos e um potencial risco à saúde pública.(AU)

Was evaluated the presence of the gene (tst -1) for toxic shock syndrome toxin - 1 (TSST -1), using the technique of PolymeraseChain Reaction (PCR) on a total of 264 Staphylococcus spp. isolated from milk. Of these, 221 were Staphylococcus aureus, 33Staphylococcus coagulase negative (SCN) and 10 Staphylococcus coagulase positive (SCP). The samples were from cows withmastitis (n=96) and refrigerated raw milk (n=168), collected from 46 and 22 dairy herds, respectively. Samples were collectedfrom herds located in different regions of Minas Gerais and Rio de Janeiro States. Was observed PCR amplification of the tst-1gene (250 base pairs-bp) in seven (2.6 %) samples, and all strains of Staphylococcus aureus isolated from refrigerated raw milk.Although its detection in isolated does not mean that it will be expressed, monitoring of bacterial strains producing potentiallybecomes important as performing an epidemiological survey and control of Brazilian dairy herds, since this gene is associatedwith mobile genetic elements, representing a risk to possible horizontal gene transfer to other bacteria. Furthermore, the presenceof these genes have been associated with the presence of genes for enterotoxins, which may result in increased pathogenicity ofthe isolates and a potential risk to public health.(AU)

Ocorrência do gene da toxina da síndrome do choque tóxico em Staphylococcus spp. isolados de leite de vacas com mastite e de leite cru refrigerado / Occurrence of the toxic shock syndrome toxin gene in Staphylococcus spp.isolated from bovine mastitis milk and refrigerated raw milk

Avaliou-se a presença do gene (tst-1) para Toxina da Síndrome do Choque Tóxico-1 (TSST-1), utilizando-se a técnica de Reaçãoem Cadeia da Polimerase (PCR) em um total de 264 Staphylococcus spp. isolados de leite. Desses, 221 eram Staphylococcusaureus, 33 Staphylococcus coagulase negativo (SCN) e 10 Staphylococcus coagulase positivo (SCP). As amostras eram oriundasde vacas com mastite (n=96) e de leite cru refrigerado (n=168), coletadas de 46 e 22 propriedades, respectivamente. As amostrasforam coletadas de rebanhos localizados em diferentes regiões dos Estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro. Observou-seproduto de amplificação (250 pares de base-pb) na reação de PCR para tst-1 em sete amostras (2,6%), sendo todas as estirpesidentificadas como Staphylococcus aureus isoladas de leite cru refrigerado. Embora a detecção do gene não indique a produçãoda toxina, o monitoramento de estirpes bacterianas potencialmente produtoras torna-se importante como forma de realizar umlevantamento epidemiológico e controle dos rebanhos leiteiros brasileiros, uma vez que esse gene está associado aos elementosgenéticos móveis, representando um risco à possível transferência horizontal de genes para outras bactérias. Além disso, a presençadesses genes tem sido associada à presença de genes para enterotoxinas estafilocócicas, o que pode implicar o aumento dapatogenicidade dos isolados bacterianos e um potencial risco à saúde pública.

Was evaluated the presence of the gene (tst -1) for toxic shock syndrome toxin - 1 (TSST -1), using the technique of PolymeraseChain Reaction (PCR) on a total of 264 Staphylococcus spp. isolated from milk. Of these, 221 were Staphylococcus aureus, 33Staphylococcus coagulase negative (SCN) and 10 Staphylococcus coagulase positive (SCP). The samples were from cows withmastitis (n=96) and refrigerated raw milk (n=168), collected from 46 and 22 dairy herds, respectively. Samples were collectedfrom herds located in different regions of Minas Gerais and Rio de Janeiro States. Was observed PCR amplification of the tst-1gene (250 base pairs-bp) in seven (2.6 %) samples, and all strains of Staphylococcus aureus isolated from refrigerated raw milk.Although its detection in isolated does not mean that it will be expressed, monitoring of bacterial strains producing potentiallybecomes important as performing an epidemiological survey and control of Brazilian dairy herds, since this gene is associatedwith mobile genetic elements, representing a risk to possible horizontal gene transfer to other bacteria. Furthermore, the presenceof these genes have been associated with the presence of genes for enterotoxins, which may result in increased pathogenicity ofthe isolates and a potential risk to public health.

Viabilidade de Staphylococcus Aureus (FRI361 e N315) e modulação da expressão de suas toxinas (SEC e TSST- 1) em queijo tipo frescal adicionado de lactobacillus rhamnosus (D1) e Weissella paramesenteroides (GIR1604*)

Os padrões microbiológicos dos alimentos são indicativos da qualidade e segurança sanitária desses produtos que podem causar danos à saúde do consumidor quando fora dos parâmetros adequados. Staphylococcus spp. estão fortemente associados às doenças transmitidas por alimentos por causarem intoxicação, por ação de suas enterotoxinas termoestáveis. O leite e seus derivados são um dos principais alimentos relacionados à intoxicação estafilocócica pelo fato de Staphylococcus spp. serem um dos principais causadores de mastite bovina. Diante disso, se faz necessário pesquisar alternativas capazes de inibir o crescimento de Staphylococcus spp. em produtos lácteos, bem como a produção de suas enterotoxinas. As bactérias ácido láticas (BAL), componentes da microbiota natural do leite cru, são conhecidas por apresentar potencial antimicrobiano diante de diversos micro-organismos patogênicos, inclusive Staphylococcus aureus. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo produzir 81 queijos em laboratório, sob condições de esterilidade, adicionados de combinações entre S. aureus, produtores de SEC (FRI361) e TSST-1 (N315) e Lactobacillus rhamnosus (D1) isolada de queijo Minas artesanal da Serra da Canastra e Weisella paramesenteroides (GIR16L4*), isolada de leite cru, e estudar a viabilidade de S. aureus e a sua capacidade produtora de toxinas na presença de BAL. Os queijos foram armazenados a 7ºC e estocados por 14 dias. O delineamento experimental foi elaborado segundo esquema fatorial 9x3, sendo nove combinações de micro-organismos e três tempos de estocagem dos queijos, em três repetições. As análises microbiológicas (contagem de S. aureus e BAL), físico-químicas (umidade pelo método gravimétrico, compostos nitrogenados pelo método de Kjeldahl, acidez titulável e pH) e moleculares (expressão dos genes das toxinas SEC e TSST-1 por qPCR) foram realizadas em três períodos de tempo (1, 7 e 14 dias). Ao longo dos 14 dias, observou-se que a presença de BAL não alterou o crescimento de S. aureus. Entretanto, foi detectada, por qPCR, uma diminuição na expressão das toxinas avaliadas, sugerindo que as BAL utilizadas podem inibir a expressão de toxinas produzidas por S. aureus em queijos. A modulação da expressão de sec e tsst-1 por N315 ocorreu desde o primeiro dia de análise, já a expressão de sec por FRI361 reduziu a partir do sétimo dia de análise, sugerindo uma modulação cepa-dependente. Esses resultados nos levam a crer numa interação entre as BAL e S. aureus presentes na microbiota endógena do leite, capaz de inibir a expressão de toxinas estafilocócicas, reduzindo assim, a possibilidade de um indivíduo desenvolver o quadro de intoxicação estafilocócica

Microbiological food standards are indicative of health quality and safety. Products that can cause harm to the consumer's health when they are applied. Staphylococcus spp. are strongly associated with foodstuffs transmitted through intoxication, caused by the action of their thermostable enterotoxins. Milk and its derivatives are one of the main foods related to staphylococcal intoxication due to the fact that Staphylococcus spp. are one of the main causes of bovine mastitis. Therefore, it is necessary to investigate alternatives capable of inhibiting the growth of Staphylococcus spp. in dairy products, as well as a production of its enterotoxins. Like lactic acid bacteria (BAL), components of the natural microbiota of raw milk, they are known to present antimicrobial potential against several pathogenic microorganisms, including Staphylococcus aureus. Thus, the present work had the objective of producing 81 cheeses in the laboratory under sterile conditions, adding combinations of S. aureus, producers of SEC (FRI361) and TSST-1 (N315) and Lactobacillus rhamnosus (D1) isolated from cheese Serra da Canastra and Weissella paramesenteroides (GIR16L4 *), isolated from raw milk, and to study the viability of S. aureus and its toxin-producing capacity in the presence of BAL. The cheeses were stored at 7 ° C and stored for 14 days. The experiment was delimited in a factorial scheme according to a 9x3 factorial scheme, with nine combinations of microorganisms and three storage times of the cheeses in three sreplicates. The experimental design was elaborated according to the factorial scheme 9x3, being nine combinations of microorganisms and three times of storage of the cheeses, in three replicates. Microbiological analyzes (counting of S. aureus and BAL), physical-chemical (moisture by the gravimetric method, nitrogen compounds by the Kjeldahl method, titratable acidity and pH) and molecules (qPCR) were performed in three time periods (1, 7 and 14 days). Over the 14 days it was observed that the presence of BAL did not alter the growth of S. aureus. However, BAL is able to include an expression of toxins produced by S. aureus in cheeses. A modulation of the expression of secte and tsst-1 by N315 from the first day of analysis, an expression of FRI361 seg reduced from the analysis period, suggesting a strain-dependent modulation. These results are a company specialized in microbiota, capable of inhibiting an expression of staphylococcal and reduced toxins, as well as a possibility of an individual developed in staphylococcal intoxication.

Epidemiologia molecular aplicada ao monitoramento de estirpes de Staphylococcus aureus na produção de queijo Minas frescal / Molecular epidemiology applied to monitoring strains of Staphylococcus aureus in Minas frescal cheese production

Foi realizado o monitoramento epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do queijo Minas frescal em micro-usina do Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras. Essas amostras foram colhidas da superfície dos tanques de recepção e estocagem do leite cru, da superfície do tanque de equilíbrio do leite pasteurizado, da rede de abastecimento de água, das tubulações e equipamentos, das mãos do manipulador e de queijos embalados prontos para consumo. As colônias isoladas em Agar Baird-Parker confirmadas como cocos Gram positivos e que mostravam-se positivas às provas de catalase, coagulase e da produção de acetoína, foram submetidas à extração do DNA bacteriano através da utilização do Kit Invitek - Uniscience®. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1 foi realizada a partir da amplificação dos fragmentos de DNA cromossômico específico. Entre as 74 estirpes de estafilococos coagulase positivos isoladas, somente 41 (55.4%) amostras foram confirmadas como sendo Staphylococcus aureus, das quais 25 (61,0%) mostraram-se positivas na pesquisa de toxinas estafilocócicas. A enterotoxina de maior frequência identificada foi a SEA. As estirpes de Staphylococcus aureus toxigênico foram mais isoladas nas mãos do manipulador (16,0%), no leite cru do tanque de recepção (12,0%), no leite pasteurizado para elaboração do queijo (12,0%) e no queijo Minas frescal pronto para consumo (12,0%).

We studied the molecular epidemiology of Staphylococcus aureus strains potentially toxigenic, isolated from the production process of Minas frescal cheese in a small dairy plant in the state of São Paulo. For this, samples were taken during the period from June 2008 to July 2009. Samples were collected from the surface of the receiving and storage tanks of raw milk, the surface of the balance tank of pasteurized milk, the water supply system, the pipes and equipments, the hands of the handler and from the packaged cheese, totaling 140 samples. The colonies isolated on Baird-Parker Agar confirmed as Gram positive and positive for catalase, coagulase and acetoin production, were submitted to extraction of bacterial DNA using the Invitek - Uniscience® kit. Confirmation of the isolated species and enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin was carried out through the amplification of specific fragments of chromosomal DNA. Among the 74 strains of isolated coagulase-positive staphylococci, only 41 (55.4%) strains were confirmed as Staphylococcus aureus, of which 25 (61.0%) were positive to the presence of staphylococcal toxins. The most frequently identified enterotoxin was SEA. The toxigenic strains of Staphylococcus aureus were more frequently isolated from hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk for cheese making (12.0%) and fresh white cheese ready for consumption (12.0%).

Epidemiologia molecular aplicada ao monitoramento de estirpes de Staphylococcus aureus na produção de queijo Minas frescal / Molecular epidemiology applied to monitoring strains of Staphylococcus aureus in Minas frescal cheese production

Foi realizado o monitoramento epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do queijo Minas frescal em micro-usina do Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras. Essas amostras foram colhidas da superfície dos tanques de recepção e estocagem do leite cru, da superfície do tanque de equilíbrio do leite pasteurizado, da rede de abastecimento de água, das tubulações e equipamentos, das mãos do manipulador e de queijos embalados prontos para consumo. As colônias isoladas em Agar Baird-Parker confirmadas como cocos Gram positivos e que mostravam-se positivas às provas de catalase, coagulase e da produção de acetoína, foram submetidas à extração do DNA bacteriano através da utilização do Kit Invitek - Uniscience®. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1 foi realizada a partir da amplificação dos fragmentos de DNA cromossômico específico. Entre as 74 estirpes de estafilococos coagulase positivos isoladas, somente 41 (55.4%) amostras foram confirmadas como sendo Staphylococcus aureus, das quais 25 (61,0%) mostraram-se positivas na pesquisa de toxinas estafilocócicas. A enterotoxina de maior frequência identificada foi a SEA. As estirpes de Staphylococcus aureus toxigênico foram mais isoladas nas mãos do manipulador (16,0%), no leite cru do tanque de recepção (12,0%), no leite pasteurizado para elaboração do queijo (12,0%) e no queijo Minas frescal pronto para consumo (12,0%).(AU)

We studied the molecular epidemiology of Staphylococcus aureus strains potentially toxigenic, isolated from the production process of Minas frescal cheese in a small dairy plant in the state of São Paulo. For this, samples were taken during the period from June 2008 to July 2009. Samples were collected from the surface of the receiving and storage tanks of raw milk, the surface of the balance tank of pasteurized milk, the water supply system, the pipes and equipments, the hands of the handler and from the packaged cheese, totaling 140 samples. The colonies isolated on Baird-Parker Agar confirmed as Gram positive and positive for catalase, coagulase and acetoin production, were submitted to extraction of bacterial DNA using the Invitek - Uniscience® kit. Confirmation of the isolated species and enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin was carried out through the amplification of specific fragments of chromosomal DNA. Among the 74 strains of isolated coagulase-positive staphylococci, only 41 (55.4%) strains were confirmed as Staphylococcus aureus, of which 25 (61.0%) were positive to the presence of staphylococcal toxins. The most frequently identified enterotoxin was SEA. The toxigenic strains of Staphylococcus aureus were more frequently isolated from hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk for cheese making (12.0%) and fresh white cheese ready for consumption (12.0%).(AU)

TSST-1, enterotoxin and bacteriocin-like substance production by Staphylococcus aureus isolated from foods / TSST-1, enterotoxinas e substâncias tipo bacteriocina produzidas por Staphylococcus aureus isolados de alimentos

The production of Toxic Shock Syndrome Toxin-1 (TSST-1), enterotoxins and bacteriocin-like substances was evaluated in 95 strains of Staphylococcus aureus recovered from raw bovine milk (n=31) and from food samples involved in staphylococcal food poisoning (n=64). Enterotoxigenicity tests with the membrane over agar associated to optimal sensibility plate assays were performed and showed that 96.77% of strains recovered from milk and 95.31% from food samples produced enterotoxins A, B, C, D or TSST-1. Reference strains S. epidermidis, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus casei, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Enterococcus faecalis and Bacteroides fragilis were used as indicator bacteria in the antagonistic assays, the first five being sensitive to antagonistic substances. Brain heart infusion agar, in pH values ranging from 5.0 to 7.0 in aerobic atmosphere showed to be the optimum condition for antagonistic activity as evaluated with the best producer strains against the most sensitive indicator bacterium, L. monocytogenes. Sensitivity to enzymes confirmed the proteinaceous nature of these substances. Neither bacteriophage activity nor fatty acids were detected and the antagonistic activity was not due to residual chloroform. Results did not establish a positive correlation between the bacteriocinogenic profile and toxigenicity in the tested S. aureus strains.(AU)

Avaliou-se a produção de toxina-1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), enterotoxinas e substâncias antagonistas tipo bacteriocina em 95 amostras de Staphylococcus aureus recuperadas de leite bovino in natura (n=31) e de alimentos envolvidos em surto de intoxicação (n=64). Testes de enterotoxigenicidade pelo método da membrana sobre ágar, associado à técnica da sensibilidade ótima em placa, revelaram que 96,77% das amostras do leite e 95,31% daquelas dos alimentos produziram enterotoxinas estafilocócicas tipos A, B, C, D ou TSST-1. Nos ensaios de antagonismo, foram utilizadas como reveladoras amostras de referência de S. epidermidis, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus casei, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Bacteroides fragilis, sendo as cinco primeiras sensíveis às substâncias produzidas. As condições ótimas para a atividade antagonista, avaliadas com as melhores produtoras contra a indicadora mais sensível, L. monocytogenes, foram observadas em aerobiose, em ágar infuso de cérebro-coração, nos valores de pH entre 5,0 e 7,0. A sensibilidade a enzimas confirmou a natureza proteica destas substâncias. Não foram detectadas atividades de bacteriófagos nem de ácidos graxos, e a atividade antagonista não foi devido ao clorofórmio residual. Os resultados não mostraram correlação entre o perfil bacteriocinogênico e a toxigenicidade nas amostras de Staphylococcus testadas.(AU)

DETECÇÃO DE GENES DE TOXINAS EM Staphylococcus spp. RESISTENTES ISOLADOS DE MASTITE BOVINA

Staphylococcus spp. estão entre os principais agentes etiológicos da mastite bovina. Esses microrganismos são relatados como importantes contaminantes de leite cru e seus derivados, sendo capazes de produzir diversas toxinas, capazes de provocar surtos de intoxicação alimentar, e síndrome do choque tóxico em humanos. Embora as intoxicações alimentares estejam mais relacionadas a Staphylococcus aureus, há relatos de cepas de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) produtoras de toxinas. Neste cenário, o objetivo deste estudo foi investigar a presença dos genes sea, sec e tst, responsáveis pela produção das enterotoxinas estafilocócicas A, C e da TSST-1, respectivamente, em 67 cepas de Staphylococcus spp. resistentes a princípios ativos antimicrobianos (27-S. aureus, e 40-SNC), isoladas de amostras de secreção láctea de novilhas e vacas com mastite clínica ou subclínica de propriedades comerciais e experimentais do estado de São Paulo, Brasil. Por meio da técnica de PCR, não foram encontrados em nenhuma das 67 cepas os genes sea e tst, entretanto o gene sec foi detectado em 20 cepas (29,85%) de S. aureus. A presença do gene sec em amostras de leite de vacas com mastite pode representar um sério risco do ponto de vista epidemiológico, uma vez que, quando se trata de saúde pública, a detecção de genes de virulência em amostras de alimentos, pode representar um risco à saúde do consumidor. Além disso, esses microrganismos podem conter outros genes de virulência não avaliados no presente estudo.

Staphylococcus spp. are considered one of the main etiological agents of bovine mastitis. These microorganisms are reported as important contaminants of raw milk and dairy products, being able to produce various toxins, causing food poisoning outbreaks, and toxic shock syndrome in humans. While food poisoning is more related to Staphylococcus aureus, there are reports of Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) strains produced from toxins. With that scenery, the objective of this study was to investigate the presence of genes sea, sec and tst, responsible for the production of staphylococcal enterotoxin A, C and TSST-1, respectively, in 67 strains of Staphylococcus spp resistant to antimicrobial (27-S aureus, and 40-CNS) isolates from milk secretory samples of heifers and cows with clinical or subclinical mastitis of commercial and experimental farms in São Paulo State, Brazil. By PCR technique, they were not found in any of the 67 strains of the sea genes, however the gene was detected in 20 strains (29.85%) of S. aureus. The presence of the gene in samples of cow's milk with mastitis may represent an epidemiological risk, a detection of virulence genes in food samples may pose a risk to consumer health. Although these microorganisms may contain other virulence genes not assessed in the present study.

Detecção de genes de enterotoxinas e da toxina-1 da Síndrome do Choque Tóxico de Staphylococcus aureus isolados de mastites no Distrito Federal e Entorno.

Staphylococcus aureus é o microrganismo mais isolado nos casos de mastites bovina e destaca-se por possuir resistência aos tratamentos com antimicrobianos convencionais e devido ao seu potencial em produzir toxinas causadoras de doenças. O objetivo desse trabalho foi detectar a presença dos genes de enterotoxinas e da toxina da Síndrome do Choque Tóxico dos Staphylococcus aureus isolados do leite de animais em mastite clínica. Foram analisadas 75 amostras de S. aureus do banco de germoplasma do Laboratório de Microbiologia Médica Veterinário da Universidade de Brasília. As amplificações obtidas apresentaram valores maiores que o esperado para os genes de enterotoxinas. Foram identificados entre os isolados de S. aureus um percentual de 10,68% de amplificações com utilização de primers isoladamente (uniplex) e não houve amplificações em combinação com diferentes primers (multiplex). Analisando a PCR-uniplex, houve maior número de amplificações da enterotoxina SEA, presente em 8% dos isolados. Os genes SEB e SEC, foram detectados em 1,34% das amostras e os genes SED e TSST-1 não apresentaram nenhuma amplificação nesse estudo. O tamanho do fragmento para SEA foi de 1.200 pb em 4 amostras amplificadas, 1 amostra com 800 pb e outra com 620 pb. Em relação a SEB e a SEC, houve apenas amplificação de uma de suas amostras, com tamanho da banda de 1.200 pb e 1100 pb respectivamente. O conhecimento do perfil molecular dos S. aureus auxilia em estudos epidemiológicos de infecções intramamárias de rebanhos leiteiros e conhecendo o potencial toxigênico das estirpes de S. aureus, corrobora para prevenir e controlar as infecções nos rebanhos para melhorar a qualidade dos produtos oferecidos à população.

Staphylococcus aureus is the most frequently isolated organism in cases of bovine mastitis and stands by having resistance to conventional antibiotic treatments and due to its potential to produce toxins that cause diseases. The aim of this study was to detect the presence of enterotoxin genes and the Toxic Shock Syndrome toxin gene of Staphylococcus aureus isolated from the milk of animals with clinical mastitis. Seventy-five samples of S. aureus, from the gene bank of the Medical Veterinary Microbiology Laboratory of the University of Brasilia, were analysed. The obtained amplifications showed higher values than expected for the enterotoxin genes. We identified 10.68% amplifications when using singly primers (uniplex), but there were no amplification when combining different primers (multiplex). Analyzing the uniplex PCR, there were more amplifications of the SEA enterotoxin gene (8% of the isolates). The SEB and SEC genes were detected in 1.34% of the samples and the SED and the TSST-1 genes showed no amplification in this study. The size of the SEA fragment was 1.200 pb in 4 amplified samples, 800 pb in 1 sample and 620 pb in another one. Regarding the SEB and the SEC genes, there was the amplification of only one of the samples, that had a band size of 1.200 pb and 1100 bp, respectively. Knowledge about the molecular profile of S. aureus assists in epidemiological studies about mammary infections of dairy herds. Moreover, knowledge about the toxigenic potential of S. aureus strains helps to prevent and control infections in herds in order to improve the quality of the products offered to the population.

Identification and antimicrobial resistance of microflora colonizing feral pig (Sus scrofa) of Brazilian Pantanal

Antimicrobial resistance of bacteria is a worldwide problem affecting wild life by living with resistant bacteria in the environment. This study presents a discussion of outside factors environment on microflora of feral pigs (Sus scrofa) from Brazilian Pantanal. Animals had samples collected from six different body sites coming from two separated geographic areas, Nhecolandia and Rio Negro regions. With routine biochemical tests and commercial kits 516 bacteria were identified, with 240 Gram-positive, predominantly staphylococci (36) and enterococci (186) strains. Among Gram-negative (GN) bacteria the predominant specimens of Enterobacteriaceae (247) mainly represented by Serratia spp. (105), Escherichia coli (50), and Enterobacter spp. (40) and specimens not identified (7). Antimicrobial susceptibility was tested against 17 drugs by agar diffusion method. Staphylococci were negative to production of enterotoxins and TSST-1, with all strains sensitive towards four drugs and highest resistance toward ampicillin (17%). Enterococci presented the highest sensitivity against vancomycin (98%), ampicillin (94%) and tetracycline (90%), and highest resistance pattern toward oxacillin (99%), clindamycin (83%), and cotrimoxazole (54%). In GN the highest resistance was observed with Serratia marcescens against CFL (98%), AMC (66%) and AMP (60%) and all drugs was most effective against E. coli SUT, TET (100%), AMP, TOB (98%), GEN, CLO (95%), CFO, CIP (93%). The results show a new profile of oxacillin-resistant enterococci from Brazilian feral pigs and suggest a limited residue and spreading of antimicrobials in the environment, possibly because of low anthropogenic impact reflected by the drug susceptibility profile of bacteria isolated.

OCORRÊNCIA DE GENES DE CITOTOXINAS, TOXINAS ESFOLIATIVAS E PIROGÊNICAS EM ISOLADOS DE Staphylococcus pseudintermedius DE ESPÉCIES DOMÉSTICAS E SILVESTRES

Staphylococcus pseudintermedius é uma espécie coagulase-positiva do SIG (grupo Staphylococcus intermedius). É um agente patogênico oportunista que pode causar infecções em diversos sítios e ainda possui potencial zoonótico. Embora o conhecimento sobre o processo de patogenicidade do S. pseudintermedius seja limitado, é de conhecimento a detenção de diversos fatores de virulência por este patógeno. As toxinas são incluídas nestes fatores, e estudos epidemiológicos sobre sua distribuição em S. pseudintermedius são praticamente inexistentes. Podem ser classificadas em três principais grupos: toxinas pirogênicas com propriedades de superantígenos (TSST-1 e SEs), toxinas esfoliativas e citotoxinas (leucocidinas, hemolisinas). Neste estudo a ocorrência de genes para 8 toxinas (sea, sec, tst-1, SIET, EXI, LuK F-I, Luk S-I e hlg ) foi estudada em isolados de S. pseudintermedius através da Reação em Cadeia da Polimerase em 4 espécies de animais domésticos (cães, gatos, bovino e suíno) e 2 espécies silvestres (lobinho e guaxinim) provindos de diversos sítios de infecção. Todas as amostras apresentaram ao menos um gene de alguma toxina, isoladamente ou em associação. As maiores ocorrências foram relatas para Luk S-I (94,83%), Luk F-I (91,38%) e SIET (91,38%) e a menor em hlg (5,17). Não houve associação entre toxina, espécie infectada ou sitio de infecção. A extensa ocorrência destes genes indica um papel importante na gravidade de infecções causadas por estes microrganismos quando patogênicos.

Staphylococcus pseudintermedius is a coagulase-positive species of SIG (Staphylococcus intermedius Group). It is an opportunistic pathogen that can cause infections in several places and also has zoonotic potential. Although knowledge about the pathogenic process of S. pseudintermedius is limited, it is known the arrest of several virulence factors of this pathogen. Toxins are included in these factors, and epidemiological studies of their distribution in S. pseudintermedius are virtually nonexistent. They can be classified into three main groups: pyrogenic toxin superantigens with properties (SEs and TSST-1), exfoliative toxins and cytotoxins (leucocidins, hemolysin). In this study the occurrence of toxins 8 (sea, sec, tst-1, SIET, EXI, LuK F-I, Luk S-I and hlg ) was studied in isolates of S. pseudintermedius by Polymerase Chain Reaction in 4 species of domestic animals (dogs , cats, cow and swine) and two wild species (Crab-eating Fox and Crab-eating Raccoon) stemmed from several sites of infection. All samples showed the gene of at least one type of toxin, alone or in combination. The highest occurrences were relates in LukS-I (94.83%), Luk F-I (91.38%) and EXI (91.38%) and the lowest in hlg (5.17%). There was association of occurrence of hlg and LukF-I genes (p = 0.0175). The extensive occurrence of these genes indicates an important role in the severity of infections caused by these pathogenic commensal microorganisms when.

CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS DE Staphylococcus COAGULASE-NEGATIVOS E TAXAS DE CURA DA MASTITE OVINA

A mastite em ovelhas de dupla aptidão é reconhecida por afetar a qualidade do leite. Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os principais micro-organismos responsáveis pela doença, e o tratamento ao final da lactação, pode contribuir para a cura e prevenção de casos subclínicos na lactação consecutiva. Entretanto, fatores de virulência e mecanismos de resistência apresentados por SCN podem reduzir as taxas de cura. Os objetivos deste trabalho foram identificar no leite de ovelhas tratadas e não tratadas à secagem com antimicrobianos, as espécies de SCN antes e após o tratamento e identificar nesses micro-organismos a presença dos genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed e tsst-1, determinar o perfil clonal das principais espécies identificadas e relacionar os casos de cura após o tratamento com a presença/ausência dos respectivos genes. Sessenta ovelhas foram divididas em três grupos experimentais: G1, controle, metades mamárias que não receberam antimicrobiano; G2, metades mamárias em que foram administrados 10 mL de cloxacilina-benzatina 100 mg via intramamária / estrutura convencional; G3, metades mamárias em que foram administrados 86 mL de cloxacilina-benzatina 50 mg via intramamária / estrutura nanoencapsulada. As amostras de leite foram coletadas à secagem e aos 15 e 30 dias pós-parto da lactação seguinte. As análises para identificação das espécies de SCN foram realizadas por meio de testes bioquímicos e Internal Transcribe Spacer (ITS-PCR), e a pesquisa dos genes responsáveis pelos fatores de virulência e pela resistência à oxacilina foram realizados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Dentre as espécies identificadas S. warneri prevaleceram nos três grupos experimentais. Nenhuma amostra foi positiva para o gene mecA. O único gene relacionado com a produção de enterotoxinas encontrado foi o sec. Dentre os genes relacionados com a produção de biofilme, icaD foi o único identificado nos três grupos experimentais. Staphylococcus warneri, S. simulans e S. epidermidis apresentaram clones na mesma metade mamária no pré e pós-parto das ovelhas. A cloxacilina benzatina nanoparticulada 50mg / 86 mL foi eficiente para reduzir a mastite subclínica no pós-parto de ovelhas (P= 0,0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis e S. xylosus foram as espécies de maior ocorrência. Os genes icaA, icaC, icaD e bap foram encontrados no momento da desmama e no pós-parto, os genes sec e icaD estão associados à ausência de cura da mastite subclínica no pós-parto. Ovelhas em que foram isolados SCN portadores de genes responsáveis pela formação de biofilme não apresentaram resultados satisfatórios quando submetidas a esquemas de controle e ao tratamento da mastite subclínica. Os genes sec e icaD, estão associadas à ausência de cura microbiológica da mastite subclínica no pós-parto. Staphylococcus epidermidis e S. xylosus portador do gene bap estão associados à reinfecção.

Mastitis in dual-purpose sheep is recognized to affect their milk quality. Coagulase-negative Staphylococcus (CNS) is the main microorganism responsible for this disease and treatment at the end of lactation may contribute towards curing it and preventing subclinical cases during the consecutive lactation. However, virulence factors and resistance mechanisms presented by CNS may reduce the cure rates. The aims of this study were to identify CNS species in sheeps milk with and without treatment with antimicrobials at the time of drying off and, in these microorganisms, to identify presence of the genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed and tsst-1, determine clonal profile of the main species identified and correlate the cases of cure after treatment with the presence or absence of the respective genes. Sixty sheep were divided into three experimental groups: G1 (control), mammary glands that did not receive antimicrobials; G2, mammary glands to which 10 mL of cloxacillin-benzathine (100 mg) was administered via the intramammary route in a conventional structure; and G3, mammary glands to which 86 mL of cloxacillin-benzathine (50 mg) was administered via the intramammary route in a nanoencapsulated structure. Milk samples were collected at the time of drying off and 15 and 30 days after lambing in the next lactation. The analyses to identify the CNS species were performed by means of biochemical tests and internal transcribe spacer polymerase chain reaction (ITS-PCR), and the genes responsible for the virulence factors and resistance to oxacillin were investigated by means of the PCR technique. Among the species identified, Staphylococcus warneri was most prevalent in the three experimental groups. None of the samples were positive for the gene mecA. The only gene relating to production of enterotoxins that was found was sec. Among the genes relating to biofilm production, icaD was the only one identified in the three experimental groups. Staphylococcus warneri, S. simulans and S. epidermidis presented clones in the same mammary gland before and after lambing. The dose of 86 mL of nanoparticulate cloxacillin-benzathine (50 mg) was efficient for reducing subclinical mastitis after lambing (P = 0.0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis and S. xylosus were the species that occurred most frequently. The genes icaA, icaC, icaD and bap were found at the time of weaning and in the postpartum period. The genes sec and icaD were correlated with absence of cure for subclinical mastitis after lambing. Sheep in which CNS carrying genes responsible for biofilm formation was isolated did not present satisfactory results when they were subjected to regimens for controlling and treating subclinical mastitis. The genes sec and icaD were correlated with absence of microbiological control over subclinical mastitis after lambing. Staphylococcus epidermidis and S. xylosus carrying the gene bap were correlated with reinfection.

GENES ENTEROTOXIGÊNICOS E RESISTÊNCIA À METICILINA EM Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LEITE CAPRINO

O objetivo do presente trabalho foi investigar a presença de genes enterotoxigênicos e de resistência à meticilina em Staphylococcus aureus isolados de leite caprino obtido de produtores do estado do Rio Grande do Norte. Para a realização do estudo, realizou-se a pesquisa de S.aureus em 49 amostras de leite caprino. O isolamento foi realizado em placas Petrifilm, modelo Staph Express 3M e identificadas bioquimicamente. Em seguida, os isolados foram submetidos a avaliação quanto ao perfil de resistência a antibióticos, utilizando a técnica de difusão em discos em Agar Mueller-Hinton. Seguiu-se com a realização da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para pesquisa dos seguintes genes selecionados: 16S rRNA (para identificação molecular dos S. aureus), mecA (que caracteriza S. aureus resistente à meticilina) e genes enterotoxigênicos (sea, seb-sec, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej e tsst-1). Os resultados das análises morfológicas e bioquímicas revelaram que todos os isolados pertenciam a espécie Staphylococcus aureus. Observou-se através do antibiograma realizado um maior percentual de resistência para os antimicrobianos penicilina G (87,75%) e oxacilina (75,51%). Multirresistência foi verificada em 73,46% dos isolados. Com a análise da PCR, confirmou-se que 100% dos isolados eram S. aureus, pela amplificação do gene 16S rRNA. O gene mecA foi detectado em 4,08% das amostras. Na pesquisa de enterotoxinas estafilocócicas (SE), nas amostras confirmadas para S. aureus, houve amplificação em 79,5 % dos fragmentos do gene sej, seguido de 48,9% do gene sei, 22,4% do gene sed, 12,2% para o gene sea, 8,1% para os genes seh e seg e 2% para o gene sec. Não foi observada nenhuma amplificação para os genes seb-sec, see e Tsst-1. As amostras de S. aureus isoladas a partir do leite caprino demostraram presença de genes responsáveis pela produção de toxinas, fato que exige um maior cuidado no tratamento deste leite pela indústria de alimentos. Além disso a resistência aos antibióticos e detecção do gene mecA também leva a preocupação, podendo representar riscos à saúde do consumidor.

The aim of this study was to investigate the presence of enterotoxigenic and methicillin-resistant genes in Staphylococcus aureus isolated from goat milk obtained from Rio Grande do Norte state producers. To achieve such goal, 49 samples of goat milk and searched for S. aureus. The colonies were isolated in Petrifilm plates, Staph Express 3M model and biochemically identified. Afterwards, the isolated strains underwent an assessment to evaluate their antibiotic resistance profile, through the use of disk diffusion technique on Mueller-Hinton agar. Following we carried out a polymerase chain reaction (PCR) to search for the following selected genes: 16S rRNA (for molecular identification of S. aureus), mecA (characterizes the methicillin-resistant S.aureus) and enterotoxigenic genes (sea, seb-sec, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej and tsst-1). Results from morphological and biochemical analyses revealed that all isolated strains belonged to the Staphylococcus aureus species. We also observed, through the antibiogram, high percentage of resistance to the antibiotics penicillin G (87.75%) and oxacillin (75.51%). Multidrug resistance was detected in 73.46% of the isolated strains. Analyzing the PCR, we confirmed that 100% of the isolated strains were S. aureus because of the amplification of the 16S rRNA gene. The mecA gene was found in 4.08% of the samples. In samples confirmed as S. aureus, concerning the research for staphylococcal enterotoxins (SE), there was amplification of the sej gene fragments in 79.5% of the samples, followed by the sei gene in 48.9%, sed gene in 22.4%, sea gene in 12, 2%, seh and sec genes in 8.1%, and sec gene in 2% for the samples. We did not observe any amplification for the seb-sec, see and tsst-1 genes. The strains of S. aureus isolated from goat milk have shown the presence of genes responsible for the production of toxins, a fact that requires greater care when processing this milk in the dairy industry. In addition, to antibiotic resistance and detection of mecA gene also leads to concern, can pose risks to consumer health.