Phytochemical screening and in vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and antitumor activities of the red propolis Alagoas / Triagem fitoquimico e atividade antibacteriana, antifúngica, antioxidante e antitumoral in vitro da propólis vermelha de Alagoas

The study aimed to evaluate the antimicrobial activity, antioxidant, toxicity and phytochemical screening of the Red Propolis Alagoas. Antimicrobial activity was evaluated by disk diffusion method. Determination of antioxidant activity was performed using the DPPH assay (1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), FTC (ferric thiocyanate) and determination of phenolic compounds by Follin method. Toxicity was performed by the method of Artemia salina and cytotoxicity by MTT method. The phytochemical screening for the detection of allelochemicals was performed. The ethanol extract of propolis of Alagoas showed significant results for antimicrobial activity, and inhibitory activity for Staphylococcus aureus and Candida krusei. The antioxidant activity of the FTC method was 80% to 108.3% hydrogen peroxide kidnapping, the DPPH method showed an EC50 3.97 mg/mL, the content of total phenolic compounds was determined by calibration curve gallic acid, resulting from 0.0005 mg/100 g of gallic acid equivalent. The extract was non-toxic by A. salina method. The propolis extract showed high activity with a higher percentage than 75% inhibition of tumor cells OVCAR-8, SF-295 and HCT116. Chemical constituents were observed as flavonones, xanthones, flavonols, and Chalcones Auronas, Catechins and leucoanthocyanidins. It is concluded that the extract can be tested is considered a potential source of bioactive metabolites.(AU)

O trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante, a toxicidade e a prospecção fitoquímica da Própolis Vermelha de Alagoas. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco. A determinação do potencial antioxidante foi realizada utilizando o método de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), FTC (Tiocianato Férrico) e determinação de compostos fenólicos pelo método de Follin. A toxicidade foi realizada pelo método de Artemia salina e a citotoxicidade pelo método do MTT. Foi realizada a prospecção fitoquímica para a pesquisa de aleloquímicos. O extrato etanólico da própolis vermelha de Alagoas apresentou resultados significantes para atividade antimicrobiana, tendo a atividade inibitória para Staphylococcus aureus e Candida krusei. Quanto a atividade antioxidante o método de FTC teve 80% a 108,3% de sequestro de peróxido de hidrogênio, o método de DPPH apresentou um CE50 de 3,97 g/mL, o teor de compostos fenólicos totais foi determinado mediante curva de calibração do ácido gálico, tendo resultado de 0,0005 mg/100 g equivalente de ácido gálico. O extrato foi atóxico pelo método de A. salina. O extrato da própolis mostrou elevada atividade com percentual de inibição maior que 75% sobre células tumorais OVCAR-8, SF-295 e HCT116. Foram observados constituintes químicos como flavononas, xantonas, flavonóis, Chalconas e Auronas, Catequinas e Leucoantocianidinas. Conclui-se que o extrato testado pode ser considerado é uma fonte potencial de metabólitos bioativos.(AU)

Phytochemical screening and in vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and antitumor activities of the red propolis Alagoas

Abstract The study aimed to evaluate the antimicrobial activity, antioxidant, toxicity and phytochemical screening of the Red Propolis Alagoas. Antimicrobial activity was evaluated by disk diffusion method. Determination of antioxidant activity was performed using the DPPH assay (1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), FTC (ferric thiocyanate) and determination of phenolic compounds by Follin method. Toxicity was performed by the method of Artemia salina and cytotoxicity by MTT method. The phytochemical screening for the detection of allelochemicals was performed. The ethanol extract of propolis of Alagoas showed significant results for antimicrobial activity, and inhibitory activity for Staphylococcus aureus and Candida krusei. The antioxidant activity of the FTC method was 80% to 108.3% hydrogen peroxide kidnapping, the DPPH method showed an EC50 3.97 mg/mL, the content of total phenolic compounds was determined by calibration curve gallic acid, resulting from 0.0005 mg/100 g of gallic acid equivalent. The extract was non-toxic by A. salina method. The propolis extract showed high activity with a higher percentage than 75% inhibition of tumor cells OVCAR-8, SF-295 and HCT116. Chemical constituents were observed as flavonones, xanthones, flavonols, and Chalcones Auronas, Catechins and leucoanthocyanidins. It is concluded that the extract can be tested is considered a potential source of bioactive metabolites.

Resumo O trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante, a toxicidade e a prospecção fitoquímica da Própolis Vermelha de Alagoas. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco. A determinação do potencial antioxidante foi realizada utilizando o método de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), FTC (Tiocianato Férrico) e determinação de compostos fenólicos pelo método de Follin. A toxicidade foi realizada pelo método de Artemia salina e a citotoxicidade pelo método do MTT. Foi realizada a prospecção fitoquímica para a pesquisa de aleloquímicos. O extrato etanólico da própolis vermelha de Alagoas apresentou resultados significantes para atividade antimicrobiana, tendo a atividade inibitória para Staphylococcus aureus e Candida krusei. Quanto a atividade antioxidante o método de FTC teve 80% a 108,3% de sequestro de peróxido de hidrogênio, o método de DPPH apresentou um CE50 de 3,97 g/mL, o teor de compostos fenólicos totais foi determinado mediante curva de calibração do ácido gálico, tendo resultado de 0,0005 mg/100 g equivalente de ácido gálico. O extrato foi atóxico pelo método de A. salina. O extrato da própolis mostrou elevada atividade com percentual de inibição maior que 75% sobre células tumorais OVCAR-8, SF-295 e HCT116. Foram observados constituintes químicos como flavononas, xantonas, flavonóis, Chalconas e Auronas, Catequinas e Leucoantocianidinas. Conclui-se que o extrato testado pode ser considerado é uma fonte potencial de metabólitos bioativos.

Phytochemical screening and in vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and antitumor activities of the red propolis Alagoas

Abstract The study aimed to evaluate the antimicrobial activity, antioxidant, toxicity and phytochemical screening of the Red Propolis Alagoas. Antimicrobial activity was evaluated by disk diffusion method. Determination of antioxidant activity was performed using the DPPH assay (1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), FTC (ferric thiocyanate) and determination of phenolic compounds by Follin method. Toxicity was performed by the method of Artemia salina and cytotoxicity by MTT method. The phytochemical screening for the detection of allelochemicals was performed. The ethanol extract of propolis of Alagoas showed significant results for antimicrobial activity, and inhibitory activity for Staphylococcus aureus and Candida krusei. The antioxidant activity of the FTC method was 80% to 108.3% hydrogen peroxide kidnapping, the DPPH method showed an EC50 3.97 mg/mL, the content of total phenolic compounds was determined by calibration curve gallic acid, resulting from 0.0005 mg/100 g of gallic acid equivalent. The extract was non-toxic by A. salina method. The propolis extract showed high activity with a higher percentage than 75% inhibition of tumor cells OVCAR-8, SF-295 and HCT116. Chemical constituents were observed as flavonones, xanthones, flavonols, and Chalcones Auronas, Catechins and leucoanthocyanidins. It is concluded that the extract can be tested is considered a potential source of bioactive metabolites.

Resumo O trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante, a toxicidade e a prospecção fitoquímica da Própolis Vermelha de Alagoas. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco. A determinação do potencial antioxidante foi realizada utilizando o método de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), FTC (Tiocianato Férrico) e determinação de compostos fenólicos pelo método de Follin. A toxicidade foi realizada pelo método de Artemia salina e a citotoxicidade pelo método do MTT. Foi realizada a prospecção fitoquímica para a pesquisa de aleloquímicos. O extrato etanólico da própolis vermelha de Alagoas apresentou resultados significantes para atividade antimicrobiana, tendo a atividade inibitória para Staphylococcus aureus e Candida krusei. Quanto a atividade antioxidante o método de FTC teve 80% a 108,3% de sequestro de peróxido de hidrogênio, o método de DPPH apresentou um CE50 de 3,97 g/mL, o teor de compostos fenólicos totais foi determinado mediante curva de calibração do ácido gálico, tendo resultado de 0,0005 mg/100 g equivalente de ácido gálico. O extrato foi atóxico pelo método de A. salina. O extrato da própolis mostrou elevada atividade com percentual de inibição maior que 75% sobre células tumorais OVCAR-8, SF-295 e HCT116. Foram observados constituintes químicos como flavononas, xantonas, flavonóis, Chalconas e Auronas, Catequinas e Leucoantocianidinas. Conclui-se que o extrato testado pode ser considerado é uma fonte potencial de metabólitos bioativos.

High-quality total RNA isolation from melon (Cucumis melo L. ) fruits rich in polysaccharides / Isolamento de RNA total de alta qualidade a partir de frutos de melão (Cucumis melo L. ) contendo altos níveis de polissacarídeos

Melon, a member of the family Cucurbitaceae, is the fourth most important fruit in the world market and, on a volume basis, is Brazils main fresh fruit export. Many molecular techniques used to understand the maturation of these fruits require high concentrations of highly purified RNA. However, melons are rich in polyphenolic compounds and polysaccharides, which interfere with RNA extraction. This study aimed to determine the most appropriate method for total RNA extraction from melon fruits. Six extraction buffers were tested: T1) guanidine thiocyanate/phenol/chloroform; T2) sodium azide/?-mercaptoethanol; T3) phenol/guanidine thiocyanate; T4) CTAB/PVP/?-mercaptoethanol; T5) SDS/sodium perchlorate/PVP/?-mercaptoethanol, and T6) sarkosyl/PVP/guanidine thiocyanate, using the AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit. The best method for extracting RNA from both mature and green fruit was based on the SDS/PVP/?-mercaptoethanol buffer, because it rapidly generated a high quality and quantity of material. In general, higher amounts of RNA were obtained from green than mature fruits, probably due to the lower concentration of polysaccharides and water. The purified material can be used as a template in molecular techniques, such as microarrays, RT-PCR, and in the construction of cDNA and RNA-seq data.(AU)

O melão pertencente à família Cucurbitaceae é o quarto fruto mais importante no mercado mundial e a fruta mais exportada pelo Brasil. Muitas técnicas moleculares utilizadas para compreender a maturação destes frutos requerem o uso de RNA altamente purificado e em alta concentração. Entretanto, o elevado nível de compostos polifenólicos e polissacarídeos nos frutos tornam a extração de RNA um desafio. Este trabalho teve por objetivo determinar o método mais adequado para extração de RNA total em frutos de melão. Seis diferentes tampões de extração foram testados: T1) tiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio; T2) azida de sódio/?-mercaptoetanol; T3) fenol/tiocianato de guanidina, T4) CTAB/PVP/?-mercaptoetanol, T5) SDS/perclorato de sódio/PVP/?-mercaptoetanol e T6) sarcosil/PVP/tiocianato de guanidina associado com AxyPrep TM Multisource Total RNA Miniprep Kit. O melhor método para extração do RNA tanto de fruto verde quanto maduro foi o baseado no tampão SDS/PVP/?-mercaptoetanol, por gerar material íntegro e de qualidade em grande quantidade, associado à rapidez de execução. Em geral, maiores quantidades de RNA foram obtidas a partir de frutos verdes, provavelmente devido à baixa concentração de polissacarídeos e água. O material purificado poderá ser utilizado como molde em técnicas de estudos moleculares como microarrays, RT-PCR e bibliotecas de cDNA e RNAseq, pelo qual foi testado.(AU)

Efficiency of boiling and four other methods for genomic DNA extraction of deteriorating spore-forming bacteria from milk / Eficiência da fervura e outros quatro métodos para extração do DNA genômico de bactérias esporuladas deteriorantes do leite

The spore-forming microbiota is mainly responsible for the deterioration of pasteurized milk with long shelf life in the United States. The identification of these microorganisms, using molecular tools, is of particular importance for the maintenance of the quality of milk. However, these molecular techniques are not only costly but also labor-intensive and time-consuming. The aim of this study was to compare the efficiency of boiling in conjunction with four other methods for the genomic DNA extraction of sporulated bacteria with proteolytic and lipolytic potential isolated from raw milk in the states of Paraná and Maranhão, Brazil. Protocols based on cellular lysis by enzymatic digestion, phenolic extraction, microwave-heating, as well as the use of guanidine isothiocyanate were used. This study proposes a method involving simple boiling for the extraction of genomic DNA from these microorganisms. Variations in the quality and yield of the extracted DNA among these methods were observed. However, both the cell lysis protocol by enzymatic digestion (commercial kit) and the simple boiling method proposed in this study yielded sufficient DNA for successfully carrying out the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the rpoB and 16S rRNA genes for all 11 strains of microorganisms tested. Other protocols failed to yield sufficient quantity and quality of DNA from all microorganisms tested, since only a few strains have showed positive results by PCR, thereby hindering the search for new microorganisms. Thus, the simple boiling method for DNA extraction from sporulated bacteria in spoiled milk showed the same efficacy as that of the commercial kit. Moreover, the method is inexpensive, easy to perform, and much less time-consuming.

A microbiota esporulada é a principal responsável pela deterioração do leite pasteurizado de longa vida útil nos Estados Unidos. A identificação destes micro-organismos é de especial importância para a qualidade do leite e ferramentas moleculares são fundamentais nesse processo. No entanto, exigem a execução de etapas onerosas e laboriosas que podem inviabilizar algumas pesquisas. O objetivo do presente trabalho foi comparar a eficiência do método de extração de DNA por fervura com outros quatro métodos para extração de DNA genômico de bactérias esporuladas com potencial proteolítico e lipolítico isoladas do leite cru dos estados do Paraná e Maranhão, Brasil. Foram utilizados protocolos que se baseavam na lise celular por digestão enzimática, agitação com fenol, aquecimento em micro-ondas, tiocianato de guanidina e este trabalho propõe um método por fervura simples para o estudo desses micro-organismos. Observaram-se variações nos métodos de quantificação do DNA extraído e baixo coeficiente de correlação de Person entre esses métodos. No entanto, observou-se que tanto no protocolo de lise celular por digestão enzimática (kit comercial) quanto na fervura simples proposta pelo presente estudo, houve êxito na realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa dos genes rpoB e 16S rRNA para todas as 11 cepas de micro-organismos testadas. Os outros protocolos não apresentaram sucesso na extração de DNA para a totalidade da microbiota avaliada, já que somente algumas amostras tiveram êxito nas reações de PCR, fato que os inviabiliza para a pesquisa desses micro-organismos. Dessa forma, o método de fervura simples das suspensões de bactérias esporuladas deteriorantes do leite demonstrou a mesma eficiência do kit comercial para a extração do DNA desses micro-organismos, sendo um método de baixo custo e de fácil e rápida execução.

Efficiency of boiling and four other methods for genomic DNA extraction of deteriorating spore-forming bacteria from milk / Eficiência da fervura e outros quatro métodos para extração do DNA genômico de bactérias esporuladas deteriorantes do leite

The spore-forming microbiota is mainly responsible for the deterioration of pasteurized milk with long shelf life in the United States. The identification of these microorganisms, using molecular tools, is of particular importance for the maintenance of the quality of milk. However, these molecular techniques are not only costly but also labor-intensive and time-consuming. The aim of this study was to compare the efficiency of boiling in conjunction with four other methods for the genomic DNA extraction of sporulated bacteria with proteolytic and lipolytic potential isolated from raw milk in the states of Paraná and Maranhão, Brazil. Protocols based on cellular lysis by enzymatic digestion, phenolic extraction, microwave-heating, as well as the use of guanidine isothiocyanate were used. This study proposes a method involving simple boiling for the extraction of genomic DNA from these microorganisms. Variations in the quality and yield of the extracted DNA among these methods were observed. However, both the cell lysis protocol by enzymatic digestion (commercial kit) and the simple boiling method proposed in this study yielded sufficient DNA for successfully carrying out the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the rpoB and 16S rRNA genes for all 11 strains of microorganisms tested. Other protocols failed to yield sufficient quantity and quality of DNA from all microorganisms tested, since only a few strains have showed positive results by PCR, thereby hindering the search for new microorganisms. Thus, the simple boiling method for DNA extraction from sporulated bacteria in spoiled milk showed the same efficacy as that of the commercial kit. Moreover, the method is inexpensive, easy to perform, and much less time-consuming.(AU)

A microbiota esporulada é a principal responsável pela deterioração do leite pasteurizado de longa vida útil nos Estados Unidos. A identificação destes micro-organismos é de especial importância para a qualidade do leite e ferramentas moleculares são fundamentais nesse processo. No entanto, exigem a execução de etapas onerosas e laboriosas que podem inviabilizar algumas pesquisas. O objetivo do presente trabalho foi comparar a eficiência do método de extração de DNA por fervura com outros quatro métodos para extração de DNA genômico de bactérias esporuladas com potencial proteolítico e lipolítico isoladas do leite cru dos estados do Paraná e Maranhão, Brasil. Foram utilizados protocolos que se baseavam na lise celular por digestão enzimática, agitação com fenol, aquecimento em micro-ondas, tiocianato de guanidina e este trabalho propõe um método por fervura simples para o estudo desses micro-organismos. Observaram-se variações nos métodos de quantificação do DNA extraído e baixo coeficiente de correlação de Person entre esses métodos. No entanto, observou-se que tanto no protocolo de lise celular por digestão enzimática (kit comercial) quanto na fervura simples proposta pelo presente estudo, houve êxito na realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa dos genes rpoB e 16S rRNA para todas as 11 cepas de micro-organismos testadas. Os outros protocolos não apresentaram sucesso na extração de DNA para a totalidade da microbiota avaliada, já que somente algumas amostras tiveram êxito nas reações de PCR, fato que os inviabiliza para a pesquisa desses micro-organismos. Dessa forma, o método de fervura simples das suspensões de bactérias esporuladas deteriorantes do leite demonstrou a mesma eficiência do kit comercial para a extração do DNA desses micro-organismos, sendo um método de baixo custo e de fácil e rápida execução.(AU)

CARACTERIZAÇÃO E PERFIL DA EXPRESSÃO DOS GENES CSF3 E LPO RELACIONADOS À MASTITE EM BÚFALAS LEITEIRAS

A mastite é a principal doença que acomete os rebanhos leiteiros e promove grandes perdas na produção devido a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Estudo de expressão gênica vem sendo empregado em vários organismos com a finalidade de identificar genes relacionados com características economicamente importantes como resistência a doenças. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa dos genes do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos 3 (CSF3) e Lactoperoxidase (LPO), em leite de búfalas mestiças saudáveis e com mastite, por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para isso, foi realizada a extração de RNA total, com Trizol, de células somáticas do leite de doze animais diagnosticados com mastite e de doze animais livres da infecção. Foram realizadas análises de qualidade e quantificação do RNA total e das contaminações por DNA genômico para garantir a integridade das amostras. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio do método do Delta Delta Ct. Os genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 e RPLP0, foram selecionados na literatura, e testados como genes de referência. As análises referentes às quantificações foram realizadas com os valores de Ct obtidos para cada gene. O gene CSF3 foi significativamente mais expresso em animais com mastite em comparação com animais sem mastite (P<0,001) e 5,14 vezes mais expresso na amostra alvo do que na amostra de referência. O CSF3 é uma citocina naturalmente produzidas e secretadas por uma grande variedade de células pertencentes ou não ao sistema imune. Desempenham importante papel na defesa do hospedeiro, já que regulam parte da atividade das células que participam da imunidade inata e específica, o que demonstra importância no seu uso no diagnóstico e prognóstico das mastites. O gene LPO expressa uma proteína sintetizada na glândula mamária por íons tiocianato (SCN-), originados por metabolismo hepático e peróxido de hidrogênio (H2O2), derivado da atividade dos leucócitos e outras células, para gerar produtos reativos com intensa atividade antimicrobiana. Esse foi 2,41 vezes mais expresso em animais com mastite em relação a animais sem mastite (p-valor = 0,097), não havendo diferença significativa, porém a mastite é uma doença multifatorial e afetada por muitos genes, sendo necessário mais estudos com animais em diferentes fases de infecção e incluindo outros genes para compreender o mecanismo de resposta imune relacionado a mastite.

Mastitis is the main disease affecting dairy herds and causes large production losses due to changes in milk composition and damage to animal health, thus increasing production costs. It is characterized by the inflammatory response of the mammary gland to infectious agents, altering its physiology and metabolism. Gene expression studies have been used in several organisms to identify genes related to economically important characteristics such as disease resistance. In order to better understand the mechanisms of immune response involved in the mastitis resistance / susceptibility phenotype, the relative expression of the Granulocyte Colony Stimulating Factor 3 (CSF3) and Lactoperoxidase (LPO) genes in milk of Healthy mestizo buffaloes with mastitis by means of the quantitative real-time PCR technique (qRT-PCR). For this, total RNA extraction was performed with Trizol from milk somatic cells from twelve animals diagnosed with mastitis and from twelve animals free of infection. Quality assays and quantification of total RNA and contamination by genomic DNA were performed to guarantee the integrity of the samples. Quantification of the gene expression was performed by the Delta Delta Ct method. The genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 and RPLP0, were selected in the literature, and tested as reference genes. Quantification analyzes were performed with the Ct values obtained for each gene. The CSF3 gene was significantly more expressed in animals with mastitis compared to animals without mastitis (P <0.001) and 5.14 times more expressed in the target sample than in the reference sample. CSF3 is a cytokine naturally produced and secreted by a wide variety of cells belonging or not to the immune system. They play an important role in the defense of the host, since they regulate part of the activity of the cells that participate in the innate and specific immunity, which demonstrates importance in its use in the diagnosis and prognosis of mastitis. The LPO gene expresses a protein synthesized in the mammary gland by thiocyanate ions (SCN-), caused by hepatic metabolism and hydrogen peroxide (H2O2), derived from the activity of leukocytes and other cells, to generate reactive products with intense antimicrobial activity. This was 2.41 times more expressed in animals with mastitis than in animals without mastitis (p-value = 0.097), but there was no significant difference, but mastitis is a multifactorial disease affected by many genes and further animal studies At different stages of infection and including other genes to understand the mechanism of immune response related to mastitis.

Extração de DNA e avaliação da composição espécie-específica de queijos / DNA extraction and evaluation of the specie-specific composition of cheeses

Foram testados três métodos de extração de DNA em amostras de queijo, com o objetivo de identificar uma técnica eficiente para extração de DNA em amostras com várias limitações, como alto teor de gordura, alto grau de degradação do DNA e grande concentração de impurezas. A técnica que faz uso do tiocianato de guanidina mostrou-se mais adequada para identificação de adição intencional não declarada de leite bovino em queijos bubalinos, podendo ser empregada para certificação de produto específico (selo de Identidade de Espécie).(AU)

Three methods of DNA extraction were tested in cheese samples. The objective of this study was to identify an efficient technique for DNA extraction in different samples with several limitations, such as high fat tenor, high degree of DNA degradation and great sludge concentration. The technique using Guanidine thiocyanate was more appropriate for identification of intentional undeclared addition of bovine milk in buffalo cheeses. This technique can be used for certification of a specific product (stamp of Identity of Species).(AU)

Exposição cianídrica em suínos: Uma abordagem dos parâmetros toxicocinéticos utilizando o tiocianato como biomarcador / Cianidric exposition in swines: A bording of the toxicocinetics parameters using the tiocianato as biomarker

O objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos sobre a cinética do cianeto, em suínos, em diferentes fases da vida, usando o tiocianato como biomarcador. Vinte e dois suínos, foram divididos em quatro grupos (60 dias da idade, 95 dias da idade, 80 dias do gestação e 21 dias de lactação), e receberam por via oral, a dose única de 3.0 mg /kg de peso vivo de cianeto do potássio (KCN). As concentrações do tiocianato no sangue foram medidas dentro de 24h. O tempo máximo (Tmax) e constante de eliminação (Kel) foram mais elevados em porcas lactantes (15 hs e 0.045, respectivamente); por ouro lado, a maior concentração do tiocianato (Cmax) foi observada nas fêmeas grávidas (161.8). A meia vida de eliminação (t1/2) e o volume da distribuição (Vd) foram mais elevados nas fêmeas adultas (41, 57 e 1.23, respectivamente). Contudo a área sob a curva (AUC) do tiocianato foi mais elevado nos animais novos (354183,28), e o clearance o mais baixo (0.007) nestes animais. Concluindo, os resultados do presente estudo, evidenciam que o metabolismo do cianeto, varia extremamente, considerando o estado fisiológico dos suínos fêmeas, e que são os animais novos, provavelmente, os mais sensíveis aos efeitos tóxicos, da exposição crônica as baixas doses do cianeto.(AU)

The aim of the present study was to determine the effects of the swine, in different periods of life on the toxicokinetics of cyanide using thiocyante as biomaker. Twenty and two swines, was divided into four groups (60 days of age, 95 days of age, sows with 80 days of gestation and lactating swine), were dosed orally with 3,0 mg/kg/ body weigth of potassium cyanide (KCN). Thiocyanate concentrations in blood were measured within 24h. The time of peak concentration (Tmax) and constant of elimination (Kel) were higher in lactating sows (15 hs and 0,045, respectively); on the other hand, the maximum plasma concentration (Cmax) of thiocyanate was observed in pregnant females (161,8). The elimination half life (t1/2) and volume of distribution (Vd) were higher in adult sows (41, 57 and 1,23, respectively). Whereas the clearance and the area under the curve (AUC) of thiocyanate was higher in young animals (354183,28) the clearance was lower (0,007) in these animals. In coclusion , the results of the present study evidence that the metabolism of cyanide varies greatly considering the physiologic state of female swine being the young animals probably more sensitive to the toxic effects of chronic exposure to low doses of cyanide.(AU)

Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é, freqüentemente, encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas d

Um protocolo de "nested-PCR" para detecção do vírus da anemia das galinhas / A nested-PCR protocol for detection of the chicken anemia virus

Este trabalho descreve o estabelecimento de um pro!tocolo de "nested-PCR" para a detecção do vírus da anemia das galinhas (CAV, chicken anemia virus), agente causador da anemia infecciosa das galinhas. Para a extração de DNA a partir de amostras clínicas um método baseado no uso de tiocianato de guanidina mostrou-se mais sensível e prático, do que os demais avaliados. Para a PCR inicial foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pares de bases (pb) do gene VP1. Para a "nested-PCR" propriamente dita, foi selecionado um segundo par que amplifica uma região interna de 520 pb. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV. Outras trinta amostras vírus e bactérias, causadoras de doenças em aves, não geraram produto de amplificação. A sensibilidade do teste foi determinada a partir de diluições seriadas de uma amostra vacinal de CAV. A "nested-PCR" mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar pelo menos 0,16 TCID50 por cento da cepa vacinal. Além disso, detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sinais clínicos. Conclui-se que, como técnica para a detecção do CAV, o protocolo de "nested-PCR" aqui descrito, é mais sensível, rápido e menos trabalhoso do que o isolamento viral em cultivo celular. (AU)

This paper reports a nested polymerase chain reaction (nested-PCR) protocol for detection of chicken anemia virus (CAV), the causal agent of infectious chicken anemia. For DNA extraction from clinical samples, a method based on guanidine thiocyanate was found more sensitive and practical than other extraction protocols tested. The pair of primers used in the initial PCR targeted a 664 bp fragment on the VP1 gene. The primers for the internal PCR targeted a fragment of 520 bp. The specificity of the primers was evaluated on samples of CAV controlled flocks. Thirty different viruses and bacteria isolated from chickens did not give rise to any amplification product in the assay. The sensitivity of the nested-PCR was determined on serial dilutions of a CAV vaccine. The nested-PCR was more sensitive than a one step PCR and was able to detect at least 0.16 TCID50 of the vaccine strain. In addition, the protocol employed here detected viral DNA from tissues, sera and litter from flocks with or without clinical signs of disease. It is concluded that the nested-PCR protocol described here is more sensitive, faster and less cumbersome than virus isolation in cell culture as a diagnostic technique for detection of CAV.(AU)

Thiocyanate degradation by pure and mixed cultures of microorganisms

A mixed culture and a pure bacterial strain (BMV8) were isolated from a bioreactor for thiocyanate treatment. Both cultures removed 5 mM of thiocyanate from the medium in 36 hours. The mixed culture was able to tolerate concentrations up to 60 mM. The efficiency of thiocyanate degradation decreased when the cells were immobilized.

Uma cultura mixta e uma linhagem bacteriana pura foram isoladas de um bioreator para tratamento de tiocianato. As culturas removeram 5mM de tiocianato do meio em 36 horas. A cultura mixta foi capaz de tolerar concentrações superiores a 60mM. A eficiência da degradação de tiocianato diminuiu quando as células foram imobilizadas.

A presença de substâncias inorgânicas tóxicas no gênero Humirianthera (Icacinaceae)

In this paper we relate the isolation of crystals of sodium and potassium thio-cyanates, nitrates and nitrites from the tubers and stem of Humiranthera ampla. We have also determined the amounts of nitrate and nitrite in young and matures leaves of H. ampla and H. rupesiris. The maximum amounts of N-NO-3 observed in H. ampla and H. rupesiris were 8,828 mg% and 6,422 mg%, respectively.

Neste trabalho relata-se o isolamento de cristais de tiocianato e de nitrato e nitrito de sódio e potássio no tubérculo e caule de Humirianthera ampla. Determinou-se ainda o teor de nitrato e nitrito nas folhas de H. ampla e H. rupestris, nas idades jovem e adulta. Os teores máximos de N-NO-3 observados para H. ampla e H. rupestris foram, res pectivamente, 8.828 mg% e 6.422 mg%.

A presença de substâncias inorgânicas tóxicas no gênero Humirianthera (Icacinaceae)

In this paper we relate the isolation of crystals of sodium and potassium thio-cyanates, nitrates and nitrites from the tubers and stem of Humiranthera ampla. We have also determined the amounts of nitrate and nitrite in young and matures leaves of H. ampla and H. rupesiris. The maximum amounts of N-NO-3 observed in H. ampla and H. rupesiris were 8,828 mg% and 6,422 mg%, respectively.

Neste trabalho relata-se o isolamento de cristais de tiocianato e de nitrato e nitrito de sódio e potássio no tubérculo e caule de Humirianthera ampla. Determinou-se ainda o teor de nitrato e nitrito nas folhas de H. ampla e H. rupestris, nas idades jovem e adulta. Os teores máximos de N-NO-3 observados para H. ampla e H. rupestris foram, res pectivamente, 8.828 mg% e 6.422 mg%.

High-quality total RNA isolation from melon (Cucumis melo L.) fruits rich in polysaccharides / Isolamento de RNA total de alta qualidade a partir de frutos de melão (Cucumis melo L.) contendo altos níveis de polissacarídeos

Melon, a member of the family Cucurbitaceae, is the fourth most important fruit in the world market and, on a volume basis, is Brazils main fresh fruit export. Many molecular techniques used to understand the maturation of these fruits require high concentrations of highly purified RNA. However, melons are rich in polyphenolic compounds and polysaccharides, which interfere with RNA extraction. This study aimed to determine the most appropriate method for total RNA extraction from melon fruits. Six extraction buffers were tested: T1) guanidine thiocyanate/phenol/chloroform; T2) sodium azide/?-mercaptoethanol; T3) phenol/guanidine thiocyanate; T4) CTAB/PVP/?-mercaptoethanol; T5) SDS/sodium perchlorate/PVP/?-mercaptoethanol, and T6) sarkosyl/PVP/guanidine thiocyanate, using the AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit. The best method for extracting RNA from both mature and green fruit was based on the SDS/PVP/?-mercaptoethanol buffer, because it rapidly generated a high quality and quantity of material. In general, higher amounts of RNA were obtained from green than mature fruits, probably due to the lower concentration of polysaccharides and water. The purified material can be used as a template in molecular techniques, such as microarrays, RT-PCR, and in the construction of cDNA and RNA-seq data.

O melão pertencente à família Cucurbitaceae é o quarto fruto mais importante no mercado mundial e a fruta mais exportada pelo Brasil. Muitas técnicas moleculares utilizadas para compreender a maturação destes frutos requerem o uso de RNA altamente purificado e em alta concentração. Entretanto, o elevado nível de compostos polifenólicos e polissacarídeos nos frutos tornam a extração de RNA um desafio. Este trabalho teve por objetivo determinar o método mais adequado para extração de RNA total em frutos de melão. Seis diferentes tampões de extração foram testados: T1) tiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio; T2) azida de sódio/?-mercaptoetanol; T3) fenol/tiocianato de guanidina, T4) CTAB/PVP/?-mercaptoetanol, T5) SDS/perclorato de sódio/PVP/?-mercaptoetanol e T6) sarcosil/PVP/tiocianato de guanidina associado com AxyPrep TM Multisource Total RNA Miniprep Kit. O melhor método para extração do RNA tanto de fruto verde quanto maduro foi o baseado no tampão SDS/PVP/?-mercaptoetanol, por gerar material íntegro e de qualidade em grande quantidade, associado à rapidez de execução. Em geral, maiores quantidades de RNA foram obtidas a partir de frutos verdes, provavelmente devido à baixa concentração de polissacarídeos e água. O material purificado poderá ser utilizado como molde em técnicas de estudos moleculares como microarrays, RT-PCR e bibliotecas de cDNA e RNAseq, pelo qual foi te

Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é, freqüentemente, encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas d

Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é, freqüentemente, encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas d

High-quality total RNA isolation from melon (Cucumis melo L. ) fruits rich in polysaccharides / Isolamento de RNA total de alta qualidade a partir de frutos de melão (Cucumis melo L. ) contendo altos níveis de polissacarídeos

Melon, a member of the family Cucurbitaceae, is the fourth most important fruit in the world market and, on a volume basis, is Brazils main fresh fruit export. Many molecular techniques used to understand the maturation of these fruits require high concentrations of highly purified RNA. However, melons are rich in polyphenolic compounds and polysaccharides, which interfere with RNA extraction. This study aimed to determine the most appropriate method for total RNA extraction from melon fruits. Six extraction buffers were tested: T1) guanidine thiocyanate/phenol/chloroform; T2) sodium azide/?-mercaptoethanol; T3) phenol/guanidine thiocyanate; T4) CTAB/PVP/?-mercaptoethanol; T5) SDS/sodium perchlorate/PVP/?-mercaptoethanol, and T6) sarkosyl/PVP/guanidine thiocyanate, using the AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit. The best method for extracting RNA from both mature and green fruit was based on the SDS/PVP/?-mercaptoethanol buffer, because it rapidly generated a high quality and quantity of material. In general, higher amounts of RNA were obtained from green than mature fruits, probably due to the lower concentration of polysaccharides and water. The purified material can be used as a template in molecular techniques, such as microarrays, RT-PCR, and in the construction of cDNA and RNA-seq data.

O melão pertencente à família Cucurbitaceae é o quarto fruto mais importante no mercado mundial e a fruta mais exportada pelo Brasil. Muitas técnicas moleculares utilizadas para compreender a maturação destes frutos requerem o uso de RNA altamente purificado e em alta concentração. Entretanto, o elevado nível de compostos polifenólicos e polissacarídeos nos frutos tornam a extração de RNA um desafio. Este trabalho teve por objetivo determinar o método mais adequado para extração de RNA total em frutos de melão. Seis diferentes tampões de extração foram testados: T1) tiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio; T2) azida de sódio/?-mercaptoetanol; T3) fenol/tiocianato de guanidina, T4) CTAB/PVP/?-mercaptoetanol, T5) SDS/perclorato de sódio/PVP/?-mercaptoetanol e T6) sarcosil/PVP/tiocianato de guanidina associado com AxyPrep TM Multisource Total RNA Miniprep Kit. O melhor método para extração do RNA tanto de fruto verde quanto maduro foi o baseado no tampão SDS/PVP/?-mercaptoetanol, por gerar material íntegro e de qualidade em grande quantidade, associado à rapidez de execução. Em geral, maiores quantidades de RNA foram obtidas a partir de frutos verdes, provavelmente devido à baixa concentração de polissacarídeos e água. O material purificado poderá ser utilizado como molde em técnicas de estudos moleculares como microarrays, RT-PCR e bibliotecas de cDNA e RNAseq, pelo qual foi testado.

Standardization of a polymerase chain reaction (Semi NestedPCR) to detect bovine herpesvirus type 1 in aborted fetus and semen from naturally infected cattle / Otimização da reação em cadeia pela polimerase (Semi Nested-PCR) para a detecção do herpesvírus bovino tipo 1 em fragmentos de órgãos fetais e em sêmen de bovinos naturalmente infectados

The glycoprotein D gene of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was detected in clinical samples from naturally infected cattle by semi-nested polymerase chain reaction (SN-PCR). Different protocols were tested to increase the sensitivity and specificity of the technique. An association of DNA extraction methods using phenol/chloroform/isoamyl alcohol followed by silica/guanidine isothiocyanate yield greater concentration and quality of amplified DNA. After optimization of primers and reaction conditions, the genome of BHV-1 (Los Angeles strain) was detected by SN-PCR in tissue culture supernatant and artificially infected semen at the 1 and 0.1 TCID50 limit, respectively. When used on clinical specimens from naturally infected cattle, the SN-PCR yield positive results in semen of seropositive bull and in organ fragments of aborted cattle fetus. The SN-PCR was a viable alternative, which was faster, sensitive, specific and less laborious to be used in the routine diagnosis of BHV-1 infection and semen health monitoring.

A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi empregada para a detecção parcial do gene da glicoproteína D do herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em material biológico proveniente de bovinos naturalmente infectados. Para o aumento da sensibilidade e da especificidade da PCR, foram avaliados diferentes protocolos. Para a extração do DNA, a associação dos métodos fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/tiocianato de guanidina, proporcionou a amplificação do DNA em maior concentração e qualidade. Após a otimização dos primers e condições da reação foi possível detectar, por meio da Semi Nested-PCR (SN-PCR), o genoma da estirpe Los Angeles do BHV-1 em sobrenadante de cultura celular, sem processamento prévio, até o limite de 1 TCID50. Em sêmen artificialmente infectado o limite de detecção do BHV-1 foi de 0,1 TCID50. Quando utilizada em material biológico, proveniente de bovinos naturalmente infectados, a SN-PCR apresentou resultados positivos tanto em fragmentos de órgãos de fetos bovinos abortados quanto em sêmen. Essa técnica revelou-se uma alternativa viável, rápida, sensível e específica para aplicação na rotina de diagnóstico da infecção pelo BHV-1, bem como, para o monitoramento sanitário do sêmen.

Standardization of a polymerase chain reaction (Semi NestedPCR) to detect bovine herpesvirus type 1 in aborted fetus and semen from naturally infected cattle / Otimização da reação em cadeia pela polimerase (Semi Nested-PCR) para a detecção do herpesvírus bovino tipo 1 em fragmentos de órgãos fetais e em sêmen de bovinos naturalmente infectados

The glycoprotein D gene of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was detected in clinical samples from naturally infected cattle by semi-nested polymerase chain reaction (SN-PCR). Different protocols were tested to increase the sensitivity and specificity of the technique. An association of DNA extraction methods using phenol/chloroform/isoamyl alcohol followed by silica/guanidine isothiocyanate yield greater concentration and quality of amplified DNA. After optimization of primers and reaction conditions, the genome of BHV-1 (Los Angeles strain) was detected by SN-PCR in tissue culture supernatant and artificially infected semen at the 1 and 0.1 TCID50 limit, respectively. When used on clinical specimens from naturally infected cattle, the SN-PCR yield positive results in semen of seropositive bull and in organ fragments of aborted cattle fetus. The SN-PCR was a viable alternative, which was faster, sensitive, specific and less laborious to be used in the routine diagnosis of BHV-1 infection and semen health monitoring.

A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi empregada para a detecção parcial do gene da glicoproteína D do herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em material biológico proveniente de bovinos naturalmente infectados. Para o aumento da sensibilidade e da especificidade da PCR, foram avaliados diferentes protocolos. Para a extração do DNA, a associação dos métodos fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/tiocianato de guanidina, proporcionou a amplificação do DNA em maior concentração e qualidade. Após a otimização dos primers e condições da reação foi possível detectar, por meio da Semi Nested-PCR (SN-PCR), o genoma da estirpe Los Angeles do BHV-1 em sobrenadante de cultura celular, sem processamento prévio, até o limite de 1 TCID50. Em sêmen artificialmente infectado o limite de detecção do BHV-1 foi de 0,1 TCID50. Quando utilizada em material biológico, proveniente de bovinos naturalmente infectados, a SN-PCR apresentou resultados positivos tanto em fragmentos de órgãos de fetos bovinos abortados quanto em sêmen. Essa técnica revelou-se uma alternativa viável, rápida, sensível e específica para aplicação na rotina de diagnóstico da infecção pelo BHV-1, bem como, para o monitoramento sanitário do sêmen.