Desenvolvimento de um RT-PCR RFLP para a detecção e diferenciação molecular das variantes vacinais e brasileiras do vírus da Bronquite infecciosa das Galinhas no Rio de Janeiro

A Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), é uma doença causada por um vírus RNA de fita simples pertencente a Família coronaviridae, do gênero Gammacoranavirus.. A BIG é uma doença de alta importância econômica para a avicultura mundial, não só por causar prejuízos aos plantéis acometidos pela doença como também por ser diagnóstico diferencial de diversas patologias importantes na sanidade avícola. Os objetivos da presente pesquisa foi desenvolver uma técnica de RT-PCR RFLP capaz de detectar e discriminar com segurança as cepas do vBIG do sorotipo massachusetts e BR a partir de tecidos da traqueia, rim e intestino em granjas de frango de corte e postura no Estado do Rio de Janeiro. Neste estudo, foram coletadas 117 amostras de Intestino, rim e/ou traqueia de um total de 50 aves provenientes de 4 granjas (três granjas de corte e uma granja de postura) no estado do Rio de Janeiro. O RNA total foi extraído de todas as amostras e submetidos a uma reação de transcrição reversa, para realizar a síntese do cDNA. As amostras de cDNA foram submetidas a técnica de RT-qPCR. Constatou-se que 92% das aves (n = 46/50) foram positivas em pelo menos um dos órgãos para o vírus da bronquite das galinhas (vBIG). A técnica de RT-PCR RFLP desenvolvido por esse trabalho foi capaz de detectar uma frequência de 94,64% (n = 53/56) das amostras pertencentes ao sorotipo BR-I, 3,57% (n = 2/56) das amostras apresentaram fragmentos com padrão semelhante ao esperado do Sorotipo massachusetts e 1,78%(1/56) apresentou padrão para ambos os sorotipos (Massachusettsachusetts e BR). Não houve diferença significativa entre a frequência da detecção molecular do vBIG nos tecidos da traquéia, rim e intestino de frangos de corte e galinhas de postura de granjas no estado do Rio de Janeiro. A técnica de RT-PCR RFLP foi capaz de detectar e diferenciar com segurança os sorotipos massachusetts e BR.A alta frequência do sorotipo BR demonstra que apesar de vacinadas, as aves desenvolveram a doença, sugerindo, que um novo protocolo vacinal deva ser abordado, já que a maioria das cepas encontradas pertencem a um sorotipo geneticamente distinto.

The avian infectious bronchitis (AIB) is a disease caused by a single-stranded RNA virus pertaining to the coronaviridae family of the Gammacoranavirus genera. AIB is a disease of great economic significance to aviculture worldwide, not only because of the injury it causes to the breeders, but also because it is a differential diagnosis for several important pathologies that may affect poultry. The goals of the present research were to develop a RT-PCR RFLP technique capable of safely detecting and discriminating the strains of the IBV of themassachusetts and BR serotypes from the trachea, kidney and intestines issues in poultry farms of broilers and layers in the estate of Rio de Janeiro. In this study, 117 samples of intestines, kidneys and/or tracheae were collected from a total of 50 birds originating from 4 farms (three broiler farms and one layer farm) in the estate of Rio de Janeiro. The total RNA was extracted from all the samples and subjected to a reverse transcription process for the cDNA synthesis. The cDNA samples were subjected to the RT-qPCR technique. It was found that 92% of the birds (n= 46/50) were positive in at least one of the organs for the chicken bronchitis virus (vBIG). The RT-PCR RFLP techinique developed in this work was able to detect a frequency of 94,64% (n= 53/56) of the samples belonging to the BR-I serotype, 3,7% (n= 2/56) of the samples showed fragments with patterns similar to what is expected from themassachusetts Serotype and 1,78% (n= 1/56) showed patterns from both serotypes (Massachusettsachusetts and BR). There was no significant difference in the frequency of molecular detection of vBIG in the tissues of the trachea, kidney and intestines of the broiler and layer poultries from farms in the estate of Rio de Janeiro. The RT-PCR RFLP technique was able to safely detect and distinguish themassachusetts and BR serotypes. The high frequency of the BR serotype demonstrates that, although vaccinated, the birds developed the disease, indicating that a new vaccine protocol must be addressed, since the majority of the strains found belong to a genetically distinct serotype.

Variabilidade do gene S1 em tecidos de aves naturalmente infectadas com o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em granjas do Estado do Rio de Janeiro.

O vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (vBIG) é um agente viral altamente contagioso entre a espécie Gallus gallus, sendo considerado uma das patologias que mais acomete a criação avícola de pequeno e grande porte. A vacinação como forma de prevenção a esta doença, não tem sido eficaz, devido a grande variabilidade genética encontrada. Assim como no mundo, no Brasil também já existem diversos estudos caracterizando a variabilidade genética encontrada neste vírus. No Rio de Janeiro, a criação avícola sofre com a doença, porém ainda não existe um estudo recente com o objetivo de analisar a variabilidade genética das cepas encontradas, como uma forma de apoio a estudos epidemiológicos, que possam auxiliar no futuro, na escolha de protocolos vacinais mais adequados. Este estudo teve como objetivo realizar a caracterização molecular do gene S1 do vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (vBIG) em granjas de frangos de corte na região Sul fluminense, como também avaliar a variabilidade genética do gene S1 em um surto de BIG em uma granja de poedeiras da região Norte fluminense. Foram realizadas coletas de tecidos dos animais que apresentavam sinais clínicos compatíveis com BIG, como perda de peso, problemas respiratórios e baixa produtividade. Amostras de tecidos coletados foram armazenadas em solução de RNA Later e formalina 10% tamponada para os diagnósticos molecular e histopatológico, respectivamente. Para realização das análises moleculares foram utilizadas técnicas de extração de RNA, bem como RT-PCR (Reverse Transcriptase, Polymerase Chain Reaction), PCR em tempo real (RT-qPCR), Nested PCR (RT-nPCR), e sequenciamento de algumas amostras coletadas. Para as análises histopatológicas foram realizadas clivagem e elaboração de lâminas de microscopia. Os resultados obtidos do sequenciamento foram comparados a sequência da cepa vacinal Ma5, como cepa referência, além de outras sequencias depositadas no GenBank, apresentando um percentual de identidade variável de 72,41% a 100%. Dentre as amostras de cada granja, houve variabilidade, até mesmo dentro de uma mesma ave. Todas as sequencias analisadas foram descritas como genótipo 1, pertencentes as linhagens 1 e 11; Na comparação de aminoácidos, houve mudanças nas regiões hiperváriaveis do vírus nas sequências classificadas como BR-1, podendo explicar a baixa proteção-cruzada que vêm ocorrendo nos plantéis brasileiro. Estes resultados demonstraram a importância da identificação gênica do vírus, pois torna-se uma ferramenta importante na vigilância epidemiológica e em elaborações de protocolos vacinais que sejam eficientes.

Infectious Bronchitis Virus (vBIG) is a highly contagious viral agent among the species Gallus gallus, being considered one of the pathologies that most affects small and large poultry producers. Vaccination as a form of prevention to this disease, has not been effective, due to the great genetic variability found. As in the world, in Brazil there are already several studies characterizing the genetic variability found in this virus. In Rio de Janeiro, poultry farming suffers from the disease, but there is no recent study to analyze the genetic variability of the strains found, as a way of supporting epidemiological studies that may help in the future, in the choice of Protocols. The objective of this study was to characterize the S1 gene of the Chicken Infectious Bronchitis virus (vBIG) in chickens farms in the southern region of Rio de Janeiro, as well as to evaluate the genetic variability of the S1 gene in a BIG outbreak on a farm Of laying hens of the northern region of. Tissue samples were collected from animals presenting BIG-compatible clinical signs, such as weight loss, respiratory problems and low productivity. Samples of collected tissues were stored in solution of RNA Later and formalin 10% buffered for molecular and histopathological diagnoses, respectively. In order to perform the molecular analyzes, RNA extraction techniques, as well as RT-PCR (Reverse Transcriptase, Polymerase Chain Reaction), real-time PCR (RT-qPCR), Nested PCR (RT-nPCR), and Sequencing of some samples collected. For the histopathological analyzes, cleavage and preparation of microscopy slides were performed. The results obtained from the sequencing were compared to the sequence of the Ma5 vaccine strain as reference strain, in addition to other sequences deposited on GenBank, exhibiting a variable identity percentage of 72.41% to 100%. Among the samples from each farm, there was variability, even within the same bird. All sequences analyzed were described as genotype 1, belonging to strains 1 and 11; In the comparison of amino acids, there were changes in the hypervariable regions of the virus in the sequences classified as BR-1, being able to explain the low cross-protection that have been occurring in Brazilian plants. These results demonstrated the importance of virus identification, since it becomes an important tool in epidemiological surveillance and in the elaboration of efficient vaccine protocols.

CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA GLICOPROTEÍNA S1 DO VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS EM PICHIA PASTORIS

ABSTRACT Genetic and antigenic variation are very frequently observed among IBV strains and affect mainly the S1 glycoprotein. In order to contribute to the availability of tools for immunodiagnosis and immunoprophylaxis of chicken infectious bronchitis we developed an expression system for production of recombinant S1 glycoprotein in Pichia pastoris. We obtained the cDNA from viral RNA on embryonated eggs infected with the M41 strain of IBV, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR), amplifying the S1 coding sequence with extremities compatible with the vector used to transform yeast. Induction with methanol led to the production of a protein with the predicted molecular weight that was detected by Western blot in the cell lysate of transformed yeast. Expression in P. pastoris proved to be an effective method for recombinant production of S1 protein from IBV, with potential for use in immuno-diagnosis of chicken infectious bronchitis virus.

RESUMO Variações genética e antigênica são observadas com frequência elevada entre estirpes do VBIG e envolvem principalmente a glicoproteína S1. Com o objetivo de contribuir com a disponibilidade de ferramentas para o imunodiagnóstico e a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa das galinhas foi desenvolvida uma metodologia para expressão recombinante da glicoproteína S1 na levedura Picchia pastoris. O cDNA do gene codificador dessa proteína foi obtido a partir de RNA viral de ovos embrionados infectados com a estirpe M41 do VBIG submetido à transcrição reversa (RT) e reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificando-se a sequência codificadora de S1 acrescida de extremidades compatíveis com a clonagem no vetor usado na transformação de leveduras. A indução com metanol resultou na produção de uma proteína detectada como banda única do tamanho previsto, em western-blot, no lisado celular das leveduras transformadas. A expressão em P. pastoris mostrou ser um método eficaz para a produção recombinante da proteína S1 do VBIG, com potencial para utilização em técnicas de imunodiagnóstico da bronquite infecciosa das galinhas.

Clonagem e expressão do gene da glicoproteína S1 do vírus da bronquite infecciosa das galinhas em Pichia pastoris / Cloning and expression in Pichia pastoris of the S1 glycoprotein gene of the chicken infectious bronchitis virus

Variações genética e antigênica são observadas com frequência elevada entre estirpes do VBIG e envolvem principalmente a glicoproteína S1. Com o objetivo de contribuir com a disponibilidade de ferramentas para o imunodiagnóstico e a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa das galinhas foi desenvolvida uma metodologia para expressão recombinante da glicoproteína S1 na levedura Picchia pastoris. O cDNA do gene codificador dessa proteína foi obtido a partir de RNA viral de ovos embrionados infectados com a estirpe M41 do VBIG submetido à transcrição reversa (RT) e reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificando-se a sequência codificadora de S1 acrescida de extremidades compatíveis com a clonagem no vetor usado na transformação de leveduras. A indução com metanol resultou na produção de uma proteína detectada como banda única do tamanho previsto, em western-blot, no lisado celular das leveduras transformadas. A expressão em P. pastoris mostrou ser um método eficaz para a produção recombinante da proteína S1 do VBIG, com potencial para utilização em técnicas de imunodiagnóstico da bronquite infecciosa das galinhas.

Genetic and antigenic variation are very frequently observed among IBV strains and affect mainly the S1 glycoprotein. In order to contribute to the availability of tools for immunodiagnosis and immunoprophylaxis of chicken infectious bronchitis we developed an expression system for production of recombinant S1 glycoprotein in Pichia pastoris. We obtained the cDNA from viral RNA on embryonated eggs infected with the M41 strain of IBV, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR), amplifying the S1 coding sequence with extremities compatible with the vector used to transform yeast. Induction with methanol led to the production of a protein with the predicted molecular weight that was detected by Western blot in the cell lysate of transformed yeast. Expression in P. pastoris proved to be an effective method for recombinant production of S1 protein from IBV, with potential for use in immuno-diagnosis of chicken infectious bronchitis virus.

Bronquite infecciosa das galinhas / Avian infectious bronchitis

RESUMO A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença respiratória altamente contagiosa causada por um Coronavírus, o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG). Embora o VBIG seja um patógeno primário do trato respiratório, ele é também uma causa comum de redução da produção e qualidade dos ovos em galinhas. Certos tipos de VBIG causam lesões renais, com significativa mortalidade. Há também mortalidade por conseqüências respiratórias. A doença possui grande importância econômica devida às perdas na produção, sendo estas maiores que as perdas por mortalidade. A ocorrência de múltiplos sorotipos e as características mutantes de seu agente etiológico tem complicado e aumentado os custos de produção e dificultado sua prevenção através da imunização. Recentemente, uma variante do VBIG tem sido descrita associado com a miopatia dos músculos peitorais em muitas partes do mundo, inclusive no Brasil.

ABSTRACT Avian infectious bronchitis (IB) is a highly contagious respiratory disease of chickens caused by a Coronavirus, infectious bronchitis virus (IBV). Although IBV is primarily a respiratory tract pathogen, it is also a common cause of reduced egg production and egg quality in laying hens, and certain strains of IBV cause kidney lesions with significant mortality. Mortality by tracheal blockage also occurs. The disease has high economic importance due the loss of production, which is more important than the loss by mortality. The occurrence of multiple serotypes and mutants of the IBV have complicated and increased the production costs and have impaired its prevention through immunization. Recently, a variant IBV has been reported associated with pectoral muscle myopathy in many parts of world including Brazil.

Alterações de parâmetros fisológicos e imunológicos em matrizes de frangos de corte vacinadas ou não contra a bronquite infecciosa das galinhas submetidas a diferentes períodos de jejum pós-eclosão

Foram avaliados parâmetros fisiológicos e imunológicos de matrizes de corte vacinadas ou não contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG), submetidas a diferentes períodos de jejum após a eclosão, seguido de alimentação até a terceira semana de vida. No Capítulo 2, encontram-se os resultados do desempenho zootécnico e o desenvolvimento de órgãos gastrintestinais. No Capítulo 3, estão descritos os resultados de parâmetros hematológicos e bioquímicos. O Capítulo 4 apresenta as cinéticas de decaimento dos anticorpos maternos e os perfis cinéticos da reposta imune humoral nos compartimentos local e sistêmico. A vacina contra a BIG influenciou parâmetros de desempenho, de morfometria intestinal, o hematócrito, parâmetros bioquímicos, percentuais de heterófilos e linfócitos e induziu a resposta imune humoral na secreção lacrimal. O jejum pós-eclosão prolongado seguido de alimentação influenciou negativamente o desempenho, o desenvolvimento das vísceras gastrintestinais, as variáveis bioquímicas, imunológicas e a maioria das variáveis hematológicas. Os dados indicam que períodos de jejum pós-eclosão superiores a 48 h devem ser evitados, pois ao afetar negativamente parâmetros hematológicos, intestinais e imunológicos, podem comprometer o crescimento das matrizes e inferir negativamente sobre sua resposta imune. No entanto, o jejum moderado pode favorecer a resposta imune vacinal

Immunological and physiological parameters were evaluated in broiler breeder vaccinated or not against infectious bronchitis virus (IBV), submitted to different periods of fasting post-hatching, followed by feed until the third week of life. In Chapter 2, are the results of zootechnical performance and development of gastrointestinal organs. The Chapter 3 describes the results of hematological and biochemical parameters of blood. Chapter 4 presents the kinetics of decay of maternal antibodies and the kinetic profiles of humoral immune response in local and systemic compartments. The IBV vaccine influenced parameters of performance, intestinal morphology, hematocrit, biochemical parameters, percentage of heterophils and lymphocytes, and induced humoral immune response in tear secretion. Prolonged fasting post-hatching, followed by feeding, negatively affected the performance, the development of gastrointestinal organs, biochemical variables, immunological and the most of hematological variables. The data indicate that periods of fasting post-hatching over 48 h should be avoided as they adversely affect the hematological, gastrointestinal and immunologic, may compromise the growth of broiler breeder and infer a negative effect on their immune response. However, moderate fasting can promote the immune response vaccine

Respostas mediadas por anticorpos e células T de memória na imunidade contra o Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas

O vírus da bronquite infecciosa aviária (VBIG) permanece como um dos principais problemas para a avicultura industrial. Para a imunoprofilaxia dessa virose existem vacinas ?vivas? atenuadas ou inativadas, mas elas não são efetivas para o controle dessa doença infecciosa a longo prazo, especialmente contra estirpes variantes desse vírus. A função primordial das vacinas usuais contra o VBIG são estimular as respostas imunes sistêmicas e locais, mediadas por anticorpos ou por células T efetoras. Com a finalidade de investigar os mecanismos envolvidos na imunidade protetora, os níveis de anticorpos locais e sistêmicos e a expressão de genes associados a respostas de linfócitos T citotóxicos, tais como o CD8 e a granzima A foi avaliada na mucosa traqueal, após a imunização primária de pintinhos de 1 dia de idade com vacinas atenuadas contra o VBIG seguida do desafio 42 dias depois. Proteção ao desafio foi avaliada por meio da ciliostase traqueal, histopatologia e detecção de vírus pela técnica de RT-PCR em tempo real na traquéia. Os níveis de anticorpos no soro e na secreção lacrimal foram mensurados pelo Sandwich- Concanavalina A ? ELISA. A expressão dos genes de CD8 e de granzima A foram avaliadas pela técnica de RT-PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que a proteção contra a infecção pelo VBIG em aves vacinadas se correlacionou com os níveis de anticorpos anti-virais específicos dos isótipos IgG, IgM e IgA na secreção lacrimal e com os níveis de expressão de CD8 e de granzima A. Concluindo, os resultados possibilataram definir o perfil cinético do desenvolvimento das respostas imunes de memória contra o VBIG na mucosa que é o sítio primário de replicação viral e indicaram que os mecanismos de imunidade humoral e celular podem ser muito importantes para a proteção de hospedeiros naturais contra a infecção pelo VBIG

Avian infectious bronchitis (IBV) remains a major problem in the poultry industry. Live and inactivated vaccines are available, but they are not effective long term in controlling IBV infection, specially against variant strains. The essential function of existing IBV vaccines is to elicit, ideally, local and systemic specific antibodies, as well as cell-mediated immunity to this virus. To investigate the mechanisms of protective immunity, the levels of systemic and local specific antibodies and the expression of genes responsible for cytotoxic T cell killing such as CD8-marker and granzyme-A at tracheal mucosa was evaluated after the primary immunization of 1- day-old chicks with an attenuated avian infectious bronchitis virus (IBV) and challenge 42 days later. Challenge protection was evaluated by tracheal ciliostasis, histopathology and virus detection by real time RT-PCR. The serum and lachrymal anti-IBV antibody levels of IgG, IgM and IgM isotypes were measured with a Sandwich-ELISA Concanavalina-A method. The expression of CD8 and granzyme A genes were evaluated by real time RT-PCR. The results showed protection against challenge with the M-41. Lachrymal IgG, IgM and IgA anti-IBV specific antibodies and the levels of expression of CD8 and granzyme A genes correlated significantly with the protection to challenge. Overall, the results provided the kinetics on the development of memory mucosal immune responses against IBV at the primary replication site and indicate that tracheal humoral and cellular immune mechanisms may be very important in protecting natural hosts against IBV infection

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas

Monoclonal antibodies (Mab) specific to IBV Massachusetts M41 were produced aiming to the development of assays for IBV diagnosis and research, such as for rapidly detecting or typing IBV isolates. Mabs were detected by ELISA and characterized based on the isotype (ELISA) or IBV structural specificity (western blotting) respectively as IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b or IgM or as specific to S1 (42), S2 (34, 43 and 71), M (7 and 22), N (15 and 50) and S whole molecule (3, 18, 52 and 57), the major IBV structural proteins

Um painel de anticorpos monoclonais (AcM) específicos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) amostra Massachusetts M41 foi desenvolvido com a finalidade de possibilitar ferramentas para futuros estudos de amostras locais de VBIG. Os clones produtores de AcM foram detectados e caracterizados por ELISA, e para a determinação quanto à especificidade ao componente de VBIG foi utilizado western blotting (WB). Os híbridos produtivos foram clonados por diluição limitante, expandidos in vitro e mantidos em nitrogênio líquido. As bandas protéicas reconhecidas em WB pelos AcM apresentaram pesos moleculares que variaram de 180 a 30 kDa. Oito AcM reconheceram apenas um polipeptídeo e quatro ligaram-se ao polipeptídeo S (3, 18, 52 e 57) inteiro, com a banda de peso molecular aproximado de 180 kDa. Cinco AcM (5, 12, 41, 70 e 72) ligaram-se em mais de uma banda de VBIG. Outros sete AcM não se ligaram a nenhum polipeptídeo de VBIG. Entre os AcM que apresentam perspectivas de utilização em pesquisa e diagnóstico de VBIG incluem-se os produzidos pelo clone 42, dirigido contra S1, os produzidos pelos clones 34, 43 e 71, dirigidos contra S2, pelos clones 7 e 22, dirigidos contra M e pelos clones 15 e 50, cujos AcM reagiram contra a nucleoproteína N.

Production of monoclonal antibodies against conserved components of infectious bronchitis virus

Murine hybridomas producing IgG1 monoclonal antibodies (Mabs) against N and S2 proteins (53KDa and 82KDa, respectively) from avian infection bronchitis virus (IBV) strain M41 were generated by the fusion of a myeloma cell line (Sp2/0-Ag14) with spleen cells from Balb/c mice previously immunized with whole virus IBV M41. Post-fusion screening criterion was by ELISA and 36 positive hybrids were generated after fusions. Two hybrids specific to N (N3F10) and S2 (S12B2) proteins from M41 (serotype Massachusetts) were selected by western blotting. These Mabs recognized the Ark-99 (serotype Arkansas) and A5968 (serotype Connecticut) IBV strains in addition to M41. By ELISA, the Mab against the S2 (S12B2) recognized all reference and Brazilian strains (M41, SE-17, H52, 297, 283, PM-1, PM-2, PM-3, 351, 29-78 E 327) studied, while the Mab against N recognized only six (M41, SE-17, H52, 283, 327 e 297) strains. The Mab against S2 may become a useful tool for IBV detection on the routine diagnosis of infectious bronchitis, especially for helping the differential diagnosis of clinically and pathologically confusing diseases, while the Mab against N (N3F10) recognized a probably less conserved region among the strains and may be interesting to comparing IBV isolates.

Foram produzidos anticorpos monoclonais (AcM) da subclasse IgG1 contra as proteínas N (53KDa) e S2 (82KDa) do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) amostra M41. Os híbridos secretores originaram-se da fusão entre células de mielomas da linhagem Sp2/0-Ag14 e linfócitos B de camundongos Balb/c previamente imunizados com o vírus completo. O primeiro critério de seleção foi por ELISA, no qual 36 híbridos originados de duas fusões reagiram positivamente; destes, foram selecionados dois AcM que reagiram contra as proteínas N (N3D4) e S2 (S12B2) do VBIG da amostra M41 (sorotipo Massachusetts) no western blotting. Os mesmos AcM foram também capazes de reconhecer as estirpes Ark-99 (sorotipo Arkansas) e A5968 (sorotipo Connecticut) do VBIG no western blotting. No ELISA, o AcM contra S2 (S12b2) reconheceu 11 estirpes das 11 estudadas (M41, SE-17, H52, 297, 283, PM-1, PM-2, PM-3, 351, 29-78 E 327), enquanto o AcM contra a proteína N reconheceu apenas seis estirpes (M41, SE-17, H52, 283, 327 e 297). O anticorpo monoclonal contra S2 comportou-se como uma boa ferramenta de diagnóstico do VBIG, independentemente do sorotipo que pode ser aplicado em ensaios de rotina laboratorial, especialmente no diagnóstico das doenças que se confundem com a BIG nas galinhas, enquanto o AcM contra N (N3F10) demonstrou reconhecer uma região menos conservada entre as estirpes de VBIG e pode ser útil em estudos comparativos entre isolados de VBIG.

Afinidades antigênicas de amostras de campo do vírus da bronquite infecciosa das galinhas com a amostra Massachusetts M41 / Antigenic affinities of infectious bronchitis virus field isolates to Massachusetts M41 strain

Com o objetivo de avaliar as afinidades antigênicas entre 14 amostras de vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) isoladas de casos clínicos ocorridos entre 1972 e 1989 no Estado de Minas Gerais, sua reatividade frente a dois anticorpos monoclonais (AcMs) específicos contra a glicoproteína S1(subscrito) do sorotipo Massachusetts de VBIG foi examinada em ELISA. As 14 amostras de campo estudadas foram agrupadas,de acordo com o relacionamento antigênico aos AcMs, em relacionadas (três amostras) e não relacionadas (onze amostras) à amostra M41 do sorotipo Massachusetts. As amostras de campo não reconhecidas, considerando a alta especificidade dos AcMs à amostra M41, compõem uma diversidade que pode variar de integrantes do sorotipo Massachusetts de origem vacinal a sorotipos heterólogos. Amostras com afinidade antigênica à M41 (208-1972, PM1-1987 e PM2-1987) foram detectadas, o que configura a preservação da amostra no campo, apesar da alta variabilidade da glicoproteína S1(subscrito), já que foram isoladas de surtos de doença natural nas regiões de avicultura de Minas Gerais. A detecção de antígenos de alta variabilidade que caracterizam a amostra M41, apesar das pressões da imunidade dos plantéis e da mutabilidade, pode indicar que os antígenos de alta afinidade aos receptores celulares (best fit) que atingiram alto estágio evolutivo podem estar sendo preservados(AU)

Aiming to the evaluation of antigenic relationships among isolates of infectious bronchitis virus (IBV) through their reactivity against Massachusetts M41 S1 glycopolypeptide specific monoclonal antibodies (Mab) an ELISA was developed. Fourteen IBV isolates obtained from field cases of disease, reported from 1972 to 1989 in Minas Gerais, Brazil, were examined. The IBV isolates could be grouped into related or not to M41, based on the reactivity to M41 S1 specific Mabs. The unrecognized field isolates conform a diversity of representatives, which may range from Massachusetts vaccine strains to unrelated heterologous IBV serotypes. The detection of three M41-related isolates (208-1972, PM1-1987 and PM2-1987) indicate that, despite the high variability and pressure for changes in the S1 protein, M41 clones are still present in the field and may point out that the survival strategies for isolates should include mechanisms that preserve the best fits for cellular receptors. (AU)

Detecção de um coronavírus entérico aviário em aves de corte, poedeiras comerciais e matrizes: distribuição, diversidade molecular e diagnóstico diferencial com outros vírus entéricos aviários / Detection of an enteric coronavirus in broiler chickens, laying hens and broiler breeders: distribution, molecular diversity and diferential diagnosis with other avian enteric viruses

Doenças infecciosas entéricas das aves comerciais apresentam uma etiologia complexa e são distribuídas mundialmente, acarretando elevadas perdas econômicas. Aliadas à possibilidade de infecções únicas ou concomitantes entre diversos patógenos, as gastroenterites podem se refletir em outros sistemas, contribuindo ainda mais para a queda da performance dos lotes. Recentemente, foi detectado um coronavírus no conteúdo intestinal de aves apresentando despigmentação e diarréia. Este vírus, denominado de CECoV (chicken enteric coronavírus) é sugestivo de pertencer ao grupo 2, divergente dos demais coronavírus comuns em aves, pertencentes ao grupo 3 do gênero Coronavirus. No Brasil, há uma grande necessidade no conhecimento acerca da participação dos agentes virais nas diarréias de aves, sendo este um passo fundamental para o estabelecimento de medidas profiláticas específicas e para a exportação de produtos avícolas. Este estudo teve por objetivos detectar este coronavírus do grupo 2 em aves de corte, poedeiras comerciais e matrizes com e sem diarréia pela técnica de PCR dirigida ao gene codificador da RNA-polimerase RNA-dependente (gene RdRp) dos coronavírus do grupo 2, estabelecer a relação genealógica entre diversas amostras detectadas deste vírus com base em seqüências dos genes RdRp, gene codificador da proteína de espícula (S), gene codificador da proteína hemaglutinina-esterase (HE), gene 5, gene 3 e região 3\'UTR e realizar o diagnóstico diferencial com reovírus, rotavírus, variedades enterotrópicas do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG), astrovírus e adenovírus. O coronavírus CECoV foi detectado em 25 de 119 amostras de conteúdo entérico de aves de corte, matrizes e poedeiras com e sem diarréia, em diversas granjas produtoras no Brasil, pela técnica da reação em cadeia pela polimerase dirigida ao gene RdRp. O CECoV tem papel como agente primário e secundário em processos patológicos do trato digestório de aves e, ao serem analisadas filogeneticamente, diferentes amostras de CECoV formaram um grupo único com base no gene RdRp dentro do grupo 2 do gênero Coronavirus, possuindo homologia com coronavírus do grupo 3 na região 3\'UTR, sendo sua origem sugerida como um evento de recombinação entre coronavírus dos grupos 2 e 3. Através do estabelecimento de uma rotina de diagnóstico diferencial, as freqüências de ocorrência de vírus entéricos em aves de produção criadas nas 119 granjas no Brasil foram: rotavírus=48,74%, reovírus=2,52%, VBIG=65,54%, CECoV=21% e astrovírus=3,36%

Infectious enteric diseases in poultry have a complex etiology and a worldwide distribution, causing large economic losses. Along with the possibility of single or multiple infections by different pathogens, enteric diseases may also be reflected in other systems, contributing even more to the fall of performance in the affected flocks. Recently, a coronavirus was detected in the intestinal contents of chickens with depigmentation and diarrhea. This virus, named CECoV (chicken enteric coronavirus), has been suggested as belonging to group 2, divergent of the common avian coronaviruses, which belongs to the group 3 of the genus Coronavirus. In Brazil, there is a great need for the knowledge on the role of viral agents in diarrhea of poultry, what is a fundamental step for the establishment of specific prophylactic measures and for the exportation of poultry-derived products. The present study aimed the detection of this group 2 coronavirus in broilers, laying hens and breeders with and without diarrhea using a PCR targeted to the gene coding for the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp) of group 2 coronaviruses, the establishment of the genealogical relationship among the different strains detected based on sequences of the RdRp, the genes coding for the spike protein (S gene), hemagglutinin-esterase protein (HE gene), gene 5, gene 3 and the 3\' UTR and the differential diagnosis with reovirus, rotavirus, enterotropic strains of infectious bronchitis virus (IBV), astrovirus and adenovirus. CECoV was found in 25 out of 119 samples of enteric contents of broilers, breeders and laying hens in different farms in Brazil using the PCR to the RdRp. CECoV has a role as a primary and secondary pathogen in pathological processes of the enteric tract of poultry and the phylogenetic analysis showed that different strains of CECoV formed an unique cluster based on the RdRp inside the group 2 of coronaviruses, harboring homology with group 3 coronaviruses in the 3\'UTR, being its origin suggested as a recombination event between coronaviruses of groups 2 and 3. By the establishment of a routine of diagnosis, the frequencies of enteric viruses in the 119 poultry farms surveyed were: rotavirus = 48.74%, reovirus = 2.52%, IBV = 65.54%, CECoV = 21% and astrovirus = 3.36%