Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.(AU)

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.

QUALIDADE ESPERMÁTICA DURANTE A CURVA DE RESFRIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO DILUÍDO EM ÁGUA DE COCO EM PÓ VISANDO SUA CRIOPRESERVAÇÃO

Abstract Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 ºC for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution - BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Resumo A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 ºC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution - BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution – BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution – BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.(AU)

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.(AU)

CRIOPRESERVAÇÃO E AVALIAÇÃO PÓS-DESCONGELAÇÃO DO SÊMEN DE TOUROS DA RAÇA CURRALEIRO PÉ-DURO E NELORE NOS PERÍODOS SECO E CHUVOSO

O objetivo deste estudo foi analisar, comparativamente as respostas fisiológicas e seminais ao estresse térmico na raça Curraleiro Pé-Duro (CPD), bovino tropicalmente adaptado, e na raça Nelore em diferentes períodos estacionais (seco e chuvoso) na região Meio-Norte brasileira. Para tanto, foram utilizados 12 touros previamente selecionados de acordo com as Normas do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, sendo seis da raça Curraleiro Pé-Duro (Bos taurus taurus), e seis da raça Nelore (Bos taurus indicus), sendo os CPD oriundos da Unidade de Pesquisa da EMBRAPA Meio-Norte localizada no município de Campo Maior PI, enquanto os Nelore foram provenientes da Fazenda Vitória localizada no município de Brasileira PI. Foram realizados exames comparativos entre as duas raças, iniciando pela análise clínica reprodutiva de cada animal, o qual consiste na examinação do sistema genital, contemplando a inspeção e/ou palpação dos órgãos que constitui o sistema genital masculino. Nesse contexto, cabe ressaltar a utilização da Ultrassonografia Doppler no contexto da avaliação. Foram realizadas, pelo método da eletroejaculação, seis coletas de cada animal, cujo material foi avaliado de imediato quanto aos parâmetros de volume, aspecto, motilidade total e vigor espermático. De imediato uma alíquota de cada amostra foi diluída em formol salino para determinação da concentração e dos defeitos espermáticos. Em seguida, com base na concentração estabelecida foi feita a diluição do sêmen, sendo então criopreservados em máquina automatizada (TK 3000) pelo método de congelação lenta, e estocado em botijões criogênicos. Trinta dias após a descongelação, as amostras foram analisadas quanto a valores de termorresistência (TTR), cinética (CASA), integridade da membrana plasmática e acrossomal. Para análise dos dados foram utilizadas médias e desvio padrão, além do teste Shapiro-Wilk para verificar se os dados seguem distribuição Normal. Para comparar as médias entre as raças e entre os períodos foi usado o teste t de Student e o teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. Os dados foram tabulados e analisados no IBM Statistical Package for the Social Sciences versão 20.0. O nível de significância adotado foi p 0,05.

O objetivo deste estudo foi analisar, comparativamente as respostas fisiológicas e seminais ao estresse térmico na raça Curraleiro Pé-Duro (CPD), bovino tropicalmente adaptado, e na raça Nelore em diferentes períodos estacionais (seco e chuvoso) na região Meio-Norte brasileira. Para tanto, foram utilizados 12 touros previamente selecionados de acordo com as Normas do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, sendo seis da raça Curraleiro Pé-Duro (Bos taurus taurus), e seis da raça Nelore (Bos taurus indicus), sendo os CPD oriundos da Unidade de Pesquisa da EMBRAPA Meio-Norte localizada no município de Campo Maior PI, enquanto os Nelore foram provenientes da Fazenda Vitória localizada no município de Brasileira PI. Foram realizados exames comparativos entre as duas raças, iniciando pela análise clínica reprodutiva de cada animal, o qual consiste na examinação do sistema genital, contemplando a inspeção e/ou palpação dos órgãos que constitui o sistema genital masculino. Nesse contexto, cabe ressaltar a utilização da Ultrassonografia Doppler no contexto da avaliação. Foram realizadas, pelo método da eletroejaculação, seis coletas de cada animal, cujo material foi avaliado de imediato quanto aos parâmetros de volume, aspecto, motilidade total e vigor espermático. De imediato uma alíquota de cada amostra foi diluída em formol salino para determinação da concentração e dos defeitos espermáticos. Em seguida, com base na concentração estabelecida foi feita a diluição do sêmen, sendo então criopreservados em máquina automatizada (TK 3000) pelo método de congelação lenta, e estocado em botijões criogênicos. Trinta dias após a descongelação, as amostras foram analisadas quanto a valores de termorresistência (TTR), cinética (CASA), integridade da membrana plasmática e acrossomal. Para análise dos dados foram utilizadas médias e desvio padrão, além do teste Shapiro-Wilk para verificar se os dados seguem distribuição Normal. Para comparar as médias entre as raças e entre os períodos foi usado o teste t de Student e o teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. Os dados foram tabulados e analisados no IBM Statistical Package for the Social Sciences versão 20.0. O nível de significância adotado foi p 0,05.

PERFIL DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS À QUALIDADE E IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES OVINOS CRIOPRESERVADOS POR DIFERENTES TÉCNICAS

A transferência de embriões frescos resulta em maior taxa de gestação comparada à transferência de embriões criopreservados, sugerindo comprometimento do estabelecimento da gestação após criopreservação. Este estudo objetivou avaliar o efeito da técnica de criopreservação (vitrificação ou congelação lenta) de embriões ovinos produzidos in vivo, na taxa de sobrevivência e perfil de expressão de genes relacionados à apoptose (BAX, BCL2), proliferação e diferenciação celular (TGFB1), respiração celular (NFR1), manutenção da pluripotência (NANOG) e implantação (CDX2). Trinta e duas ovelhas foram submetidas à superovulação e posterior coleta de embriões. Os embriões obtidos foram classificados quanto ao estágio de desenvolvimento e qualidade. Os embriões GI e GII foram uniformemente distribuídos dentro dos grupos experimentais: CONT) blastocistos frescos (n=15); CONG) congelação lenta (n=42); ou VIT) vitrificação (n=43). Os embriões CONT foram congelados a seco em três pools de cinco embriões, para posterior RT-qPCR. Os embriões CONG e VIT após descongelamento/aquecimento, respectivamente, foram alocados para análise de expressão gênica ou cultivo in vitro (24 e 48 h) em meio SOF com aminoácidos suplementado com 2,5% soro fetal bovino, a 38,5 °C e 5% CO2 (CONG: n=27; VIT: n=28). As taxas de sobrevivência de CONG e VIT foram, respectivamente, 29,6% (8/27) e 14,2% (4/28) em 24 h; e 48,1% (13/27) e 32,1% (9/28) em 48 h (P > 0,05). Independentemente da técnica de criopreservação, o gene CDX2 foi super expresso (P < 0,05) quando comparado ao CONT. A expressão dos genes BAX, BCL2, TGFB1 e CDX2 foi aumentada no grupo VIT (P < 0,05) quando comparados ao CONT. Contudo, quando as duas técnicas de criopreservação foram comparadas, apenas o gene BAX foi super expresso (P < 0,05) no VIT, em comparação com o CONG. Esses dados sugerem que o decréscimo de 16% (não-significativo) na taxa de sobrevivência, observado no grupo VIT, pode estar associado ao aumento na expressão do gene pró-apoptótico (BAX). Em conclusão, a técnica de vitrificação levou a um decréscimo de 16% (não significativo) na taxa de sobrevivência do embrião e aumento do gene pró-apoptótico.

Transfer of fresh sheep embryos have a higher pregnancy rate compared to cryopreserved embryos, suggesting that cryopreservation compromises embryonic signaling during implantation and establishment of pregnancy. This mechanism needs to be more clarified. Thus, this study aimed to evaluate the effect of the cryopreservation technique (vitrification or slow freezing) of sheep embryos produced in vivo on embryo survival rate and expression of genes related to apoptosis (BAX and BCL2), cellular differentiation and proliferation (TGFB1), cellular respiration (NFR1), maintenance of pluripotency (NANOG) and implantation (CDX2). Superovulation (n=32 ewes) was performed and embryos were transcervically collected. A total of 100 GI/II embryos was randomly allocated into three groups: 1) fresh blastocysts (CONT; n=15); 2) slow freezing (SF; n=42); or 3) vitrification (VT; n=43). After thawing/warming, three pools of five embryos per group were used for RT-qPCR; and other embryos were cultured in vitro (24 and 48 h) in SOF with aminoacids and 2.5% of fetal bovine serum medium at 38.5 °C and 5% CO2 (SF: n=27; VT: n=28). Embryonic survival rate of SF and VT were, respectively, 29.6% (8/27) and 14.2% (4/28) at 24 h; and 48.1% (13/27) and 32.1% (9/28) at 48 h (P > 0.05). Only the CDX2 gene was affected (up-regulated, P < 0.05) in both groups compared to CONT. The BAX gene was up-regulated in VT, compared to SF group. The VT increased (P < 0.05) the expression of all genes associated with embryonic quality and implantation, except for NANOG and NRF1, when compared to the CONT. In conclusion, the VT technique led to a decrease of 16% (non-significant) in embryo survival rate and increased pro-apoptotic gene expression.

Congelação de sêmen e tecidos de peixes brasileiros / Semen and tissues freezing in Brazilian fish

Neste trabalho é apresentada uma revisão dos principais procedimentos adotados para a conservação da viabilidade do sêmen de diferentes espécies de peixes, com ênfase nos peixes nativos do Brasil, bem como, destaca alguns dos principais avanços obtidos na congelação de embriões e tecidos de peixes.(AU)

This paper presents a review of the main procedures adopted for the conservation of the viability of semen from different fish species, with emphasis on native fish species from Brazil, and highlights some of the major advances obtained in freezing fish embryos and tissues.(AU)

Congelação de sêmen e tecidos de peixes brasileiros / Semen and tissues freezing in Brazilian fish

Neste trabalho é apresentada uma revisão dos principais procedimentos adotados para a conservação da viabilidade do sêmen de diferentes espécies de peixes, com ênfase nos peixes nativos do Brasil, bem como, destaca alguns dos principais avanços obtidos na congelação de embriões e tecidos de peixes.

This paper presents a review of the main procedures adopted for the conservation of the viability of semen from different fish species, with emphasis on native fish species from Brazil, and highlights some of the major advances obtained in freezing fish embryos and tissues.

Crioprotetor para sêmen de carneiro a base de plasma de gema mantém membrana acrossomal intacta após a descongelação / Ram semen cryoprotector based on egg yolk plasma maintain the viability of acrosomal membrane

O presente estudo teve como objetivo avaliar a capacidade crioprotetora das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) presentes no plasma de gema de ovo, adicionado ao trihidroxiaminometano (TRIS) para congelar sêmen ovino. Trinta e seis ejaculados foram coletados para formar 12 "pool". Cada alíquota de sêmen foi diluída em TRIS-gema de ovo (TRISG) ou TRIS- plasma de gema de ovo (TRISP) antes de congelar o sêmen. Para a obtenção do plasma da gema de ovo, foi utilizado o método de ultracentrifugação. Após o descongelamento, não houve diferença entre os dois extensores em relação aos parâmetros seminais (motilidade, viabilidade, membrana acrossômica e plasma). No entanto, no Teste de Termo Resistência Lenta (TTRL - 4h/38°C), o sêmen congelado com TRISP resultou no aumento do número de espermatozoides com acrossoma intacto (P 0,032). Conclui-se que o diluente TRISP é uma alternativa para criopreservação do sêmen de carneiros, pois permite uma melhora da característica seminal em relação ao diluente TRIS gema, mas sem a necessidade do processo de purificação das LDL.(AU)

The present study aimed to evaluate the cryoprotectant low-density lipoprotein (LDL) present in the plasma of egg yolk added to the extender trihidroxiaminometano (TRIS) for freezing ram semen. Thirty-six ejaculates were collected to form 12 pool. Each aliquot of semen was diluted in TRIS-egg yolk (TRISG) or TRIS-egg yolk plasma (TRISP) before freezing the semen. The plasma of egg yolk was obtained by ultracentrifugation. After thawing, no difference was detected between the two extenders in relation to seminal parameters (motility, viability, plasma membrane and acrosome). However, in the thermal resistance slow test (4h in a water bath at 38°C), the semen frozen with TRISP resulted in higher number of sperm with intact acrosome than those with TRISG (P 0.032). It was concluded that the TRISP extender is an alternative for cryopreservation of ram semen, once it improves the semen characteristics in comparison to TRISG, avoiding the purification process of LDL.

ESTABELECIMENTO DE CARIOPLASTOS E CITOPLASTOS DE CATETOS, Pecari tajacu (LINNAEUS, 1758), VISANDO A CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULA SOMÁTICA EM TAIASSUÍDEOS

O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos.

The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries.

Criopreservação lenta e vitrificação de oócitos ovinos na produção in vitro de embriões

Objetivou-se avaliar a viabilidade de oócitos imaturos de ovinos submetidos à congelação lenta e vitrificação na produção in vitro de embriões partenogenéticos. Para tanto, foram colhidos 394 ovários oriundos de 197 ovelhas púberes, provenientes de abatedouros localizados no município de Teresina, PI. Os ovários foram transportados para o laboratório em garrafa térmica, contendo solução salina fisiológica a 37 °C acrescida de 40mg/mL de sulfato de gentamicina. Os ovários foram aspirados utilizando-se um aspirador cirúrgico adaptado, contendo na extremidade de aspiração uma agulha 21G. Foram recuperados 373 CCOs, obtendo-se uma taxa de recuperação de 1,89 CCOs por par de ovários. Após seleção e classificação, os CCOs foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais, oócitos destinado a congelação lenta e oócitos destinado a vitrificação. Em seguida os CCOs foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta e vitrificação. Após o período mínimo de 30 dias, os oócitos da congelação lenta e vitrificação foram descongelados. Um grupo aleatório de oócitos oriundos da congelação lenta foi submetido ao teste do Azul Cresil Brilhante (ACB). 10% dos oócitos de ambos os grupos experimentais foram submetidos à análise através da associação de sondas fluorescentes (iodeto de propídio e diacetato de carboxifluresceína). Ulteriormente, os oócitos oriundos da vitrificação e da congelação lenta, inclusive os que haviam sido avaliados no teste do ACB, foram submetidos à maturação in vitro (MIV). Após 24 horas de MIV, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Seguidamente, às 28 horas após MIV, os oócitos foram submetidos à ativação partenogenética. Ao término da ativação, com 32 horas, os oócitos foram submetidos ao cultivo in vitro (CIV) durante oito dias. As estruturas em CIV foram avaliadas no D2, D7 e D8. No último dia de CIV, realizou-se a coloração das estruturas com Hoechts 33342. Os oócitos frescos (grupo controle) apresentaram diferença estatística (P < 0,001) em relação aos grupos experimentais, oócitos da congelação lenta e vitrificação, quanto ao número de oócitos viáveis, maturados, ativados por partenogênese, clivados em D2 e com presença de mórula em D7 e D8 (0,008). Não havendo diferença significativa (P < 0,001) entre oócitos da congelação lenta e vitrificação quanto aos mesmos parâmetros supracitados. Houve diferença significativa (P < 0,001) entre os oócitos frescos, oócitos da congelação lenta e vitrificação, quanto ao número de maturados, evidenciando que o número de oócitos frescos maturados foi superior. Na análise de sondas fluorescentes houve igualdade estatística (P = 0,280) entre os oócitos da congelação lenta e vitrificação. No teste ACB houve diferença estatisticamente significativa (P = 0,001) entre os oócitos frescos e oócitos da congelação lenta. No grupo de oócitos frescos submetidos ao teste ACB, não houve diferença estatística (P = 0,400). Conclui-se que os oócitos imaturos de ovinos apresentaram viabilidade após congelação lenta e vitrificação. Porém, nas etapas de produção in vitro de embriões, os oócitos progrediram até a fase de maturação in vitro, não evoluindo no desenvolvimento embrionário após ativação partenogenética. Dessa forma, sendo relevante a realização de mais pesquisas relativas às técnicas de congelação lenta para oócitos ovinos e vitrificação, a fim de produzir embriões in vitro.

Objetivou-se avaliar a viabilidade de oócitos imaturos de ovinos submetidos à congelação lenta e vitrificação na produção in vitro de embriões partenogenéticos. Para tanto, foram colhidos 394 ovários oriundos de 197 ovelhas púberes, provenientes de abatedouros localizados no município de Teresina, PI. Os ovários foram transportados para o laboratório em garrafa térmica, contendo solução salina fisiológica a 37 °C acrescida de 40mg/mL de sulfato de gentamicina. Os ovários foram aspirados utilizando-se um aspirador cirúrgico adaptado, contendo na extremidade de aspiração uma agulha 21G. Foram recuperados 373 CCOs, obtendo-se uma taxa de recuperação de 1,89 CCOs por par de ovários. Após seleção e classificação, os CCOs foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais, oócitos destinado a congelação lenta e oócitos destinado a vitrificação. Em seguida os CCOs foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta e vitrificação. Após o período mínimo de 30 dias, os oócitos da congelação lenta e vitrificação foram descongelados. Um grupo aleatório de oócitos oriundos da congelação lenta foi submetido ao teste do Azul Cresil Brilhante (ACB). 10% dos oócitos de ambos os grupos experimentais foram submetidos à análise através da associação de sondas fluorescentes (iodeto de propídio e diacetato de carboxifluresceína). Ulteriormente, os oócitos oriundos da vitrificação e da congelação lenta, inclusive os que haviam sido avaliados no teste do ACB, foram submetidos à maturação in vitro (MIV). Após 24 horas de MIV, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Seguidamente, às 28 horas após MIV, os oócitos foram submetidos à ativação partenogenética. Ao término da ativação, com 32 horas, os oócitos foram submetidos ao cultivo in vitro (CIV) durante oito dias. As estruturas em CIV foram avaliadas no D2, D7 e D8. No último dia de CIV, realizou-se a coloração das estruturas com Hoechts 33342. Os oócitos frescos (grupo controle) apresentaram diferença estatística (P < 0,001) em relação aos grupos experimentais, oócitos da congelação lenta e vitrificação, quanto ao número de oócitos viáveis, maturados, ativados por partenogênese, clivados em D2 e com presença de mórula em D7 e D8 (0,008). Não havendo diferença significativa (P < 0,001) entre oócitos da congelação lenta e vitrificação quanto aos mesmos parâmetros supracitados. Houve diferença significativa (P < 0,001) entre os oócitos frescos, oócitos da congelação lenta e vitrificação, quanto ao número de maturados, evidenciando que o número de oócitos frescos maturados foi superior. Na análise de sondas fluorescentes houve igualdade estatística (P = 0,280) entre os oócitos da congelação lenta e vitrificação. No teste ACB houve diferença estatisticamente significativa (P = 0,001) entre os oócitos frescos e oócitos da congelação lenta. No grupo de oócitos frescos submetidos ao teste ACB, não houve diferença estatística (P = 0,400). Conclui-se que os oócitos imaturos de ovinos apresentaram viabilidade após congelação lenta e vitrificação. Porém, nas etapas de produção in vitro de embriões, os oócitos progrediram até a fase de maturação in vitro, não evoluindo no desenvolvimento embrionário após ativação partenogenética. Dessa forma, sendo relevante a realização de mais pesquisas relativas às técnicas de congelação lenta para oócitos ovinos e vitrificação, a fim de produzir embriões in vitro.

Biotecnologia da reprodução: uso do ACP®-407 na criopreservação e do ACP®-414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos

As Biotecnologias da reprodução são ferramentas capazes de aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva do animal, assim como, superar alguns obstáculos envolvidos na reprodução animal. A proposta adotada neste presente trabalho foi avaliar o Uso do ACP®- 407 na criopreservação e do ACP®- 414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos. Para este fim, os complexos cumulus-oócitos aspirados de folículos ovárianos de cabras púberes foram classificados morfologicamente e divididos em três (3) grupos. O grupo1- oócitos submetidos ao método de vitrificação (Cryotech®), grupo 2 - congelação lenta (1,5 M de EG (Etilenoglicol) /ACP®- 407) e o grupo 3 - oócitos frescos. Após descongelação e reaquecimento dos oócitos cripreservados, os classificados como viáveis foram maturados em meio de maturação in vitro convencional com e sem ACP®- 414 (10%) de acordo com fabricante a 38 C e 5% CO2 por 24 h e então ativados com exposição a Ionomicina (5 µM) por 5 minutos e incubados com 6-Dimethylaminopurina (6-DMAP) e Cicloheximida por 4h. Estas células ativadas foram cultivadas em meio para cultivo de embriões G1 e G2 (Vitrolife) por oito dias e então aferidos os blastócitos e corados com Hoechst 33342 (5µ/mL). Na avalição dos métodos de criopreservação o número de oócitos degenerados foi maior nos oócitos criopreservado em congelação lenta quando comparado com os vitrificados (p < 0,05). Baixas taxas de maturação indicando diferença significativa entre os métodos de vitrificação e congelação lenta com controle. Não houve clivagens e formação de blastocistos, demonstrando diferença significativa da incompetência meiótica quando comparado com o controle. No estudo do grupo de oócitos frescos não houve diferença significativa nas taxas de maturação dos oóctitos com e sem ACP (66,2% e 69,2%), respectivamente. Houve melhores taxas de clivagens no grupo de maturado sem ACP quando comparado com o grupo de maturados com ACP (p < 0,05). Ocorreu diferença significativa nas taxas de blastocistos no grupo de maturados sem ACP (10,8%) com relação ao grupo de maturados com ACP (0%). O uso do ACP®- 407/414 não apresentou resultados efetivos na competência oocitária dos oócitos criopreservados, mas no grupo dos oócitos frescos apresentaram resultados similares nas taxas de maturação dos oócitos frescos sem ACP, indicando ser uma boa opção de substituição de algum componente presente no meio de maturação para espécie caprina.

As Biotecnologias da reprodução são ferramentas capazes de aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva do animal, assim como, superar alguns obstáculos envolvidos na reprodução animal. A proposta adotada neste presente trabalho foi avaliar o Uso do ACP®- 407 na criopreservação e do ACP®- 414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos. Para este fim, os complexos cumulus-oócitos aspirados de folículos ovárianos de cabras púberes foram classificados morfologicamente e divididos em três (3) grupos. O grupo1- oócitos submetidos ao método de vitrificação (Cryotech®), grupo 2 - congelação lenta (1,5 M de EG (Etilenoglicol) /ACP®- 407) e o grupo 3 - oócitos frescos. Após descongelação e reaquecimento dos oócitos cripreservados, os classificados como viáveis foram maturados em meio de maturação in vitro convencional com e sem ACP®- 414 (10%) de acordo com fabricante a 38 C e 5% CO2 por 24 h e então ativados com exposição a Ionomicina (5 µM) por 5 minutos e incubados com 6-Dimethylaminopurina (6-DMAP) e Cicloheximida por 4h. Estas células ativadas foram cultivadas em meio para cultivo de embriões G1 e G2 (Vitrolife) por oito dias e então aferidos os blastócitos e corados com Hoechst 33342 (5µ/mL). Na avalição dos métodos de criopreservação o número de oócitos degenerados foi maior nos oócitos criopreservado em congelação lenta quando comparado com os vitrificados (p < 0,05). Baixas taxas de maturação indicando diferença significativa entre os métodos de vitrificação e congelação lenta com controle. Não houve clivagens e formação de blastocistos, demonstrando diferença significativa da incompetência meiótica quando comparado com o controle. No estudo do grupo de oócitos frescos não houve diferença significativa nas taxas de maturação dos oóctitos com e sem ACP (66,2% e 69,2%), respectivamente. Houve melhores taxas de clivagens no grupo de maturado sem ACP quando comparado com o grupo de maturados com ACP (p < 0,05). Ocorreu diferença significativa nas taxas de blastocistos no grupo de maturados sem ACP (10,8%) com relação ao grupo de maturados com ACP (0%). O uso do ACP®- 407/414 não apresentou resultados efetivos na competência oocitária dos oócitos criopreservados, mas no grupo dos oócitos frescos apresentaram resultados similares nas taxas de maturação dos oócitos frescos sem ACP, indicando ser uma boa opção de substituição de algum componente presente no meio de maturação para espécie caprina.

ESTEBELECIMENTO DE PROTOCOLOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO TESTICULAR DE CATETOS (Pecari tajacu LINNAEUS, 1758)

A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG CL e DMSO/G VSS (P<0.05). Assim, sugere-se a utilização da combinação DMSO/EG associada aos métodos de congelação lenta ou vitrificação para a criopreservação de tecido testicular de catetos adultos.

Cryopreservation of male gonadal tissue can be used in the conservation of genetic material, in order to form a germplasm bank allowing the maintenance of genetic variability in prepubertal and adult animals. Therefore, the aim was to establish an efficient protocol for cryopreservation of testicular tissue of collared peccaries. Therefore, the study was divided into two experiments, using 10 adult animals, 5 for each experiment, from the UFERSA Center for Wild Animals Multiplication. In experiment I, five pairs of testicles were fragmented (9 mm3) and allocated to non-vitrified (control) and vitrified solid-surface (SSV) groups following exposure to different cryoprotectants (3.0 M dimethyl sulfoxide (DMSO), 3.0 M ethylene glycol (EG) or 1.5 M DMSO/1.5 M EG). After warming, samples were evaluated for histomorphology, ultrastructure, viability, and proliferative capacity potential. The appropriate conservation of the ultrastructural organization of the seminiferous tubule in terms of lumen presence and cell junctions was only observed at the use of DMSO/EG combination. Regardless of the cryoprotectant, the vitrification effectively preserved cell nuclear visualization and condensation similarly as observed at the non-vitrified group. Moreover, DMSO/EG combination provided a better preservation of basal membranes of seminiferous tubules than DMSO (P < 0.05). Only the DMSO/EG combination maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia (3.69 Nucleolus Organizing Regions - NORs/cell) and Sertoli cell (3.19 NORs/cell) similar to controls (3.46 and 3.31 NORS/cell, respectively). In conclusion, DMSO/EG in combination is better than DMSO or EG alone for SSV of testicular tissue biopsies from adult collared peccaries. In experiment II, five pairs of testicles were also fragmented (3 mm3) and allocated to non-cryopreserved (control) and cryopreserved groups using three cryopreservation methods: slow freezing (SF), cryotube vitrification (CV) and solid surface vitrification (SSV), and then exposed to different combinations of cryoprotectants (1.5 M DMSO/1.5 M EG, 1.5 M DMSO/1.5 M glycerol - G, and 1.5 M G/1.5 M EG). Non-cryopreserved and cryopreserved samples were evaluated for histomorphology, viability, proliferative potential and DNA fragmentation. Only in the use of DMSO/EG during SF and CV, it was possible to preserve DNA integrity in a similar way to control (P> 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P <0.05). In conclusion, we suggest the use of a DMSO/EG combination associated with slow freezing or vitrification in cryotubes for cryopreservation of testicular tissue of adult peccaries.

Avanços na criopreservação de tecido ovariano de cabras e ovelhas / Advances in ovarian tissue cryopreservation in goats and sheep

A criopreservação de tecido ovariano, sem dúvidas, tem se tornado, uma prática não apenas suplementar as técnicas de reprodução assistida, mas também fundamental para a preservação da fertilidade da fêmea. Isso tem sido observado, especialmente na espécie humana, cuja espécie em uma década de trabalho, já se soma aproximadamente trinta nascimentos de bebês saudáveis oriundos de ovário criopreservado. No entanto, todo o avanço que hoje é estabelecido, muito se deve aos trabalhos pioneiros realizados em animais de animais de produção como os ovinos. Relatos de sucesso após criopreservação e transplante de tecido ovariano no início dos anos 90 impulsionaram importantes equipes a investir esforços e dedicação nessa área, voltados para a reprodução humana, e embora, o sucesso seja evidente, os avanços da criopreservação de tecido ovariano tanto na espécie ovina, como na espécie caprina são ainda bastante limitados. Portanto, o objetivo desse trabalho, é apresentar uma retrospectiva dos principais resultados obtidos com a criopreservação de tecido ovariano nessas duas espécies.

Cryopreservation of ovarian tissue, no doubt, has been considerated not only as an additional practice to assisted reproductive techniques, but it is fundamental for female fertility preservation. This have been related particularly in humans, whose specie in a decade, it was reported approximately thirty healthy babies born after procedures of cryopreservation and tranplant of ovarian tissue. However, the currently successful is due to hardefforts done in animals farm such as sheep. Reports of success after cryopreservation and transplantation of ovarian tissue in the early 90 stimulated several researchers to invest efforts and dedication in that research field, regarding human reproduction, and although success is evident, advances in cryopreservation of ovarian tissue in sheep and goats are still quite limited. Therefore, the aim of this work is to present a retrospective of the main results obtained with the cryopreservation of ovarian tissue in these two species.

Avanços na criopreservação de tecido ovariano de cabras e ovelhas / Advances in ovarian tissue cryopreservation in goats and sheep

A criopreservação de tecido ovariano, sem dúvidas, tem se tornado, uma prática não apenas suplementar as técnicas de reprodução assistida, mas também fundamental para a preservação da fertilidade da fêmea. Isso tem sido observado, especialmente na espécie humana, cuja espécie em uma década de trabalho, já se soma aproximadamente trinta nascimentos de bebês saudáveis oriundos de ovário criopreservado. No entanto, todo o avanço que hoje é estabelecido, muito se deve aos trabalhos pioneiros realizados em animais de animais de produção como os ovinos. Relatos de sucesso após criopreservação e transplante de tecido ovariano no início dos anos 90 impulsionaram importantes equipes a investir esforços e dedicação nessa área, voltados para a reprodução humana, e embora, o sucesso seja evidente, os avanços da criopreservação de tecido ovariano tanto na espécie ovina, como na espécie caprina são ainda bastante limitados. Portanto, o objetivo desse trabalho, é apresentar uma retrospectiva dos principais resultados obtidos com a criopreservação de tecido ovariano nessas duas espécies.(AU)

Cryopreservation of ovarian tissue, no doubt, has been considerated not only as an additional practice to assisted reproductive techniques, but it is fundamental for female fertility preservation. This have been related particularly in humans, whose specie in a decade, it was reported approximately thirty healthy babies born after procedures of cryopreservation and tranplant of ovarian tissue. However, the currently successful is due to hard efforts done in animals farm such as sheep. Reports of success after cryopreservation and transplantation of ovarian tissue in the early 90 stimulated several researchers to invest efforts and dedication in that research field, regarding human reproduction, and although success is evident, advances in cryopreservation of ovarian tissue in sheep and goats are still quite limited. Therefore, the aim of this work is to present a retrospective of the main results obtained with the cryopreservation of ovarian tissue in these two species.(AU)

DESCRIÇÃO HISTOLÓGICA, CULTIVO IN VITRO DE FIBROBLASTOS E CRIOPRESERVAÇÃO DA PELE DO PAVILHÃO AURICULAR DE ONÇA-PINTADA, Panthera onca (LINNAEUS, 1758)

A onça-pintada é um carnívoro de elevada importância ecológica para a biodiversidade mundial. Sua atual condição de vulnerabilidade a extinção requer estratégias de conservação, como a criopreservação de tecidos somáticos. Contudo, o emprego de técnicas de criopreservação depende do conhecimento das características histológicas e celulares dos tecidos em estudo. Portanto, os objetivos foram descrever histologicamente e por cultivo in vitro a pele do pavilhão auricular apical (Etapa 1) e comparar três técnicas de criopreservação [congelação lenta (CL), vitrificação direta em criotubos (VDC) e vitrificação em superfície sólida (VSS)] sobre a conservação dessas amostras de onça-pintada (Etapa 2). Para tanto, fragmentos foram recuperados de cinco animais oriundos de zoológicos do Brasil. Na primeira etapa, amostras de apenas dois animais, sendo um de pelagem amarela e outro de pelagem preta, foram avaliadas quanto à espessura da pele, quantificação e distribuição das células, percentual de matriz colágena, atividade proliferativa e viabilidade dos tecidos após cultivo. Para a segunda etapa, fragmentos foram criopreservados por CL, VDC ou VSS, e comparados com fragmentos não criopreservados (controle) quanto à espessura da pele, número de células, percentual de matriz colágena, e atividade proliferativa tecidual. Além disso, células resultantes dos fragmentos cultivados foram avaliadas quanto à morfologia, aderência, confluência, viabilidade, atividade proliferativa e metabólica. Assim, na primeira etapa, o estudo histomorfométrico mostrou uma espessura da pele total de 273,2 m e 274,6 m para onça pelagem amarela e preta, respectivamente. Além disso, melanócitos e fibroblastos para onça amarela foram de 9,3 e 23,0 e para onça preta foram de 11,3 e 26,8, respectivamente. Um percentual de matriz colágena de 67,0% e 49,0% foi observado para onça de pelagem amarela e preta, respectivamente. Adicionalmente, ambos os animais apresentaram uma atividade proliferativa celular variando de 1,201,30 e todos os fragmentos foram hábeis para promover o desprendimento celular, atingindo a subconfluência entre 10 a 15 dias. Na segunda etapa, todos os fragmentos criopreservados, independente da técnica empregada, mostraram uma redução na espessura da derme e da pele (P < 0,05). Embora uma matriz colágena similar ao grupo controle tenha sido observada somente para os fragmentos derivados dos grupos CL e VSS, todas as técnicas mantiveram o número de fibroblastos (P > 0,05). Além disso, VDC e VSS mantiveram a atividade proliferativa dos tecidos após o aquecimento. Após o cultivo, somente CL e VSS foram eficientes para a recuperação de células somáticas, de acordo com a maioria dos parâmetros avaliados. Em conclusão, a pele do pavilhão auricular de onça-pintada amarela e preta possui algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto à espessura, densidade de matriz colágena, e número de melanócitos e fibroblastos. Contudo, o padrão de crescimento celular foi similar a outros felídeos silvestres. Além disso, a VSS foi a técnica mais eficiente para a criopreservação de pele de onça-pintada, quando comparada a VDC e CL. Estes resultados irão contribuir para a formação criobancos nesta espécie, direcionando a criopreservação adequada de amostras somáticas para aplicações em medicina regenerativa e tecnologias de reprodução assistida.

The jaguar is a carnivore of high ecological importance for the world's biodiversity. Its current condition of vulnerability to extinction requires conservation strategies, such as cryopreservation of somatic tissues. Nevertheless, the use of cryopreservation techniques depends on the knowledge of the histological and cellular characteristics of the tissues under study. Therefore, the aims were described by histological techniques and by in vitro culture the apical ear skin (Step 1) and to compare three cryopreservation techniques [slow freezing (SF), direct vitrification in cryotubes (DVC) and solid-surface vitrification (SSV)] on the conservation of these jaguar samples (Step 2). Thus, fragments were recovered derived from five animals from zoos of Brazil. In the first step, samples of only two animals, one with yellow and one black pelage, were evaluated for skin thickness, cell quantification and distribution, percentage of collagen matrix, proliferative activity and tissue viability after culture. For the second step, fragments were cryopreserved by SF, DVC or SSV, and compared to non-cryopreserved fragments (control) for skin thickness, number of cells, percentage of collagen matrix, and tissue proliferative activity. Moreover, cells resulting from the cultured fragments were evaluated for morphology, adhesion, confluence, viability, proliferative and metabolic activity. Thus, in the first stage, the histomorphometric study showed a total skin thickness of 273.2 m and 274.6 m for jaguars of yellow and black pelage, respectively. Likewise, melanocytes and fibroblasts for yellow jaguar were 9.3 e 23.0 and to black jaguar were of 11.3 e 26.8, respectively. A percentage of collagen matrix of 67.0% e 49.0% was observed for jaguars of yellow and black pelage, respectively. Additionally, both animals had a cell proliferative activity ranging from 1.201.30 and all the fragments were able to promote cell detachment, reaching the subconfluence between 10 and 15 days. In the second step, all the cryopreserved fragments, regardless of the technique employed, showed a reduction in the thickness of the dermis and skin (P < 0.05). Although a collagen matrix similar to the control group was observed only for the fragments derived from the SF and SSV groups, all techniques maintained the number of fibroblasts (P > 0.05). Additionally, DVC and SSV maintained tissue proliferative activity after warming. After culture, only SF and SSV were efficient for the recovery of somatic cells, according to most of the evaluated parameters. In conclusion, the apical ear skin of the yellow and black jaguar has some variations relative to other mammals, regarding thickness, collagen matrix density, and number of melanocytes and fibroblasts. Nevertheless, the pattern of cell growth was similar to other wild felids. Moreover, SSV was the most efficient technique for jaguar skin cryopreservation when compared to DVC and SF. These results will contribute to the formation of crybanks of this species, directing the adequate cryopreservation of somatic samples for applications in regenerative medicine and assisted reproduction technologies.