Transferrina como marcador de maturação pulmonar em cordeiros nascidos a termo ou prematuros / Transferrin as a marker of pulmonary maturation in lambs born at term or premature

O objetivo do estudo foi procurar proteínas de fase aguda que possam indicar sinais de maturação no neonato prematuro, por meio da quantificação sérica delas. Identificou-se a imunoglobulina A, a ceruloplasmina, a haptoglobina, a glicoproteína ácida, a transferrina, a albumina e as imunoglobulinas G de cadeias leve e pesada, pela comparação do perfil dos proteinogramas de cordeiros nascidos a termo com os prematuros submetidos a diferentes protocolos terapêuticos, a fim de estimular a atividade respiratória. Constituíram-se seis grupos: PN (n= 9): nascidos de parto normal; CN (n= 7): nascidos de cesariana em tempo normal de gestação; CP (n= 6): nascidos de cesariana prematura sem nenhum tipo de tratamento; DEX (n= 9): prematuros cujas mães receberam dexametasona pré-parto; SURF (n= 6): prematuros tratados com surfactante; e DEXSURF (n= 6): prematuros tratados com surfactante cujas mães receberam dexametasona pré-parto. As avaliações foram realizadas nos momentos imediatamente após o nascimento (M0), após 24 (M24) e após 48 horas (M48). As amostras foram processadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A albumina, as imunoglobulinas e a proteína total dos cordeiros tiveram elevação após a ingestão de colostro. Maiores valores séricos de transferrina são referentes a maior período gestacional, podendo essa proteína ser utilizada como marcador de maturação neonatal.(AU)

The aim of this study was to search for acute phase proteins that could indicate signs of maturation in the premature neonate by quantifying them in serum. Immunoglobulin A, ceruloplasmin, haptoglobin, acid glycoprotein, tranferrin, albumin, light and heavy chain immunoglobulin G were quantified, comparing the profile of proteinograms from term to preterm lambs submitted to different protocols that stimulate respiratory activity. Six groups were used: PN (n= 9): born from normal birth; CN (n= 7): born from caesarean section at normal time of gestation; CP (n= 6): born from premature cesarean without any type of treatment; DEX (n= 9) preterm whose mothers received prepartum dexamethasone; SURF (n= 6) preterm treated with surfactant; DEXSURF (n= 6): preterm treated with surfactant whose mothers received prepartum dexamethasone. The evaluations were performed immediately after birth (M 0), after 24 and 48 hours (M 24 and M 48). Samples were processed with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Albumin, immunoglobulins, and serum total protein of the lambs were elevated, after colostrum ingestion. Higher serum transferrin values refer to a longer gestational period, and this protein may be used as a marker of neonatal maturation.(AU)

Transferrina como marcador de maturação pulmonar em cordeiros nascidos a termo ou prematuros / Transferrin as a marker of pulmonary maturation in lambs born at term or premature

O objetivo do estudo foi procurar proteínas de fase aguda que possam indicar sinais de maturação no neonato prematuro, por meio da quantificação sérica delas. Identificou-se a imunoglobulina A, a ceruloplasmina, a haptoglobina, a glicoproteína ácida, a transferrina, a albumina e as imunoglobulinas G de cadeias leve e pesada, pela comparação do perfil dos proteinogramas de cordeiros nascidos a termo com os prematuros submetidos a diferentes protocolos terapêuticos, a fim de estimular a atividade respiratória. Constituíram-se seis grupos: PN (n= 9): nascidos de parto normal; CN (n= 7): nascidos de cesariana em tempo normal de gestação; CP (n= 6): nascidos de cesariana prematura sem nenhum tipo de tratamento; DEX (n= 9): prematuros cujas mães receberam dexametasona pré-parto; SURF (n= 6): prematuros tratados com surfactante; e DEXSURF (n= 6): prematuros tratados com surfactante cujas mães receberam dexametasona pré-parto. As avaliações foram realizadas nos momentos imediatamente após o nascimento (M0), após 24 (M24) e após 48 horas (M48). As amostras foram processadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A albumina, as imunoglobulinas e a proteína total dos cordeiros tiveram elevação após a ingestão de colostro. Maiores valores séricos de transferrina são referentes a maior período gestacional, podendo essa proteína ser utilizada como marcador de maturação neonatal.(AU)

The aim of this study was to search for acute phase proteins that could indicate signs of maturation in the premature neonate by quantifying them in serum. Immunoglobulin A, ceruloplasmin, haptoglobin, acid glycoprotein, tranferrin, albumin, light and heavy chain immunoglobulin G were quantified, comparing the profile of proteinograms from term to preterm lambs submitted to different protocols that stimulate respiratory activity. Six groups were used: PN (n= 9): born from normal birth; CN (n= 7): born from caesarean section at normal time of gestation; CP (n= 6): born from premature cesarean without any type of treatment; DEX (n= 9) preterm whose mothers received prepartum dexamethasone; SURF (n= 6) preterm treated with surfactant; DEXSURF (n= 6): preterm treated with surfactant whose mothers received prepartum dexamethasone. The evaluations were performed immediately after birth (M 0), after 24 and 48 hours (M 24 and M 48). Samples were processed with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Albumin, immunoglobulins, and serum total protein of the lambs were elevated, after colostrum ingestion. Higher serum transferrin values refer to a longer gestational period, and this protein may be used as a marker of neonatal maturation.(AU)

Structural and physical-chemical analyses of sulfated polysaccharidesfrom the sea lettuce Ulva lactuca and their effects on thrombin generation / Análises estrutural e físico-química de polissacarídeos sulfatados da alface do mar Ulva lactuca e seus efeitos sobre geração de trombina

Ulva lactuca (Chlorophyceae) has biotechnologically-important sulfated-polysaccharides (Ul-SPs), but their potentials on thrombin generation (TG) are unknown. This study analyzed the structural and physicalchemical features of the Ul-SPs as modulators of TG. Proteolytic digestion yielded (13.13%) extract containing sulfate (20.43%) and total sugars (65.72%), besides ulvan consisting of rhamnose, xylose, glucose, glucuronic acid and α-/β-types glycosidic linkages as characterized by one-/two-dimensions nuclear magnetic resonance (NMR) experiments. Fractionation of the Ul-SPs by DEAE-cellulose chromatography yielded Ul-SP1 and Ul-SP2 (0.50 and 0.75 M NaCl, respectively) showing sulfation (15.72-18.04%) and total sugars (59.73-60.58%) consistent with the charge density pattern by combination of agarose/polyacrylamide gel eletrophoresis using sequential staining with toluidine blue and stains-all, although with slight differences in their sizes (40 and >100 kDa, respectively). By both activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT) tests, anticoagulation of the fractions was virtually detected by APTT (0.39 and 0.43 IU, respectively) against heparin (193 IU). Fractions acted differently on both intrinsic/extrinsic pathways in TG using 60-fold diluted human plasma, with 50% efficacies up to 8.3 μg, whereas at high concentrations suggested intrinsic hypercoagulability since heparin abolished both systems at low amounts. Ul-SPs block TG, but predicting thrombosis in increasing doses.

Clorofícea Ulva lactuca possui polissacarídeos sulfatados (Ul-PSs) importantes biotecnologicamente, porém são desconhecidos seus potenciais sobre geração de trombina (GT). Analisaram-se as características estruturais e físico-químicas dos Ul-PSs como moduladores de GT. Digestão proteolítica rendeu (13,13%) extrato contendo sulfato (20,43%) e açúcares totais (65,72%), além de ulvana, como caracterizada por experimentos de ressonância magnética nuclear uni-/bi-dimensionais, consistindo de ramnose, xilose, glucose, ácido glucurônico e ligações glicosídicas tipos-α/-β. Fracionamento dos Ul-PSs por cromatografia de DEAE-celulose rendeu Ul-PS1 e Ul-PS2 (0,50 e 0,75 M de NaCl, respectivamente) mostrando sulfatação (15,72-18,04%) e açúcares totais (59,73- 60,58%) consistentes com o grau de densidade de carga por combinação de eletroforese em gel de agarose/poliacrilamida usando coramento sequencial com azul de toluidina e "stains-all", embora com diferenças quanto aos seus tamanhos (40 e >100 kDa, respectivamente). Por ambos os testes do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e do tempo de protrombina, anticoagulação das frações foi detectada virtualmente pelo TTPA (0,39 e 0,43 UI, respectivamente) frente heparina (193 UI). Frações atuaram diferentemente sobre ambas as vias intrínsica/extrínsica na GT usando plasma humano diluído 60 vezes, com eficácias de 50% até 8,3 μg, enquanto em concentrações maiores sugeriram hipercoagulabilidade intrínsica visto que heparina aboliu ambos os sistemas em quantidades baixas. Ul-PSs bloqueiam GT, porém prevendo trombose em doses crescentes.

Structural and physical-chemical analyses of sulfated polysaccharidesfrom the sea lettuce Ulva lactuca and their effects on thrombin generation / Análises estrutural e físico-química de polissacarídeos sulfatados da alface do mar Ulva lactuca e seus efeitos sobre geração de trombina

Ulva lactuca (Chlorophyceae) has biotechnologically-important sulfated-polysaccharides (Ul-SPs), but their potentials on thrombin generation (TG) are unknown. This study analyzed the structural and physicalchemical features of the Ul-SPs as modulators of TG. Proteolytic digestion yielded (13.13%) extract containing sulfate (20.43%) and total sugars (65.72%), besides ulvan consisting of rhamnose, xylose, glucose, glucuronic acid and α-/β-types glycosidic linkages as characterized by one-/two-dimensions nuclear magnetic resonance (NMR) experiments. Fractionation of the Ul-SPs by DEAE-cellulose chromatography yielded Ul-SP1 and Ul-SP2 (0.50 and 0.75 M NaCl, respectively) showing sulfation (15.72-18.04%) and total sugars (59.73-60.58%) consistent with the charge density pattern by combination of agarose/polyacrylamide gel eletrophoresis using sequential staining with toluidine blue and stains-all, although with slight differences in their sizes (40 and >100 kDa, respectively). By both activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT) tests, anticoagulation of the fractions was virtually detected by APTT (0.39 and 0.43 IU, respectively) against heparin (193 IU). Fractions acted differently on both intrinsic/extrinsic pathways in TG using 60-fold diluted human plasma, with 50% efficacies up to 8.3 μg, whereas at high concentrations suggested intrinsic hypercoagulability since heparin abolished both systems at low amounts. Ul-SPs block TG, but predicting thrombosis in increasing doses.(AU)

Clorofícea Ulva lactuca possui polissacarídeos sulfatados (Ul-PSs) importantes biotecnologicamente, porém são desconhecidos seus potenciais sobre geração de trombina (GT). Analisaram-se as características estruturais e físico-químicas dos Ul-PSs como moduladores de GT. Digestão proteolítica rendeu (13,13%) extrato contendo sulfato (20,43%) e açúcares totais (65,72%), além de ulvana, como caracterizada por experimentos de ressonância magnética nuclear uni-/bi-dimensionais, consistindo de ramnose, xilose, glucose, ácido glucurônico e ligações glicosídicas tipos-α/-β. Fracionamento dos Ul-PSs por cromatografia de DEAE-celulose rendeu Ul-PS1 e Ul-PS2 (0,50 e 0,75 M de NaCl, respectivamente) mostrando sulfatação (15,72-18,04%) e açúcares totais (59,73- 60,58%) consistentes com o grau de densidade de carga por combinação de eletroforese em gel de agarose/poliacrilamida usando coramento sequencial com azul de toluidina e "stains-all", embora com diferenças quanto aos seus tamanhos (40 e >100 kDa, respectivamente). Por ambos os testes do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e do tempo de protrombina, anticoagulação das frações foi detectada virtualmente pelo TTPA (0,39 e 0,43 UI, respectivamente) frente heparina (193 UI). Frações atuaram diferentemente sobre ambas as vias intrínsica/extrínsica na GT usando plasma humano diluído 60 vezes, com eficácias de 50% até 8,3 μg, enquanto em concentrações maiores sugeriram hipercoagulabilidade intrínsica visto que heparina aboliu ambos os sistemas em quantidades baixas. Ul-PSs bloqueiam GT, porém prevendo trombose em doses crescentes.(AU)

FATORES CLÍNICOS E LABORATORIAIS DISCRIMINANTES NOS DIFERENTES ESTÁDIOS DA DOENÇA RENAL CRÔNICA EM CÃES

A doença renal crônica (DRC) é uma condição progressiva e irreversível que acomete grande parcela da população de cães. Diante da importância dessa doença, objetivou-se fazer uma análise estatística multivariada de resultados de avaliações clínicas e exames laboratoriais de 142 cães nos diferentes estádios da doença para obtenção de uma nova forma de avaliar esses dados. Os resultados demonstraram alta relação entre a ocorrência de doenças nos dois últimos anos com o início da DRC. Os principais sinais clínicos da doença foram poliúria, polidipsia, vômito e diarreia. Fósforo, ureia e creatinina apresentaram alta correlação positiva. E esses apresentaram alta correlação negativa com o cálcio. Albumina e globulinas apresentaram correlação forte e negativa. Houve correlação forte e negativa entre proteinúria e densidade urinária. A acidose metabólica foi uma alteração importante a partir do estádio IRIS 3. Em um segundo poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) para avaliação das proteínas de fase aguda (PFAs) de 63 cães com DRC em diferentes estádios e diferentes momentos. Com os resultados obtidos concluiu-se que haptoglobina e a PFA com peso molecular de 23kDa são PFAs positivas para DRC, não discriminando os diferentes estádios da doença. A -1 antitripsina tem comportamento de PFA negativa e discrimina o estádio mais grave, IRIS 4, podendo ser utilizada como indicador de prognóstico na DRC em cães. A IgG cadeia pesada é uma PFA positiva, que apresenta elevação gradual e maiores valores em IRIS 3.

Chronic kidney disease (CKD) is a progressive and irreversible disease that affects a large number of dogs. Considering the importance of this disease, it was aimed to perform a multivariate statistical analysis of the results of clinical evaluations and laboratory tests of 142 dogs at different stages of the disease to establish a new way to evaluate these data. The results showed a high relation between the ocurrance of diseases within the last two years and the onset of CKD. The diseases main clinical signs were polyuria, polydipsia, vomiting and diarrhea. Phosphorus, urea and creatinine showed a high positive correlation and they showed a high negative correlation with calcium. Albumin and globulins showed a strong negative correlation. There was a strong negative correlation between proteinuria and urinary density. Metabolic acidosis was an important abnormality present on IRIS 3 stage onwards. Serum proteinograms with polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) were used to evaluate the acute phase proteins (APPs) of 63 dogs with CKD at different stages and at different times. With the results it was concluded that haptoglobin and the APP with molecular weight of 23kDa are positive APPs in CKD, not differentiating between the different stages of the disease. -1 antitripsin behaves as a negative APP and differentiates the most severe stage, IRIS 4, and can be used as an indicator of prognosis in CKD in dogs. The heavy chain IgG is a positive APP, presenting gradual elevation and higher values in IRIS 3.

MUDANÇAS NO ÚTERO DA ÉGUA APÓS A INFUSÃO DE FRAGMENTOS DE CONCEPTOS

A Comunicação materno embrionária equina ainda tem um pobre entendimento. Mudanças histológicas, vasculares e proteicas na prenhez inicial tem sido reportadas. O objetivo do presente trabalho foi determinar mudanças histológicas, vasculares e proteicas, comparando o endométrio e o liquido endometrial de éguas no sétimo dia após ovulação com éguas nas quais no quinto dia após ovulação foram infundidos fragmentos de conceptos de 13 dias. No presente estudo, foram utilizadas 10 éguas sadias e cíclicas, onde uma vez detectado o estro, as éguas foram examinadas diariamente até detectar a ovulação, sendo classificado como o dia 0. Após a ovulação, as éguas foram examinadas por palpação e ultrassonografia modo B e Doppler até o dia 7. Neste primeiro ciclo, liquido uterino e biopsias intrauterinas foram coletas no dia 7 após a ovulação, conformando o grupo Cíclico (n=10). No segundo ciclo, as mesmas éguas foram examinadas diariamente até detectar novamente a ovulação. Aos 5 dias pós-ovulação, fragmentos de conceptos de dia 13, que haviam sido previamente coletados, foram infundidos no útero de cada égua. Liquido uterino e biopsias endometriais foram coletadas no dia 7 pós-ovulação, compondo o grupo Fragmento (n=10). As éguas foram examinadas diariamente por ultrassonografia Power Doppler e Spectral Doppler desde a ovulação até o dia 7, nos dois ciclos. Biopsias foram divididas e armazenadas em solução de glutaraldeído a 2.5% para microscopia eletrônica de varredura e solução de paraformaldeído tamponado a 4% para estudos histológicos. Liquido uterino foi submetido a 2D-PAGE eletroforese, gerando géis que foram analisados e comparados. Os Spots com diferenças (P < 0.01) foram removidos, tripsinizados, liofilizados e submetidos a espectrometria de massa (LC-MS/MS e MALDI-TOF/TOF) e identificação. Observou-se uma diminuição na porcentagem de células ciliadas e planas no grupo Fragmento em relação ao grupo Cíclico. No entanto, células ingurgitadas, secreção superficial e intraglandular, lúmen e diâmetro glandular, diâmetro dos vasos sanguíneos, vascularização endometrial e células imunes foram maiores no grupo Fragmento do que no grupo Cíclico. Mudanças na abundancia das proteínas do líquido uterino foram identificadas por 2D-PAGE. 13 proteínas foram identificas por espectrometria de massa: Albumina, Apolipoproteina A1, Fator de complemento B, Fibrinogênio B, Fibrinogênio G, Hemopexin, IGL, IGHCp, IGHC1, Lipocalina 2, Serpin B1, Serotransferrin e Serotransferrin-semelhante. Mudanças histológicas e proteicas e suas interações sugerem novos achados para um melhor entendimento da comunicação materno-embrionária.

Equine maternal-embryonic communication still has poor understanding. Histological, vascular and protein changes in early pregnancy have been reported. The aim of the present study was to determine histomorphological, vascular and protein changes, comparing endometrium and uterine fluid of mares at 7 th day after ovulation with mares in which at 5 th day after ovulation were infused conceptus fragments of 13 days. In the present study, ten healthy and cyclic mares were used, where once estrus was detected, the mares were examined daily until ovulation was detected, being classified as day 0. After ovulation the mares were examined by palpation and ultrasonography mode B and Doppler since to day 7. In this first cycle, uterine fluid and intrauterine biopsies were collected on day 7 after ovulation, forming the Cyclic group (n = 10). In the second cycle, the same mares were examined daily until ovulation was detected again. At 5 days after ovulation, fragments of concepts from day 13, which had previously been collected, were infused into the uterus of each mare. Uterine fluid and endometrial biopsies were collected on day 7 postovulation, composing the Fragment group (n = 10). The mares were examined daily by Power Doppler ultrasonography and Spectral Doppler from ovulation to day 7, in both cycles. Biopsies were divided and stored in 2.5% glutaraldehyde solution for scanning electron microscopy and 4% buffered paraformaldehyde solution for histological studies. Uterine fluid was subjected to 2D-PAGE electrophoresis, generating gels that were analyzed and compared. Spots with differences (P <0.01) were removed, trypsinized, lyophilized and subjected to mass spectrometry (LCMS/MS and MALDI-TOF / TOF) and identification. A decrease in the percentage of ciliated and flattened cells was observed in Fragment group in relation to the Cyclic group. Nevertheless, protruded cells, superficial and intraglandular secretion, glandular lumen and diameter, blood vessel diameter, endometrial vascularization and immune cells were higher in Fragment group than in Cyclic group. Changes in uterine fluid protein abundance were identified by 2D-PAGE. 13 proteins were identified by mass spectrometry: Albumin, Apolipoprotein A1, Complement Factor B, Fibrinogen B, Fibrinogen G, Hemopexin, IGL, IGHC1, IGHCp, Lipocalin 2, Serpinb1 and Serotransferrin, Like-Serotransferrin. Histological and protein changes and their interactions suggest new findings for a better understanding of maternal-embryonic communication.

Semen parameters and seminal plasma protein and biochemical profiles of dogs with benign prostatic hyperplasia after botulinum toxin type A intraprostatic injection / Parâmetros seminais e perfis bioquímicos e proteicos do plasma seminal de cães com hyperplasia prostática benigna após a administração intra-prostática de toxina botulínica tipo A

This study aimed to determine the effects of different concentrations of botulinum toxin type A (BT-A) on semen parameters, and seminal plasma biochemical and protein profiles of dogs with benign prostatic hyperplasia (BPH). Eighteen sexually intact male dogs with BPH were randomly divided in three groups, and received an intraprostatic injection of saline solution (control group - CG), 250UI (GI) or 500UI (GII) of BT-A under transabdominal ultrasound guidance. Semen was collected at baseline, 2, 4 and 8 weeks after treatment. Semen parameters were determined and seminal plasma pH, total protein (TP), total chlorides (TC), calcium (Ca), potassium (K), and sodium (Na) concentrations were assessed. One-dimensional sodium dodecyl sulfatepolyacrilamide gel eletrophoresis (SDS- PAGE) was performed to determine seminal plasma protein profile. Sperm parameters and seminal plasma pH, TP, TC, Ca and K mean values did not change significantly at any time point and among treated groups (P>0.05). The SDS-PAGE analysis of the pooled fractions identified 31 protein bands with molecular weights ranging from 3.9 to 106.2kDA in all treatment groups during the entire evaluation period. Regardless the used dose, intraprostatic BT-A injection do not alter semen parameters and seminal plasma biochemical and protein profiles of dogs with BPH.(AU)

O objetivo do presente estudo foi determinar a ação de diferentes concentrações de toxina botulínica tipo A (TB-A) sobre os parâmetros seminais, perfis bioquímicos e proteicos do plasma seminal de cães com hiperplasia prostática benigna (HPB). Dezoito cães hígidos, não orquiectomizados com HPB foram divididos em três grupos, os quais foram submetidos à injeção intra-prostática de solução salina (grupo controle - GC), 250UI (GI) ou 500UI (GII) de TB-A. Amostras seminais foram coletadas previamente aos tratamentos e após 2, 4 e 8 semanas. Os parâmetros seminais assim como os valores de pH e concentrações de proteínas totais (TP), cloretos totais (CT), cálcio (Ca), potássio (K), sódio (Na) do plasma seminal foram mensurados após as coletas. O perfil proteico do fluido prostático foi estabelecido por meio de eletroforese SDS-PAGE. Não foram constatadas diferenças significativas quanto aos parâmetros espermáticos e perfil bioquímico do plasma seminal intragrupos e intergrupos (P>0,05). À SDS-PAGE foram identificadas 31 bandas proteicas com pesos moleculares de 3,9 a 106,2kDA, em todos os tratamentos e durante todo o período de avaliação. Dessa forma, concluiu-se que, independentemente da dose utilizada, a injeção intra-prostática de TB-A não altera os parâmetros seminais, assim como os perfis bioquímico e proteico do plasma seminal de cães com HPB.(AU)

PRODUCAO, PURIFICACAO E CARACTERIZACAO DE -galactosidase A PARTIR DE Enterococcus faecium UTILIZANDO LIQUIDO METABOLICO DE MICROALGAS EM MEIO DE CULTURA COMERCIAL

A -galactosidase comumente conhecida como lactase, se destaca como uma das enzimas mais importantes utilizadas no processamento de alimentos. Convencionalmente, sua principal aplicação tem sido a hidrólise de lactose em produtos lácteos. Uma de suas principais fontes são bactérias ácido láticas, tais como Enterococcus faecium, conhecida pela capacidade de crescer em diferentes tipos de meios de cultura. No entanto, a produção em larga escala desse produto gera altos custos de meio de cultivo, levando a busca de alternativas para a substituição total ou parcial dele. O sobrenadante de microrganismos fotossintetizantes pode ser uma opção devido a quantidade de vitaminas, açúcares e proteinas presentes no meio que podem ser reaproveitados para o crescimento do microrganismo e produção de bioativos. O objetivo deste estudo foi avaliar a produção, purificação e caracterização da -galactosidase a partir de E. faecium usando sobrenadante de cultivo de microalgas em meio de cultura comercial. Inicialmente, foi realizado uma seleção do melhor meio alternativo utilizando sobrenadante de três microalgas (Chlorella vulgaris, Dunaliella tertiolecta e Scenedesmus sp) em diferentes concentrações combinado ao meio comercial, em seguida o melhor meio foi submetido ao planejamento experimental com análise de superfície de resposta com o intuito de otimizar as condições da produção da enzima, através das seguintes variáveis: pH, temperatura, tempo de cultivo e concentração de lactose. Os resultados mostraram que o meio contendo sobrenadante de C.vulgaris foi o melhor na produção da enzima e as variáveis pH, temperatura e concentração de lactose influenciaram significativamente na produção de -galactosidade. Sendo a maior atividade encontrada 30,83 U/ml pelas variáveis: pH 8, 5% de lactose e temperatura de 31°C. A -galactosidase foi purificada utilizando cromatografia de troca iônica e sua massa molecular foi determinada por eletroforese SDS-PAGE. O fator de purificação da enzima encontrado foi de 3,05 com rendimento de 7,02%. A enzima purificada foi então, caracterizada visando sua aplicação industrial sendo sua atividade máxima a 40°C e pH 7,0. Quando testada em estabilidade, a enzima manteve-se estável por 45 min a 30°C em pH ótimo. Estes resultados apontam que a -galactosidade de E. faecium mostrou potencial aplicação industrial a partir da produção por resíduo de baixo custo.

-galactosidase commonly known as lactase, stands out as one of the most important enzymes used in food processing. Conventionally, its main application has been the hydrolysis of lactose in dairy products. One of its main sources are lactic acid bacteria, such as Enterococcus faecium, known for its ability to grow in different types of culture media. However, a large-scale production of these product generates high culture medium costs, leading to the search for alternatives for a total or partial replacement of that. The metabolic liquid of photosynthetic microorganisms can be an option due to the amount of vitamins, sugars and proteins present in the medium, which can be reused for the microorganism growth and bioactive production. The aim of this work was avaluate the production, purification and characterization of - galactosidase from E.faecium using culture supernatant of the microalgae in commercial culture medium. Initially, a selection of the best alternative medium was performed using three microalgae supernatant (Chlorella vulgaris, Dunaliella tertiolecta and Scenedesmus sp) with different concentrations in commercial medium, then the best medium was submitted to the experimental design with response surface analysis aiming of optimizing the production conditions of the enzyme, through the following variables: pH, temperature, culture time and lactose concentration. The results showed that the medium containing C.vulgaris supernatant was the best in the production of the enzyme. The higher - galactosidase activity was 30.83 U/ml with variables pH 8, 5% lactose concentration and temperature of 31°C. -galactosidase was purified using ion exchange chromatography and molecular weigth was determinated by SDS- PAGE eletrophoresis. The purified fold was 3,05 with 7,02% of yield. The purified enzyme was then characterized aiming its industrial uses with maximal activity at 40°C and pH 7.0. When tested for stability, the enzyme keeping active for 45 min at 30 °C and optimum pH. These results indicate that -galactosidase of E.faecium showed potential industrial application from low cost residue.

Perfil proteico do líquido folicular coletado de ovários em diferentes fases do ciclo estral de bovinos / Proteic profile of follicular fluid from ovaries in different phases of bovine estrous cycle

O microambiente do gameta feminino é o líquido folicular e, portanto, as proteínas ali presentes devem interferir na qualidade do oócito. Este experimento foi delineado com o objetivo de verificar o perfil proteico do líquido folicular de folículos em diferentes fases do ciclo estral de bovinos. Para tanto, os líquidos foliculares provenientes de ovários de vacas de abatedouro foram alocados em 5 diferentes fases do ciclo estral, levando em conta a presença ou ausência do corpo lúteo (CL) e sua caracterização morfológica. “Pools” de líquido folicular foram coletados de folículos de 2 a 7 mm de ovários em 5 diferentes fases do ciclo estral (1=CL inicial, hemorrágico; 2=CL em desenvolvimento; 3=CL maduro; 4=CL em regressão e 5=ausência de CL). O perfil proteico foi avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida e determinado em porcentagens nas amostras de cada fase. Os polipeptídeos de 35, 32, 30 e 18 KDa variaram consideravelmente nas amostras. O polipeptídeo de mesmo peso molecular que o IGFBP-2 está mais presente nas amostras de líquido folicular ao final do ciclo estral. Maior número de polipeptídeos foi observado em folículos antrais pequenos de ovários em que o CL está em regressão.

The female gamete’s microenvironment is the follicular fluid. The proteins in the follicular fluid must interfere in the oocyte quality. The objective of this study was to verify the protein profile in the follicular fluid of different phases of bovine estrous cycle. The follicular fluid was taken from follicles of bovine ovaries obtained at slaughterhouse. The ovaries were classified into five different phases of estrous cycle, according to presence or absence of corpus luteum (CL) and the morphologic characteristics. Pools of follicular fluid were collected from follicles ranging from 2 to 7mm in diameter from ovaries in five different phases of estrous cycle (1=initial CL, hemorrhagic; 2= developing CL; 3= mature CL; 4=regressing CL and 5=absence CL). The protein profile was evaluated by poliacrilamide eletrophoresis and determined by percentages of samples from each phase. The polypeptides with molecular weigh of 35, 32, 30 and 18 KDa changed considerably in samples from different phases of estrous cycle. The polypeptide with the same molecular weight of IGFBP-2 is more observed in samples from follicular fluid in the end of estrous cycle. The most polypeptides were observed in small follicles from ovaries with regressing CL.

Perfil proteico do líquido folicular coletado de ovários em diferentes fases do ciclo estral de bovinos / Proteic profile of follicular fluid from ovaries in different phases of bovine estrous cycle

O microambiente do gameta feminino é o líquido folicular e, portanto, as proteínas ali presentes devem interferir na qualidade do oócito. Este experimento foi delineado com o objetivo de verificar o perfil proteico do líquido folicular de folículos em diferentes fases do ciclo estral de bovinos. Para tanto, os líquidos foliculares provenientes de ovários de vacas de abatedouro foram alocados em 5 diferentes fases do ciclo estral, levando em conta a presença ou ausência do corpo lúteo (CL) e sua caracterização morfológica. “Pools” de líquido folicular foram coletados de folículos de 2 a 7 mm de ovários em 5 diferentes fases do ciclo estral (1=CL inicial, hemorrágico; 2=CL em desenvolvimento; 3=CL maduro; 4=CL em regressão e 5=ausência de CL). O perfil proteico foi avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida e determinado em porcentagens nas amostras de cada fase. Os polipeptídeos de 35, 32, 30 e 18 KDa variaram consideravelmente nas amostras. O polipeptídeo de mesmo peso molecular que o IGFBP-2 está mais presente nas amostras de líquido folicular ao final do ciclo estral. Maior número de polipeptídeos foi observado em folículos antrais pequenos de ovários em que o CL está em regressão.(AU)

The female gametes microenvironment is the follicular fluid. The proteins in the follicular fluid must interfere in the oocyte quality. The objective of this study was to verify the protein profile in the follicular fluid of different phases of bovine estrous cycle. The follicular fluid was taken from follicles of bovine ovaries obtained at slaughterhouse. The ovaries were classified into five different phases of estrous cycle, according to presence or absence of corpus luteum (CL) and the morphologic characteristics. Pools of follicular fluid were collected from follicles ranging from 2 to 7mm in diameter from ovaries in five different phases of estrous cycle (1=initial CL, hemorrhagic; 2= developing CL; 3= mature CL; 4=regressing CL and 5=absence CL). The protein profile was evaluated by poliacrilamide eletrophoresis and determined by percentages of samples from each phase. The polypeptides with molecular weigh of 35, 32, 30 and 18 KDa changed considerably in samples from different phases of estrous cycle. The polypeptide with the same molecular weight of IGFBP-2 is more observed in samples from follicular fluid in the end of estrous cycle. The most polypeptides were observed in small follicles from ovaries with regressing CL.(AU)

Perfil genotípico de Staphylococcus aureus e variáveis zootécnicas e climáticas associadas à mastite em vacas mestiças.

No presente estudo foram realizados três trabalhos em dois rebanhos de vacas mestiças (½ Holandês-Zebu e ¾ Holandês Zebu) que foram divididos em capítulos intitulados: Associação entre dados climáticos e zootécnicos com presença de novas infecções intramamárias em vacas mestiças (Capítulo 1); Dados climáticos e zootécnicos associados à ocorrência e etiologia da mastite em vacas ½ Holandês-Zebu (Capítulo 2); Genótipos de Staphylococcus aureus isolados de vacas com infecções intramamárias subclínicas transientes e persistentes e clínicas em dois rebanhos mestiços brasileiros (Capítulo 3). O objetivo do primeiro capítulo foi identificar variáveis zootécnicas e climáticas associadas com a presença de novas de infecções intramamárias em vacas mestiças ½ HZ e ¾ HZ. As variáveis ordem de parto, relação gordura e proteína (G/P), temperatura máxima e umidade relativa do mês da coleta foram significativamente associadas à novas infecções intramamárias, enquanto produção de leite demonstrou ser fator de proteção no rebanho de vacas ½ HZ. No rebanho de vacas ¾ HZ foi considerado como fator de risco, a variável relação G/P, diferentemente da variável ordem de parto que demonstrou ser um fator de proteção. Os patógenos mais frequentemente isolados nos dois rebanhos foram Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase-negativo e o Corynebacterium sp. No segundo capítulo foram identificadas as variáveis zootécnicas e climáticas associadas com a presença dos patógenos causadores de mastite e com a alta celularidade no leite de vacas mestiças ½ HZ. O resultado deste estudo demonstrou que as variáveis ordem de parto, relação gordura e proteína, temperatura máxima e umidade relativa do mês da coleta são fatores de risco em relação à alta CCS, e as variáveis nitrogênio ureico do leite, produção de leite e precipitação do mês da coleta, fatores de proteção. Em relação à presença de patógenos, ordem de parto, temperatura máxima, índice temperatura e umidade e umidade relativa do mês foram considerados fatores de risco e temperatura mínima do mês foi fator de proteção. No terceiro capítulo, os genótipos de 124 amostras de S. aureus provenientes de vacas ½ e ¾ HZ com mastite subclínica persistente e transiente, de vacas que apresentaram mastite subclínica e clínica por S. aureus e de vacas que apresentaram mastite subclínica causada por outros patógenos e clínica por S. aureus foram avaliados por meio da técnica de Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE). O resultado do estudo demonstrou que a maioria dos casos de mastite bovina nos rebanhos deve-se a ocorrência de cinco pulsotipos predominantes (A, G, I, K e B) e três subtipos A1, G2 e A9. A identificação dos fatores que favorecem a ocorrência da mastite, assim como a determinação epidemiológica de S. aureus permitem implementar medidas que sejam efetivas no controle da mastite.

In the present study three studies in two dairy herds of crossbred cows (Holstein-Zebu ½ and ¾ Holstein-Zebu) were performed and divided into chapters entitled: Association between climate and zootecnical data with the presence of new intramammary infections in crossbred cows (chapter 1); Climate and zootechnical data associated with the occurrence and etiology of mastitis in ½ Holstein-Zebu cows (Chapter 2) and Staphylococcus aureus genotypes isolated from cows with transient and persistent subclinical and clinical intramammary infections in two Brazilian crossbred dairy herds (Chapter 3). The aim of the first chapter was to identify production and climatic variables associated with the presence of new intramammary infections in crossbred cows ½ and ¾ HZ. The variables parity, the fat and protein (F/P), maximum temperature and relative humidity of the month of collection were significantly associated with new intramammary infections, while milk production was shown to be a protection factor in the herd of ½ HZ cows. In the herd of cows ¾ HZ were considered a risk factor to the variable F/P ratio, unlike the variable parity that was shown to be a protective factor. The most frequent pathogens in both herds were S. aureus, coagulase-negative Staphylococcus and Corynebacterium sp. In the second chapter, production and climatic variables associated with the presence of pathogens causing mastitis and high cellularity in milk of crossbred cows (½ HZ) were identified. The result of this study showed that the variables parity, fat and protein ratio, maximum temperature and relative humidity at the month of sampling collection were risk factors in relation to high SCC. Variables such as milk urea nitrogen, milk production and rainfall at the of sampling were protective factors. Regarding the presence of pathogens, the variables parity, maximum temperature, index temperature and humidity and relative humidity of the month were considered as risk factors and as a protection factor the minimum temperature variable at the month of sampling. In the third chapter, we compare Staphylococcus aureus genotypes from transient and persistent subclinical and clinical intramammary infections in two crossbreed dairy herds. A total of 124 samples were evaluated using the technique of Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The majority of bovine mastitis cases were related to five predominant pulse types (A, G, I, K e B) and to three subtypes A1, G2 e A9. The identification of the factors that improve the risks of mastitis and the epidemiological determination of S. aureus allow effective measures to control this disease.

SERUM PROTEIN CONCENTRATION OF SHEEP EXPERIMENTALLY POISONED BY Ipomoea asarifolia / Proteinograma sérico de ovinos intoxicados experimentalmente por salsa

In order to evaluate the serum protein concentration of sheep experimentally poisoned by Ipomoea asarifolia, four groups of five animals received diet with inclusion of 25% (G1), 50% (G2), 75% (G3) and 100% (G4) of the plant replacing to Pennisetum purpureum. Blood samples for serum protein concentration evaluation were collected at seven moments (M): before of the I. asarifolia supply (M1), and five (M2), ten (M3), 15 (M4), 20 (M5), 25 (M6) and 30 (M7) days after I. asarifolia supply. The serum concentration of total protein (TP) was measured through spectrophotometry and the protein fractions by means of eletrophoresis in poliacrylamide (SDS-PAGE). Twenty-nine to 31 proteins were detected by densitometric tracing, with molecular weights varying from 19,160 to 250,000 Dáltons (Da). Reduction of the transferrin concentration and increase of acid ?1-glycoprotein level were verified in sheep that ingested 75% and 100% of the plant, immediately before dying. Also, reduction of concentration of IgG heavy chain was evident in M3 and M4, in G3 animals, as well as the level IgG light chain in M2, M3 and M4 of this group, suggesting interference in the immune function in poisoned sheep, especially in those with higher level of the plant on the diet. It is inferred that these proteins can be utilized as auxiliary indicators to diagnose intoxication by I. asarifolia.KEYWORDS: Ipomoea asa

Para avaliar a concentração sérica de proteínas de ovinos experimentalmente intoxicados por Ipomoea asarifolia, quatro grupos de cinco animais receberam dieta com inclusão de 25% (G1), 50% (G2), 75% (G3) e 100% (G4) da planta em substituição ao Pennisetum purpureum. Amostras de sangue para proteinograma foram colhidas em sete momentos (M): antes do início do fornecimento de I. asarifolia (M1), cinco (M2), dez (M3), 15 (M4), 20 (M5), 25 (M6) e 30 (M7) dias após o início do tratamento. A concentração sérica de proteína total (PT) foi obtida por meio de espectrofotometria e as frações protéicas mediante eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Detectou-se 29 a 31 proteínas no traçado densitométrico, com pesos moleculares variando de 19.160 a 250.000 Dáltons (Da). Notou-se redução do teor de transferrina e aumento de ?1-glicoproteína ácida em ovinos que ingeriram 75% e 100% da planta, imediatamente antes de morrerem. Também se constatou diminuição dos teores de IgG de cadeia pesada em M3 e M4 do G3, bem como de IgG de cadeia leve em M2, M3 e M4 desse mesmo grupo, sugerindo interferência na resposta imune dos ovinos intoxicados, especialmente naqueles com maior percentual de inclusão da planta na dieta. Concluiu-se que essas proteínas podem ser utilizadas como indicadores auxiliares no diagnóstico de intoxicação por I. asarifolia.PALAVRAS-CHAVE: Ipomoea asarifolia; ovinos;

Proteinograma sérico de cordeiros nascidos a termo ou prematuros

Ao final da gestação o neonato deve estar preparado, por meio de modificações funcionais e estruturais de órgãos e sistemas para dar início à vida extra-uterina. Os animais prematuros nascem antes deste processo estar completo, apresentando falhas na maturação. O objetivo deste estudo foi tenta r identificar por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida em dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) proteínas de fase aguda, dentre elas, albumina, ceruloplasmina, transferrina, haptoglobina, glicoproteína ácida e imunoglobulinas A e G, que possam indicar a maturação no neonato prematuro. Os cordeiros foram divididos em seis grupos experimentais (parto normal, cesárea a termo, cesárea prematura, cesárea prematura com administração pré-parto materna de dexametasona, cesárea com administração de surfactante nos prematuros e cesárea prematura com administração pré-parto materna de dexametasona e surfactante ao neonato). Os resultados indicaram que após a administração de colostro, independente do tratamento, os valores séricos de proteína total e imunoglobulinas G aumentaram, indicando que há transferência de imunidade passiva através do trato gastrointestinal. A transferrina tem seus teores superiores em animais com idade gestacional superior, demonstrando potencial para ser utilizado como marcador de maturação neonatal.

At the end of gestation the neonate should be prepared, with functional and structural modifications of organs and systems to initiate extrauterine life. Premature animals are born before this process is complete, presenting maturation failures. The aim of this study was to identify an acute phase protein, such as albumin, ceruloplasmin, transferrin, haptoglobin, acid glycoprotein and immunoglobulins A and G, that demonstrates that different treatments indicate a maturation in the premature neonate using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis technique (SDS-PAGE). The lambs were divided into six experimental groups (normal birth, full-term cesarean section at normal time of gestation, premature cesarean section, premature cesarean section whose mothers received prepartum dexamethasone, cesarean section giving surfactante to the prematures and premature cesarean giving prepartum dexamethasone to the mothers and surfactant to the neonate). The results indicated that after administration of colostrum, regardless of treatment, total serum protein and immunoglobulins increased, showing the transfer of passive immunity through the gastrointestinal tract. Transferrin has higher levels in animals with higher gestational age, demonstrating potential as a marker of neonatal maturation.

INFLUÊNCIA DO USO DE ANTIMICROBIANOS NA RAÇÃO DE SUÍNOS CRIADOS COM DIFERENTES NÍVEIS DE MEDICAÇÃO SOBRE RESISTÊNCIA DE Escherichia coli E PERFIL DA MICROBIOTA INTESTINAL

Bactérias resistentes aos antimicrobianos representam um risco, não apenas para a saúde animal, como também para a saúde pública. As bactérias comensais, como Escherichia coli, são consideradas um bom indicador do padrão de resistência de uma população microbiana, uma vez que, por residirem no intestino, estão submetidas à constante pressão de seleção resultante da administração de antimicrobianos, podendo sobreviver ao processo de abate de suínos e chegar aos consumidores. Neste sentido, os objetivos deste estudo foram: i. avaliar a frequência de resistência antimicrobiana fenotípica e a presença de grupos clonais em E. coli isoladas de fezes e carcaças suínas; ii. determinar o perfil fenotípico e genotípico de resistência aos antimicrobianos em isolados multirresistentes de E. coli provenientes de carcaças de suínos e identificar grupos clonais presentes em carcaças suínas; iii. comparar o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana em isolados de E. coli de fezes de suínos submetidos a diferentes protocolos de administração de antimicrobianos via ração; iv. descrever o perfil da microbiota intestinal de suínos submetidos a diferentes protocolos de uso de antimicrobianos via ração. Para isto, três etapas distintas foram realizadas. Na etapa 1, dois ciclos de amostragem foram conduzidos em três matadouros-frigoríficos (A, B, C) de suínos, sendo coletado fezes depositadas no piso da pocilga de espera e suabes de superfície de carcaças na etapa de pré-resfriamento. Escherichia coli foi isolada dessas duas origens e avaliada quanto à resistência aos antimicrobianos. Além disso, 92 isolados de ambas as origens apresentando perfil de multirresistência foram submetidos à análise por Pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE). Para a etapa 2, os isolados multirresistentes provenientes de carcaças foram submetidos a novos testes de sensibilidade antimicrobiana e de acordo com o perfil fenotípico foram pesquisados quanto aos genes de resistências e submetidos à técnica de PFGE. Em relação a etapa 3, quatro grupos de suínos que utilizavam protocolos distintos de uso de antimicrobianos via ração foram acompanhados em todas as fases zootécnicas e avaliados quanto a frequência de resistência antimicrobiana de E. coli e perfil bacteriano da microbiota intestinal através do sequenciamento de duas regiões do gene 16S rRNA. Entre os 674 isolados de E. coli da etapa 1 apenas 7,4% foram susceptíveis a todos os antimicrobianos testados. As maiores frequências de resistência foram identificadas frente à tetraciclina (85,9%), ampicilina (73,0%), sulfonamida (70,0%), florfenicol (65,0%) e ácido nalidíxico (58,9%). Do total de isolados de E. coli, 79,5% (536/674) foram classificados como multirresistentes. A análise de macro restrição (PFGE), conduzida em isolados apresentando perfis de multirresistência mais prevalentes, demonstrou que isolados de fezes e carcaças eram na maioria dos casos relacionados (similaridade 70%) nos três matadouros-frigoríficos. Dos isolados multirresistentes provenientes das carcaças, dez novos antimicrobianos foram testados; em relação a esses, as maiores frequências de resistências foram à cloranfenicol (86,4%), estreptomicina (65,8%) e trimetoprima (57%). Cada matadouro-frigorífico apresentou um perfil distinto de multirresistência predominante. Nos isolados submetidos à pesquisa de genes de resistência, foram detectados por ordem de frequência: strA (83,3%); aac(3)IVa (70%); tetB (70%); sul2 (60%); floR (56,6%); tetA (50%); aph(3)Ia (43,3%); sul3 (26,6%) e blaTEM (10%); três grupos de isolados relacionados (similaridade 70%) foram encontrados na análise por PFGE. Em relação à etapa 3, os grupos com diferentes protocolos de uso antimicrobianos via ração não apresentaram alteração significativa no perfil de microbiota intestinal e contagem de E. coli; entretanto, os perfis fenotípicos de resistência antimicrobiana foram distintos entre os grupos. O grupo que recebia protocolo com uso alternado de antimicrobianos de seis classes distintas apresentou maior frequência de resistência e multirresistência. De acordo com os resultados encontrados protocolos de uso continuado de antimicrobianos na criação de suínos gera uma pressão seletiva, resultando em cepas multirresistentes que podem sofrer propagação no ambiente e na cadeia de produção de alimentos. Considerando os perfis de resistência encontrados em E. coli originada de carcaças suínas e fezes, em todas as etapas deste trabalho, observou-se que essas cepas são selecionadas na granja pelo uso de antimicrobianos, chegaram ao pré-abate, disseminaram-se na linha de abate e contaminar a carcaça. O uso prudente de antimicrobianos é amplamente citado em toda a literatura científica veterinária e, conforme nossos resultados demonstraram, deve ser incluído entre as metas da suinocultura brasileira.

Bacteria resistant to antimicrobials present a hazard not only for animal health but public health too. Commensal bacteria, such as Escherichia coli, are considered a good indicator of microbial population resistance, because they live in gut and are subjected to constant pressure resulting selection of the administration of antibiotics, may survive in slaughtering process and get consumers. In this sense, the aims of this study were: i. to evaluate the frequency of antimicrobial phenotype resistance and presence of clonal groups for E. coli isolated from feces and pig carcasses; ii. to determine phenotypic profile and antimicrobial genotypic resistance in multiresistant E. coli isolated from pig carcasses and identify clonal groups present in pig carcasses; iii. to compare phenotypic profile of antimicrobial resistance in E. coli from swine feces submitted to different antimicrobial in-feed protocols; iv. to describe gut microbiota profile in pigs submitted to different antimicrobial in-feed protocols. For this, three steps were performed. In step 1, two sampling cycles were conducted in three slaughterhouses (A, B, C) of pigs being collected feces deposited in pen floor and pre-chill carcasses. Escherichia coli was isolated from these two sources and evaluated for antimicrobial resistance. In addition, 92 isolates with multidrug resistance profile were analyzed by pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE). In step 2, isolated from carcasses and multiresistant underwent new antimicrobial susceptibility testing and in accordance with the phenotypic profile were screened for the resistance gene and PFGE. In step 3, four groups of pigs used different antimicrobial in-feed protocols were followed in all phases and evaluated frequency of antimicrobial resistance and gut bacterial profile by sequencing two regions of 16S rRNA. Among the 674 E. coli isolates from step 1 just 7.4% were susceptible to all antibiotics. The highest frequencies of resistance were: tetracycline (85.9%), ampicillin (73.0%), sulfonamide (70.0%), florfenicol (65.0%) and nalidixic acid (58.9%). Of total E. coli isolates, 79.5% (536/674) were multidrug. Macrorestriction analysis (PFGE), conducted in isolates with profiles more prevalent multidrug resistance showed that isolated from feces and carcasses were in most cases related (70% similarity) in the three slaughterhouses. The multiresistant isolates from carcasses, ten new antibiotics were tested, with greatest frequency in add antimicrobial resistance were: chloramphenicol (86.4%), streptomycin (65.8%) and trimethoprim (57%). Each slaughterhouse showed a distinct profile of resistance and number of resistance markers. Isolates submitted to research genes were detected in order of frequency: strA (83.3%); aac(3)IV (70%); tetB (70%); sul2 (60%); floR (56.6%); tetA (50%); aph(3)Ia (43.3%); sul3 (26.6%) and blaTEM (10%); and three related groups (similarity 70%) were formed in PFGE. For step 3, groups with different antimicrobial in-feed had no significant change in gut microbiota profile and E. coli counts; however the phenotypic profiles of antimicrobial resistance were different between the groups. The group receiving protocol with alternate use of antimicrobials six different classes showed higher frequency of resistance and multidrug resistance. According to the results, different protocols of antimicrobial in pig farming creates a selective pressure, resulting in multi-drug resistant strains that may contribute to spread environment and in food production chain. Considering the resistance profiles found in E. coli originated from swine carcasses and feces, in all stages of this work, it was observed that these strains were selected for in farm by use of antimicrobials, reached the pre-slaughter, spread in the slaughterhouse and carcasses. The concept of prudent use of antimicrobials is widely quoted in all the veterinary scientific literature and, as our results showed, it should be included among the goals of the Brazilian pig farming.

Contribution and perspectives of the impact of proteomics in study of placentas and embryonic and fetal membranes / Contribuição e perspectivas do impacto da proteômica em estudo de placentas e membranas embrionárias e fetais

Proteomic approaches have revolutionized the analysis of biological samples by allowing the identification of non-characterized protein expression and its role on protein interactions and post-translational modifications during embryonic development or as a consequence of pathological states. This new frontier of knowledge is, nowadays, an essential contribution to the elucidation of biological problems, by providing information that cannot be obtained by other target driven methods. This review highlights the new perspectives of proteomics studies based on bidimensional eletrophoresis (2D-PAGE) associated to mass spectrometry (MS) analytical methods of placenta, embryonic membranes and embryo evaluation, with emphasis on comparisons between normal and diseased tissues consequence of reproductive biotechnology manipulation.

Abordagens proteômicas revolucionaram a análise de amostras biológicas por permitir a identificação de padrões ainda não caracterizados de expressão de proteínas e/ou suas interações e modificações pós-traducionais em diferentes tecidos, como a placenta ou em embriões e fetos em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta nova fronteira de conhecimento se constitui atualmente numa ferramenta fundamental para a elucidação de problemas biológicos, por fornecer informações que não podem ser obtidas por métodos mais focalizados, ou com alvos específicos. Essa revisão salienta as novas perspectivas geradas pela contribuição da proteômica baseada na eletroforese bidimensional (2D-PAGE) associada à espectrometria de massas (MS) para o estudo da placenta, das membranas embrionárias e do embrião, com ênfase nas comparações entre condições normais e aqueles provenientes de estados patológicos ou conseqüentes ao uso de biotecnologias reprodutivas.

Acute Phase Proteins in Canine Lymphoma During Antineoplastic Chemotherapy

The lymphoma is the main hematopoietic tumor in dogs and it is characterized by the proliferation of cells from lymphoid tissue, histiocytes and its precursors. Animals with lymphoma often show changes in biochemical and hematological parameters such as non-regenerative normochromic normocytic anemia, hemolytic anemia, hypocalcaemia and monoclonal gammopathy. The development of tumor can cause alterations in serum concentrations of acute phase proteins (APPs), consequent of hepatocytes stimulus by cytokines of inflammatory action. This study aimed to quantify and qualify APPs in dogs with lymphoma, at diagnosis time and during the time of chemotherapy sessions. After syneresis, centrifugation and fractioning the serum samples of 10 healthy and 10 dogs with lymphomas, the proteins fractions were separated by polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and its concentrations were determined by computer densitometry. Between 18 and 30 proteins were separated by eletrophoresis, with molecular weights ranging from 18 to 245 kDa (kilodaltons). The alpha-1-glicoprotein acid (AGP) and transferrin serum concentration showed significantly higher in dogs with lymphoma, when compared with healthy dogs at diagnosis. The alpha-1-antitripsin (AAT) serum concentrations showed significantly higher in healthy dogs, when compared with dogs with lymphoma at diagnosis. The dogs with lymphoma the albumin did not appear as negative APP. On the other hand, transferrin appeared as positive AAP at diagnosis time and during the chemotherapy sessions. Healthy dogs had AAT serum concentrations significantly higher when compared to dogs with lymphoma at diagnosis. So, in this trial, it is suggested that this protein has been shown as a negative APP in the dogs with lymphoma. These dogs presented significantly higher AGP serum concentrations, in relation to healthy dogs at diagnosis, evidencing this protein APP positive behavior in neoplasm.

Acute Phase Proteins in Canine Lymphoma During Antineoplastic Chemotherapy

The lymphoma is the main hematopoietic tumor in dogs and it is characterized by the proliferation of cells from lymphoid tissue, histiocytes and its precursors. Animals with lymphoma often show changes in biochemical and hematological parameters such as non-regenerative normochromic normocytic anemia, hemolytic anemia, hypocalcaemia and monoclonal gammopathy. The development of tumor can cause alterations in serum concentrations of acute phase proteins (APPs), consequent of hepatocytes stimulus by cytokines of inflammatory action. This study aimed to quantify and qualify APPs in dogs with lymphoma, at diagnosis time and during the time of chemotherapy sessions. After syneresis, centrifugation and fractioning the serum samples of 10 healthy and 10 dogs with lymphomas, the proteins fractions were separated by polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and its concentrations were determined by computer densitometry. Between 18 and 30 proteins were separated by eletrophoresis, with molecular weights ranging from 18 to 245 kDa (kilodaltons). The alpha-1-glicoprotein acid (AGP) and transferrin serum concentration showed significantly higher in dogs with lymphoma, when compared with healthy dogs at diagnosis. The alpha-1-antitripsin (AAT) serum concentrations showed significantly higher in healthy dogs, when compared with dogs with lymphoma at diagnosis. The dogs with lymphoma the albumin did not appear as negative APP. On the other hand, transferrin appeared as positive AAP at diagnosis time and during the chemotherapy sessions. Healthy dogs had AAT serum concentrations significantly higher when compared to dogs with lymphoma at diagnosis. So, in this trial, it is suggested that this protein has been shown as a negative APP in the dogs with lymphoma. These dogs presented significantly higher AGP serum concentrations, in relation to healthy dogs at diagnosis, evidencing this protein APP positive behavior in neoplasm.(AU)

Purification and Partial characterization of manganese peroxidase from Bacillus pumilus AND Paenibacillus sp.

The production of manganese peroxidase (MnP) from Bacillus pumilus and Paenibacillus sp. was studied under absence and presence of the inducers indulin AT, guayacol, veratryl alcohol, lignosulfonic acid and lignosulfonic acid desulfonated. Indulin AT increased the activity of B. pumilus MnP up to 31.66 U/L after 8 h, but no improve was observed for Paenibacillus sp., which reached maximum activity (12.22 U/L) after 20 h. Both MnPs produced by these microorganisms were purified in phenyl sepharose resin and the proteins from crude extracts were eluted in two fractions. However, only the first fraction of each extract exhibited MnP activities. Tests in different pH and temperature values, from pH 5.0 to pH 10.0 and 30 ºC to 60 ºC, respectively, were carried out with the purified MnP. The maximum activity reached for B. pumilus and Paenibacillus sp. MnPs were 4.3 U/L at pH 8.0 and 25 ºC and 11.74 U/L at pH 9.0 and 35 ºC, respectively. The molar masses determined by SDS-PAGE gel eletrophoresis were 25 kDa and 40 kDa, respectively, for the purified enzyme from B. pumilus and Paenibacillus sp.

Perfil eletroforético do proteinograma sérico de eqüinos com obstrução experimental do cólon menor / Eletrophoretic profile of serum proteinogram of equines with small colon experimental obstruction

Avaliaram-se as alterações do proteinograma sérico de eqüinos submetidos à isquemia e reperfusão do cólon menor por distensão intraluminal. Foram utilizados 10 animais submetidos à laparotomia pelo flanco, em posição quadrupedal, para a indução de obstrução no cólon menor durante um período de quatro horas. Cinco animais foram instrumentados, mas sem distensão (grupo controle - G1). Em cinco outros animais, foi realizada isquemia mural por distensão do cólon menor via manguito inflado com 40mmHg (grupo distendido - G2). Foram colhidas amostras de sangue antes da intervenção cirúrgica (M1), com 4 horas da colocação do manguito (M2) e com 3 horas (M3) e 12 horas (M4) de reperfusão. Após centrifugação e fracionamento das amostras, as proteínas de fase aguda foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS-PAGE, e suas concentrações determinadas por densitometria computadorizada. Foram encontradas 19 proteínas no fracionamento eletroforético, com peso molecular variando de 185.000 a 14.000 Daltons (Da). Os pesos moleculares encontrados, correspondentes às proteínas mais conhecidas, foram ceruloplasmina, 130.000 Da; proteína C-reativa, 122.000 Da; transferrina, 85.000 Da; α1-antitripsina, 61.000 Da; haptoglobina, 47.000 Da; e glicoproteína ácida, 40.000 Da. Os resultados mostram que proteínas de fase aguda se alteram após o trauma cirúrgico.(AU)

The changes in the serum proteinogram of equines submitted to ischemia and reperfusion of small colon by intraluminal distension were evaluated. Ten horses were submitted to standing laparotomy to induce a small colon obstruction for four hours. Five animals were instrumented without distention (control group - G1). In another five animals, mural ischemia was promoted placing a latex balloon distended with 40mmHg into the small colon (distended group - G2). Blood samples were collected before the surgical procedures (M1) and 4h after the balloon placement (M2) and 3h (M3) and 12h (M4) after reperfusion. After centrifugation and fractioning of the samples, the acute phase proteins were separated by SDS-PAGE and their concentrations were determined by computer densitometry. Nineteen proteins were separated by eletrophoresis and the molecular weights ranged from 185,000 to 14,000 Dalton (Da). The found molecular weights, related to the most known proteins, were: ceruloplasmin, 130,000 Da; C-reactive protein, 122,000 Da; transferrin, 85,000 Da; α1-antitripsin, 61,000 Da; haptoglobin, 47,000 Da; and acid glycoprotein, 40,000 Da. The results showed that acute phase proteins changed after surgical injury.(AU)

Interleucina 6 e proteinograma sérico de ovinos submetidos à endotoxemia experimental

Objetivando-se avaliar as concentrações séricas de Interleucina 6 (IL-6) e proteinograma de ovinos submetidos à endotoxemia experimental. Dez ovinos (4 anos) foram divididos em dois grupos, Grupo Controle (GC, n=4) inoculados com NaCl 0,9 %, IV e Grupo Tratado (GT, n= 6) inoculados com 400 ng/Kg de LPS de Escheria coli. O exame físico foi realizado, imediatamente antes da inoculação (M0), bem como a coleta de sangue para perfil hematológico e bioquímico, dosagem de IL-6 e proteinograma. As amostras foram coletadas em M0 e após 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48 e 60 horas, de realizada a inoculação. A dosagem de IL-6 foi feita pelo método de ELISA e o proteinograma pelo método de eletroforese em poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), para o perfil hematológico utilizou-se contador de células automático (BCVet- 2800), o perfil bioquímico foi realizado utilizando-se kits comerciais (Labtest®) e por fim, a concentração de glicose foi mensurada por meio de um monitor de glicemia (Breeze 2, Bayer®). Constatou-se um aumento na concentração de IL-6 60 horas pós-inoculação de LPS. O pico febril ocorreu quatro horas pós-indução endotoxêmica. Constatou- se leucopenia com neutropenia e redução na concentração da proteína total, albumina e glicoproteína ácida duas horas após a administração de LPS, acompanhados por uma elevação inicial na concentração de glicose, seguida de redução, seis horas pós-inoculação. Concluiu-se que a dosagem de Interleucina 6 e o proteinograma sérico são métodos de diagnósticos eficientes para detectar e monitorar a progressão e gravidade de processos inflamatórios provenientes de uma endotoxemia induzida experimentalmente em ovinos

Aiming to evaluate serum concentrations of interleukin 6 (IL-6) and proteinogram of sheep undergoing experimental endotoxemia. Ten animals (4 years old) were divided into two groups, Control Group (CG, n= 4) inoculated with NaCl 0,9%, IV and Treated Group (TG, n= 6) inoculated with 400 ng/Kg of LPS from Escheria coli. The physical examination was performed immediately before inoculation (M0), as well as blood collection for hematological and biochemical profiles, dosage of IL-6 and proteinogram. Samples were collected at M0 and after 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48 and 60 hours after of inoculation. The dosage of IL-6 was done by ELISA and the proteinogram by method of eletrophoresis in polyacrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE), for hematological profile was used automatic cell counter (BC-2800Vet), the biochemical profile was performed using commercial kits (Labtest®) and the glucose concentrations was measured using glucose monitor (Breeze2, Bayer®). It was found an increase in the dosage of IL-6 60 hours after LPS injection. The fever peak occurred four hours after induction of endotoxemia. There was leukopenia, with neutropenia and reduction in concentration of total protein, albumin and acid glycoprotein two hours after LPS administration, accompanied by an initial increase in glucose concentrations followed by a reduction six hours post-inoculation. It was conclude that the dosage of IL-6 and the proteinogram are effective diagnostic methods to detect and monitor the progression and severity of inflammatory processes from an experimentallay induced endotoxemia in sheep