Resumo
As avaliações rotineiras do caráter tempo de cozimento em feijão (Phaseolus vulgarisL.) podem ser efetuadas de distintas maneiras resultando em diferentes variáveis. Por vez, a análise estatística univariada não considera as interdependêcias entre as variáveis, podendo omitir importantes informações a respeito dos genótipos. Com isso, o objetivo do trabalhofoi dispor uma proposta alternativa para análise do tempo de cozimento em feijão, permitindo a discriminação entre genótipos. O experimento utilizado para esta abordagem foi conduzido em condições de campo na safra agrícola do ano 2017/18em Lages, Santa Catarina, Brasil. Ostratamentos foram compostos por doze genótipos, sendo quatro genitores, estruturados em dois cruzamentos BAF50 x BAF07 e BAF09 x IPR 88 Uirapuru, com suas gerações F2, F3, F8e F9. O delineamento utilizado foi blocos casualizados, com dois blocos e duas observações em cada unidade experimental. Posteriormente a colheita, a variável resposta tempo de cocção dos grãos de feijão foi mensurada com o cozedor Mattson, sendo considerado o tempo de cocção das 13 hastes iniciais. Na análise multivariada, as variáveis tempo de cocção da segunda (TCH2), décima segunda (TCH12) e décima terceira haste (TCH13) foram utilizadas com base em sua significância pelo método de seleção de variáveis passo a passo (stepwise). A análise de variância multivariada demonstrou diferença entre os genótipos (P<0,05). A partir da matriz de dissimilaridade com as distâncias de Mahalanobis e o dendrograma de agrupamento, foi possível verificaras distâncias dos genótipos derivados dos cruzamentos BAF50 x BAF07 e BAF09 x IPR 88 Uirapuru. Comisso, a análise multivariada possibilitou a discriminação dos genótipos, adicionalmente o cruzamento BAF50 x BAF07 demonstrou maiores estimativas de dissimilaridade nas progênies.(AU)
Routine evaluations of cooking time traitin common bean (Phaseolus vulgarisL.) can be performed in different ways resulting in different variables. At the same time, the univariate statistical analysis does not consider the interdependencies between the variables, and may omit important information regarding the genotypes. With this,the objective of this work was to present an alternative proposal foranalysis of the cooking time in common bean, allowing the discrimination between genotypes. The experiment used for this approach was conducted under field conditions in the 2017/18 agricultural season in Lages, Santa Catarina, Brazil. The treatments consisted of twelve genotypes, (fourparents, structured in two crossings BAF50 x BAF07and BAF09 x IPR 88 Uirapuru, with their generations F2, F3, F8and F9). The design used was randomized blocks, with two blocks and two observations in each experimental unit. After the harvest, the response variable cooking time of thegrains was measuredwith a Mattson cooker, considering the cooking time of the 13 initial stems. In the multivariate analysis, the variables cooking time of the second (TCH2), twelfth (TCH12) and thirteenth stem (TCH13) were used based on their significance by the stepwise variable selection method. Multivariate analysis of variance showed differences between genotypes (P<0.05). From the dissimilarity matrix with the Mahalanobis distances and the clustering dendrogram, itwas possible to verify the distances of the genotypes derived from crosses BAF50 x BAF07 and BAF09 x IPR 88 Uirapuru. With that, the multivariate analysis enabled thegenotypes, additionally the crossing BAF50 x BAF07 showed higher estimates of dissimilarity in the progenies.(AU)
Assuntos
Fito-Hemaglutininas/genética , Melhoramento Vegetal , Análise MultivariadaResumo
Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.(AU)
Assuntos
Animais , Cavalos/virologia , Vírus da Influenza A Subtipo H3N8 , Infecções por Orthomyxoviridae/epidemiologia , Variação Genética , Brasil , Neuraminidase , HemaglutininasResumo
Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)
A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Filogenia , Vírus da Cinomose Canina/genética , Hemaglutininas/genética , BrasilResumo
Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)
A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Vírus da Cinomose Canina/genética , Hemaglutininas/genética , Filogenia , BrasilResumo
O vírus da cinomose canina (CDV) é um dos principais agentes infecciosos de cães domésticos e carnívoros silvestres, causando uma doença infecciosa multissistêmicas de alta mortalidade que acomete animais de diferentes faixas etárias, raças, machos e fêmeas e, tanto vacinados quanto não vacinados. A vacinação é o principal método de controle desta doença, no entanto, estudos vêm mostrando a possível existência de falhas vacinais em decorrência de diferença genética entre estirpes circulantes e estirpes vacinais. Dados referentes à epizootiologia são desconhecidos em Goiânia, poucos estudos comparam métodos diagnósticos em diferentes amostras em uma população de cães sintomáticos e às características moleculares do CDV em Goiás ainda não foram documentados. Este estudo objetivou determinar as características epizootiológicas do CDV, comparar os métodos diagnósticos de imunocromatografia (IC) e RT-PCR para a identificação do agente etiológico em diferentes amostras biológicas [swab conjuntival, sangue, urina, fluido cerebroespinal (FCE) e pool de amostras] e identificar as estirpes do CDV circulantes em cães naturalmente infectados e sintomáticos, no município de Goiânia, GO, Brasil, durante os anos de 2017 e 2020. Dados epizootiológicos foram coletados de 74 cães com sinais clínicos extraneurais e/ou neurais compatíveis com cinomose. Destes cães, 46 (62%) foram positivos por meio do teste de imunocromatografia (31%) ou pela técnica de RT-PCR (53%). Cães machos e fêmeas, de diferentes raças e idades foram acometidos, mas houve predominância em cães sem raça definida, adultos de um a seis anos e não vacinados. No entanto, aproximadamente 10,9% dos cães infectados e sintomáticos eram vacinados. Os sinais extraneurais predominantes foram hiporexia ou anorexia, secreção nasal e/ou ocular, desidratação e hiperqueratose de coxins e trufa. Dentre os sinais clínicos neurais os mais frequentes foram alteração de estado mental, déficit motor e mioclonias. Foi observada letalidade de aproximadamente 89% entre os animais com acometimento neurológico. As amostras de swab conjuntival, urina, pool e FCE tiveram maior frequência de positividade no teste de IC enquanto as amostras de urina e sangue, na RT-PCR. Do total de 149 amostras (sangue, urina e FCE) destinadas ao RT-PCR (gene N), o vírus foi identificado em 64 amostras (42,95%) e foram selecionadas 54 positivas para a RT-PCR seguida por Nested PCR para amplificação parcial do gene hemaglutinina (H). A amplificação parcial do gene H foi realizada e oito amostras foram sequenciadas e caracterizadas por meio da análise filogenética como pertencentes ao genótipo América do Sul 1/ Europa. Foram encontrados diferentes locais de substituição de aminoácidos no fragmento do gene H analisado das sequências identificadas e uma estirpe apresentou a mutação Y549H, típica de animais silvestres. Outros locais do fragmento apresentaram substituições em epítopos (resíduos 367, 376, 379, 381, 386 e 388) que podem interferir com a habilidade da vacina em promover proteção adequada contra a infecção pelo CDV, reduzindo sua efetividade. As estirpes isoladas foram geneticamente distante das estirpes vacinais, pertencentes ao genótipo América do Norte 1, com aproximadamente 10% de diferença nucleotídica. A partir da análise do genótipo América do Sul 1/ Europa, foram definidos dez subgenótipos. Esses achados evidenciam a relevância da infecção de cães por cinomose no Brasil, demonstrando a predominância do genótipo América do Sul 1/ Europa na região central do país e suportam a necessidade da realização de estudos epizootiológicos e de identificação molecular do CDV em outras regiões do país, em decorrência de sua grande extensão geográfica, da variabilidade de espécies animais acometidas, das diferenças moleculares entre as estirpes e da alta taxa de letalidade entre os animais infectados sintomáticos.
The canine distemper virus (CDV) is one of the main infectious agents of domestic dogs and wild carnivores, causing a multisystemic infectious disease with high mortality that affects animals of different age groups, breeds, males and females, and both vaccinated and unvaccinated. Vaccination is the main method of controlling this disease, however, studies have shown the possible existence of vaccine failures due to a genetic difference between circulating strains and vaccine strains. Data regarding epizootiology are unknown in Goiânia, few studies compare diagnostic methods in different samples in a population of symptomatic dogs and the molecular characteristics of CDV in Goiás have not yet been documented. This study aimed to determine the epizootiological characteristics of CDV, compare the diagnostic methods of immunochromatography (IC) and RT-PCR for the identification of the etiological agent in different biological samples [conjunctival swab, blood, urine, cerebrospinal fluid (CSF), and sample pool] and identify the circulating CDV strains in naturally infected and symptomatic dogs in the municipality of Goiânia, GO, Brazil, during 2017 and 2020. Epizootiological data were collected from 74 dogs with extraneural and/or neural clinical signs compatible with distemper. Of these dogs, 46 (62%) were positive using the immunochromatography test (31%) or by the RT-PCR technique (53%). Male and female dogs of different breeds and ages were affected, but there was a predominance in mixed breed dogs, adults aged one to six years and not vaccinated. However, approximately 10.9% of infected and symptomatic dogs were vaccinated. Predominant extraneural signs were hyporexia or anorexia, nasal and/or ocular discharge, dehydration, and nasal and digital hyperkeratosis. Among the neural clinical signs, the most frequent were changes in mental status, motor deficit, and myoclonus. A mortality rate of approximately 89% was observed among animals with neurological involvement. Conjunctival swab, urine, pool, and CSF samples had a higher frequency of positivity in the CI test, while urine and blood samples in RT-PCR. From a total of 149 samples (blood, urine, and FCE) destined for RT-PCR (N gene), the virus was identified in 64 samples (42.95%) and 54 positives were selected for RT-PCR followed by Nested PCR for partial amplification of the hemagglutinin (H) gene. Partial amplification of the H gene was performed and eight samples were sequenced and characterized by phylogenetic analysis as belonging to the South America 1/Europe genotype. Different amino acid substitution sites were found in the analyzed H gene fragment of the identified sequences and one strain presented the Y549H mutation, typical of wild animals. Other fragment sites had epitope substitutions (residues 367, 376, 379, 381, 386, and 388) that may interfere with the vaccine's ability to provide adequate protection against CDV infection, reducing its effectiveness. The isolated strains were genetically distant from the vaccine strains, belonging to the North America 1 genotype, with approximately 10% nucleotide difference. From the analysis of the South America 1/ Europe genotype, ten subgenotypes were defined. These findings highlight the relevance of canine distemper infection in Brazil, demonstrating the predominance of the South America 1/ Europe genotype in the central region of the country and support the need to conduct epizootiological and molecular identification studies of CDV in other regions of the country, due to its large geographic extension, the variability of animal species affected, the molecular differences between the strains and the high lethality rate among symptomatic infected animals.
Resumo
O Morbillivirus canino (CDV) é o agente etiológico da cinomose canina (CC), uma importante doença de cães e carnívoros silvestres caracterizada por alta morbidade e mortalidade. A proteína hemaglutinina (H) presente no envelope possui importante função de adsorção viral e por isso apresenta elevada variabilidade genética em relação aos outros genes do CDV. Por essa razão tem sido utilizada para caracterizar as estirpes do CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. Diante do exposto o objetivo do presente estudo foi caracterizar a proteína hemaglutinina (H) em estirpes de CDV detectados em 15 cães naturalmente infectados no estado de Mato Grosso e Rondônia. As amostras foram coletadas de tecido nervoso central de cães que vieram a óbito. Foram inicialmente submetidas a RT-PCR para detecção do gene do nucleocapsídeo (N). As positivas foram em seguida testadas para amplificar o gene H. Em dez amostras houve amplificação completa do gene H. Análise filogenética revelou que as amostras se posicionaram em dois grupos: um geneticamente relacionado com isolados do Uruguai e, outro com linhagens oriundos de cepas brasileiras (especificamente dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul), todas as sequências foram classificadas dentro do genótipo América do Sul I/ Europa.
Canine Morbillivirus (CDV) is the etiological agent of canine distemper (CC), an important disease of dogs and wild carnivores characterized by high morbidity and mortality. The hemagglutinin (H) protein present in the envelope has an important function of viral adsorption and therefore has high genetic variability in relation to the other CDV genes. For this reason, it has been used to characterize CDV strains, allowing the identification of specific strains. Given the above, the objective of the present study was to characterize the hemagglutinin (H) protein in CDV strains detected in 15 naturally infected dogs in the states of Mato Grosso and Rondônia. The samples were collected from central nervous tissue of dogs that died. They were initially submitted to RT-PCR to detect the nucleocapsid (N) gene. The positive ones were then tested to amplify the H gene. In ten samples, there was complete amplification of the H gene. Phylogenetic analysis revealed that the samples were positioned in two groups: one genetically related to isolates from Uruguay and the other with strains from Brazilian strains (specifically from the states of Paraná and Rio Grande do Sul), all sequences were classified within the South America I / Europe genotype.
Resumo
O feijão (Phaseolus vulgaris) é um grão comumente utilizado na alimentação humana e de animais monogástricos, que está ganhando espaço na nutrição de ruminantes em regiões tropicais. O Brasil é o maior produtor e exportador deste grão, o que torna o uso de excedentes de produção ou subprodutos na alimentação animal uma alternativa. P. vulgaris é uma leguminosa que possui elevado teor proteico e que tem um custo de produção menor em relação a proteína animal. Entretanto seus grãos apresentam alguns limitantes, como fatores antinutricionais em sua composição. Um destes fatores é a fito-hemaglutinina (PHA), uma lectina capaz de provocar intoxicação em humanos e animais. A intoxicação ocorre pela ingestão de grãos não processados, sendo a cocção o método mais empregado na desnaturação dos fatores antinutricionais como a PHA. A intoxicação é amplamente estudada em humanos e animais monogástricos, entretanto, estudos em ruminantes são escassos. O acompanhamento de um surto de intoxicação natural por P. vulgaris em búfalos há alguns anos possibilitou o presente projeto, que tem por objetivo aprofundar alguns aspectos histoquímicos e imuno-histoquímicos da intoxicação nesta espécie animal.
Bean (Phaseolus vulgaris) is a common grain used in human food and monogastric animals, which is gaining ground in ruminant nutrition in tropical regions. Brazil is the largest producer and exporter of this grain which makes the use of surplus production or by-products in animal feed an alternative. P. vulgaris is a legume that has a high protein content and a relatively lower production cost in relation to animal protein. However, it presents some limitations, as antinutritional factors in its composition. One of these factors is phytohemagglutinin (PHA), a lectin capable of causing intoxication in humans and animals. Intoxication occurs by ingestion of unprocessed grains. Cooking is the most used method for the denaturation of antinutritional factors such as PHA. Intoxication is widely studied in monogastric humans and animals, however, studies on ruminants are scarce. The follow up of an outbreak of natural poisoning by P. vulgaris in buffaloes a few years ago enabled the present project, which aims to deepen some histochemical and immunohistochemical aspects of intoxication in this animal species.
Resumo
A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/L, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.
Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/L, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.
Resumo
O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012-2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo co-infecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012-2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas
Influenza A virus (IAV) causes an acute respiratory disease in pigs, characterized by high morbidity in the herds. The IAVs have a segmented negative sense genomic RNA, which contributes to genetic mutations and virus rearrangements. The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the main targets of host immune response, and mutations in these glycoproteins contribute to the genetic diversity of the virus. Three subtypes of swine influenza virus (SIV) circulate worldwide in the swine population: H1N1, H1N2 and H3N2. Rapid identification of viral subtypes is important for virus monitoring, assisting the detection of possible outbreaks and viral antigenic variations. The objective of this study was to standardize a RT-PCR test for the detection of SIV subtypes present in Brazil, analyzing their distribution combined with serological data from 2012-2018. The delineation of specific primers for the HA region was carried out from sequences of Brazilian samples, previously deposited at GenBank database. Characterized samples of H1N1pdm09, H3N2 and H1Delta were used as references. A first (One Step RT-PCR) and a second (Nested PCR) reaction was performed to standardize the test. Ninety-two field samples, previously positive for IAV, from 2012 to 2018 were used for the test validation. Sensitivity was assessed from the detection limit test and specificity from cross primer assays in control samples. The amplified PCR products from the field samples were sequenced and phylogenetic analysis was performed, as well as the p-distance calculation between samples of the same subtype. Partial HA sequences of H1pdm, from samples of the study and from other years, were translated and compared. Subtyping the N gene of H1Delta positive samples was performed. Serological analyzes were performed on 949 serum samples obtained from 2017-2018, evaluating the presence of antibodies against H1N1pdm09 and H3N2 by the Hemagglutination Inhibition (HI) test. The Nested test was more sensitive than the One-step reaction. There was no nonspecific cross amplification. Seventy-one (71/92-77%) of the field samples were subtyped by the Nested RT-PCR, 14 (14/71-20%) collected in 2012-2013, 35 (35/71- 49%) in 2014-2015, and 22 (22/71-31%) in 2017-2018. In 2012-2015, most of the samples were positive for H1N1pdm09, followed by H1Delta and H3N2, with H1N1pdm09 + H3N2 and H1N1pdm09 + H1Delta co-infection. In 2017-2018, there were more positive samples for H1Delta, followed by H1N1pdm and H3N2, and co-infection was also observed. From the H1Delta positive samples, only 57% (12/21) were subtyped for the N gene, with the majority positive for N2. A total of 716 serum samples were positive for IAV, and in 2017-2018 the occurrence of H3N2 was higher than H1N1pdm09 as well as the co-infection between H1N1pdm09+H3N2. By the phylogenetic analysis, partial sequences of each analyzed subtype have grouped into similar clusters. The p-distance analysis identified dissimilarity between samples into the H1Delta cluster and samples into H1N1pdm09 group. Amino acid alignment of H1N1pdm partial sequences, from different years, showed residual variations, especially at antigenic sites. The Nested RT-PCR technique was fast, sensitive and specific, which is recommended for SIV subtyping. Four subtypes of SIV circulate in Brazil. In 2012-2015 a higher occurrence of H1N1pdm was evidenced, but H3N2 was the most observed in 2017-2018. Analysis of amino acid residues of the H1N1pdm sequences demonstrated point substitutions between samples from different years, suggesting the evolution of the virus over time. Studies related to the genetic characterization of circulating SIVs in Brazil are essential to understand the evolution of viruses and their antigenic characteristics.
Resumo
Dois experimentos foram conduzidos com o objetivo de determinar a metabolizabilidade, a composição química, os valores energéticos e os coeficientes de metabolizabilidade de nutrientes do resíduo de estévia em frangos de corte e de avaliar os efeitos da sua inclusão na dieta sobre o desempenho, o rendimento de carcaça e as atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Um terceiro experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a utilização de cálices de hibisco como aditivo na alimentação de frangos de corte na fase de 28 aos 42 dias de idade e seus efeitos sobre o desempenho, o rendimento de carcaça e a qualidade da carne. Resíduo de estévia - Experimento - Foram utilizados 140 frangos de corte, machos, com 21 dias, distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado, com cinco tratamentos, sete repetições e quatro aves por unidade experimental. Para determinar o valor energético e a composição do alimento, foi utilizado o método de coleta total de excretas. Os tratamentos consistiram em quatro rações com níveis de 5%, 10%, 15% e 20% de resíduo de estévia em substituição à ração referência. A energia e os coeficientes de metabolizabilidade do alimento alternativo foram determinados por meio de ajuste de equações, obtendo assim a EMA e EMAn estimadas em 1268,60 e 1237,91 kcal/kg, respectivamente. O alimento apresentou 14,86% de PB, 3,8% de MM e 3,3% de EE expressos na matéria seca. Experimento - Foram utilizados 700 pintos de corte machos de 1 dia da linhagem comercial Cobb, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos (níveis de inclusão de resíduo de estévia 0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0%), com sete repetições e 20 aves por unidade experimental. A inclusão de estévia nas rações diminuiu linearmente (p<0,05) o ganho de peso, e proporcionou um aumento linear da conversão alimentar (p<0,05), sem influenciar o consumo de ração (p>0,05). Os órgãos gastrointestinais não apresentaram efeito com o aumento da inclusão do resíduo. Não houve efeito no rendimento de carcaça (p>0,05), porém, observou-se a redução (p<0,05) do rendimento de peito e o aumento da porcentagem de gordura abdominal (p<0,05) com o aumento dos níveis. Os níveis séricos de colesterol apresentaram uma resposta linear decrescente (p<0,05) com a inclusão da estévia. Os aspectos de qualidade de carne (cor, pH e capacidade de retenção de água) não foram influenciados (p>0,05). Para avaliação da oxidação lipídica da carne, foi observada interação (p<0,05) entre os níveis de resíduo de estévia (0,0%, 2,5%, 5,0%, 7,5% e 10,0%) e tempo de armazenamento (0, 3, 6, 9 e 12 dias), onde dentro do dia 0, a maior concentração de malonaldeído (MDA) encontrada foi para as dietas sem inclusão de estévia. E para os dias 9 e 12, o tratamento que apresentou maior oxidação foi de 5,0% de inclusão. Para os níveis de inclusão de resíduo de estévia, foi observado que a concentração de malonaldeído aumentou a partir do dia 3, para o tratamento contendo 2,5% de inclusão, e a partir do dia 9 para os tratamentos contendo de 5,0% a 10,0% de resíduo de estévia. Para o peso relativo dos órgãos linfoides, houve um aumento linear (p<0,05) do peso do timo e da bolsa cloacal, e uma redução linear (p<0,05) para o peso do baço. A reação inflamatória à fito hemaglutinina apresentou interação entre os níveis de estévia (0,0%, 2,5%, 5,0%, 7,5% e 10,0%) e o tempo (6, 12, 24, 48 e 72 horas). Após 24 horas, o tratamento com 10,0% de estévia se apresentou maior reação. Com 2,5% de inclusão, às 12 horas a reação apresentou-se maior e para 5,0%, a maior reação foi observada após 48 horas. Com 10,0% de inclusão, a maior reação foi encontrada após 48 horas. O resíduo de estévia apresentou 1268,60 e 1237,91 kcal/kg de EMA e EMAn, respectivamente. Não interferiu no ganho de peso e conversão alimentar até 2,5% de inclusão nas rações de frangos de corte no período de 1 a 42 dias de idade, e influenciou positivamente a qualidade de carne e as atividades antioxidante e anti-inflamatória. Experimento I: Cálices de hibisco - Foram utilizados 450 frangos de corte, de 28 dias de idade, da linhagem comercial Cobb, distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado, com cinco tratamentos (0,0; 0,15; 0,30; 0,45 e 0,60% de inclusão de hibisco) e seis repetições de 15 aves por unidade experimental. O ganho de peso piorou (p<0,05) com o aumento da inclusão de hibisco, no entanto, não foram observadas diferenças (p>0,05) para o consumo de ração e conversão alimentar. O hibisco não apresentou efeito (p>0,05) sobre o peso relativo dos órgãos gastrointestinais, com exceção do peso relativo do intestino delgado (p<0,05). Para o rendimento de carcaça, cortes e porcentagem de gordura abdominal, a inclusão de hibisco não apresentou efeito (p>0,05). Para a qualidade de carne, foi observada uma queda linear do pH de coxa e sobrecoxa e de peito (p<0,05) conforme os níveis de hibisco. Houve uma redução linear da luminosidade (P<0,05), um aumento da perda de peso por cocção (P<0,05) e uma resposta quadrática para força de cisalhamento da carne do peito, na qual o ponto mínimo encontrado foi com 0,26% de hibisco. A adição de hibisco na dieta de frangos não promoveu melhorias no desempenho das aves e rendimento de carcaça dos 28 aos 42 dias de idade.
Two experiments were carried out to determine the metabolizability, the chemical composition, the energy values and the nutrient metabolizability coefficients the stevia residue in broilers and to evaluate the effects of their inclusion in the diet on performance, carcass yield and antioxidant and anti-inflammatory activities. A third experiment was carried out with the objective of evaluating the use of hibiscus calyxes as a natural additive in the feeding of broiler chickens from 28 to 42 days of age and its effects on performance, carcass yield and meat quality. Stevia residue - Experiment - A total of 140 males, 21 days old, were distributed in a completely randomized experimental design with five treatments, seven replicates and four birds per experimental unit. To determine the energy value and the composition of the food, the total excreta collection method was used. The treatments consisted of four diets with levels of 5%, 10%, 15% and 20% of stevia residue instead of the reference diet. The energy and metabolizable coefficients of the food were determined by equation adjustment, thus obtaining the EMA and EMAn estimated at 1268.60 and 1237.91 kcal / kg, respectively. The food presented 14.86% of CP, 3.8% of MM and 3.3% of EE expressed in the dry matter. Experimental - A total of 700 male 1-day-old male broilers from the commercial Cobb line were used, distributed in a completely randomized design with five treatments (stevia residue - 0.0, 2.5, 5.0, 7, 5 and 10.0%), with seven replicates and 20 birds per experimental unit. . The inclusion of stevia in the diet decreased (p<0.05) the weight gain linearly, and provided a linear increase (p<0.05) in feed conversion, without influencing feed intake (p>0.05). The gastrointestinal organs had no effect with increasing inclusion of the residue. There was no effect on carcass yield (p>0.05), but there was a reduction (p<0.05) in breast yield and an increase in abdominal fat percentage (p<0.05) with increased levels . Serum cholesterol levels presented a linear decreasing response (p<0.05) with the inclusion of stevia. The meat quality aspects (color, pH and water retention capacity) were not influenced (p>0.05). To evaluate the lipid oxidation of the meat, interaction (p<0.05) was observed between stevia (0.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% and 10.0% ) and storage time (0, 3, 6, 9 and 12 days). At day 0, the highest concentration of malonaldehyde (MDA) found was for the diets without stevia inclusion. And for days 9 and 12, the treatment that presented greater oxidation was of 5.0% of inclusion. For the inclusion levels of stevia residue, it was observed that the concentration of malonaldehyde increased from day 3, for the treatment containing 2.5% inclusion, and from day 9 for treatments containing 5.0% to 10.0% stevia residue. For the relative weight of the lymphoid organs, there was a linear increase (p<0.05) in thymus weight and cloacal pouch, and linear reduction (p <0.05) for spleen weight. The inflammatory reaction to phytohemagglutinin showed interaction between stevia levels (0.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% and 10.0%) and time (6, 12, 24, 48 and 72 hours). After 24 hours, the treatment with 10.0% of stevia presented greater reaction. At 2.5% inclusion, at 12 hours the reaction was higher and at 5.0%, the highest reaction was observed after 48 hours. With 10.0% inclusion, the highest reaction was found after 48 hours. The stevia residue showed 1268.60 and 1237.91 kcal / kg of AME and AMEn, respectively. It did not interfere in the weight gain and feed conversion up to 2.5% inclusion in broiler rations from 1 to 42 days of age, and positively influenced meat quality and antioxidant and anti-inflammatory activities. Experiment I: Hibiscus calyxes - 450 broilers, 28 days old, from Cobb commercial line, were distributed in a completely randomized experimental design with five treatments (0.0, 0.15, 0.30, 0.45 and 0.60% hibiscus inclusion) and six replicates of 15 birds per experimental unit. Weight gain worsened (p<0.05) with the increase of the hibiscus inclusion, however, no differences (p>0.05) were observed for feed intake and feed conversion. Hibiscus had no effect (p>0.05) on the relative weight of the gastrointestinal organs, except for the relative weight of the small intestine (p<0.05). For the carcass yield, cuts and percentage of abdominal fat, the inclusion of hibiscus had no effect (p>0.05). As for meat quality, a linear decrease of thigh and overthigh and breast pH (p<0.05) was observed according to the levels of hibiscus. There was a linear reduction of the luminosity (p<0.05), an increase of the weight loss by cooking (p<0.05) and a quadratic response for shear force of the meat of the chest, in which the minimum point was 0, 26% hibiscus. The addition of hibiscus into the broiler diet did not promote improvements in poultry performance and carcass yield from 28 to 42 days of age.
Resumo
O vírus da cinomose canina (CDV) é um relevante patógeno de caninos domésticos e carnívoros selvagens. Pertencente á família Paramyxoviridae e ao gênero Morbillivirus, o CDV constitui o agente etiológico de uma infeção enzoótica mundialmente. Alguns relatos de cães supostamente vacinados que desenvolveram a doença trazem à tona questionamentos sobre a eficácia das formulações vacinais frente às cepas selvagens, levantando algumas hipóteses acerca da evolução do CDV. Com o objetivo de produzir uma linhagem do vírus de CDV capaz de reproduzir a enfermidade em camundongos e analisar o gene da Hemaglutinina do vírus CDV em amostras de campo de cães naturalmente infectados no Brasil, esta dissertação será apresentada na forma de dois artigos científicos. No primeiro, foi proposto o estabelecimento de uma linhagem de CDV neurotrópica para camundongos, capaz de induzir a doença a partir de uma cepa de CDV brasileira selvagem, através de inoculação intracerebral em camundongos Swiss neonatos, observando-se através de análises moleculares que não houve amplificação do material genético viral de interesse. No segundo artigo, amostras clínicas de cães naturalmente infectados no Brasil foram submetidas a um estudo filogenético utilizando o genoma full-lenght da glicoproteína H do CDV, onde foram obtidos cinco isolados distintos: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, todos agrupados no genogrupo Europa/América do Sul-1, grupo distinto do que abrange as cepas vacinais. Pesquisas de polimorfismos já descritos na literatura foram realizadas nos aminoácidos gerados, onde foi detectada a substituição R580Q nas amostras isoladas de Pernambuco, importante na eficiência da fusão e expressão da superfície proteica da hemaglutinina.
Canine distemper virus (CDV) is a relevant pathogen of domestic canines and wild carnivores. Belonging to the Paramyxoviridae family and the genus Morbillivirus, CDV is the etiologic agent of an enzootic infection worldwide. Some reports of supposedly vaccinated dogs that developed the disease raise questions about the efficacy of vaccine formulations against wild-type strains, raising some hypotheses about the development of CDV. With the objective of producing a CDV virus strain capable of reproducing the disease in mice and analyzing the Hemagglutinin CDV virus gene in field samples from naturally infected dogs in Brazil, this dissertation will be presented in the form of two scientific articles. In the first, it was proposed the establishment of a neurotropic CDV line for mice, capable of inducing the disease from a wild Brazilian CDV strain, through intracerebral inoculation in Swiss neonatal mice, observing through molecular analyzes that there was no amplification of viral genetic material of interest. In the second article, clinical samples of naturally infected dogs in Brazil were submitted to a phylogenetic study using the full-lenght genome of CDV H-glycoprotein, where five different isolates were obtained: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, all grouped in the genogroup Europe / South America-1, a group distinct from that covering the vaccine strains. Polymorphism studies already described in the literature were performed on the generated amino acids, where the R580Q substitution was detected in samples isolated from Pernambuco, important in the fusion efficiency and expression of the protein surface of hemagglutinin.
Resumo
A cinomose canina é uma das enfermidades infectocontagiosas mais importantes que acomete os cães. É uma doença causada pelo vírus da Cinomose (Canine Distemper Virus - CDV), um Paramyxovirus, do gênero Morbillivirus, de ocorrência mundial, sem sazonalidade, sem predileção de sexo ou raça, apresenta maior incidência em animais jovens, podendo acometer todas as idades. No Brasil, pesquisas sobre o uso de técnicas que comparam os diferentes testes diagnósticos direto para o vírus da cinomose (CDV) associado a análise molecular e filogenética do mesmo ainda continuam escassas. Além disso, são poucos os estudos sobre epidemiologia molecular que relatam diferenças marcantes na análise filogenética do gene hemaglutinina (H) do CDV entre os isolados de campo e as cepas de referência do CDV, especialmente àquelas utilizadas na produção de vacinas. Dessa maneira, o presente trabalho tem como principal objetivo avaliar os principais métodos diagnósticos laboratoriais para identificação do CDV em cães com suspeita de cinomose associando à análise filogenética do gene H dos isolados de campo. O Ensaio imunocromatografico direto (IC), a RT-PCR e a Nested-PCR foram avaliados para detecção do CDV em diferentes amostras clínicas (urina, suabes retais e conjuntivais) de 62 animais suspeitos de cinomose, provenientes do atendimento ambulatorial do hospital veterinário da Unesp (Jaboticabal-SP) e de clínicas particulares da região. Após detecção viral as amostras foram submetidas a sequenciamento seguida de análise filogenética do gene H do CDV. Um total de 42 animais foram positivos em pelo menos uma das técnicas utilizadas neste experimento. As técnicas moleculares (RT-PCR e Nested-PCR) demonstraram maior sensibilidade que o ensaio comercial de IC. Os resultados obtidos da análise filogenética do gene H sugeriram que o grupo de isolados do CDV no Brasil são distintos das cepas vacinais e são mais relacionados genotipicamente aos isolados Europeus 1/Sul-Americanos 1. Em conclusão, a técnica Nested-PCR aplicada na detecção do CDV em suabes retais revelou-se o método mais eficaz e sensível para identificação desse vírus, que associado a análise filogenética pode ser classificado em um clado diferente das cepas vacinais sugerindo um potencial de infecção para os cães domésticos inclusive os vacinados.
Canine distemper is one of the most important infectious diseases that affects dogs. It is a Canine Distemper Virus (CDV), a Paramyxovirus, of the genus Morbillivirus, a global deforest, without seasonality, without predilection of sex or race, that is constituted by the majority of the animals, being able to affect all ages. In Brazil, research on the use of techniques that compare the different direct diagnostic tests for the distemper virus (CDV) associated with a molecular and phylogenetic analysis of the same are still scarce. In addition, there are some studies on molecular epidemiology that report differences in the phylogenetic analysis of the hemagglutinin (H) gene from CDV between the fields of action and as a reference for CDV, especially the practices used in the production of vaccines. Thus, the main objective of this study is to identify laboratory diagnoses for the identification of CDV in dogs with suspected pair association to the phylogenetic analysis of the H gene of the field isolates. The direct immunochromatographic (CI) assay, RT-PCR and nested-PCR were evaluated for the detection of CDV in different animal species (urine, swabs and conjunctival) of 62 suspected cases of distemper from the outpatient clinic of the Unesp (Jaboticabal-SP) and the private medical records of the region. After viral detection as sequential sequencing followed by phylogenetic analysis of the CDV H gene. A total of 42 animals were positive at least one of the experiment techniques in this experiment. As molecular techniques (RT-PCR and Nested-PCR) demonstrated greater sensitivity than the commercial IC test. The results obtained from the phylogenetic analysis of the H gene suggest that the group of CDV cells in Brazil are distinct from the vaccine strains and are more commonly genotyped to the following European 1 / South American 1. In conclusion, a Nested-PCR technique. CDV can be used as a more effective and sensitive method to virus infection, which is associated with a phylogenetic analysis that can be classified into one of the different clones of the vaccines, suggesting a potential for infection for animals that include the vaccinated.
Resumo
A influenza equina (EI) é uma enfermidade respiratória viral aguda que acomete equídeos de todas as idades. A doença é causada pelo vírus da influenza equina (EIV do inglês Equine Influenza Virus), que podem ser do subtipo viral H3N8 (antigo Equi-2), mundialmente distribuído, e o H7N7 (antigo Equi-1), considerado extinto desde 1980. Os EIVs pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A, possuem genoma RNA fita simples segmentado de senso negativo e são envelopados. A EI tem alta morbidade e baixa mortalidade leva a grandes perdas econômicas no ramo equestre. Os animais acometidos ficam impedidos de serem transportados ou de participarem de eventos equestres no Brasil. A rápida e fácil disseminação do EIV é bastante característico em surtos de EI. Surtos de EI foram descritos em 2012 em diversos países, incluindo o Brasil. Em 2015, um surto de EIV ocorreu em um Hospital Veterinário na cidade de São Paulo-SP. Os objetivos do presente trabalho foram: a) obter isolados do vírus da influenza equina de surtos recentes do estado de São Paulo, Brasil; b) realizar o sequenciamento dos EIVs isolados; c) promover a análise filogenética e evolutiva desses EIVs. Foram isolados 12 EIVs de um surto de EI em um hospital veterinário na cidade de São Paulo em 2015. Promoveu-se o sequenciamento dos oito genes virais dos isolados de 2015 e de uma estirpe de EIV de um surto brasileiro de 2012, e da hemaglutinina de outras duas estirpes do mesmo surto de 2012. Os vírus do surto de 2012 foram cedidos pelo Laboratório de Raiva e Encefalites Virais do Instituto Biológico de São Paulo para as análises. O sequenciamento dos genes HA e NA indicaram que os EIVs de 2012 e 2015 brasileiros são do subtipo H3N8 e pertencem à sublinhagem Flórida 1 e tiveram maiores identidades com os vírus de 2012 da América do Sul, Estados Unidos e Dubai de 2012. Os vírus de 2015 formaram um clado separado dos demais EIV Flórida 1, tanto na análise filogenética quanto na análise de relógio molecular. As análises de mutações de nucleotídeos e aminoácidos, associados à análise de perfil de hidrofobicidade sugerem mudanças em estruturas antigênicas que poderiam acarretar no maior distanciamento em relação à estirpe vacinal A/equine/South Africa/4/03.
The equine influenza (EI) is a viral acute respiratory disease that can affect equines of any age. The disease is caused by the equine influenza virus (EIV) and has two different subtypes H3N8 (formerly Equi-2) that occurs worldwide and H7N7 (formerly Equi-1), considered extinct since 1980. EIVs belong to the Orthomyxoviridae family, Influenza A genus, are enveloped and has negative segmented single strand RNA genome. EI causes high morbidity and low mortality and drives to high economic losses in equestrian industry. In Brazil, the transport and participation in equestrian events are not allowed when horses have EIV. The quickly spread pattern is easily seen in EIV outbreaks. EI outbreaks occurred in 2012 in several countries, including Brazil. In 2015, an outbreak occurred in a Veterinarian Hospital in São Paulo-SP. The objectives of the present study were: a) to obtain isolates of equine influenza virus from recent outbreaks in the State of São Paulo, Brazil; b) to promote the sequencing of these EIVs; c) to perform the phylogenetic and evolutive analysis of these EIVs. Twelve EIVs were isolated from an outbreak in a veterinarian hospital in the State of São Paulo in 2015. The eight viral genes were sequenced from EIVs of 2015 and from one EIV of a Brazilian outbreak, 2012. Also, the HA gene from two other EIVs from the same 2012-outbreak were sequenced. The viruses from the 2012-outbreak were from the Laboratory of Rabies and Viral Encephalitis, Instituto Biológico de São Paulo. Sequencing on HA and NA genes indicates that the Brazilian 2012 and 2015 EIVs are H3N8 subtype, belong to the Florida 1 sublineage and were more identical to the 2012 EIVs from South America, United States and Dubai. In the phylogenetic tree and the molecular clock the EIVs from 2015 grouped in a cluster that was separeted from other Florida 1 EIVs. The nucleotide, amino acid and hydrophobicity analysis suggest changes in antigenic structures that could lead to differences from the vaccine strain A/equine/South Africa/4/03.
Resumo
Birds of the Cracidae family (curassows, guans, and chachalacas) are endemic of the Neotropics and 50 species are currently classified. Brazil has 22 species, seven of which are considered threatened. The Alagoas Curassow (Pauxi mitu) species is considered extinct in the wild; but about 120 birds are alive in captivity. Conservation of this species depends entirely on correct management. Health reports of both wildlife and captive curassows are rare. In this study the presence of Escherichia coli was evaluated in 23 healthy Alagoas Curassows from two private breeding centres. E. coli was isolated from cloacal swabs, and the presence of genes encoding cytotoxic necrotising factor 1 (cnf1), alpha-haemolysin (hly), aerobactin (iuc), serum resistance (iss) and the following adhesions: S fimbriae (sfa), pili associated with pyelonephritis (pap) and temperature-sensitive haemagglutinin (tsh) were investigated. E. coli was isolated from 78.3% (18/23) of the birds, and the percentage of curassows colonized by E. coli was similar between the two facilities. From the 22 E. coli isolates, 15 (68.2%) were positive for at least one virulence factor by PCR, and the most frequently found gene was iss (50%). No curassows had clinical signs of disease. Nevertheless, the presence of some E. coli strains may be a concern to the wildlife in captivity. Additional health surveillance studies are essential to guarantee successful conservation programmes for threatened cracids in Brazil.(AU)
Aves da família Cracidae (mutuns, jacutingas e aracuãs) são endêmicas da região Neotropical com 50 espécies atualmente classificadas. O Brasil possui 22 espécies nesta família e sete delas são consideradas ameaçadas de extinção. O mutum-do-nordeste (Pauxi mitu) é considerado extinto na natureza, no entanto, aproximadamente 120 indivíduos são mantidos em cativeiro. A conservação desta espécie depende inteiramente de um manejo correto. Informações sobre o status sanitário de mutuns são raras, tanto em vida livre quanto em cativeiro. Neste estudo a presença de Escherichia coli foi avaliada em 23 mutuns-do-nordeste sadios de dois criatórios particulares. E. coli foi isolada a partir de suabes cloacais, em seguida, foi avaliada a presença de genes que codificam fator citotóxico necrotizante 1 (cnf1), alfa-hemolisina (hly), produção de aerobactina (iuc) e resistência sérica (iss) e genes que codificam os seguintes fatores de virulência: fímbria S (sfa), pili associado à pielonefrite (pap) e hemaglutinina termosensível (tsh). E. coli foi isolada de 78,3% (18/23) das aves e o percentual de mutuns positivos para E. coli foi semelhante entre as duas criações. De 22 isolados de E. coli, 15 (68,2%) foram positivos para pelo menos um fator de virulência pela PCR e o gene mais frequente foi o iss (50%). Nenhuma ave apresentava sinal clínico de doença, no entanto, a presença de determinadas cepas de E. coli pode representar uma preocupação em relação às aves silvestres mantidas em cativeiro. Estudos adicionais de monitoria do status sanitário do plantel são essenciais para garantir o sucesso de futuros programas de conservação de cracídeos ameaçados no Brasil.(AU)
Assuntos
Animais , Galliformes/microbiologia , Escherichia coli/isolamento & purificação , Virulência/genética , Sinais e Sintomas/veterinária , Avaliação de Sintomas/veterináriaResumo
O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose.
Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.
Resumo
O vírus da cinomose canina (CDV), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae, é o agente etiológico de doença neurológica e sistêmica em cães. O diagnóstico laboratorial da infecção requer o isolamento viral ou detecção do material genético do vírus em secreções ou tecidos de cães com suspeita clínica da doença. A diversidade genética entre os isolados de CDV pode ser aferida pelo sequenciamento efilogenia molecular do gene que codifica a hemaglutinina viral (gene H), havendo atualmente um especial interesse em comparar as amostras circulantes a campo com o genogrupo América-1, que abrange as cepas presentes nas vacinas disponíveis no mercado. No presente estudo, foi realizada a detecção molecular do gene H de CDV a partir de amostras biológicas colhidas ante- e post- -mortem de 15 cães com sinais clínicos sugestivos de cinomose na região metropolitana de Campinas, São Paulo. Dez dos 15 cães analisados tiveram ao menos um órgão positivo na detecção molecular e os amplicons obtidos foram submetidos ao sequenciamento nucleotídico seguido de análise filogenética molecular. De forma semelhante ao que já foi reportado para estudo analisando a diversidade do gene H em outros países, a reconstrução filogenética obtida para as amostras de casos de cinomose da região de Campinas demonstrou as mesmas foram agrupadas junto a amostras norte-americanas, europeias e japonesas recentes, em um grupo genético distinto do grupo de amostras clássicas de CDV, nomeado America-1, o qual engloba as estirpes vacinais Snyder Hill, Onderstepoort e Lederle.(AU)
Canine distemper virus (CDV), a Morbillivirus of the family Paramyxoviridae, is the etiological agent of neurological and systemic disease in dogs. The laboratory diagnosis of infection requires viral isolation or detection of genetic material of the virus in secretions or tissues of dogs with clinical suspicion of the disease. The genetic diversity among isolates of CDV can be assessed by sequencing and phylogenetic analysis of the gene that encodes the viral hemagglutinin (H gene), and there is currently a special interest in comparing the strains currently circulating in the field with the genogroup America-1, which comprises strains present in vaccines available in the market. In this study, the molecular detection of CDV gene H was performed from biological samples harvested ante-and post-mortem from 15 dogs with clinical signs suggestive of canine distemper in the metropolitan region of Campinas, São Paulo. Ten of the 15 dogs examined had at least one positive organ under molecular detection and the obtained amplicons were sequenced and further analyzed by molecular phylogenetic analysis. Similarly to what has already been reported on previous studies regarding the diversity of the gene H in other countries, the phylogenetic reconstruction obtained for the samples of cases of distemper from Campinas region showed they were grouped with the North American, European and Japanese newly described samples, a genetic group distinguished from classical samples of CDV, named America-1, which encompasses the vaccine strains Snyder Hill, Onderstepoort and Lederle.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Vírus da Cinomose Canina/isolamento & purificação , Vírus da Cinomose Canina/patogenicidade , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa/veterinária , RNA Viral/isolamento & purificação , Filogenia , Anotação de Sequência MolecularResumo
Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.
A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.
Assuntos
Animais , Suínos/virologia , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Surtos de Doenças/veterinária , Infecções , Pulmão/virologiaResumo
Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.(AU)
A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.(AU)
Assuntos
Animais , Suínos/virologia , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Infecções , Surtos de Doenças/veterinária , Pulmão/virologiaResumo
Escherichia coli isolates from 24 sick psittacine birds were serogrouped and investigated for the presence of genes encoding the following virulence factors: attaching and effacing (eae), enteropathogenic E. coli EAF plasmid (EAF), pili associated with pyelonephritis (pap), S fimbriae (sfa), afimbrial adhesin (afa), capsule K1 (neu), curli (crl, csgA), temperature-sensitive hemagglutinin (tsh), enteroaggregative heat-stable enterotoxin-1 (astA), heat-stable enterotoxin -1 heat labile (LT) and heat stable (STa and STb) enterotoxins, Shiga-like toxins (stx1 and stx2), cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1), haemolysin (hly), aerobactin production (iuc) and serum resistance (iss). The results showed that the isolates belonged to 12 serogroups: O7; O15; O21; O23; O54; O64; O76; O84; O88; O128; O152 and O166. The virulence genes found were: crl in all isolates, pap in 10 isolates, iss in seven isolates, csgA in five isolates, iuc and tsh in three isolates and eae in two isolates. The combination of virulence genes revealed 11 different genotypic patterns. All strains were negative for genes encoding for EAF, EAEC, K1, sfa, afa, hly, cnf, LT, STa, STb, stx1 and stx2. Our findings showed that some E. coli isolated from psittacine birds present the same virulence factors as avian pathogenic E. coli (APEC), uropathogenic E. coli (UPEC) and Enteropathogenic E. coli (EPEC) pathotypes.(AU)
Amostras de Escherichia coli isoladas de 24 psitacídeos doentes foram sorogrupadas e investigadas para a presença de genes que codificam os seguintes fatores de virulência: attaching e effacing (eae), plasmídeo EAF (EAF), pili associado à pielonefrite (pap), fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), cápsula K1 (neu), curli (crl, csgA), hemaglutinina termosensível (tsh), enterotoxina termo-estável 1 de E. coli enteroagregativa (astA), toxina termolábil (LT) e toxina termoestável (STa e STb), Shiga-like toxinas (stx1 e stx2), fator citotóxico necrotizante 1 (cnf1), hemolisina (hly), produção de aerobactina (iuc) e resistência sérica (iss). Os resultados mostraram que os isolados pertenciam a 12 sorogrupos: O7; O15; O21; O23; O54; O64; O76; O84; O88; O128; O152 e O166. Os genes de virulência encontrados foram: crl em todos os isolados, pap em 10 isolados, iss em sete isolados, csgA em cinco isolados, iuc e tsh em três isolados e eae em dois isolados. A combinação dos genes de virulência revelou 11 perfis genotípicos distintos. Todas as amostras foram negativas para os genes que codificam EAF, EAEC, K1, sfa, afa, hly, cnf, LT, STa, STb, stx1 e stx2. Estes resultados demonstraram que algumas amostras de E. coli isoladas de psitacídeos apresentam os mesmos fatores de virulência presentes nos patotipos de E. coli patogênicas para aves (APEC), uropatogênicas (UPEC) e E. coli enteropatogênicas (EPEC).(AU)
Assuntos
Animais , Papagaios/virologia , Fatores de Virulência/análise , Escherichia coli , Sepse/diagnósticoResumo
Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.(AU)
O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.(AU)