Differential sprouting ability during micropropagation of Nidularium minutum Mez (Bromeliaceae)

Nidularium minutum is an ornamental bromeliad from the Brazilian Rainforest. The micropropagation of this species is essential for obtaining plants available for conservation programs or commercial use. Our study aimed to establish an efficient plant production method by in vitro sprouting. This bromeliad takes a long time to sprout in vitro, and 10% of the plants produce shoots in a culture medium without plant growth regulators (PGRs). When subcultured in a PGR-free medium, these individualized shoots can sprout like the mother plant. The Murashige and Skoog basal medium (MS) containing 1.0 mg L-1 of 6-benzylaminopurine (BAP) promoted the induction of adventitious shoots in greater than 90% of the plants after 240 days of culture with an average of more than eight shoots per plant. Approximately 100% of the in vitro-produced shoots survived after acclimatization, reaching the flowering stage. Therefore, our results showed that in vitro regeneration of N. minutum depends on the cultivation period and that plants with a higher sprouting capacity can be selected and used as micropropagation matrices, contributing to the production of this endangered bromeliad.(AU)

In vitromorphogenesis of gypsophila: Response to exogenous phytohormones / Morfogênese de gypsophila in vitro: Resposta a fitormônios exógenos

The success of in vitro cultivation of plant species depends on factors associated with the induction and control of morphogenesis regarding the regeneration of shoots and roots in the organogenesis process, such as the culture medium composition. Thus, the objective of this study was to investigate if theconcentration of growth regulators in culture medium interferes with the in vitro morphogenesis of gypsophila. 'Golan' cultivar was subjected to three culture media (M), which constituted the study treatments: M1) Murashige and Skoog (MS) medium without the addition of growth regulators; M2) MS + 1 mg L-1of benzylaminopurine (BAP) + 0.05 mg L-1of naphthaleneacetic acid (NAA); M3) MS + 0.05 mg L-1BAP + 1 mg L-1NAA. After 45 days, the multiplication rate, plant height and root length were evaluated. The results showed that plantlets produced in M2 medium had a higher multiplication rate. Also, plantlets produced in M1 and M3 media showed higher shoot height and root length. It is concluded that there is a difference in the in vitromorphogenesis of gypsophila according to the concentration of growth regulators in the micropropagation medium.(AU)

O sucesso do cultivo in vitro de espécies vegetais depende de fatores associados à indução e ao controle da morfogênese quanto à regeneração de brotos e raízes no processo de organogênese, a exemplo da composição de meio de cultura. Assim, o objetivo do estudo foi investigar se a concentração de reguladores de crescimento em meio de cultura interfere na morfogênese in vitrode gipsofila. A cultivar 'Golan' foi submetida a três meios de cultura (M), que constituíram os tratamentos do estudo: M1) meio Murashige e Skoog (MS) sem adição de reguladores de crescimento; M2) MS + 1 mg.L-1de benzilaminopurina (BAP) + 0.05 mg.L-1de ácido naftalenoacético (ANA); M3) MS + 0.05 mg.L-1BAP + 1 mg.L-1de ANA. Após 45 dias avaliou-se a taxa de multiplicação, altura de plantas e comprimento de raízes. Os resultados mostraram que plântulas produzidas no meio M2 tiveram maior taxa de multiplicação. Ainda, plântulas produzidas nos meios M1 e M3 apresentaram maior altura de parte aérea e comprimento de raízes. Conclui-se que há diferença na morfogênese in vitrode gipsofila de acordo com a concentração de reguladores de crescimento em meio de cultura na micropropagação.(AU)

Ex situ conservation of the endangered "sempre-viva" species Comanthera mucugensis

The "sempre-viva" species Comanthera mucugensis is endemic to the municipality of Mucugê, Bahia, Brazil, where it was widely exploited through extractivism to be commercialized as an ornamental, causing a drastic reduction of its population, so that it is now classified as endangered. Although its main area of occurrence is now protected for being within Chapada Diamantina National Park, the continued risks of inclement conditions and anthropic actions make it necessary to develop alternative methods for ex situ conservation of the species, such as in vitro conservation. Therefore, the objective of this study was to test the effect of different concentrations of salts and sucrose on the in vitro conservation of Comanthera mucugensis. Two salts concentrations of the medium MS (½ and ») and two sucrose levels (7.5 and 15.0 g L-1) were tested, and the experimental design was completely randomized with four treatments. After 365 days, the survival, growth and regeneration of the conserved plants were analyzed, achieving up to 100% survival, reduced shoot growth and maintenance of regenerative capacity. Reduction of the concentration of salts and sucrose in the culture medium is indicated to conserve the plants in vitro for a period of one year.(AU)

Influence of silver nanoparticles on the tissue reaction of polyacrylic acid-based gel

Purpose: To study the influence of silver nanoparticles (AgNP) on tissue reaction when incorporated into a polymeric matrix of polyacrylic acid-based (Carbopol®) gel as a proposal for a new low-cost type of biomaterial that is simple to manufacture for use as an antimicrobial and antioxidative dressing. Methods: In-vivo tests of implantation in the subcutaneous tissue of the back of rats were performed using polyethylene tubes in three situations: empty, only the gel, and gel incorporated with AgNP. Then, the tissue reaction was studied by counting inflammatory cells. Additionally, in-vitro tests of the antioxidative and antimicrobial activity of AgNP were performed. The radical 2,2 diphenyl-1 picrylhydrazyl (DPPH) was used to test the antioxidative activity of AgNP using electron spin resonance. The antimicrobial activity of AgNP was determined by minimum inhibitory concentration against the microorganisms: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli. Results: The results indicated that AgNP presents antioxidative activity and was able to inhibit the growth of the microorganisms tested. The addition of AgNP in Carbopol® did not alter the tissue inflammatory response (p>0.05, Kruskal-Wallis's test). Conclusions: The new biomaterial is promising for future use as a dressing for its beneficial properties for regenerative processes

In vitro multiplication of wild Manihot species with different naphthaleneacetic acid and benzylaminopurine concentrations

In vitro multiplication is an important tissue culture technique that is capable of efficiently producing seedlings at any scale. It is a propagation method based on the aseptic culture of small propagules in a suitable culture medium to enable plant regeneration. Multiplication experiments conducted in vitro to set protocols adapted to wild Manihot species have used modified mineral salts and MS vitamins as basic culture medium. Here, 25 treatments based on combinations of the regulators benzylaminopurine (BAP) and naphthaleneacetic acid (NAA) at 0, 0.025, 0.05, 0.075, and 0.1 mg L-1 were used for in vitro multiplication of three genotypes of wild Manihot species (M. violaceae Pohl Müll. Arg., M. pseudoglaziovii Pax & Hoff., and M. flabellifolia Pohl). Plant height and the number of 1 cm minicuttings, number of roots, shoots, green leaves and senescent leaves were recorded 120 days after explant inoculation. M. violaceae Pohl. Müll. Arg. and M. flabellifolia Pohl. presented favorable results with 0.05 and 0.025 mg L-1 NAA, respectively. Culture medium lacking NAA and BAP favored the in vitro growth of M. pseudoglaziovii Pax & Hoff.

In vitro multiplication of wild Manihot species with different naphthaleneacetic acid and benzylaminopurine concentrations

In vitro multiplication is an important tissue culture technique that is capable of efficiently producing seedlings at any scale. It is a propagation method based on the aseptic culture of small propagules in a suitable culture medium to enable plant regeneration. Multiplication experiments conducted in vitro to set protocols adapted to wild Manihot species have used modified mineral salts and MS vitamins as basic culture medium. Here, 25 treatments based on combinations of the regulators benzylaminopurine (BAP) and naphthaleneacetic acid (NAA) at 0, 0.025, 0.05, 0.075, and 0.1 mg L-1 were used for in vitro multiplication of three genotypes of wild Manihot species (M. violaceae Pohl Müll. Arg., M. pseudoglaziovii Pax & Hoff., and M. flabellifolia Pohl). Plant height and the number of 1 cm minicuttings, number of roots, shoots, green leaves and senescent leaves were recorded 120 days after explant inoculation. M. violaceae Pohl. Müll. Arg. and M. flabellifolia Pohl. presented favorable results with 0.05 and 0.025 mg L-1 NAA, respectively. Culture medium lacking NAA and BAP favored the in vitro growth of M. pseudoglaziovii Pax & Hoff.(AU)

In vitro evaluation of hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial to support bone healing / Avaliação in vitro do biomaterial compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono como adjuvante no reparo ósseo

Hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were developed to improve bone healing. Previous studies suggested that a combination of biomaterials and mesenchymal stem cells (MSCs) can potentially help promote bone regeneration. In the present study, we first developed hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial. Then, the effect of different concentrations of the extract on the viability of Vero cells (ATCC CCL-81) and MSCs obtained from sheep bone marrow using methylthiazol tetrazolium (MTT) and propidium iodide (PI) assays were evaluated. The biomaterial group demonstrated an absence of cytotoxicity, similar to the control group. Samples with 50% and 10% biomaterial extract concentrations showed higher cell viability compared to samples from the control group (MTT assay). These results suggest that the presence of this composite biomaterial can be used with MSCs. This study also concluded that hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were not cytotoxic. Therefore, these could be used for performing in vivo tests.(AU)

O compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono foi desenvolvido com o intuito de auxiliar na consolidação óssea. Estudos anteriores sugerem que a combinação de substitutos ósseos e células-tronco mesenquimais (CTM) podem auxiliar a potencializar e promover a regeneração óssea. No presente estudo, o biomaterial foi desenvolvido e a viabilidade e a citotoxicidade de células Vero (ATCC CCL-81) e CTM obtidas de medula óssea provenientes de ovinos utilizando ensaios metil-tiazol-tetrazólio, MTT e iodeto de propídeo (PI) foram avaliadas em diferentes concentrações de extrato desse compósito. O compósito demonstrou ausência de citotoxicidade com comportamento semelhante ao grupo controle. Amostras com 50% e 10% de concentração de extrato do compósito mostraram resultados maiores comparados ao grupo controle (ensaio MTT). Esses resultados também sugerem que a presença do biomaterial pode ser utilizada em associação a CTM. Assim, esse estudo conclui que o compósito apresentado de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de cabono não foi considerado citotóxico e pode ser utilizado em teste in vivo.(AU)

In vitro evaluation of hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial to support bone healing / Avaliação in vitro do biomaterial compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono como adjuvante no reparo ósseo

Hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were developed to improve bone healing. Previous studies suggested that a combination of biomaterials and mesenchymal stem cells (MSCs) can potentially help promote bone regeneration. In the present study, we first developed hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial. Then, the effect of different concentrations of the extract on the viability of Vero cells (ATCC CCL-81) and MSCs obtained from sheep bone marrow using methylthiazol tetrazolium (MTT) and propidium iodide (PI) assays were evaluated. The biomaterial group demonstrated an absence of cytotoxicity, similar to the control group. Samples with 50% and 10% biomaterial extract concentrations showed higher cell viability compared to samples from the control group (MTT assay). These results suggest that the presence of this composite biomaterial can be used with MSCs. This study also concluded that hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were not cytotoxic. Therefore, these could be used for performing in vivo tests.(AU)

O compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono foi desenvolvido com o intuito de auxiliar na consolidação óssea. Estudos anteriores sugerem que a combinação de substitutos ósseos e células-tronco mesenquimais (CTM) podem auxiliar a potencializar e promover a regeneração óssea. No presente estudo, o biomaterial foi desenvolvido e a viabilidade e a citotoxicidade de células Vero (ATCC CCL-81) e CTM obtidas de medula óssea provenientes de ovinos utilizando ensaios metil-tiazol-tetrazólio, MTT e iodeto de propídeo (PI) foram avaliadas em diferentes concentrações de extrato desse compósito. O compósito demonstrou ausência de citotoxicidade com comportamento semelhante ao grupo controle. Amostras com 50% e 10% de concentração de extrato do compósito mostraram resultados maiores comparados ao grupo controle (ensaio MTT). Esses resultados também sugerem que a presença do biomaterial pode ser utilizada em associação a CTM. Assim, esse estudo conclui que o compósito apresentado de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de cabono não foi considerado citotóxico e pode ser utilizado em teste in vivo.(AU)

Adaptation of in vitro regeneration protocol for Brazilian wheat genotypes / Adaptação do protocolo de regeneração in vitro para genótipos de trigo brasileiros

The availability of an efficient protocol for in vitro regeneration is imperative for genetic transformation. Using genotypes adapted to the target region as a transgenic platform accelerates the development of cultivars. Therefore, this study aimed to adapt an in vitro regeneration protocol for Brazilian wheat genotypes. For this purpose, the in vitro regeneration capacity of immature embryos from six Brazilian wheat genotypes using two protocols of regeneration of somatic embryos was analysed. Furthermore, combinations of 2,4-D and picloram in the callus induction medium were tested in order to improve regeneration efficiency. Genotypes with higher regeneration efficiency were BR18-Terena and PF020037, yielding 0.42 and 1.13 shoots per explant using the Hu and the Wu protocol, respectively. Adding 1mgL-1 2,4-D in the callus induction medium was the most favourable, producing 3.73 and 3.07 shoots per explant for PF020037 and BR18-Terena, respectively. In conclusion, a protocol for regeneration for two Brazilian wheat genotypes recommended and developed to be cultivated at the Cerrado region has been adapted.(AU)

A disponibilidade de um protocolo eficiente de regeneração in vitro é imperativa para a transformação genética de plantas. O uso de material genético adaptado à região alvo como plataforma de transgenia permite acelerar o desenvolvimento de uma cultivar. Portanto, o objetivo deste estudo foi adaptar um protocolo de regeneração in vitro para genótipos brasileiros de trigo. Para esta finalidade, a capacidade de regeneração in vitro de embriões imaturos de seis genótipos brasileiros de trigo, utilizando dois protocolos de regeneração de embriões somáticos, foi analisada. Além disso, combinações de 2,4-D e picloram no meio de indução de calos foram analisadas buscando aumentar a eficiência de regeneração. Os genótipos com maior eficiência de regeneração foram BR18-Terena e PF020037, produzindo 0,42 e 1,13 brotações por explante usando os protocolos Hu e Wu, respectivamente. A adição de 1mgL-1 de 2,4-D no meio de indução de calos foi o mais favorável, produzindo 3,73 e 3,07 brotações por explante para PF020037 e BR18-Terena, respectivamente. Concluindo, foi adaptado um protocolo de regeneração para dois genótipos brasileiros recomendados e desenvolvidos para o cultivo no Cerrado.(AU)

Phenotypic, genetic and symbiotic characterization of Erythrina velutina rhizobia from Caatinga dry forest

Erythrina velutina ("mulungu") is a legume tree from Caatinga that associates with rhizobia but the diversity and symbiotic ability of "mulungu" rhizobia are poorly understood. The aim of this study was to characterize "mulungu" rhizobia from Caatinga. Bacteria were obteined from Serra Talhada and Caruaru in Caatinga under natural regeneration. The bacteria were evaluated to the amplification of nifH and nodC and to metabolic characteristics. Ten selected bacteria identified by 16S rRNA sequences. They were tested in vitro to NaCl and temperature tolerance, auxin production and calcium phosphate solubilization. The symbiotic ability were assessed in an greenhouse experiment. A total of 32 bacteria were obtained and 17 amplified both symbiotic genes. The bacteria showed a high variable metabolic profile. Bradyrhizobium (6), Rhizobium (3) and Paraburkholderia (1) were identified, differing from their geographic origin. The isolates grew up to 45 °C to 0.51 mol L-1 of NaCl. Bacteria which produced more auxin in the medium with l-tryptophan and two Rhizobium and one Bradyrhizobium were phosphate solubilizers. All bacteria nodulated and ESA 90 (Rhizobium sp.) plus ESA 96 (Paraburkholderia sp.) were more efficient symbiotically. Diverse and efficient rhizobia inhabit the soils of Caatinga dry forests, with the bacterial differentiation by the sampling sites.(AU)

In vitro morphogenic response from zygotic embryos of Genipa americana / Resposta morfogênica in vitro de embriões zigóticos de Genipa americana

The aim of this study was to evaluate the in vitro morphogenic potential of genipap (Genipa americana L.) zygotic embryos. Seeds obtained from ripe fruits had their zygotic embryos excised and inoculated in MS medium with 4.44µM of 6-benzylaminopurine (BAP) and supplemented with 0.0; 1.07; 2.14 and 3.21µM of naphthalene acetic acid (NAA). The potential of explants regeneration and the shoot length and number of leaves in plantlets were evaluated. The in vitro regeneration of genipap is possible from the conversion of zygotic embryos in a MS medium with 4.44µM BAP supplemented with 3.21µM NAA.

O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial morfogênico in vitro de embriões zigóticos de jenipapeiro (Genipa americana L.). Sementes obtidas de frutos tiveram seus embriões zigóticos excisados e inoculados em meio MS com 4,44µM de 6-benzilaminopurina (BAP) suplementado com 0,0; 1,07; 2,14 e 3,21µM de ácido naftaleno acético (ANA). O potencial de regeneração dos explantes e o comprimento da parte aérea e o número de folhas nas plântulas formadas foi avaliado. Observou-se que é possível a regeneração in vitro de jenipapeiro a partir da conversão de embriões zigóticos em meio MS com 4,44µM de BAP, suplementado com 3,21µM de ANA.

In vitro morphogenic response from zygotic embryos of Genipa americana / Resposta morfogênica in vitro de embriões zigóticos de Genipa americana

The aim of this study was to evaluate the in vitro morphogenic potential of genipap (Genipa americana L.) zygotic embryos. Seeds obtained from ripe fruits had their zygotic embryos excised and inoculated in MS medium with 4.44µM of 6-benzylaminopurine (BAP) and supplemented with 0.0; 1.07; 2.14 and 3.21µM of naphthalene acetic acid (NAA). The potential of explants regeneration and the shoot length and number of leaves in plantlets were evaluated. The in vitro regeneration of genipap is possible from the conversion of zygotic embryos in a MS medium with 4.44µM BAP supplemented with 3.21µM NAA.(AU)

O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial morfogênico in vitro de embriões zigóticos de jenipapeiro (Genipa americana L.). Sementes obtidas de frutos tiveram seus embriões zigóticos excisados e inoculados em meio MS com 4,44µM de 6-benzilaminopurina (BAP) suplementado com 0,0; 1,07; 2,14 e 3,21µM de ácido naftaleno acético (ANA). O potencial de regeneração dos explantes e o comprimento da parte aérea e o número de folhas nas plântulas formadas foi avaliado. Observou-se que é possível a regeneração in vitro de jenipapeiro a partir da conversão de embriões zigóticos em meio MS com 4,44µM de BAP, suplementado com 3,21µM de ANA.(AU)

Genetic transformation of the Brazilian BR 451 maize variety by the Agrobacterium tumefaciens method / Transformação genética da variedade brasileira de milho BR 451 pelo método da Agrobacterium tumefaciens

The asexually gene introduction by genetic engineering has brought enormous possibilities to innovate plant breeding. However, principally because of the low in vitro response, genetic transformation has been restricted to only certain genotypes of agronomically significant species. With the objective of establishing a protocol for genetically transforming the Brazilian BR 451 maize variety through Agrobacterium tumefaciens, it was studied the capacity of plant regeneration in vitro from embryogenic calli cultivated in three regeneration media, each having different growth regulators. It was also evaluated the temperature stress effect on the transformation of the immature embryos with A. tumefaciens EHA 101 containing the plasmid pTF102 with uidA and bar genes. The BR 451 variety embryos and those of the Hi-II hybrid (control) were exposed to three treatments applied as they were being infected with the agrobacteria (a) infection at 25°C; (b) infection at 40°C; (c) pretreatment at 40°C for 5 seconds followed by infection at 25°C. Transformation was determined by uidA gene expression and through the callus resistant to the herbicide Bialaphos® formation. Embryos infected at 40°C showed a higher degree of genetic transformation in the Hi-II, although the same was not noted in BR 451. When growth regulators were added to the culture medium the number of regenerated BR 451 plants showed no increase.(AU)

A introdução de genes de forma assexual por meio da engenharia genética tem ampliado as possibilidades do melhoramento genético vegetal. No entanto, devido principalmente a baixa resposta in vitro, a transformação genética tem se limitado a poucos genótipos das espécies de interesse agronômico. Visando estabelecer protocolo de transformação genética da variedade de milho BR 451 via Agrobacterium tumefaciens, foi estudada a capacidade de regeneração de plantas in vitro a partir de calos embriogênicos cultivados em três meios de regeneração contendo diferentes reguladores de crescimento. Também foi avaliado o efeito do estresse de temperatura na transformação de embriões imaturos com a A. tumefaciens EHA 101portadora do plasmídeo pTF102 que contém os genes uidA e bar. Para tal, três tratamentos foram aplicados aos embriões da variedade BR 451 e do híbrido Hi-II (controle) durante a infecção com a agrobactéria: (a) infecção em 25oC; (b) infecção a 40oC; (c) pré-tratamento de 40oC por cinco segundos seguido por infecção em 25oC. A transformação foi avaliada mediante a expressão do gene uidA e a formação de calos resistentes ao herbicida Bialaphos®. A infecção de embriões a 40oC aumentou a transformação genética em Hi-II, mas não em BR 451. A adição de reguladores de crescimento no meio de regeneração não incrementou o número de plantas regeneradas.(AU)

Flask sealing on in vitro seed germination and morphogenesis of two types of ornamental pepper explants / Tipo de vedação na germinação e na morfogênese in vitro de dois tipos de explante de pimenteira ornamental

The influence of flask sealing and explant source on the in vitro morphogenesis of pepper, were evaluated in Capsicum annuum. Seeds were sterilized and inoculated in Murashige and Skoog media supplemented with vitamins, myo-inositol, sucrose, and agar. Gas exchange was evaluated in the germination stage by comparing 3 flask-sealing systems: rigid polypropylene lids (PLs) without vents, PLs with 1 vent, and PLs with 2 vents covered with membranes. In the regeneration stage, cotyledon and hypocotyl segments were transferred to the organogenesis-inducing media, being the different sealing types also tested in a factorial scheme. Photosynthetic pigments, morphological and hystological analyses were conducted for each treatment. Plants maintained in glass flasks capped with vented lids showed more vigorous growth and differentiated anatomical structures. These treatments resulted in taller plants, higher numbers and more expanded leaves, higher fresh and dry weights, and an increase in photosynthetic pigments. Cultivation of C. annuum in flasks with reduced gas exchange was more effective on callus induction. During the regeneration stage, hypocotyls were more effective than cotyledons. Sealing type influenced the morphogenic responses of pepper, demonstrating that an increase in gas exchange has a positive effect on biomass production and acclimatization of the plantlets.

Objetivando avaliar a influência de trocas gasosas e da fonte de explante na morfogênese in vitro de pimenteira ornamental, sementes de Capsicum annuum foram desinfestadas e inoculadas em meio de Murashige e Skoog suplementado com vitaminas, mio-inositol, sacarose e ágar. O efeito das trocas gasosas foi avaliado na fase de germinação, utilizando três tipos de vedações nos frascos: tampas de polipropileno rígido (TPR) sem membrana (controle), TPR com um orifício (10mm de diâmetro) coberto com membrana e TPR com dois orifícios cobertos com membranas permeáveis à gases. Na fase de regeneração, segmentos de hipocótilo e cotilédones foram transferidos para o meio de indução de organogênese e os diferentes tipos de vedação foram novamente testados em esquema fatorial. Análises anatômicas de pigmentos fotossintéticos e de características morfológicas foram realizadas. Plântulas cultivadas em frascos com tampas com membranas apresentaram estruturas anatômicas diferenciadas e mais vigorosas. Esses tratamentos resultaram em plântulas maiores, com folhas mais expandidas, maior número de folhas, maior massa fresca e seca e maior quantidade de pigmentos fotossintéticos. O cultivo de C. annuum em frascos com menores trocas gasosas foi mais eficaz na indução de calos. Durante o estágio de regeneração, hipocótilos foram mais eficazes do que cotilédones. O tipo de vedação influenciou nas respostas morfogênicas em pimenteira, demonstrando que o aumento nas trocas gasosas tem um efeito positivo sobre a produção de biomassa e aclimatização das plântulas.

Flask sealing on in vitro seed germination and morphogenesis of two types of ornamental pepper explants / Tipo de vedação na germinação e na morfogênese in vitro de dois tipos de explante de pimenteira ornamental

The influence of flask sealing and explant source on the in vitro morphogenesis of pepper, were evaluated in Capsicum annuum. Seeds were sterilized and inoculated in Murashige and Skoog media supplemented with vitamins, myo-inositol, sucrose, and agar. Gas exchange was evaluated in the germination stage by comparing 3 flask-sealing systems: rigid polypropylene lids (PLs) without vents, PLs with 1 vent, and PLs with 2 vents covered with membranes. In the regeneration stage, cotyledon and hypocotyl segments were transferred to the organogenesis-inducing media, being the different sealing types also tested in a factorial scheme. Photosynthetic pigments, morphological and hystological analyses were conducted for each treatment. Plants maintained in glass flasks capped with vented lids showed more vigorous growth and differentiated anatomical structures. These treatments resulted in taller plants, higher numbers and more expanded leaves, higher fresh and dry weights, and an increase in photosynthetic pigments. Cultivation of C. annuum in flasks with reduced gas exchange was more effective on callus induction. During the regeneration stage, hypocotyls were more effective than cotyledons. Sealing type influenced the morphogenic responses of pepper, demonstrating that an increase in gas exchange has a positive effect on biomass production and acclimatization of the plantlets. (AU)

Objetivando avaliar a influência de trocas gasosas e da fonte de explante na morfogênese in vitro de pimenteira ornamental, sementes de Capsicum annuum foram desinfestadas e inoculadas em meio de Murashige e Skoog suplementado com vitaminas, mio-inositol, sacarose e ágar. O efeito das trocas gasosas foi avaliado na fase de germinação, utilizando três tipos de vedações nos frascos: tampas de polipropileno rígido (TPR) sem membrana (controle), TPR com um orifício (10mm de diâmetro) coberto com membrana e TPR com dois orifícios cobertos com membranas permeáveis à gases. Na fase de regeneração, segmentos de hipocótilo e cotilédones foram transferidos para o meio de indução de organogênese e os diferentes tipos de vedação foram novamente testados em esquema fatorial. Análises anatômicas de pigmentos fotossintéticos e de características morfológicas foram realizadas. Plântulas cultivadas em frascos com tampas com membranas apresentaram estruturas anatômicas diferenciadas e mais vigorosas. Esses tratamentos resultaram em plântulas maiores, com folhas mais expandidas, maior número de folhas, maior massa fresca e seca e maior quantidade de pigmentos fotossintéticos. O cultivo de C. annuum em frascos com menores trocas gasosas foi mais eficaz na indução de calos. Durante o estágio de regeneração, hipocótilos foram mais eficazes do que cotilédones. O tipo de vedação influenciou nas respostas morfogênicas em pimenteira, demonstrando que o aumento nas trocas gasosas tem um efeito positivo sobre a produção de biomassa e aclimatização das plântulas. (AU)

Flask sealing on in vitro seed germination and morphogenesis of two types of ornamental pepper explants

ABSTRACT: The influence of flask sealing and explant source on the in vitro morphogenesis of pepper, were evaluated in Capsicum annuum. Seeds were sterilized and inoculated in Murashige and Skoog media supplemented with vitamins, myo-inositol, sucrose, and agar. Gas exchange was evaluated in the germination stage by comparing 3 flask-sealing systems: rigid polypropylene lids (PLs) without vents, PLs with 1 vent, and PLs with 2 vents covered with membranes. In the regeneration stage, cotyledon and hypocotyl segments were transferred to the organogenesis-inducing media, being the different sealing types also tested in a factorial scheme. Photosynthetic pigments, morphological and hystological analyses were conducted for each treatment. Plants maintained in glass flasks capped with vented lids showed more vigorous growth and differentiated anatomical structures. These treatments resulted in taller plants, higher numbers and more expanded leaves, higher fresh and dry weights, and an increase in photosynthetic pigments. Cultivation of C. annuum in flasks with reduced gas exchange was more effective on callus induction. During the regeneration stage, hypocotyls were more effective than cotyledons. Sealing type influenced the morphogenic responses of pepper, demonstrating that an increase in gas exchange has a positive effect on biomass production and acclimatization of the plantlets.

RESUMO: Objetivando avaliar a influência de trocas gasosas e da fonte de explante na morfogênese in vitro de pimenteira ornamental, sementes de Capsicum annuum foram desinfestadas e inoculadas em meio de Murashige e Skoog suplementado com vitaminas, mio-inositol, sacarose e ágar. O efeito das trocas gasosas foi avaliado na fase de germinação, utilizando três tipos de vedações nos frascos: tampas de polipropileno rígido (TPR) sem membrana (controle), TPR com um orifício (10mm de diâmetro) coberto com membrana e TPR com dois orifícios cobertos com membranas permeáveis à gases. Na fase de regeneração, segmentos de hipocótilo e cotilédones foram transferidos para o meio de indução de organogênese e os diferentes tipos de vedação foram novamente testados em esquema fatorial. Análises anatômicas de pigmentos fotossintéticos e de características morfológicas foram realizadas. Plântulas cultivadas em frascos com tampas com membranas apresentaram estruturas anatômicas diferenciadas e mais vigorosas. Esses tratamentos resultaram em plântulas maiores, com folhas mais expandidas, maior número de folhas, maior massa fresca e seca e maior quantidade de pigmentos fotossintéticos. O cultivo de C. annuum em frascos com menores trocas gasosas foi mais eficaz na indução de calos. Durante o estágio de regeneração, hipocótilos foram mais eficazes do que cotilédones. O tipo de vedação influenciou nas respostas morfogênicas em pimenteira, demonstrando que o aumento nas trocas gasosas tem um efeito positivo sobre a produção de biomassa e aclimatização das plântulas.

Isolation, expansion and differentiation of mesenchymal stromal cells from rabbits' bone marrow / Isolamento, expansão e diferenciação de celulas tronco mesenquimais oriundas da medula óssea de coelhos

Tissue engineering has been a fundamental technique in the regenerative medicine field, once it permits to build tri-dimensional tissue constructs associating undifferentiated mesenchymal cells (or mesenchymal stromal cells - MSCs) and scaffolds in vitro. Therefore, many studies have been carried out using these cells from different animal species, and rabbits are often used as animal model for in vivo tissue repair studies. However, most of the information available about MSCs harvesting and characterization is about human and murine cells, which brings some doubts to researchers who desire to work with a rabbit model in tissue repair studies based on MSCs. In this context, this study aimed to add and improve the information available in the scientific literature providing a complete technique for isolation, expansion and differentiation of MSCs from rabbits. Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) from humerus and femur of rabbits were obtained and to evaluate their proliferation rate, three different culture media were tested, here referred as DMEM-P, DMEM´S and α-MEM. The BMMCs were also cultured in osteogenic, chondrogenic and adipogenic induction media to prove their multipotentiality. It was concluded that the techniques suggested in this study can provide a guideline to harvest and isolate MSCs from bone marrow of rabbits in enough amount to allow their expansion and, based on the laboratory experience where the study was developed, it is also suggested a culture media formulation to provide a better cell proliferation rate with multipotentiality preservation.(AU)

A engenharia de tecidos tem sido uma técnica fundamental no campo da medicina regenerativa, uma vez que permite a criação de peças teciduais tri-dimensionais por meio da associação de células mesenquimais indiferenciadas (ou células estromais mesenquimais - CEMs) e moldes de biomateriais in vitro. Assim, muitos estudos têm sido realizados utilizando estas células oriundas de diferentes espécies animais, e os coelhos são frequentemente utilizados como um modelo animal para estudos in vivo de reparação tecidual. No entanto, a maioria das informações disponíveis sobre a coleta e caracterização de CEMs referem-se às células humanas e murinas, o que traz algumas dúvidas para pesquisadores que desejam trabalhar com coelhos em estudos de reparação de tecidos baseados em CEMs. Neste contexto, o presente estudo objetivou contribuir e aprimorar as informações disponíveis na literatura científica fornecendo uma técnica completa para o isolamento, expansão e diferenciação das MSCs de coelhos. Células mononucleares da medula óssea (CMMOs) do úmero e fêmur de coelhos foram obtidas e, para avaliar sua taxa de proliferação, três meios de cultura diferentes foram testadas, aqui referidos como DMEM-P, DMEM'S e α-MEM. As CMMOs também foram cultivadas em meios de indução osteogênico, condrogênico, e linhagens adipogênico para provar a sua multipotencialidade. Concluiu-se que as técnicas sugeridas neste estudo podem fornecer um guia para a coleta e isolamento de CEMs da medula óssea de coelhos em quantidade suficiente para permitir a sua expansão e, com base na experiência de laboratório onde o estudo foi desenvolvido, é também sugerida uma formulação de meio de cultivo para proporcionar uma melhor taxa de proliferação celular com preservação da multipotencialidade.(AU)

Functional analysis of the SAP30 gene and its relation to muscle development

Entender a maquinaria molecular envolvida em determinadas características de interesse econômico é importante para que informações genéticas possam ser aplicadas junto aos programas de melhoramento animal, visando estabelecer maior acurácia na seleção genômica. Estudos de GWAS identificaram regiões de QTL e CNV localizadas no cromossomo 4 na espécie Gallus gallus, em uma população brasileira de frangos de corte, associadas com características de desenvolvimento muscular, como peso e porcentagem de peito. Buscas por genes candidatos presentes nessas regiões e que pudessem estar participando do desenvolvimento muscular foram realizadas. O gene SAP30 foi identificado como um possível candidato ao desenvolvimento muscular. Diante disso, e com o objetivo de validar sua função, SAP30 foi editado usando CRISPR/Cas9 e teve sua expressão reduzida por meio de siRNA, em cultura de mioblastos in vitro. Após essas análises, análises morfométricas foram realizadas na cultura celular para avaliar as alterações ocorridas no tamanho de área dessas células. Posteriormente, as análises de sequenciamento de RNA, genes diferencialmente expressos e enriquecimento funcional foram realizadas para investigar redes gênicas e processos biológicos que as mutações e/ou redução da expressão do SAP30 estariam ocasionando. Os resultados para ambos os trabalhos mostram o envolvimento do SAP30 na hipertrofia de células musculares. Tanto a redução na expressão do gene, quanto a indução de mutações em sua sequência, fizeram com que os miotubos tivessem maior área nos grupos tratados, quando comparado aos controles. As análises de sequenciamento de RNA revelaram, para ambos, uma importante diferença na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento muscular, bem como, genes que atuam em vias de formação e regeneração do músculo. Assim, pela primeira vez, apresentamos o gene SAP30 como um possível regulador de hipertrofia muscular.

Understanding the molecular machinery involved in certain traits of economic interest is important because the genetic information can be applied to animal breeding programs, defining greater accuracy in genomic selection. GWAS studies have identified general QTL and CNV regions on chromosome 4 in Gallus gallus species, in a Brazilian broiler population, associated with muscle development traits such as weight and percentage of breast. Searches for candidate genes present in these regions and that could be participating in muscle development were performed. The SAP30 gene was identified as a possible candidate for muscle development. Therefore, and to validate its function, SAP30 was edited using CRISPR/Cas9 and had its expression reduced by means of siRNA, in myoblast culture in vitro. After these analyses, morphometric analyzes were performed in cell culture to evaluate changes in the area size of these cells. Subsequently, RNA sequencing, differentially expressed genes and functional enrichment analyzes were performed to investigate gene networks and biological processes that mutations and/or reduced expression of SAP30 would be causing. The results for both papers presented the involvement of SAP30 in muscle cell hypertrophy. Both the reduction in gene expression and the induction of mutations in its sequence made the myotubes have a larger area in the treated groups when compared to controls. RNA sequencing analyzes revealed, for both, an important difference in the expression of genes related to muscle development, as well as genes that act in muscle formation and regeneration pathways. So, for the first time, we present the SAP30 gene as a possible regulator of muscle hypertrophy.

Exploring the in vivo wound healing effects of a recombinant hemolin from the caterpillar Lonomia obliqua

Background Hemolin proteins are cell adhesion molecules from lepidopterans involved in a wide range of cell interactions concerning their adhesion properties. However, hemolin's roles in cell proliferation and wound healing are not fully elucidated. It has been recently reported that rLosac, a recombinant hemolin from the caterpillar Lonomia obliqua, presents antiapoptotic activity and is capable of improving in vitro wound healing. Therefore, this study aimed to explore rLosac's in vivo effects using a skin wound healing model in rats. Methods Circular full-thickness wounds in the rat dorsum skin were treated either with rLosac, or with saline (control), allowing healing by keeping the wounds occluded and moist. During the wound healing, the following tissue regeneration parameters were evaluated: wound closure and collagen content. Furthermore, tissue sections were subjected to histological and immunohistochemical analyses. Results The rLosac treatment has demonstrated its capacity to improve wound healing, as reflected in findings of a larger number of activated fibroblasts, proliferation of epithelial cells, increase of collagen type 1, and decrease of inflammatory infiltrate. Conclusion The findings have indicated the rLosac protein as a very promising molecule for the development of new wound-healing formulations.(AU)

CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS CULTIVADAS COM DESFERROXAMINE (DFO) E INTERFERON GAMMA, MIMETIZANDO CONDIÇÕES DE HIPÓXIA E INFLAMAÇÃO

As células tronco mesenquimais (MSC) tem se destacado como candidatas ao uso em terapias regenerativas. Porém, foi demonstrado que nem todas as condições clínicas podem ser favorecidas pela presença das MSCs, já que suas propriedades são influenciadas pelas condições do microambiente onde serão aplicadas, que normalmente estão acompanhadas da presença de fatores inflamatórios e isquêmicos. Devido a isto, este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos in vitro da adição de DFO e/ou ao IFN- no meio de cultivo de células tronco mesenquimais (MSCs do inglês Mesenchymal Stem Cells) de tecido adiposo canino (cAT-MSCs). Foram utilizadas MSCs originadas de 6 cadelas e pertencentes a um banco celular em terceira passagem. As amostras foram divididas em 4 grupos, controle (MSCs em condições normais de cultivo em meio de manutenção), grupo DFO (50 µmol de DFO no meio de manutenção), grupo IFN- (50 ng/mL de IFN- no meio de manutenção) e grupo IFN-/DFO (50 µmol de DFO e 50 ng/mL IFN- no meio de manutenção). O teste de proliferação foi feito por 144 horas de cultivo e, viabilidade, apoptose e expressão gênica foram avaliadas após 48 horas de cultivo. Na expressão genica foram analisados transcritos relacionados com apoptose (BCL2, CASP8 e CASP9), sobrevivência celular (DKC1, HDAC1 e DNMT1), imunomodulação (HGF, IDO, PGE2 e IL-6), proliferação e diferenciação (FGF2), angiogênese (MMP2 e VEGFA), reguladores do ciclo celular (Cyclin-D1 e TP53) e regulador celular de resposta adaptativa a hipóxia (HIF1-). As cAT-MSCs mostraram durante e ao final do cultivo morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico. No entanto, os grupos tratados apresentaram maior distanciamento entre as células aderidas. Após 144 horas de cultivo, todos os grupos tiveram comportamento similar quanto a curva de proliferação celular, com diminuição da concentração nas primeiras 48 horas, seguido por uma fase de manutenção e finalizando com um ligeiro crescimento. A expressão gênica revelou que as cAT-MSCs tratadas com IFN- apresentaram um incremento na expressão do gene pró-apoptótico Casp9 quando comparado com o grupo IFN-/DFO; o gene FGF2 importante para os processos de proliferação e diferenciação celular foi aumentado no grupo IFN- quando comparado aos outros grupos tratados; os genes DKC1 e TP53 envolvidos com a sobrevida celular e supressão tumoral respectivamente, tiveram um incremento no grupo IFN- quando comparado com o grupo DFO; a expressão do gene relacionado com os processos de angiogênese, o VEGFA, foi maior nos grupos onde o DFO foi usado. Concluímos que condicionar as cAT-MSCs com a citocina pro-inflamatória IFN- estimulou um aumento na sobrevivência, proliferação celular e angiogênese mediada por MMP2. Já a mimetização de hipóxia, levou a uma diminuição da expressão de genes relacionados a estas propriedades associadas a um estímulo para a angiogênese dependente de VEGF. Apesar disso, os genes relacionados a imunomodulação não foram influenciados pelas condições de cultivo. Os resultados obtidos indicam que as propriedades de indução da regeneração tecidual foram mais afetadas pelas condições de cultivo, em comparação às propriedades imunomodulados das cAT-MSC

Mesenchymal stem cells (MSC) have been highlighted as candidates for use in regenerative therapies. However, it has been shown that not all clinical conditions can be favored by the presence of MSCs, as their properties are influenced by the conditions of the microenvironment where it will be applied, conditions that are usually accompanied by the presence of inflammatory and ischemic factors. So, this study aimed to evaluate the in vitro effects of the addition of DFO and/or IFN- in the culture medium of mesenchymal stem cells (MSCs Mesenchymal Stem Cells) from canine adipose tissue (cAT-MSCs). MSCs from 6 bitches and belonging to a cell bank in the third passage were used. Samples were divided in 4 groups: Control (MSCs under standard culture conditions in maintenance medium); DFO group (50 µM of DFO in maintenance medium), IFN- Group (50 ng/mL of IFN- in maintenance medium) and IFN-/DFO group (50 µM of DFO and 50 ng/mL IFN- in maintenance medium). Proliferation test was performed for 144 hours of culture and viability, apoptosis and gene expression were evaluated after 48 hours of culture. In gene expression, transcripts related to apoptosis (BCL2, CASP8 and CASP9), cell survival (DKC1, HDAC1 and DNMT1), immunomodulation (HGF, IDO, PGE2 and IL-6), proliferation and differentiation (FGF2), angiogenesis (MMP2 and VEGFA), cell cycle regulators (Cyclin-D1 and TP53) and cellular regulator of adaptive response to hypoxia (HIF1-) were analyzed. The cAT-MSCs showed fibroblastoid morphology and plastic adherence during and at the end of the culture. However, the treated groups showed greater distance between adhered cells. After 144 hours of culture, all groups had a similar behavior regarding the cell proliferation curve, with a decrease in concentration in the first 48 hours, followed by a maintenance phase and ending with a slight growth. Gene expression revealed that cAT-MSCs treated with IFN- showed an increase in the expression of the pro-apoptotic Casp9 gene when compared to the IFN-/DFO group; the FGF2 gene important for cell proliferation and differentiation processes was increased in the IFN- group when compared to the other treated groups; the DKC1 and TP53 genes involved with cell survival and tumor suppression respectively, had an increase in the IFN- group when compared to the DFO group; the expression of the gene related to the angiogenesis processes, VEGFA, was higher in the groups where DFO was used. We conclude that conditioning cAT-MSCs with the pro-inflammatory cytokine IFN- stimulated an increase in survival, cell proliferation and MMP2-mediated angiogenesis. The mimicry of hypoxia, on the other hand, led to a decrease in the expression of genes related to these properties associated with a stimulus for VEGF-dependent angiogenesis. Despite this, genes related to immunomodulation were not influenced by culture conditions. The results obtained indicate that tissue regeneration induction properties were more affected by culture conditions, compared to the immunomodulated properties of cAT-MSC.