Cell differentiation events in pre-implantation mouse and bovine embryos

Abstract Early mammal embryogenesis starts with oocyte fertilization, giving rise to the zygote. The events that the newly formed zygote surpasses are crucial to the embryo developmental success. Shortly after activation of its genome, cells of the embryo segregate into the inner cell mass (ICM) or the trophectoderm (TE). The first will give rise to the embryo while the latter will become the placenta. This first segregation involves cellular and molecular processes that include cell polarity linked to intracellular pathway activation, which will regulate the transcription of trophectoderm-related genes. Then, cells of the ICM undergo the second event of mammalian cell differentiation, which consists of the separation between epiblast (EPI) and hypoblast or primitive endoderm (PrE). This second segregation involves paracrine signaling, leading to differential expression of key genes that will dictate the fate of the cell. Although these processes are described in detail in the mouse, recent studies suggest that the bovine embryo could also be an interesting model for early development, since there are differences to the mouse and similarities with early human embryogenesis. In this review, we gathered the main data available in the literature upon bovine and mouse early development events, suggesting that both models should be analyzed and studied in a complementary way, to better model early events occurring in human development.

Cell differentiation events in pre-implantation mouse and bovine embryos

Early mammal embryogenesis starts with oocyte fertilization, giving rise to the zygote. The events that the newly formed zygote surpasses are crucial to the embryo developmental success. Shortly after activation of its genome, cells of the embryo segregate into the inner cell mass (ICM) or the trophectoderm (TE). The first will give rise to the embryo while the latter will become the placenta. This first segregation involves cellular and molecular processes that include cell polarity linked to intracellular pathway activation, which will regulate the transcription of trophectoderm-related genes. Then, cells of the ICM undergo the second event of mammalian cell differentiation, which consists of the separation between epiblast (EPI) and hypoblast or primitive endoderm (PrE). This second segregation involves paracrine signaling, leading to differential expression of key genes that will dictate the fate of the cell. Although these processes are described in detail in the mouse, recent studies suggest that the bovine embryo could also be an interesting model for early development, since there are differences to the mouse and similarities with early human embryogenesis. In this review, we gathered the main data available in the literature upon bovine and mouse early development events, suggesting that both models should be analyzed and studied in a complementary way, to better model early events occurring in human development.(AU)

Morphometry of bovine blastocysts produced in vitro in culture media with antioxidants cysteamine or oily extract of Lippia origanoides / [Morfometria de blastocistos bovinos produzidos in vitro em meio de cultura com antioxidantes cisteamina ou extrato oleoso de Lippia origanoides]

This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50µM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5µg/mL, 5.0µg/mL or 10.0µg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50µM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5µg/mL, 5,0µg/mL ou 10,0µg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Leiomioma de bexiga em um cão / Bladder leiomyoma in a male dog

Background: In dogs, neoplasms of the urinary bladder are uncommon; among urinary bladder tumors, transitional cell carcinoma is the most frequent type. Urinary bladder leiomyomas are rare mesenchymal tumors whose etiology is associated with urinary retention and exposure to carcinogens. Diagnosis of this neoplasm can be determined by histopathological analysis, and treatment is surgical. The aim of this report is to describe a case of leiomyoma in the urinary bladder of a dog.Case: A 10-year-old male mongrel dog was examined at the Veterinary Hospital of Federal University of Paraíba, where a mass in the urinary bladder was identified, and was estimated to have been developing over the course of a month. Hematuria, congested ocular mucosa, and engorged episcleral vessels were observed during the physical examination. Ultrasonographic examination confirmed distension of the urinary bladder, which exhibited anechoic content and echogenic sediment. A neoplasm measuring 8 x 3.39 cm was detected in the bladder wall. This neoplasm had mixed echogenicity, heterogeneous echotexture, and well-defined borders. Color Doppler ultrasonography allowed observation of vascularization inside the mass. The animal was subjected to cystotomy to excise the mass, which was slightly adhered to the inner wall of the bladder. After this procedure, the excised specimen was submitted for histopathological analysis. Macroscopic examination revealed that the mass was firm, lobulated, nodular, and resistant to cutting. The sample was fixed in 10% formalin; the fragments were processed and stained with hematoxylin and eosin (HE) or Masson’s trichrome (MT) for analysis by optical microscopy. The histopathological examination revealed that the mass was encapsulated, had well-delimited borders composed by bundles of elongated cells with no atypical characteristics. These cells exhibited a slightly eosinophilic cytoplasm that contained moderate to abundant fusiform nuclei.[...]

Leiomioma de bexiga em um cão / Bladder leiomyoma in a male dog

Background: In dogs, neoplasms of the urinary bladder are uncommon; among urinary bladder tumors, transitional cell carcinoma is the most frequent type. Urinary bladder leiomyomas are rare mesenchymal tumors whose etiology is associated with urinary retention and exposure to carcinogens. Diagnosis of this neoplasm can be determined by histopathological analysis, and treatment is surgical. The aim of this report is to describe a case of leiomyoma in the urinary bladder of a dog.Case: A 10-year-old male mongrel dog was examined at the Veterinary Hospital of Federal University of Paraíba, where a mass in the urinary bladder was identified, and was estimated to have been developing over the course of a month. Hematuria, congested ocular mucosa, and engorged episcleral vessels were observed during the physical examination. Ultrasonographic examination confirmed distension of the urinary bladder, which exhibited anechoic content and echogenic sediment. A neoplasm measuring 8 x 3.39 cm was detected in the bladder wall. This neoplasm had mixed echogenicity, heterogeneous echotexture, and well-defined borders. Color Doppler ultrasonography allowed observation of vascularization inside the mass. The animal was subjected to cystotomy to excise the mass, which was slightly adhered to the inner wall of the bladder. After this procedure, the excised specimen was submitted for histopathological analysis. Macroscopic examination revealed that the mass was firm, lobulated, nodular, and resistant to cutting. The sample was fixed in 10% formalin; the fragments were processed and stained with hematoxylin and eosin (HE) or Massons trichrome (MT) for analysis by optical microscopy. The histopathological examination revealed that the mass was encapsulated, had well-delimited borders composed by bundles of elongated cells with no atypical characteristics. These cells exhibited a slightly eosinophilic cytoplasm that contained moderate to abundant fusiform nuclei.[...](AU)

Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino

A separação entre massa interna celular (MCI) e trofectoderma (TE) é o primeiro evento de diferenciação celular que ocorre no embrião mamífero, seguida pela diferenciação na MCI do epiblasto (EPI) e endoderma primitivo (PE). Falhas nestes processos de desenvolvimento inicial podem ocasionar perdas embrionárias e consequentemente econômicas. A influência do sistema de produção embrionária nos primeiros eventos de diferenciação celular precisa ser mais elucidada, refletindo em índices que ainda podem ser melhorados na produção de embriões bovinos in vitro. O soro fetal bovino (SFB), apesar de seus efeitos deletérios sobre fatores epigenéticos, ainda é usado em sistemas de produção in vitro e pode influenciar esta diferenciação. Ainda, as técnicas para estudo dos embriões normalmente envolvem a destruição dos mesmos e não permitem acompanhar em tempo real a dinâmica de expressão dos genes relacionados à diferenciação em MCI e TE. Novas técnicas como CRISPR/Cas9 permitem alteração direcionada da sequência de DNA genômico, assim, a introdução direcionada de proteínas fluorescentes repórteres permitiria a visualização em tempo real da expressão de genes de interesse nos embriões. Diante disso, nossos objetivos foram: testar a influência do soro fetal bovino nas primeiras diferenciações e, realizar a inserção dirigida de uma proteína repórter fluorescente na região do gene SOX2 por recombinação homóloga. Ainda, comparamos a eficiência da inserção gênica com uso do sistema CRISPR em diferentes momentos do desenvolvimento embrionário, com diferentes horários pós inseminação e com diferentes concentrações de material injetado. No primeiro experimento observamos que a retirada do SFB do cultivo embrionário não causa alterações na alocação de células na MCI ou TE, quando se alia esta remoção à renovação de uma parte do meio de cultivo às 90 horas pós inseminação (hpi). A ausência de suplementação de SFB ou de meio de cultivo levou à diminuição das células do TE, entretanto não alterou o número de células do PE. No segundo experimento, nenhum embrião produzido apresentou fluorescência, portanto todos os blastocistos tiveram seu DNA extraído para genotipagem. Foi realizada uma amostragem, e de 34 embriões verificados, um apresentou banda correspondente ao local do inserto e também banda correspondente ao embrião controle (wild type), sugerindo mosaicismo. Ao final, observamos que as melhores probabilidades de inserção gênica nos embriões bovinos aconteceram quando a injeção dos componentes do sistema CRISPR foi realizada após 8 horas de FIV e com maiores concentrações. Em conclusão, pudemos remover o SFB do nosso sistema de produção de embriões e surpreendentemente o SFB não influenciou a diferenciação em PE. Ainda, são necessários maiores estudos a fim de se otimizar a ferramenta para a obtenção de knock-in em embriões bovinos, principalmente para que se obtenha taxas de maior sucesso e redução da probabilidade de ocorrência de mosaicismo nestes embriões.

The separation between inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) is the first cell differentiation event that occurs in the mammalian embryo, followed by differentiation into the epiblast MCI (EPI) and primitive endoderm (PE). Failures in these early development processes can lead to embryonic and subsequent economic losses. The influence of the embryo production system on the first cell differentiation events needs to be further elucidated, reflecting in rates that can still be improved in the production of in vitro bovine embryos. Fetal bovine serum (FBS), despite its deleterious effects on epigenetic factors, is still used in in vitro production systems and may influence this differentiation. Furthermore, the techniques for studying embryos usually involve their destruction and do not allow real-time monitoring of the expression dynamics of genes related to differentiation in ICM and TE. New techniques such as CRISPR/Cas9 allow targeted alteration of genomic DNA sequence, thus targeted introduction of fluorescent reporter proteins would allow real-time visualization of the expression of genes of interest in embryos. Therefore, our objectives were: to test the influence of fetal bovine serum in the first differentiations and to carry out the targeted insertion of a fluorescent reporter protein in the region of the SOX2 gene by homologous recombination. Furthermore, we compared the efficiency of gene insertion using the CRISPR system at different moments of embryonic development, with different times after insemination and with different concentrations of injected material. In the first experiment, we observed that FBS removal from the embryonic culture does not cause changes in cell allocation in the ICM or TE, when this removal is combined with the renewal of a part of the culture medium at 90 hours after insemination (hpi). The absence of FBS or culture medium supplementation led to a decrease in TE cells, however it did not change the number of PE cells. In the second experiment, no embryo showed a fluorescent signal, so all blastocysts had their DNA extracted for genotyping. We sampled 34 embryos and one presented a band corresponding to the insertion site and also a band corresponding to the control embryo (wild type), suggesting mosaicism. We observed that best chances of gene insertion occurred when the injection of components of the CRISPR system was performed after 8 hours of IVF and with higher concentrations. In conclusion, we were able to remove SFB from our embryo production system and surprisingly SFB did not influence differentiation into PE. Still, further studies are needed in order to optimize the tool for obtaining knock-in in bovine embryos, mainly to obtain higher success rates and reduce the probability of occurrence of mosaicism in these embryos. Palavras-chave em inglês (separadas por vírgula): Gene editing. CRISPR/Cas9. Homologous Recombination. Blastocyst

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária.

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.(AU)

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária. (AU)

Bovine conceptus of Bos indicus produced by somatic cell nuclear transfer and parthenogenesis present morphological variations since the blastocyst stage / Conceptos bovinos (Bos indicus) produzidos por transferência nuclear de células somáticas e partenogênese apresentam variações morfológicas desde o estágio de blastocisto

In cattle, embryo development is characterized by the appearance of two distinct cell layers, the trophectoderm and the inner cell mass. The latter will undergo differentiation to form the embryonic disc consisting of the epiblast and hypoblast. The aim of this study was to ultrastructurally characterize the bovine embryo from different in vitro production techniques, with emphasis on trophectoderm and inner cell mass cells. Bovine embryos on day 7 (conception = D1) of pregnancy, derived via in vitro production techniques, were fixed for light and transmission electron microscopy processing. Results suggested that embryos produced by nuclear transfer of somatic cells and parthenogenesis showed significant changes in macroscopic and microscopic structure. Size was reduced, and the inner cell mass had no defined shape. Furthermore, organelles responsible for the absorption processes, communication, growth, and cellular metabolism were fewer and had changes in shape, when compared to results in embryos produced by in vitrofertilization. We concluded that embryos produced by parthenogenesis and SCNT exhibit morphological differences when compared with IVF embryos, such as undeveloped blastocoel, poorly defined distribution of ICM, and morphological differences in organelles(AU)

Em bovinos, o desenvolvimento embrionário é caracterizado pelo surgimento de duas camadas distintas, o trofectoderma e a massa celular interna. Este último irá sofrer diferenciação para formar o disco embrionário, o qual consiste em epiblasto e hipoblasto. O objetivo deste estudo foi caracterizar ultraestruturalmente o embrião bovino proveniente de diferentes técnicas de produção in vitro, com ênfase no trofectoderma e na massa celular interna. Embriões bovinos com sete dias de gestação (fecundação = D1), derivados de técnicas de produção in vitro, foram fixados para processamento de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os resultados sugerem que os embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas e partenogênese apresentaram alterações significativas em suas estruturas macro e microscópica. O tamanho foi reduzido, e a massa celular interna não tinha uma forma definida. Além disso, organelas responsáveis por processos de absorção, comunicação, crescimento e metabolismo celular estavam em menor número e tinham alterações na forma quando comparadas aos resultados em embriões produzidos por fertilização in vitro. Conclui-se que os embriões produzidos por SCNT e partenogênese apresentam diferenças morfológicas quando comparados aos embriões de fertilização in vitro, tais como blastocele pouco desenvolvida, massa celular interna pouco definida e diferenças morfológicas nas organelas(AU)

Effects of culture medium and substrate on attachment of in vitro produced bovine embryos

The study of large animal embryonic stem cells (ESCs) in vitro has implications for the understanding of lineage differentiation and transgenesis. The first step for ESC derivation is the attachment of the embryo to a substrate on which they can form outgrowths. However, the culture conditions for large animal embryo attachment and ESC derivation have not been studied extensively. Defining culture conditions for embryo attachment such as culture medium and substrate is an important first step for derivation of inner cell mass-derived stem cells. The aim of this study was to compare different types of culture media and substrates for their ability to support attachment of in vitro produced bovine embryos in culture. Bovine embryos were produced in vivo following established protocols. Blastocysts formed on day 8 after fertilization were transferred to 12-well culture plates containing different types of culture media (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM or Medium 199, M199) and substrates [bovine fetal fibroblasts, goat fetal fibroblasts, mouse embryonic fibroblasts (STO) or non-cellular substrates (gelatin, laminin, fibronectin)]. Percentage of attached embryos and number of days since fertilization required for attachment were recorded. Bovine blastocysts preferrably attached to feeder cells rather than non-cellular substrates and there was an interact ion of feeder cell type and culture medium used. Therefore, the choice of both feeder cell type and culture medium has to be considered when optimizing conditions to derive cell lines from bovine embryos.

Effects of culture medium and substrate on attachment of in vitro produced bovine embryos

The study of large animal embryonic stem cells (ESCs) in vitro has implications for the understanding of lineage differentiation and transgenesis. The first step for ESC derivation is the attachment of the embryo to a substrate on which they can form outgrowths. However, the culture conditions for large animal embryo attachment and ESC derivation have not been studied extensively. Defining culture conditions for embryo attachment such as culture medium and substrate is an important first step for derivation of inner cell mass-derived stem cells. The aim of this study was to compare different types of culture media and substrates for their ability to support attachment of in vitro produced bovine embryos in culture. Bovine embryos were produced in vivo following established protocols. Blastocysts formed on day 8 after fertilization were transferred to 12-well culture plates containing different types of culture media (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM or Medium 199, M199) and substrates [bovine fetal fibroblasts, goat fetal fibroblasts, mouse embryonic fibroblasts (STO) or non-cellular substrates (gelatin, laminin, fibronectin)]. Percentage of attached embryos and number of days since fertilization required for attachment were recorded. Bovine blastocysts preferrably attached to feeder cells rather than non-cellular substrates and there was an interact ion of feeder cell type and culture medium used. Therefore, the choice of both feeder cell type and culture medium has to be considered when optimizing conditions to derive cell lines from bovine embryos.(AU)

MELHORIA DO DESENVOLVIMENTO E CRIORESISTÊNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS in vitro COM ADIÇÃO DE MODULADORES DA APOPTOSE CELULAR E DA SÍNTESE LIPÍDICA

A produção de embriões bovinos in vitro é deficiente devido a aspectos tais como as condições subótimas onde se desenvolvem, as quais induzem a apoptose conduzindo a uma baixa criotolerância. Objetivou-se modular a ativação da apoptose e a síntese lipídica via ativação dos receptores proliferadores para diminuir a apoptose celular e aumentar a criotolerância. No experimento 1 foram colocados aleatoriamente para cultivo embrionário (dia 1) presumíveis zigotos (grupo controle n=609; grupo DHA n=611; e grupo L-165041 n=608). A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 (D2) e a produção de blastocistos no dia 7 (D7). Para avaliar a taxa de apoptose pre vitrificação foram fixados embriões no D7 para o ensaio de TUNEL. O acumulo lipídico foi analisado pela técnica de Sudan Black em embriões fixados no D7. No experimento 2 foram vitrificados e desvitrificados (grupo controle n=98; grupo DHA= 76; L- 165041= 111) para avaliar a taxa de eclosão. Aqueles embriões que eclodiram foram congelados para analisar o perfil lipídico pela técnica de espectrometria de massa (MALDI- MS). A taxa de apoptose pós vitrificação foi analisada pelo ensaio de TUNEL. No experimento 1 a produção de blastocistos em D7 foi menor no grupo DHA quando comparada com a produção dos grupos controle e L-165041 (P < 0.05). Por outro lado, a proporção de células da MCI foi maior, e as taxas de apoptose total e da MCI foram menores no grupo L- 165041 quando comparadas às dos grupos controle e DHA (P < 0,05). Por sua vez, o grupo DHA teve a menor proporção de MCI e as maiores taxas de apoptose total e da MCI quando comparado com os grupos controle e L-165041 (P < 0,05). No grupo DHA, as mitocôndrias exibiam sinais de estresse celular, assim como várias células apresentaram vacuolização intensa. A taxa de apoptose total e da massa celular interna foi reduzida (P<0,05) no grupo L- 165041, quando comparada às dos grupos DHA e controle. No experimento 2 as taxas de eclosão das 36h às 72h após desvitrificação foram maiores (P < 0.05) no grupo L-165041 comparadas ás do grupo controle, e a partir das 48h com o grupo DHA. Foi encontrada uma abundancia relativa das fosfatidilcolina (PC) protonada (34:2) + H]+ e PC oxidado [PC (36:1) + H]+ no grupo L-165041 comparado com o grupo controle. O grupo DHA teve uma maior abundância relativa (P <0.05) da PC protonada (32:0) comparado com o grupo controle. Em conclusão, a adição de L-165041 no cultivo embrionário diminui a apoptose pré e pós vitrificação. O estudo indica que a adição de 1M de L-165041 no meio de cultivo aumenta a proliferação celular pré vitrificação e diminui a apoptose pré e pós vitrificação, além de aumentar a criotolerância. Por outro lado, a adição de DHA diminui o desenvolvimento embrionário não sendo aconselhável seu uso na PIVE nas condições deste estudo.

The production of bovine embryos in vitro is deficient, due to aspects such as suboptimal conditions where they develop, which induces apoptosis, leading to low cryotolerance. The aim of this study was to modulate the activation of apoptosis and lipid synthesis through activation of proliferation receptors (PPARs) to diminish cell apoptosis and increase cryotolerance. In experiment 1, day 1 presumptive zygotes were allocated at random for embryo culture (control group n = 609, DHA group n = 611, and L-165041 (selective agonist of PPARD) group n = 608). The cleavage rate was evaluated on day 2 (D2) and blastocyst production on day 7 (D7). To evaluate the pre-vitrification apoptosis rate, embryos were fixed in D7 for TUNEL assay. Lipid accumulation was analyzed by the Sudan Black technique in embryos fixed in D7. In experiment 2, blastocysts were vitrified and devitrified (control group n = 98, DHA group = 76, L-165041 group = 111) to evaluate the eclosion rate. The embryos that ecloded were frozen to analyze the lipid profile by the mass spectrometry technique (MALDI-MS). The post-vitrification apoptosis rate was analyzed by TUNEL assay. In experiment 1, blastocyst production in D7 was less in the DHA group than production in the control and L-165041 groups (P < 0.05). However, the proportion of MCI cells was greater, and the total apoptosis and MCI rates were lower in the L-165041 group compared to the control and DHA groups (P < 0.05). The DHA group had a lower proportion of MCI and higher total apoptosis and MCI rates compared to the control and L-165041 groups (P < 0.05). In the DHA group, the mitochondria exhibited signs of cell stress, just as various cells exhibited intense vacuolization. The total apoptosis rate and inner cell mass was reduced (P<0.05) in the L-165041 group compared to the DHA and control group. In experiment 2, the eclosion rates from 36 h to 72 h after devitrification were greater (P < 0.05) in the L- 165041 group compared to the control group, and from 48 h on compared to the DHA group. A relative abundance of protonated phosphatidylcholine [PC (34:2) + H]+ and oxidized PC [PC (36:1) + H]+ in the L-165041 group was found compared to the control group. The DHA group had relative abundance (P <0.05) of protonated PC (32:0) compared to the control group. In conclusion, the addition of L-165041 in the embryonic culture decreases pre- and post-vitrification apoptosis. Our study indicates that the addition of 1 M of L-165041 in the culture medium increases pre-vitrification cell proliferation and decreases pre- and post- vitrification apoptosis, and also increases cryotolerance. In contrast, addition of DHA decreases embryonic development, and its use in in vitro production of bovine embryos under the conditions of this study is not recommended.

TRANSCRIÇÃO EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

O processo transcricional em embriões extremamente complexo, nosso trabalho estimou o impacto de perturbações nos processos de transcricionais, durante as fases de ativação do genoma embrionário sobre o desenvolvimento embrionário in vitro de embriões; analisamos dados de sequenciamento de rna (RNA-seq) depositados nos bancos públicos (GEO) desde o estágio de oóocito até o dia 19 do desenvolvimento embrionário; Isolamos e caracterizamos a massa celular interna (ICM) e a trofectoderma (TE) do sexo masculino e feminino, oriundos de um mesmo blastocisto produzido in vitro com espermatozoides sexados (X e Y) e com sêmen convencional e caracterizamos e exploramos o transcriptoma desses isolados celulares. Concluímos então que a EGA menor é essencial para o desenvolvimento embrionário bovino, blastocistos possuem a maior atividade transcricional de um total de 6457 genes diferentemente expressos entre os contrastes avaliado encontramos; 2065 genes diferencialmente expressos entre a ICM e a TE, enquanto a ICM está voltada para a manutenção da pluripotência, a TE está voltada ao metabolismo energético. Os nossos dados sugerem que os embriões fêmeas são mais sensíveis ao cultivo in vitro.

Transcription process in embryos is a complex process, our work estimated the impact of perturbations in the transcriptional processes during genome activation of vitro produced bovine embryos on their development; we analyzed public data (GEO) from rna sequencing data (RNA-seq) of oocyte up to the 19th day of embryonic development; Wed performed isolation and characterization of male and female inner cell mass (ICM) and trofectoderma (TE) from the same blastocyst produced in vitro with sorted semen (X and Y) and with conventional semen. We did the characterization and exploratory analysis of the transcriptome of these cells. We conclude that minor EGA is essential for bovine embryonic development. Blastocysts possess the highest transcriptional activity of 6457 differentially expressed genes among analyzed contrasts. We found 2065 genes differentially expressed between ICM and TE, while ICM is maintaining pluripotency, TE is focused on energy metabolism. Our data suggest that female embryos are more sensitive to in vitro culture.

Uso de meio condicionado por células estromais mesenquimais uterinas durante o cultivo in vitro de embriões bovinos

As tecnologias de reprodução assistida, tais como a fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões, transgenia e clonagem, ainda não tem o impacto comercial desejado devido a baixa produção embrionária. Apenas 30 a 40% dos blastocistos desenvolvidos são obtidos de oócitos após a MIV, fertilização e cultivo dos embriões, embora 80% dos oócitos maturados in vitro sejam fertilizados com sucesso. O soro fetal bovino (SFB) é o suplemento mais utilizado no cultivo de embriões in vitro, uma vez que melhora o desenvolvimento dos blastocistos. Apesar disso, sua presença está relacionada a alterações do metabolismo embrionário, perda de qualidade e indução de modificações na expressão de vários genes embrionários. Na tentativa de minimizar os efeitos deletérios do SFB, várias citocinas e fatores de crescimento têm sido acrescentados aos meios de cultivo embrionários in vitro, com a intenção de mimetizar as condições de cultivo in vivo. O presente experimento tem como objetivo avaliar e comparar os efeitos da adição do SFB e de meio condicionado por células mesenquimais estromais (MSCs) durante o cultivo embrionário. Os parâmetros analisados foram a viabilidade embrionária, apoptose e o perfil transcricional de genes relacionados à qualidade dos embriões. Não foi observado uma diferença (P0,05) na clivagem dos blastocistos, porém observou-se que a taxa de produção de embriões utilizando SFB no CIV foi maior (P0,05) quando comparada com MC, mas não diferiu (P0,05) do grupo produzido com BSA. A expressão relativa de mRNA para ELOVL6 foi maior no grupo MC, para CASP3 no grupo BSA, e para ACSL3 e VEGF no grupo SFB. Em conjunto, esses dados sugerem que o MC pode ser utilizado como uma alternativa ao SFB. Observamos um perfil de expressão gênica diferente, sugerindo que o MC inibiu o aumento da expressão relativa de mRNA para CASP3. Ademais, o MC favoreceu o número total de células, inibiu a porcentagem de células em apoptose e produziu um embrião de melhor qualidade.

Endometrial mesenchymal stromal cell (eMSCs) secretes bioactive molecules such as cytokines and growth factors which are released as soluble factors or through EVs. CM of the MSCs maintains the immunomodulation and regenerative potential properties of the cells that produced it. This study investigated the use of eMSC-CM plus BSA as an alternative to FBS in bovine embryo culture medium. The developmental ability and quality of bovine embryos were determined by assessing their cell number and gene expression. The percentage of embryos that underwent cleavage was similar (P>0.05) among the groups but blastocyst formation was higher (P<0.05) in FBS group. The total cell number was higher in CM group, but not statistically different from the others (P>0.05). The relative mRNA expression of ELOVL6 was higher in the CM group, of CASP3 in the BSA group and of ACSL3 and VEGF in the FBS group. Taken together, these data suggest that CM can be used as an alternative supplement to FBS. The gene expression profile suggested that the use of CM inhibited an increase in the relative mRNA levels for CASP3. Moreover, the CM favored the total number cells, inhibited the percentage of cells in apoptosis and produces better quality embryo.

ADIÇÃO DE MELATONINA AO MEIO DE MATURAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS SUBMETIDOS AO CHOQUE TÉRMICO IN VITRO: EFEITOS SOBRE AS TAXAS DE PRODUÇÃO E QUALIDADE DE BLASTOCISTOS

O estresse térmico por calor aumenta a produção de radicais livres, o que contribui para diminuição da qualidade dos oócitos e dos embriões. Assim, a adição de antioxidantes, como a melatonina, ao meio de maturação in vitro (MIV), tem o potencial de reduzir os prejuízos causados pela alta temperatura. O objetivo foi avaliar os efeitos da adição de melatonina ao meio MIV de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico sobre as taxas de produção e qualidade de blastocistos. Os oócitos utilizados, para a produção in vitro de embriões, foram provenientes de ovários de abatedouros e maturados sob choque térmico (12h a 41,0 oC seguido por 12h a 38,5 oC) em meio MIV sem melatonina (0 M) ou acrescido de melatonina nas concentrações 10-12 ;10-9; 10-6 e 10-3 M. No controle positivo (não-estresse), os oócitos foram maturados na ausência de melatonina sob condição convencional (24h a 38,5 oC). No controle DMSO, os oócitos foram maturados em meio contendo 0,46% de DMSO (mesma concentração presente no tratamento 10-3 M), sob choque térmico. Foi utilizado o delineamento em blocos ao acaso, sendo os blocos constituídos pelos dias de coleta de ovários. Os tratamentos 10-3, 10-6 e 10-9 M de melatonina e o controle não estresse não diferiram (P>0,05) e resultaram em maior proporção (P<0,05) de embriões com oito ou mais células, no dia 3 de cultivo (D3), em comparação aos tratamentos 10-12 e 0 M. A proporção de embriões com oito ou mais células no D3 foi maior (P<0,05) no grupo controle DMSO quando comparado com os grupos 10-9, 10-12 e 0 M. A produção de blastocistos, nos dias 7 (D7) e 8 (D8), bem como o número total de células, a proporção de células apoptóticas, em relação ao total de células e a proporção de células apoptóticas na massa celular interna (MCI) não foram influenciados (P>0,05) pela adição de melatonina ou de DMSO ao meio MIV, assim como não foram influenciados pelo choque térmico (0 M vs controle não estresse). O tratamento 10-6 M resultou em maior proporção (P<0,05) de células da MCI, em relação ao total de células, quando comparado aos tratamentos 10-9, 10-12, 0 M e DMSO, mas não diferiu (P>0,05) dos tratamentos 10-3 M e controle não estresse. Por meio de análise de regressão logística, observou-se que a proporção de embriões com oito ou mais células no D3 aumentou, em função da concentração de melatonina (P<0,05) e que a proporção de células da MCI aumentou, a partir da concentração 10-9 M, atingindo o máximo na concentração 10-4 M, seguido por redução até 10-3 M. Conclui-se que a adição de melatonina até 10-3 M ao meio MIV de oócitos sob choque térmico estimulou o desenvolvimento embrionário ao estádio de 16 células e que a proporção de células da MCI foi aumentada pela adição de melatonina na concentração 10-4 M ao meio MIV.

Heat stress increases the production of free radicals, which contributes to a decrease in the quality of oocytes and embryos. Thus, the addition of antioxidants, such as melatonin, to the in vitro maturation medium (IVM), has the potential to reduce damages from high temperatures. Addition of melatonin to the IVM medium of bovine oocytes submitted to heat shock on production rates and blastocyst quality was evaluated. Slaughterhouse derived oocytes were matured under heat shock (12 h at 41.0 oC followed by 12 h at 38.5 oC) in IVM medium without (0M) or with melatonin at 10-12; 10-9; 10-6and 10-3 M concentrations. In the positive (non-stress) control, oocytes were matured in the absence of melatonin under conventional conditions (24 h at 38.5 oC). In the DMSO control oocytes were matured in medium containing 0.46% DMSO (same concentration as the 10-3 M treatment), under heat shock. Oocytes were randomly assigned to treatments blocked by days of ovarian collection. Greater proportions (P <0.05) of embryos with eight or more cells on day 3 of culture (D3) were observed in the 10-3, 10-6 and 10-9 M melatonin treatments and non-stress control compared to 10-12 and 0 M treatments. The proportion of embryos with eight or more cells in D3 was higher (P <0.05) in the DMSO control compared to 10-9, 10-12 e 0 M groups. Blastocyst production on days 7 (D7) and 8 (D8), total number of cells, apoptotic cells to total cell ratio and the proportion of apoptotic cells to the inner cell mass (ICM) (P> 0.05) did not change by the addition of melatonin or DMSO to the IVM medium nor by heat shock (0 M vs non-stress control). The 10-6 M treatment resulted in a greater proportion (P <0.05) of ICM in relation to total cells compared to 10-9, 10-12, 0 M and DMSO treatments, but did not differ (P> 0.05) from the 10-3 M treatment and non-stress control. The greater the melatonin concentration the greater the proportion of embryos with eight or more cells in D3 increased (P <0.05). The proportion of MCI cells increased from 10 -9 M, peaking at 10-4 M, followed by a reduction at 10-3 M. In conclusion, the addition of melatonin up to 10-3 M in the MIV medium of oocytes under heat shock stimulated embryonic development to the 16-cell stage and the proportion of MCI cells was increased by the addition of 10-4 M melatonin to the IVM medium.

PERFIL TRANSCRICIONAL DA CRIOTOLERÂNCIA DE EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VITRO

A criotolerância embrionária é um processo complexo que envolve mudanças estruturais e moleculares dinâmicas. Informações a respeito do perfil transcricional embrionário após a criopreservação ainda são insuficientes. O objetivo deste trabalho foi estabelecer o transcriptoma de blastocistos bovinos produzidos in vitro com alta e baixa criotolerância. Oócitos imaturos (n = 3926) foram recuperados de ovários derivados de abatedouro e maturados, fertilizados e cultivados in vitro sob condições padrão. A clivagem e produção de embriões foram registrados no dia três e sete após a fertilização. Blastocistos expandidos (n = 894) com qualidade excepcional (apenas grau I) foram vitrificados pelo método Cryotop. Os blastocistos vitrificados foram aquecidos, e a re-expansão e eclosão dos embriões foram registradas às 6 e 12h após o aquecimento, respectivamente. Uma rigorosa avaliação morfológica foi realizada e os embriões foram classificados em alta criotolerância (HC), reexpandido e baixa criotolerância (LC) após a criopreservação. A fim de aumentar a precisão das diferenças moleculares entre fenótipos, apenas blastocistos HC e LC (n = 3, total de 123 blastocistos por grupo, pool de 41/amostra) após a criopreservação foram submetidos à extração total de RNA (PicoPure, Applied Biosystems®). O RNA extraído foi avaliado através do 2100Bioanalyzer (Agilent Technologies®). Somente amostras com integridade de RNA 7,7 foram submetidas ao protocolo padrão de preparação da biblioteca NEBNext Ultra II (New England Biolabs®) e RNAseq (Illumina®). Os dados foram limpos (seqyClean v1.3.12), mapeados (Tophat v.2.0.8), as leituras contadas (HTSeq-count v0.5.4p2), e foi realizada análise de expressão diferencial (DESEq v1.12.1 de R/Bioconductor). Para análise de enriquecimento gênico, foi utilizado o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA). As taxas de clivagem e produção de blastocistos foram 73,2% (2873/3926) e 29,0% (1137/3926), respectivamente. As taxas de re-expansão (89,2 vs. 73,4%) e de eclosão (23,7 vs. 8,4) foram maiores (P<0,05) às 12 h em comparação com 6 h após o aquecimento, respectivamente. Uma média total de 17,8 milhões de leituras por amostra foi utilizada na análise de expressão diferencial. As amostras dos grupos de blastocistos HC e LC foram claramente separadas com individualização pronunciada na análise de componentes principais bi e tridimensionais e agrupamento de Heat Map sustentando a caracterização fenotípica do modelo (alta versus baixa criotolerância). Um total de 9.422 genes foram identificados, 114 genes foram diferencialmente expressos (GDE; FDR: P <0,05), com 27 e 84 genes superexpressos em HC e LC, respectivamente. Na análise de enriquecimento dos GDEs (FDR: P <0,1), as cinco principais funções biológicas identificadas foram movimento celular, o desenvolvimento celula, proliferação e crescimento celular e sobrevivência e morte celular. Na análise de predição do IPA, as funções biológicas de sobrevivência do organismo, sobrevivência e morte celular, crescimento e proliferação celular foram preditas como sendo mais ativadas (z-score +2), enquanto movimento celular e a sinalização célula a célula foram preditos mais inibidos (z-score -2). O presente trabalho forneceu uma análise abrangente do perfil transcricional da criotolerância de embriões bovinos e elucidou o envolvimento de um grande número de processos biológicos nobres na retomada do desenvolvimento após a criopreservação. Sobrevivência do organismo, movimento celular, sobrevivência e morte celular, crescimento e proliferação celular foram funções biológicas cruciais para a criopreservação de embriões.

Embryo cryopreservation is an assisted reproductive technology that allows the storage of in vitro produced or in vivo derived embryos for long periods while are not commercialized or transferred. It is considered as one of the most challenging areas within the biotechnologies of reproduction. The reduced pregnancy rate of the cryopreserved embryos associated with an increase demand of qualified technician to handle this biotechnology could explain the reduced number of embryos being cryopreserved. Embryo cryosurvival is a complex process involving dynamic structural and molecular changes. Embryo transcriptional profile information after cryopreservation is still lacking. The aim of this work was to establish the transcriptome of in vitro produced bovine blastocysts with high and low cryosurvival. Immature oocytes (n= 3926) were recovered from slaughterhouse-derived ovaries and in vitro matured, fertilized and culture under standard conditions. Cleavage and embryo production were recorded on day three and seven after fertilization. Expanded blastocysts (n= 894) with exceptional quality (grade I only) were vitrified by the cryotop method. Vitrified blastocysts were warmed, and embryo reexpansion and hatching were recorded at 6 and 12 h after warming, respectively. A rigorous morphological evaluation was done by experienced technician considering: a) blastocoele reexpansion; b) hatching; c) inner cell mass and trofoectoderm integrity and organization; and d) color and extrusion of blastomeres. After morphological evaluation, embryos were classified as high cryosurvival (HC: blastocysts with the blastocoele completely re-expanded followed by hatching 12 h after warming and without or with mild and few signs of degeneration); reexpanded (blastocysts with the blastocoele completely re-expanded but not followed by hatching 12 h after warming and with mild and few signs of degeneration), and non-viable (low cryosurvival - LC: blastocysts without the blastocoele completely re-expanded followed by hatching 12 h after warming and with severe and frequently signs of degeneration) after cryopreservation. In order to increase accuracy of molecular differences among phenotypes, only HC and LC blastocysts (n= 3, total of 123 blastocysts per group, pool of 41 /sample) after cryopreservation and submitted to total RNA extraction (PicoPure, Applied Biosystems®). Extracted RNA was evaluated through 2100-Bioanalyzer (Agilent Technologies®). Only samples with RNA integrity 7.7 were submitted to through standard protocol of NEBNext Ultra II library preparation (New England Biolabs®) and RNAseq (Illumina®). Data were cleaned (seqyClean v1.3.12), mapped (Tophat v.2.0.8), reads counted (HTSeq-count v0.5.4p2), and differential expression analysis was performed (DESEq v1.12.1 from R/Bioconductor). For gene enrichment analysis, ingenuity pathway analysis (IPA) was used. Cleavage and blastocyst production rates were 73.2 % (2873/3926) and 29.0 % (1137/3926), respectively. The reexpansion (89.2 vs. 73.4%) and hatching (23.7 vs. 8.4) rates were higher (P<0.05) at 12h compared with 6h after warming, respectively. A mean 17.8 millions of reads per sample were used on different expression analysis. Blastocysts group samples were clearly separated with pronounced group individualization at two- and three-dimensional principal component analysis and heat map clustering sustaining the phenotype characterization of the model (high vs. low cryosurvival). A total of 9422 genes were identified, 114 were differently expressed genes (DEG; FDR: P<0.05), with 27 and 84 genes up-regulated in HC and LC, respectively. At the enrichment analysis of the DGE (FDR: P<0.1) the top five biological functions identified were cellular movement (66 molecules), cellular development (82 molecules), cell grown and proliferation (79 molecules), and cell death and survival (80 molecules). At IPA prediction analysis, the biological functions of organismal injury, cell death and survival, cell grow and proliferation were predicted to be more activated (z-score +2), whereas cellular movement and cell-to-cell signaling were predicted to be more inhibited (z-score -2). The present work provided a comprehensive analysis of the transcriptional profile of bovine embryo cryosurvival and elucidated the involvement of a great number of noble biological processes molecules in the embryo development resumption after cryopreservation. Organismal injury, cellular movement, cell death and survival, cell growth and proliferation were crucial biological functions for embryo cryosurvival.

Efeitos da substituição de SFB por IGF-I sobre os aspectos celulares e moleculares da produção in vitro de embriões bovinos

O objetivo do presente estudo foi avaliar o benefício da substituição do soro fetal bovino (SFB) pelo fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-1) durante a maturação in vitro (MIV) ou cultivo in vitro (CIV), sobre qualidade embrionária e expressão de genes em embriões pré- e pós-compactação. Delineamento experimental foi fatorial 3 x 3 (três suplementos de MIV e três de CIV), com 9 grupos experimentais. Foram realizadas 20 réplicas (oócitos 400/grupo). Complexos cúmulus-oócito (COCs) graus I e II foram maturados in vitro com a adição de 10% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL polivinil-álcool (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) a 38,5 ºC em 5% de CO2 em ar por 22 a 24 horas. Foram fertilizados e incubados durante 18 horas. Os zigotos foram cultivados com a adição de: 2,5% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL de PVA (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) por sete dias a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas após 48 e 168 horas de cultivo, respectivamente. A técnica simplificada de coloração diferencial de células da massa celular interna (MCI) e trofoectoderma (TE) foi utilizada para avaliar a distribuição celular de blastocistos (n = 155) e a técnica de TUNEL para avaliação do índice de apoptose (n = 207). Concentrações de glicose e lactato obtidas do meio MIV utilizaram-se para analisar o metabolismo de glicose. mRNA foi extraído de embriões de 6 8 células colhidos após 66 horas post-inseminação (4 pools de 15 embriões por grupo) e de blastocistos expandidos de 7 dias (4 pools de 5 embriões por grupo). A expressão gênica foi realizada no sistema BioMark HD® de microfluídica, pelo arranjo 96.96 Dynamic Array. Os dados foram analisados ANOVA do PROC GLIMMIX do SAS. Foi utilizado o teste Tukey para comparação de médias. Valores de p 0.05 foram considerados significativos. A clivagem foi maior (p < 0,05) nos grupos maturados em SFB. MIV e CIV com SFB presentou maior (p < 0.05) taxa de produção de blastocisto e maior quantidade de blastocistos expandidos que PVA e IGF. MIV com IGF-I aumentou o consumo de glicose e síntese de lactato dos COCs e levou à produção de blastocistos com maior (p < 0.05) número total de células. Embriões cultivados em IGF-I tiveram maior (p < 0.05) quantidade de células na MCI e embriões cultivados em PVA tiveram maior (p < 0.05) apoptose do que SFB. Os genes NANOG, OTX2, POU5F1 e IFNT2 foram mais expressos em blastocistos cultivados em PVA e IGF do que em SFB. O IGF-I regula TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A e IGF1R para prevenir apoptose. IGF-I durante a MIV em meio semi-definido estimula o metabolismo de glicose de COCs, melhora a qualidade embrionária, aumentando o número total de células de blastocistos. IGF-I durante a CIV aumenta o numero de células na MCI, melhora a expressão de biomarcadores importantes de qualidade embrionária com a possibilidade de melhorar o desenvolvimento embrionário.

The aim of the present study was to analyze the benefits of fetal bovine serum (FBS) replacement by insulin-like growth factor I (IGF-I) during in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC), on embryo quality and temporal gene expression in embryos pre- and post-compaction. A 3 x 3 factorial design was performed (three supplements for IVM and three for IVC), with a total of 9 experimental groups. A total of 20 replicates (oocytes 400/group) were performed. Grade I and II cumulus-oocyte complexes (COCs) matured in vitro with the addition of 10% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of polyvinyl-alcohol (PVA), or PVA + 100 ng/mL IGF-1 (IGF) at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2 for 22 to 24 hours. After IVM, oocytes were fertilized and incubated for 18 hours. Possible zygotes were cultured with the respective addition of: 2.5% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of PVA (PVA), or PVA + 100 ng/mL of IGF-1 (IGF) for seven days at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2. Cleavage and blastocyst rates were analyzed at 48 and 168 hours of culture respectively. Simplified technique for differential staining of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cells was performed to analyze cell allocation of blastocysts (n = 155) and TUNEL assay for apoptosis rate analysis (n = 207). Glucose and lactate concentrations were measured in IVM spent media to analyze glucose metabolism. mRNA was extracted from 6 8 cells embryos collected after 66 hours post insemination (4 pools of 15 embryos per group) and 7 day expanded blastocysts (4 pools of 5 embryos per group). Gene expression analysis was performed with BioMark HD® system with microfluidic chip 96.96 Dynamic Array. Data were analyzed by ANOVA from PROC GLIMMIX model from SAS. Tuckey test was used to compare means. P value 0.05 was considered to be significant. Cleavage rate was higher (p < 0.05) for groups matured in FBS. IVM and IVC in FBS presented higher (p < 0.05) total blastocyst yield and greater quantity of expanded blastocysts than PVA and IGF. IVM with IGF-I increased glucose uptake and lactate synthesis of COCs and produced blastocysts with increased (p < 0.05) total cell number. Embryos cultured in IGF-I had greater (p < 0.05) amount of cells in the ICM and embryos cultured in PVA had higher (p < 0.05) apoptosis rate than FBS. NANOG, OTX2, POU5F1 and IFNT2 genes were more expressed in blastocysts cultured in PVA and IGF than in FBS. IGF-I regulates TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A and IGF1R genes to prevent apoptosis. The addition of IGF-I during IVM in chemically semi-defined media stimulates glucose metabolism of COCs and improves embryo quality, increasing total cell number of blastocysts. The addition of IGF-I during IVC increases the amount of cells of the ICM, improves expression of important embryo quality biomarkers with the possibility to enhance embryo development.

Effect of precursors feeding and media manipulation on production of novel anticancer pro-drug camptothecin from endophytic fungus

We have established methodology for the isolation and characterization of a novel endophytic fungus from the inner bark of medicinal plant Nothapodytes foetida, which produced camptothecin in Sabouraud broth (SB) under shake flask conditions. Camptothecin and its related compounds are at present obtained by extraction from intact plants, but fungal endopytes may be an alternative source of production. In present study we have observed the effect of different nutrient combinations and precursors (tryptophan, tryptamine, geraniol, citral, mevalonic acid and leucine) on the accumulation of camptothecin by endophytic fungus Entrophospora infrequens. The precursors were fed either alone or in combinations (tryptophan and geraniol, tryptophan and citral, tryptophan and mevalonic acid, tryptophan and leucine). The highest camptothecin content was observed in the range of 503 ± 25µg/100g dry cell mass in Sabouraud medium. Camptothecin content in the medium was increased by 2.5 folds by the presence of tryptophan and leucine whereas the production with trytophan was also significantly different from other treatments. Furthermore, the effect of fungal camptothecin on the morphology of human cancer cell lines was also studied. The treated cells showed reduction in size, condensation of nucleus and the protoplasmic extensions were reduced. All these characteristics are found in apoptotic cells.(AU)