Contribution of flagella and motility to gut colonisation and pathogenicity of Salmonella Enteritidis in the chicken

ABSTRACT Salmonella Enteritidis causes fowl paratyphoid in poultry and is frequently associated to outbreaks of food-borne diseases in humans. The role of flagella and flagella-mediated motility into host-pathogen interplay is not fully understood and requires further investigation. In this study, one-day-old chickens were challenged orally with a wild-type strain Salmonella Enteritidis, a non-motile but fully flagellated (SE motB) or non-flagellated (SE fliC) strain to evaluate their ability to colonise the intestine and spread systemically and also of eliciting gross and histopathological changes. SE motB and SE fliC were recovered in significantly lower numbers from caecal contents in comparison with Salmonella Enteritidis at early stages of infection (3 and 5 dpi). The SE motB strain, which synthesises paralysed flagella, showed poorer intestinal colonisation ability than the non-flagellated SE fliC. Histopathological analyses demonstrated that the flagellated strains induced more intense lymphoid reactivity in liver, ileum and caeca. Thus, in the present study the flagellar structure and motility seemed to play a role in the early stages of the intestinal colonisation by Salmonella Enteritidis in the chicken.(AU)

Evaluación histopatológica de los ganglios linfáticos axilar y superficie inguinal en perras (Canis familiaris) debajo mastectomía terapéutica / Histopathological evaluation of axillary and superficial inguinal lymph nodes in bitches (Canis familiaris) underwent to therapy mastectomy / Avaliação histopatológica dos linfonodos axilares e inguinais superficiais em cadelas (Canis familiaris) submetidas à mastectomia terapêutica

Los tumores mamarios son las neoplasias más comunes en perros, que constituyen alrededor del 50% de las neoplasias de la especie canina. Los tumores de mama malignos pueden establecer metástasis a los ganglios linfáticos regionales y se extendió a otros sitios. La reactividad de los ganglios linfáticos en los alrededores del tumor es un factor relacionado con el pronóstico del cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar la incidencia de los cambios histopatológicos de lesiones de mama en perros, especialmente la metástasis de los tumores malignos de mama en los ganglios linfáticos axilares e inguinales superficiales sin cambios macroscópicos. La retirada del ganglio linfático inguinal se llevó a cabo junto con la glándula inguinal debido a la íntima asociación de estas dos estructuras. Para la localización y la escisión de la linfa axilar aplicado colorante azul de metileno 2% alrededor de la mama torácica craneal a la lesión. La biopsia excisional de ganglios centinela, axilar y inguinal superficial, durante la mastectomía y posterior análisis histopatológico de los ganglios linfáticos y cadena mamaria permitió el diagnóstico del tipo de tumor primario, el grado de reactividad linfoide y la identificación de metástasis linfática. [...](AU)

Mammary tumors are the most common neoplasms in dogs, corresponding to 50% of neoplasms of the canine specie. Malignant breast tumors may metastasize to regional lymph nodes and spread to other sites. The reactivity of lymph nodes in the tumor surroundings is a factor related to the prognosis of cancer. The objective of this study was to evaluate the incidence of histopathological changes in dogs with breast lesions, especially metastasis of malignant breast tumors in axillary and superficial inguinal lymph nodes without macroscopic changes. The removal of the inguinal lymph node was held together with the inguinal gland due to the intimate association of these two structures. For localization and excision of axillary lymph node was necessary to inject the dye methylene blue 2% around the ipsilateral cranial breast to chest injury. The excisional biopsy of sentinel nodes, axillary and superficial inguinal, during mastectomy and subsequent histopathological analysis of the mammary chain and lymph nodes allowed the diagnosis of the type of primary tumor, the degree of lymphoid reactivity and lymphatic metastasis. [...](AU)

Os tumores mamários são as neoplasias mais comuns em cadelas, constituindo cerca de 50% do total de neoplasias da espécie canina. Neoplasias mamárias malignas podem estabelecer metástases para os linfonodos regionais e se disseminarem para outros sítios. A reatividade de linfonodos nas adjacências do tumor é um fator relacionado ao prognóstico da neoplasia. O objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência de alterações histopatológicas das lesões mamárias em cadelas, principalmente metástase de neoplasias mamárias malignas, nos linfonodos axilar e inguinal superficial sem alterações macroscópicas. A remoção do linfonodo inguinal foi realizada juntamente com a da glândula inguinal devido à íntima associação dessas duas estruturas. Já para a localização e exérese do linfonodo axilar, preconizou-se a ejeção do corante azul de metileno a 2% ao redor da mama torácica cranial ipsilateral à lesão. A biópsia excisional dos linfonodos sentinela, axilar e inguinal superficial, no mesmo tempo cirúrgico da mastectomia e a posterior análise histopatológica da cadeia mamária e dos linfonodos permitiu o diagnóstico do tipo de neoplasia primária, do grau de reatividade linfoide e da metástase linfática. [...](AU)

Evaluación histopatológica de los ganglios linfáticos axilar y superficie inguinal en perras (Canis familiaris) debajo mastectomía terapéutica / Histopathological evaluation of axillary and superficial inguinal lymph nodes in bitches (Canis familiaris) underwent to therapy mastectomy / Avaliação histopatológica dos linfonodos axilares e inguinais superficiais em cadelas (Canis familiaris) submetidas à mastectomia terapêutica

Los tumores mamarios son las neoplasias más comunes en perros, que constituyen alrededor del 50% de las neoplasias de la especie canina. Los tumores de mama malignos pueden establecer metástasis a los ganglios linfáticos regionales y se extendió a otros sitios. La reactividad de los ganglios linfáticos en los alrededores del tumor es un factor relacionado con el pronóstico del cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar la incidencia de los cambios histopatológicos de lesiones de mama en perros, especialmente la metástasis de los tumores malignos de mama en los ganglios linfáticos axilares e inguinales superficiales sin cambios macroscópicos. La retirada del ganglio linfático inguinal se llevó a cabo junto con la glándula inguinal debido a la íntima asociación de estas dos estructuras. Para la localización y la escisión de la linfa axilar aplicado colorante azul de metileno 2% alrededor de la mama torácica craneal a la lesión. La biopsia excisional de ganglios centinela, axilar y inguinal superficial, durante la mastectomía y posterior análisis histopatológico de los ganglios linfáticos y cadena mamaria permitió el diagnóstico del tipo de tumor primario, el grado de reactividad linfoide y la identificación de metástasis linfática. [...]

Mammary tumors are the most common neoplasms in dogs, corresponding to 50% of neoplasms of the canine specie. Malignant breast tumors may metastasize to regional lymph nodes and spread to other sites. The reactivity of lymph nodes in the tumor surroundings is a factor related to the prognosis of cancer. The objective of this study was to evaluate the incidence of histopathological changes in dogs with breast lesions, especially metastasis of malignant breast tumors in axillary and superficial inguinal lymph nodes without macroscopic changes. The removal of the inguinal lymph node was held together with the inguinal gland due to the intimate association of these two structures. For localization and excision of axillary lymph node was necessary to inject the dye methylene blue 2% around the ipsilateral cranial breast to chest injury. The excisional biopsy of sentinel nodes, axillary and superficial inguinal, during mastectomy and subsequent histopathological analysis of the mammary chain and lymph nodes allowed the diagnosis of the type of primary tumor, the degree of lymphoid reactivity and lymphatic metastasis. [...]

Os tumores mamários são as neoplasias mais comuns em cadelas, constituindo cerca de 50% do total de neoplasias da espécie canina. Neoplasias mamárias malignas podem estabelecer metástases para os linfonodos regionais e se disseminarem para outros sítios. A reatividade de linfonodos nas adjacências do tumor é um fator relacionado ao prognóstico da neoplasia. O objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência de alterações histopatológicas das lesões mamárias em cadelas, principalmente metástase de neoplasias mamárias malignas, nos linfonodos axilar e inguinal superficial sem alterações macroscópicas. A remoção do linfonodo inguinal foi realizada juntamente com a da glândula inguinal devido à íntima associação dessas duas estruturas. Já para a localização e exérese do linfonodo axilar, preconizou-se a ejeção do corante azul de metileno a 2% ao redor da mama torácica cranial ipsilateral à lesão. A biópsia excisional dos linfonodos sentinela, axilar e inguinal superficial, no mesmo tempo cirúrgico da mastectomia e a posterior análise histopatológica da cadeia mamária e dos linfonodos permitiu o diagnóstico do tipo de neoplasia primária, do grau de reatividade linfoide e da metástase linfática. [...]

ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA E IMUNOFENOTÍPICA POR PCR - PARR EM TEMPO REAL DOS LINFOMAS CANINOS

O linfoma é uma neoplasia de origem hematopoiética que frequentemente acomete caninos. O estabelecimento adequado do prognóstico e a rápida instituição do tratamento são essenciais para propiciarem melhor qualidade de vida ao paciente, sendo a imunofenotipagem uma das ferramentas utilizadas para este fim. Objetivou-se com este trabalho classificar histomorfologicamente e imunofenotipicamente pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real para Ensaio dos Receptores de Rearranjo Gênico (PCR PARR) casos de linfoma caninos obtidos no Laboratório de Histopatologia da Área de Patologia Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram obtidas 37 amostras no total; 25 emblocadas em parafina, duas amostras de tecido congelado e 10 aspirados pela citologia aspirativa por agulha fina. Nas análises histomorfológicas considerando 25 amostras; 28,00% (7/25) foram caracterizadas como linfoma difuso de grandes células, 28,00% (7/25) linfoma cutâneo epiteliotrópico, 12,00% (3/25) linfoma cutâneo não-epiteliotrópico, 8,00% (2/25) linfoma difuso de células intermediárias, 8,00% (2/25) linfoma difuso de pequenas células e 4,00% (1/25) foram classificados como plasmocitoma, hiperplasia linfóide, linfoma folicular de grandes células e mastocitoma pouco diferenciado. Já na análise imunofenotípica pela técnica de PCR-PARR em Tempo Real, 85,71% (30/35) das amostras demonstraram amplificação clonal, sendo 53,33% (16/30) para linfoma de células B, 23,33% (7/23) para células T e 23,33% (7/23) para ambos os fenótipos (B e T). Em 14,28% (5/35) as amostras foram consideradas como reatividade linfóide, por demonstrar picos irregulares e policlonais. A PCR em Tempo Real se demonstrou mais sensível as amostras antigas em bloco de parafina, podendo ser uma técnica de escolha a ser utilizada em estudos retrospectivos de amostras fixadas em formol e parafina. O uso da PCR-PARR associado ao exame histopatológico na rotina veterinária pode ser de grande auxílio aos patologistas, principalmente quando há possibilidade de diferenciação entre hiperplasia e neoplasia, sendo assim a importância desta técnica na rotina médica é essencial para um rápido diagnóstico e prognóstico ao paciente.

Lymphoma is a hematopoietic neoplasm that frequently affects canines. The establishing appropriate prognosis and rapid initiation of treatment are essential to propitiate better quality of life for the patient, and immunophenotyping of the tools used for this purpose. The objective of this work was to classify histomorphologically and immunophenotypically by the Real Time Polymerase Chain Reaction technique for Assay for Rearrangement of Antigen Receptors (PCR - PARR) cases of canine lymphoma obtained at the Histopathology Laboratory of the Pathology Department, Medicine Department Veterinary of the Federal Rural University of Pernambuco in the period from 2002 to 2019. A total of 37 samples were obtained; 25 embedded in paraffin, two samples of frozen tissue and 10 aspirated by fine needle aspiration cytology. In histomorphological analyzes considering 25 samples 28.00% (7/25) were characterized as diffuse large cell lymphoma, 28.00% (7/25) epitheliotropic cutaneous lymphoma, 12.00% (3/25) non-cutaneous lymphoma epitheliotropic, 8.00% (2/25) diffuse intermediate cell lymphoma, 8.00% (2/25) diffuse small cell lymphoma and 4.00% (1/25) were plasmacytoma, lymphoid hyperplasia, follicular lymphoma of large cells and poorly differentiated mastocytoma In the immunophenotypic analysis by PCR Real-Time PARR, 85.71% (30/35) of the samples showed clonal amplification, and 53.33% (16/30) for B-cell lymphoma, 23.33% ( 7/23) to T cells and 23.33% (7/23) for both phenotypes (B and T). In 14.28% (5/35) the samples were considered as lymphoid reactivity, as they demonstrate irregular and polyclonal peaks. Real-time PCR was shown to be more sensitive to old paraffin block samples, and may be a technique of choice to be used in retrospective studies of samples fixed in formaldehyde and paraffin. The use of PCR-PARR associated with histopathological examination in the veterinary routine can be of great help to pathologists, especially when there is a possibility of differentiation between hyperplasia and neoplasia, so the importance of this technique in the medical routine is essential for a quick diagnosis and prognosis when patient.

Gastroduodenal lesions in racehorses: evaluation and mapping according to the Updated Sidney System and Equine Gastric Ulcer Syndrome Council Classification

Gastroduodenal ulceration is found in 90% of Thoroughbred race horses. The clinical and economical importance of gastric ulcers and the scarce information about the subject in Brazil make this investigation essential. The aim of this study was to evaluate and map grossly and microscopically the gastroduodenal lesions in race horses according to the Updated Sidney System and the Equine Gastric Ulcer Syndrome Council (EGUSC) Classification. Necropsy was performed in 14 horses and macroscopy was described. Samples of the gastric regions (14 animals - nonglandular fundus, glandular fundus, margo plicatus, antrum and pylorus) and duodenum (9 animals) were obtained and processed for routine histopathology. Macroscopic evaluation of the lesions based on the Updated Sidney System showed that 100% of the horses had gastric ulcers or erosions, mainly located at the margo plicatus. The Updated Sidney System also allowed a macroscopic gastritis classification and revealed that seven horses had enanthematous gastritis (50%), four had hemorrhagic gastritis (28, 6%), and three had erosive gastritis (21, 4%). Based on the EGUSC Classification, the most frequent score is 2 (50%). The score 3 was found in 35,7% of the horses and the scores 1 and 4 in 7,1% each. The score 0 which means intact epithelium, was not seen in any of the horses. Histopathological evaluation based on the Updated Sidney System revealed mild to severe lymphoplasmacytic infiltrate, sometimes with areas of neutrophilic infiltrate, demonstrating some activity mainly in the injured mucosa. Lymphoid follicles were found in 92.9% of the animals. This study confirms that gastric ulceration in Brazilian race horses is common, and the majority consists of chronic ulceration of the margo plicatus. The use of the histopathological division of the Updated Sidney System demonstrated that chronic gastritis was predominant and the majority of cells in the inflammatory infiltrate were lymphocytes and plasmocytes. This study also showed that the association of the Updated Sidney System and the EGUSC Classification is feasible and leads to a better understanding of equine gastroduodenal ulceration. Although usually neglected, these lesions may be involved in low performance rates and therefore other investigations are necessary for the elucidation of the etiology and pathogenesis of these ulcers.(AU)

IMPORTÂNCIA DOS GENES fliC e motB DE Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis NA COLONIZAÇÃO INTESTINAL E INVASÃO SISTÊMICA EM AVES (Gallus gallus domesticus)

Salmonella Enteritidis (SE) causa o paratifo aviário em aves e frequentemente está relacionada aos surtos de infecção alimentar em seres humanos. A contribuição do flagelo versus motilidade na interação patógeno-hospedeiro requer estudos mais aprofundados. Para melhor entendimento da contribuição individual desses fatores de virulência em aves, pintinhos de um dia de vida foram desafiados oralmente com estirpe selvagem de SE, uma mutante não-móvel mas flagelada (SE motB) e outra mutante aflagelada (SE fliC). Excreção fecal e colonização de fígado, baço e conteúdo cecal pelas estirpes de SE foram avaliadas. Além disso, também foi realizada a avaliação das alterações macroscópicas e microscópicas. Nos estágios iniciais da infecção, ambos mutantes mostraram menor capacidade de colonizar o ceco, além de menor recuperação no baço por SE fliC comparando a estirpe selvagem SE. Após 7 dpi não havia diferenças na contagem das três estirpes em conteúdo cecal, fígado e baço. Análises histopatológicas demonstraram que estirpes flageladas (SE motB e SE) induziram reatividade linfóide em inglúvio, ceco, íleo e fígado. No entanto, nos estágios iniciais da infecção a estirpe SE fliC não estimulou a reatividade linfóide em lâmina própria de ceco e íleo mas induziu discretos focos necróticos em fígado. Portanto, neste estudo a presença de estrutura flagelar e motilidade parece exercer um papel nos estágios iniciais da colonização intestinal e infecção sistêmica por SE nas aves.

Salmonella Enteritidis (SE) causes fowl paratyphoid in poultry often related to outbreaks of food-borne diseases in humans. The contribution of flagella and motility in host pathogen interaction require further investigation. To better understand the individual contribution of these virulence factors in poultry, one day old chickens were challenged orally with wildtype strain of SE, a nonmotile but fully flagellated (SE motB) and aflagellated mutant (SE fliC). Faecal excretion and colonization of liver, spleen and cecal contents by the SE strains were assessed. Additionally, the assessment of gross and microscopic alterations was also performed. At the early stages of infection both mutants showed lower capacity to colonize the ceca, besides the lower recovering in spleen of SE fliC comparing to the wild type of SE. After 7 dpi there were no differences among the counts of the three strains in ceca, liver and spleen. Histopathological analyses demonstrated that flagellated strains (wild type SE and SE motB) induced lymphoid reactivity in crop, ceca, ileum and liver. On the other hand, in the early stages of infection, SE fliC strain did not stimulate lymphoid reactivity in lamina propria of ceca and ileum but induced discrete necrotic foci in liver. Thus in the present study the flagellar structure and motility seemed to play a role at the early stages of the intestinal colonization and systemic infection by SE in the chicken.

Apoptose em linfonodos de cães com Leishmaniose Visceral

A linfadenomegalia generalizada é um aspecto da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), mas existem poucos estudos enfocando alterações no linfonodo. O objetivo deste estudo foi analisar os linfonodos de cães com LVC, considerando a densidade de células apoptóticas. Utilizou-se 32 cães naturalmente infectados, de área endêmica para LVC, classificados nos grupos sintomático (S), assintomático (A) e oligossintomático (O). Os linfonodos foram colhidos para análise histopatológica. A avaliação da carga parasitária e porcentagem de apoptose foi feita pelo método de imunoistoquímica. Na avaliação histopatológica, no infiltrado dos linfonodos dos grupos O e S predominaram macrófagos e plasmócitos, envolvendo todas as regiões do linfonodo e causando distorção deste órgão pela presença de granulomas atípicos associados à atrofia linfóide nos casos crônicos. A carga parasitária e a densidade de células apoptóticas foram maiores nos cães sintomáticos, podendo estar associado à causa de atrofia linfóide, deixando-os mais susceptíveis a LVC. Os linfonodos subescapular e poplíteo foram os que apresentaram maior reatividade, porém a atrofia linfóide foi mais evidente neste último. Conclui-se que independente do quadro clínico, a resposta predominante foi granulomatosa e de plasmócitos. A associação entre a apoptose e a carga parasitária não foi significativa (P<0,05), mas parece ter importância biológica, já que cães (grupo S) com a maior carga parasitária, também tiveram o maior número de células apoptóticas, sugerindo um mecanismo de evasão imune do parasito, favorecendo sua sobrevivência e multiplicação no hospedeiro

The generalized lymphadenopathy is an aspect of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL), but there are few studies focusing on changes in the lymph node. The aim of this study was to examine the lymph nodes of dogs with CVL, considering the density of apoptotic cells. We used 32 dogs naturally infected in an endemic area for CVL, classified in groups symptomatic (S), asymptomatic (A) and oligosymptomatic (O). The lymph nodes were collected for histopathological analysis. The evaluation of parasite load and percentage of apoptosis was performed by immunohistochemistry. Histopathology, macrophages and plasma cells predominated in the infiltrate of the lymph nodes of groups O and S, involving all regions of the lymph node and forming granulomas associated with lymphoid atrophy in chronic cases. The parasite load and the density of apoptotic cells were higher in symptomatic dogs, which may be linked to causing lymphoid atrophy, leaving the dog more susceptible to LVC. The subscapular and popliteal lymph nodes were those with higher reactivity, but the lymphoid atrophy was most evident in the popliteal lymph node. It follows that regardless of the clinical picture, the predominant response was granulomatous and plasma cells. The association between apoptosis and the parasite load was not significant (P <0.05), but seems to have biological importance, since it was observed that dogs (group S) with the highest parasite load, also had the highest number of apoptotic cells, suggesting a mechanism for immune evasion of the parasite, promoting their survival and multiplication in the host

Immunophenotyping of canine lymphoma in paraffin embedded tissue / Imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina

The use of immunohistochemistry techniques to c1assify canine lymphomas in paraffin embedded tissues was the object of this study. Anti-CD3 antibodies for T-cells and anti-CD79a antibodies for B-cells were used. T-cell lymphomas were more frequent (60.2%), followed by B-cell lymphomas (32.6%) and T/B-cell lymphomas (7.2%). Using the lymphoid anti-CD3 (Dako A0452) and anti-CD79a (Dako M7051) markers specific for humans, we concluded that these antibodies showed cross-reactivity with canine tissue and can be used in determining the lymphoid line of canine lymphomas. We also showed that the immunohistochemistry technique used in paraffin embedded tissues had excellent results, specially with the development of new mono and polyclonal antibodies with cross reactivity between species.

O presente estudo teve como objetivo a utilização da técnica de imunoistoquúnica para realizar a imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina. Para isso, foram utilizados os anticorpos anti-CD3 para células T e anti-CD79a para células B. Os resultados demonstraram que os linfomas T são os de maior ocorrência (60,2%), seguidos pelos linfomas B (32,6%) e TIB (7,2%). Realizando a classificação imunofenotípica destes linfomas, concluiu-se que os marcadores linfóides anti-CD3 (Dako A0452) e anti-CD79a (Dako M7051), espécie-específicos para humanos, apresentam reatividade cruzada com a espécie canina, sendo eficientes na determinação da linhagem linfóide dos linfomas caninos. Constatou-se ainda, que a técnica de imunoistoquímica aplicada em tecido incluído em parafina, apresenta excelentes resultados, principalmente com o avanço na descoberta de novos anticorpos mono e policlonais espécie-específicos ou que apresentem reatividade cruzada entre as espécies.

Immunophenotyping of canine lymphoma in paraffin embedded tissue / Imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina

The use of immunohistochemistry techniques to c1assify canine lymphomas in paraffin embedded tissues was the object of this study. Anti-CD3 antibodies for T-cells and anti-CD79a antibodies for B-cells were used. T-cell lymphomas were more frequent (60.2%), followed by B-cell lymphomas (32.6%) and T/B-cell lymphomas (7.2%). Using the lymphoid anti-CD3 (Dako A0452) and anti-CD79a (Dako M7051) markers specific for humans, we concluded that these antibodies showed cross-reactivity with canine tissue and can be used in determining the lymphoid line of canine lymphomas. We also showed that the immunohistochemistry technique used in paraffin embedded tissues had excellent results, specially with the development of new mono and polyclonal antibodies with cross reactivity between species.

O presente estudo teve como objetivo a utilização da técnica de imunoistoquúnica para realizar a imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina. Para isso, foram utilizados os anticorpos anti-CD3 para células T e anti-CD79a para células B. Os resultados demonstraram que os linfomas T são os de maior ocorrência (60,2%), seguidos pelos linfomas B (32,6%) e TIB (7,2%). Realizando a classificação imunofenotípica destes linfomas, concluiu-se que os marcadores linfóides anti-CD3 (Dako A0452) e anti-CD79a (Dako M7051), espécie-específicos para humanos, apresentam reatividade cruzada com a espécie canina, sendo eficientes na determinação da linhagem linfóide dos linfomas caninos. Constatou-se ainda, que a técnica de imunoistoquímica aplicada em tecido incluído em parafina, apresenta excelentes resultados, principalmente com o avanço na descoberta de novos anticorpos mono e policlonais espécie-específicos ou que apresentem reatividade cruzada entre as espécies.

Avaliação da especificidade do anticorpo \"mouse anti-mouse-uNK clone 1\" e a localização da molécula antigênica correspondente nas células uNK de camundongos / Evaluation of the antibody \"mouse anti-mouse-uNK clone 1\", specificity and localization of the correspondent epitopes in mice uNK cells

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK) , cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de \"mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)\" obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular

In the pregnant uterus of animals developing hemochorial type placentation occurs a transient migration and accumulation of natural killer lymphocytes (NK) which activity in the pregnancy has not been fully elucidated. These NK cells from uterine environment (uNK) present a distinct behavior from those found in the peripheral circulating blood (cNK), composing a subset of NK cells with specific gene expression that is regulated by pregnant uterus. Actually, these cells isolated from pregnant mice uteri were inoculated in the male mice of same strains, they induced immune response with production of antibodies reactivity specifically to uNK cells. In the present work it was used one of these mouse anti-mouse uterine natural killer cells clone 1 (mam-uNK1) monoclonal antibody that was obtained previously in our laboratory, in the aim to evaluate the specificity of this antibody and localization of corresponding antigenic molecule. It was used histological sections of uteri on 9º gestational day, lymphoid organs (spleen, thymus and lymph node), brain, liver and heart processed for immunocytochemistry with mam-uNK antibody at light microscopy and immunoelectron microscopy for uNK cells in pregnant uterus and cardiac muscle cells. Tissue homogenates from the same organs that were evaluated by immunocytochemistry were obtained to perform SDS-PAGE and Western-blot primary to identify the proteins fractions reactive with mam-uNK antibody and possible homology among the tissues. The immunolabeling pattern using mam-uNK both, in histological sections and Western-blot were compared with pattern of Dolichos biflorus (DBA) lectin reactions. The results showed diffuse positive reaction distributed in the cytoplasm with higher intensity on perimeter of uNK cells and diffuse labeling in the cytoplasm of decidual cells and, in smooth muscle cells of miometrium. Positive reaction was also found in the cytoplasm of cardiac muscle cells, reticular cells of lymphoid organs, hepatocytes and in the axon bundles of the brain. By immunelectron microscopy, were observed higher number of gold particles in the cytoplasm of microvillous-like cell processes and in the marginal cytoplasm near the plasma membrane of uNK cells. In the cardiac muscle cells the most conspicuous labeling was seen in the cytoplasm of muscle cells at the end portions, that is, where the myofibrills were less organized and anchoring to plasma membrane. The Western-blot identified two bands with 52 and 54 kDa reactive do mam-uNK constantly found in all organs analyzed. These data show that the molecule that is recognized by mam-uNK1 antibody is widely distributed in several cell types, not specific for mouse uNK cells, but has a very peculiar localization in these cells and in the cardiac muscle cells. To the localization pattern that was identified by immunelectron microscopy it was suggested that, these molecules were associated to the modulation of the cytoskeleton in many activities that these structural component potentially could carry out in the cells, being particularly attractive those related to cell motility