Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos

Abstract This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Resumo Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P 0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P 0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P 0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.(AU)

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.(AU)

Phenoloxidase activity and haemolymph cytology in honeybees challenged with a virus suspension (deformed wings virus DWV) or phosphate buffered suspension (PBS) / Atividade fenoloxidase e citologia de hemolinfa em abelhas infectadas com uma suspensão de vírus (DWV deformed wings) ou suspensão tamponada com fosfato (PBS)

The innate immune system of honeybees mainly consists in antimicrobial peptides, cellular immunity and melanisation. In order to investigate the immune response of honeybees to immune stressors, three stress degrees were tested. Newly emerged bees naturally DWV-infected were collected from a Varroa mite-free apiary and divided into three experimental groups: naturally DWV infected bees, PBS injected bees, and artificially DWV super infected bees. Phenoloxidase activity and haemolymph cellular subtype count were investigated. Phenoloxidase activity was highest (P<0.05) in DWV-superinfected bees, and the haemocyte population differed within the three observed groups. Although, immune responses following DWV infection have still not been completely clarified, this investigation sheds light on the relation between cell immunity and the phenoloxidase activity of DWV-naturally infected honeybees exposed to additional stress such as injury and viral superinfection.(AU)

O sistema imune inato das abelhas consiste principalmente em peptídeos antimicrobianos, imunidade celular e melanização. Para investigar a resposta imune das abelhas a estressores imunológicos, foram testados três graus de estresse. Abelhas recém-emergidas naturalmente infectadas por DWV foram coletadas de um apiário livre de Varroa e divididas em três grupos experimentais: abelhas naturalmente infectadas por DWV, abelhas injetadas com PBS e abelhas superinfectadas artificialmente com DWV. A atividade de fenoloxidase e a contagem de subtipos celulares de hemolinfa foram investigadas. A atividade da fenoloxidase foi maior (P<0,05) nas abelhas super-infectadas com DWV, e a população de hemócitos diferiu entre os três grupos observados. Embora as respostas imunes após a infecção pelo DWV ainda não tenham sido completamente esclarecidas, esta investigação lança luz sobre a relação entre a imunidade celular e a atividade da fenoloxidase das abelhas infectadas naturalmente pelo DWV, expostas a estresse adicional, como lesão e superinfecção viral.(AU)

Identification of SNP c.-22G>A in the melanophilin gene from a dog with color dilution alopecia: case report

ABSTRACT Mutant color alopecia is an ectodermical defection of color dilution, characterized by partial alopecia, dry, shine-less hair, and peeling and papule. Melanization damages also occur on the cortical structure of the affected hair. The animals affected have big melanin grains with irregular shape on the basal keratinocytes, also on the hair matrix cells and rod. Therefore, there is not a specific treatment that makes any difference on the syndrome evolution. Although in some animals, it is possible to use weekly showers with benzyl peroxide to reduce seborrhea formation and secondary infections. There is evidence that the condition in dogs is caused by a single nucleotide polymorphism in the gene encoding the melanophilin protein. In the present study the identification of the SNP c.-22G>A in the melanophilin gene of a Dachshund breed dog with clinical and histopathologic evidence of color dilution alopecia is reported.

RESUMO Alopecia por diluição da cor é um defeito ectodérmico caracterizado por alopecia parcial, pelagem seca e sem brilho, escamação e pápulas em áreas com defeitos na melanização e na estrutura cortical dos pelos. Os animais acometidos têm grânulos de melanina grandes e com formato irregular nos ceratinócitos basais, nas células da matriz dos pelos e nas hastes pilosas. Não existe tratamento específico que altere a evolução da síndrome, mas, em alguns animais, podem ser benéficos banhos semanais com xampu de peróxido de benzoíla, para reduzir a formação de seborreia e infecções secundárias. Há evidências de que a condição em cães é causada por uma mutação de ponto no gene que codifica a proteína melanophilina. No presente estudo, é relatada a identificação da mutação SNP c.-22G>A no gene da melanophilina em um cão da raça Dachshund com evidências clínicas e histopatológicas de alopecia por diluição da cor.

Melanose multicêntrica em frango de corte: relato de caso / Multicentric melanosis in broiler: case report

Melanoblastos podem migrar de forma errática durante a embriogênese, gerando um quadro conhecido como melanose. São raros os estudos envolvendo melanose com acometimento múltiplo dos órgãos. Objetivou-se descrever um caso de melanose multicêntrica em frango de corte que gerou condenação do animal ao abate. Foram encaminhadas ao Laboratório de Patologia Animal da Universidade Federal do Espírito Santo para avaliação histopatológica amostras de diversos órgãos de uma ave de corte da linhagem Cobb de 48-49 dias de idade. Esse animal foi condenado na linha de inspeção por apresentar áreas multifocais enegrecidas. Ao exame microscópico, observou-se melanina multifocal variando de moderada a intensa quantidade em todos os órgãos acometidos com lesões enegrecidas na macroscopia. As áreas pigmentadas foram negativas para a coloração especial de azul da Prússia e não foram encontradas células neoplásicas. A pigmentação da pele em aves comercializadas no Ocidente é rara, pois a característica de pele clara foi selecionada por meio de melhoramento genético, mas pouco se sabe sobre quais mutações desencadeiam melanose nas linhagens selecionadas para não apresentar pigmentação. A ave apresentou melanose multicêntrica e tal alteração não compromete a função dos órgãos acometidos nem representa risco para a saúde humana, no entanto, devido ao aspecto macroscópico, os órgãos que apresentam tal lesão foram condenados para consumo humano.(AU)

Melanoblasts can enter an erratic migratory pathway during embryogenesis and it creates a clinical condition known as melanosis. Studies involving melanosis in multiple organs are rare. The aim of this paper is to describe a case of multicentric melanosis in a broiler resulting in animal condemnation at slaughter. Samples from diverse organs originating from a Cobb broiler, 48-49 days of age, were sent to Laboratório de Patologia Animal from Universidade Federal do Espírito Santo for histopathological avaliation. This animal was condemned in line inspection due to multifocal black areas of pigmentation. At microcopic avaliation, multifocal melanin in moderate-intense amount in all the organs stricken with macroscopic black lesions was noted. Sections of pigmented areas were negative for Prussian Blue and no neoplasic cells were found. Pigmentation of the skin in a broiler from the Ocident is rare because the white/yellow skin was selected through genetic enhancement, but there is some data about which mutations unleash melanosis in lineages selected to not have pigmentation. The broiler had multicentric melanosis and this alteration doesn't change functional activity of the stricken organs and doesn't represent any risk for human health, but the organs with this lesion were condemned for human consumption due to their macroscopic appearance.(AU)

Identification of SNP c. -22G>A in the melanophilin gene from a dog with color dilution alopecia: case report / Identificação do SNP c. -22G>A no gene da melanophilina em um cão com alopecia por diluição da cor: relato de caso

Mutant color alopecia is an ectodermical defection of color dilution, characterized by partial alopecia, dry, shine-less hair, and peeling and papule. Melanization damages also occur on the cortical structure of the affected hair. The animals affected have big melanin grains with irregular shape on the basal keratinocytes, also on the hair matrix cells and rod. Therefore, there is not a specific treatment that makes any difference on the syndrome evolution. Although in some animals, it is possible to use weekly showers with benzyl peroxide to reduce seborrhea formation and secondary infections. There is evidence that the condition in dogs is caused by a single nucleotide polymorphism in the gene encoding the melanophilin protein. In the present study the identification of the SNP c.-22G>A in the melanophilin gene of a Dachshund breed dog with clinical and histopathologic evidence of color dilution alopecia is reported.(AU)

Alopecia por diluição da cor é um defeito ectodérmico caracterizado por alopecia parcial, pelagem seca e sem brilho, escamação e pápulas em áreas com defeitos na melanização e na estrutura cortical dos pelos. Os animais acometidos têm grânulos de melanina grandes e com formato irregular nos ceratinócitos basais, nas células da matriz dos pelos e nas hastes pilosas. Não existe tratamento específico que altere a evolução da síndrome, mas, em alguns animais, podem ser benéficos banhos semanais com xampu de peróxido de benzoíla, para reduzir a formação de seborreia e infecções secundárias. Há evidências de que a condição em cães é causada por uma mutação de ponto no gene que codifica a proteína melanophilina. No presente estudo, é relatada a identificação da mutação SNP c.-22G>A no gene da melanophilina em um cão da raça Dachshund com evidências clínicas e histopatológicas de alopecia por diluição da cor.(AU)

Melanose multicêntrica em frango de corte: relato de caso / Multicentric melanosis in broiler: case report

Melanoblastos podem migrar de forma errática durante a embriogênese, gerando um quadro conhecido como melanose. São raros os estudos envolvendo melanose com acometimento múltiplo dos órgãos. Objetivou-se descrever um caso de melanose multicêntrica em frango de corte que gerou condenação do animal ao abate. Foram encaminhadas ao Laboratório de Patologia Animal da Universidade Federal do Espírito Santo para avaliação histopatológica amostras de diversos órgãos de uma ave de corte da linhagem Cobb de 48-49 dias de idade. Esse animal foi condenado na linha de inspeção por apresentar áreas multifocais enegrecidas. Ao exame microscópico, observou-se melanina multifocal variando de moderada a intensa quantidade em todos os órgãos acometidos com lesões enegrecidas na macroscopia. As áreas pigmentadas foram negativas para a coloração especial de azul da Prússia e não foram encontradas células neoplásicas. A pigmentação da pele em aves comercializadas no Ocidente é rara, pois a característica de pele clara foi selecionada por meio de melhoramento genético, mas pouco se sabe sobre quais mutações desencadeiam melanose nas linhagens selecionadas para não apresentar pigmentação. A ave apresentou melanose multicêntrica e tal alteração não compromete a função dos órgãos acometidos nem representa risco para a saúde humana, no entanto, devido ao aspecto macroscópico, os órgãos que apresentam tal lesão foram condenados para consumo humano.(AU)

Melanoblasts can enter an erratic migratory pathway during embryogenesis and it creates a clinical condition known as melanosis. Studies involving melanosis in multiple organs are rare. The aim of this paper is to describe a case of multicentric melanosis in a broiler resulting in animal condemnation at slaughter. Samples from diverse organs originating from a Cobb broiler, 48-49 days of age, were sent to Laboratório de Patologia Animal from Universidade Federal do Espírito Santo for histopathological avaliation. This animal was condemned in line inspection due to multifocal black areas of pigmentation. At microcopic avaliation, multifocal melanin in moderate-intense amount in all the organs stricken with macroscopic black lesions was noted. Sections of pigmented areas were negative for Prussian Blue and no neoplasic cells were found. Pigmentation of the skin in a broiler from the Ocident is rare because the white/yellow skin was selected through genetic enhancement, but there is some data about which mutations unleash melanosis in lineages selected to not have pigmentation. The broiler had multicentric melanosis and this alteration doesn't change functional activity of the stricken organs and doesn't represent any risk for human health, but the organs with this lesion were condemned for human consumption due to their macroscopic appearance.(AU)

Identification of SNP c. -22G>A in the melanophilin gene from a dog with color dilution alopecia: case report / Identificação do SNP c. -22G>A no gene da melanophilina em um cão com alopecia por diluição da cor: relato de caso

Mutant color alopecia is an ectodermical defection of color dilution, characterized by partial alopecia, dry, shine-less hair, and peeling and papule. Melanization damages also occur on the cortical structure of the affected hair. The animals affected have big melanin grains with irregular shape on the basal keratinocytes, also on the hair matrix cells and rod. Therefore, there is not a specific treatment that makes any difference on the syndrome evolution. Although in some animals, it is possible to use weekly showers with benzyl peroxide to reduce seborrhea formation and secondary infections. There is evidence that the condition in dogs is caused by a single nucleotide polymorphism in the gene encoding the melanophilin protein. In the present study the identification of the SNP c.-22G>A in the melanophilin gene of a Dachshund breed dog with clinical and histopathologic evidence of color dilution alopecia is reported.(AU)

Alopecia por diluição da cor é um defeito ectodérmico caracterizado por alopecia parcial, pelagem seca e sem brilho, escamação e pápulas em áreas com defeitos na melanização e na estrutura cortical dos pelos. Os animais acometidos têm grânulos de melanina grandes e com formato irregular nos ceratinócitos basais, nas células da matriz dos pelos e nas hastes pilosas. Não existe tratamento específico que altere a evolução da síndrome, mas, em alguns animais, podem ser benéficos banhos semanais com xampu de peróxido de benzoíla, para reduzir a formação de seborreia e infecções secundárias. Há evidências de que a condição em cães é causada por uma mutação de ponto no gene que codifica a proteína melanophilina. No presente estudo, é relatada a identificação da mutação SNP c.-22G>A no gene da melanophilina em um cão da raça Dachshund com evidências clínicas e histopatológicas de alopecia por diluição da cor.(AU)

MELANOGÊNESE E SENSIBILIDADE DE CEPAS DO COMPLEXO DE ESPÉCIES Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii IN VITRO: UMA MODULACÃO COM INIBIDORES DA BOMBA DE PRÓTONS, CATECOLAMINAS E PARAQUAT

Cryptococcus spp. são agentes etiológicos da criptococose. Para estabelecer a infecção, essas leveduras expressam fatores de virulência como a melanina e o biofilme. Esta tese foi dividida em três objetivos: 1. Avaliar os efeitos dos inibidores da bomba de prótons (IBPs) sobre o crescimento e a produção de melanina de Cryptococcus spp.; 2. Investigar a produção de melanina pelo complexo de espécies C. neoformans/C. gattii na presença de diferentes precursores da melanogênese, avaliando o efeito da melanização na sensibilidade antifúngica; 3. Avaliar a atividade de paraquat (PQ) contra Cryptococcus spp. nas formas planctônica e biofilme, bem como o efeito protetor de agentes antioxidantes sobre essa atividade. Buscou-se avaliar ainda a cinética da produção de melanina diante o PQ. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de IBPs foram determinadas por microdiluição. O efeito dos IBPs na produção de melanina foi avaliado na presença de sulfato de cobre ou glutationa. Foram utilizados como substratos para a melanogênese, a epinefrina, norepinefrina, dopamina, ácido cafeico e L-dopa, sendo em seguida avaliada a sensibilidade in vitro. A atividade da anfotericina B em cepas melanizadas foi investigada no ensaio de time kill. A sensibilidade ao PQ foi avaliada e, em seguida, as cepas expostas ao PQ foram cultivadas em meio com ou sem ácido ascórbico (AA) e glutationa (GSH). Ademais, a produção de melanina foi avaliada na presença de L-dopa + PQ. Os IBPs mostraram CIMs variando de 125-1000 g/mL e redução da melanização em células de Cryptococcus. O sulfato de cobre e a glutationa restauraram a melanogênese das cepas na presença de IBPs. Adicionalmente, a presença de IBPs diminuiu a toxicidade do sulfato de cobre (1 mM). As cepas produziram melanina, em escalas diferenciada, de acordo com o substrato testado. As células melanizadas foram mais tolerantes à anfotericina B. No tocante ao efeito do PQ, observou-se CIM variando de 8-256 g/mL e uma inibição na formação do biofilme. O efeito inibitório planctônico foi restaurado por AA e GSH. Além disso, L-dopa + PQ alterou a cinética da produção de melanina. Em conclusão, observou-se que IBPs inibem o crescimento planctônico e a melanogênese em Cryptococcus spp., sendo este último efeito dependente da quelação do cobre ou inibição do transporte de cobre ATPase. Ademais, os dados em conjunto, evidenciaram que a melanina contribui para a maior resiliência de Cryptococcus spp. a drogas antifúngicas, como a anfotericina B, e agentes agressores ambientais, como o paraquat.

Cryptococcus spp. are etiological agents of cryptococcosis. To establish infection, these yeasts produce virulence factors such as melanin and biofilm. This thesis was divided into three aims: 1. Evaluate the effects of proton pump inhibitors (PPIs) on growth and melanin production by Cryptococcus spp.; 2. Investigate the production of melanin by the C. neoformans/C. gattii species complex in the presence of different precursors of melanogenesis, evaluating the effect of melanization on antifungal susceptibility. 3. Evaluate the activity of paraquat (PQ) against Cryptococcus spp. in planktonic and biofilm forms, as well as the protective role of antioxidant agents against PQ. We also sought to evaluate the kinetics of melanin production in the presence of PQ. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of PPIs were determined by microdilution. The effect of PPIs on melanin production was evaluated in the presence of copper sulfate or glutathione. As substrates for melanogenesis, epinephrine, norepinephrine, dopamine, caffeic acid and L-dopa were used, then, in vitro susceptibility was evaluated. Amphotericin B activity against melanized strains was investigated by the time kill assay. The susceptibility to PQ was evaluated and the strains exposed to the PQ were cultivated in medium with or without ascorbic acid (AA) and glutathione (GSH). Furthermore, melanin production was evaluated in the presence of L-dopa + PQ. PPIs showed MICs ranging from 125-1000 g/mL and reduced melanization of Cryptococcus cells. Copper sulfate and glutathione restored the melanogenesis of the strains in the presence of PPIs. Additionally, the presence of PPIs decreased copper sulphate toxicity (1 mM). The strains produced melanin, at different levels, according to the tested substrate. Melanized cells were more tolerant to amphotericin B. Regarding the effect of PQ, MICs ranged from 8-256 g/mL and biofilm formation was inhibited. The inhibitory effect of PQ was hampered by AA and GSH. Furthermore, L-dopa + PQ altered the kinetics of melanin production. In conclusion, it was observed that PPIs inhibit planktonic growth and melanogenesis of Cryptococcus spp., with the latter being dependent on copper chelation or inhibition of copper ATPase transport. Furthermore, altogether, the data showed that melanin contributes to reduced susceptibility of Cryptococcus spp. to the antifungal drug amphotericin B, and the environmental aggressor paraquat.

USO DO PLASMA NÃO TÉRMICO NA VIDA DE PRATELEIRA DO CAMARÃO BRANCO (Litopenaeus vannamei, Boone 1931)

O pescado é um alimento que se deteriora facilmente, devendo ser bem manipulado, conservado e armazenado. Para isso, é considerável o uso de novas tecnologias afim de manter suas características sensoriais e nutricionais, de preferência livre do uso de aditivos químicos. Isso pode ser observado com a utilização de tecnologias limpas (como embalagem em atmosfera modificada, ozônio e radiação UV) e o plasma não térmico, que tem demonstrado aplicabilidade satisfatória no tratamento antimicrobiano, com um futuro promissor na indústria alimentícia. Assim, objetivou-se avaliar a qualidade química (nitrogênio de bases voláteis totais, nitrogênio de trimetilamina e substâncias reativas ao ácido 2-tiubarbitúrico), física (pH, coloração, perda de peso na cocção, capacidade de retenção de água e força de cisalhamento), microbiológica (mesófilas, psicrotróficas e salmonella sp) e sensorial (método do índice de qualidade - MIQ) do camarão branco (Litopenaeus vannamei), inteiro, fresco, submetido ao tratamento com plasma não térmico, em diferentes frequências, na conservação do mesmo. Para isso, foram divididos 4 grupos amostrais sendo um controle e os demais grupos submetidos ao plasma frio às frequências de 5, 10 e 15 MHz, durante 10 minutos de aplicação. Em seguida foi avaliado o efeito da utilização do plasma não térmico, sobre as características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais. O grupo submetido ao plasma não térmico contribuiu significativamente na manutenção da qualidade do camarão durante o armazenamento, retardando o processo de melanização, o crescimento microbiano, melhorando as qualidades físico-químicas e sensoriais das amostras. A exposição do camarão branco (Litopenaeus vannamei) ao plasma não térmico sob frequência de 15 MHz promoveu melhores resultados nas qualidades física, química, microbiológica e sensorial (comprovada por meio do MIQ), aumentando a vida de prateleira das amostras em 5 dias, sugerindo que o tratamento é eficaz na manutenção da qualidade do camarão.

Fish is a food that deteriorates easily and must be well handled, preserved and stored. For this, the use of new technologies is important to maintain its sensorial and nutritional characteristics, preferably free of the use of chemical additives. This can be observed with the use of clean technologies (such as modified atmosphere packaging, ozone and UV radiation) and non-thermal plasma, which has demonstrated satisfactory applicability in antimicrobial treatment, with a promising future in the food industry. The objective of this study was to evaluate the chemical quality (nitrogen of total volatile bases, nitrogen of trimethylamine and substances reactive to 2-tiubarbituric acid), microbial (mesophilic, psychrotrophic and salmonella sp) and sensory (quality index method - MIQ) of white shrimp (Litopenaeus vannamei), whole, fresh, treated with non-thermal plasma, at different frequencies, in the same. For this, 4 sample groups were divided into one control and the other groups submitted to cold plasma at the frequencies of 5, 10 and 15 MHz during 10 minutes of application. The effect of the use of non-thermal plasma on the microbiological, physicochemical and sensorial characteristics was then evaluated. The group submitted to non-thermal plasma contributed significantly to the maintenance of shrimp quality during storage, retarding the melanization process, microbial growth, improving the physical-chemical and sensorial qualities of the samples. The exposure of white shrimp (Litopenaeus vannamei) to non-thermal plasma under 15 MHz frequency promoted better results in physical, chemical, microbiological and sensory (proven by MIQ), increasing the shelf life of the samples in 5 days, suggesting that the treatment is effective in maintaining shrimp quality.

CARACTERIZAÇÃO E PRODUÇÃO DE MELANINA PELO FUNGO NEMATÓFAGO Duddingtonia flagrans E AVALIAÇÃO DA SUA PARTICIPAÇÃO NA ATIVIDADE PREDATÓRIA

Melaninas formam um grupo diverso de pigmentos sintetizados na maioria dos organismos por meio da hidroxilação e polimerização de compostos orgânicos. Nos fungos, a melanina exerce um importante papel na proteção contra as intempéries ambientais, a radiação ultravioleta, extremos de temperaturas, além de aumentar a virulência e a patogenicidade destes organismos. Assim, buscou-se descrever a síntese de melanina em Duddingtonia flagrans, fungo nematófago, e a relação da melanização sobre a cinética de predação do nematoide Panagrellus spp. Para tal foram testados diferentes meios de cultura na presença e na ausência de precursores L-DOPA, na adição de glicose e do inibidor tricyclazol. As análises foram realizadas por espectroscopia de infravermelho, ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e microscopia eletrônica de transmissão. O melhor crescimento e a melanização do fungo ocorreram em meio Sabouraud dextrose quando comparado aos demais meios utilizados, após 21 dias incubados a 30°C. O acréscimo de glicose nas concentrações de 2% a 10% (v/w) não inibiu o processo de melanização em D. flagrans. Entretanto acréscimos de 2% de glicose em pH 5,0 observou-se um aumento na coloração em relação aos demais tratamentos. Nas concentrações de glicose acima de 10% ocorreu a inibição completa do crescimento. Como conclusão pode-se confirmar a presença do pigmento melanina e atribuir os valores obtidos por RPE (g=2.0051 0.0001) a produção de feomelanina pelo fungo. Ainda, pode-se verificar a deposição dos grânulos de melanina sobre a parede celular. A síntese da melanina ocorreu em melanossomos e sua gênese é análoga a de melanossomos de células de mamíferos. Contudo, a presença de melanina não influenciou de forma significativa a cinética de predação entre o fungo e nematoide.

Melanins form a diverse group of pigments synthesized in most organisms through the hydroxylation and polymerization of organic compounds.In the fungi, melanin has an important role in protecting against environmental inclemencies, ultraviolet radiation, temperature extremes, virulence and pathogenicity of these organisms. Thus, we attempted to describe the melanin synthesis in Duddingtonia flagrans, nematophagous fungus, and the relationship between melanization and predation kinetics of Panagrellus spp. nematode. For this, differents culture media were tested in presence and in absence of L-DOPA precursors, in addition of glucose and tricyclazole inhibitor. The analysis were realized by infrared spectroscopy, electronic paramagnetic resonance (EPR) and transmission electron microscopy. The better growth and melanization of the fungus occurred in Sabouraud dextrose medium when compared to other media used after 21 days incubated at 30°C. The addition of glucose at 2% to 10% (v/w) concentrations did not inhibit the melanization process in D. flagrans. However, the addition of glucose at 2% at pH 5.0, it was observed an increase staining in relation to others treatments. In the glucose concentrations above 10% occurred complete inhibition of growth. It was confirmed the presence of melanin pigment and to assign the values obtained by RPE (g=2.0051 0.0001) to production of pheomelanin by the fungus. And it was observed the deposition of the melanin granules on the cell wall. Melanin synthesis has occurred in melanosomes and its genesis is analogous to that of mammalian cell melanosomes. However, the presence of melanin did not significantly influence the kinetics of predation between the fungus and the nematode.