Molecular characterization of virulence genes cctA, nanA, and fliC in Clostridium chauvoei from Rio Grande do Sul and São Paulo State, Brazil / Caracterização molecular dos genes de virulência cctA, nanA e fliC em Clostridium chauvoei isolados no Rio Grande do Sul e São Paulo, Brasil

Clostridium chauvoei toxin A (CctA), neuraminidase (NanA), and flagellin (FliC) proteins contribute to the pathogenicity of Clostridium chauvoei, the causative agent of blackleg in cattle. The aim of this study was to analyze the genetic variability of cctA, nanA, and fliC genes in C. chauvoei isolates from the Rio Grande do Sul and São Paulo state- Brazil, during different sampling periods. The presence of these genes was verified through PCR amplification and partial gene sequencing of 17 strains. Alignment of PCR amplicons combined with bioinformatics analysis was used in an attempt to study the variability across C. chauvoei solates. The similarity among the partial sequences of cctA and nanA genes was 100%. The sequencing of fliC revealed three different paralog alleles of flagellin, and two strains were seen to be polymorphic, with amino acid alterations in the predicted protein. Overall, this study indicates that strains of C. chauvoei isolated in Brazil are highly conserved with respect to the virulence factors evaluated.(AU)

Toxina A de Clostridium chauvoei (CctA), neuraminidase (NanA) e flagelina (FliC) são proteínas que contribuem para a patogenicidade de Clostridium chauvoei, o agente causador do carbúnculo sintomático em bovinos. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética dos genes cctA, nanA, e fliC em C. chauvoei isolados em diferentes períodos no Rio Grande do Sul e São Paulo. A presença destes genes foi verificada pela amplificação dos produtos da PCR e sequenciamento parcial dos genes de 17 cepas. Os alinhamentos da amplificação dos produtos da PCR combinados com a análise de bioinformática foram utilizados na tentativa de avaliar a variabilidade dos genes entre os isolados de C. chauvoei. A similaridade do sequenciamento parcial dos genes cctA e nanA foi 100%. O sequenciamento do fliC revelou três alelos paralogos diferentes de flagelina e duas cepas mostraram polimorfismos, causando alterações na sequência de aminoácidos. As cepas de C. chauvoei isoladas no Brasil mostraram-se altamente conservadas em relação aos fatores de virulência avaliados neste estudo.(AU)

Evolution of equine influenza viruses (H3N8) during a Brazilian outbreak, 2015

Abstract Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.

Evolution of equine influenza viruses (H3N8) during a Brazilian outbreak, 2015

Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.(AU)

Lectin activity in mycelial extracts of Fusarium species

Lectins are non-immunogenic carbohydrate-recognizing proteins that bind to glycoproteins, glycolipids, or polysaccharides with high affinity and exhibit remarkable ability to agglutinate erythrocytes and other cells. In the present study, ten Fusarium species previously not explored for lectins were screened for the presence of lectin activity. Mycelial extracts of F. fujikuroi, F. beomiformii, F. begoniae, F. nisikadoi, F. anthophilum, F. incarnatum, and F. tabacinum manifested agglutination of rabbit erythrocytes. Neuraminidase treatment of rabbit erythrocytes increased lectin titers of F. nisikadoi and F. tabacinum extracts, whereas the protease treatment resulted in a significant decline in agglutination by most of the lectins. Results of hapten inhibition studies demonstrated unique carbohydrate specificity of Fusarium lectins toward O-acetyl sialic acids. Activity of the majority of Fusarium lectins exhibited binding affinity to D-ribose, L-fucose, D-glucose, L-arabinose, D-mannitol, D-galactosamine hydrochloride, D-galacturonic acid, N-acetyl-d-galactosamine, N-acetyl-neuraminic acid, 2-deoxy-D-ribose, fetuin, asialofetuin, and bovine submaxillary mucin. Melibiose and N-glycolyl neuraminic acid did not inhibit the activity of any of the Fusarium lectins. Mycelial extracts of F. begoniae, F. nisikadoi, F. anthophilum, and F. incarnatum interacted with most of the carbohydrates tested. F. fujikuroi and F. anthophilum extracts displayed strong interaction with starch. The expression of lectin activity as a function of culture age was investigated. Most species displayed lectin activity on the 7th day of cultivation, and it varied with progressing of culture age.(AU)

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE ENSAIO DE RT-PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS SUBTIPOS DO VÍRUS INFLUENZA A (H1/H3, N1/N2) CIRCULANTES EM SUÍNOS NO BRASIL

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/L, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.

Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/L, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.

Swine Influenza Virus: Standardization of a nested RT-PCR and subtyping of field samples circulating in Brazil from 2012-2018

O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012-2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo co-infecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012-2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas

Influenza A virus (IAV) causes an acute respiratory disease in pigs, characterized by high morbidity in the herds. The IAVs have a segmented negative sense genomic RNA, which contributes to genetic mutations and virus rearrangements. The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the main targets of host immune response, and mutations in these glycoproteins contribute to the genetic diversity of the virus. Three subtypes of swine influenza virus (SIV) circulate worldwide in the swine population: H1N1, H1N2 and H3N2. Rapid identification of viral subtypes is important for virus monitoring, assisting the detection of possible outbreaks and viral antigenic variations. The objective of this study was to standardize a RT-PCR test for the detection of SIV subtypes present in Brazil, analyzing their distribution combined with serological data from 2012-2018. The delineation of specific primers for the HA region was carried out from sequences of Brazilian samples, previously deposited at GenBank database. Characterized samples of H1N1pdm09, H3N2 and H1Delta were used as references. A first (One Step RT-PCR) and a second (Nested PCR) reaction was performed to standardize the test. Ninety-two field samples, previously positive for IAV, from 2012 to 2018 were used for the test validation. Sensitivity was assessed from the detection limit test and specificity from cross primer assays in control samples. The amplified PCR products from the field samples were sequenced and phylogenetic analysis was performed, as well as the p-distance calculation between samples of the same subtype. Partial HA sequences of H1pdm, from samples of the study and from other years, were translated and compared. Subtyping the N gene of H1Delta positive samples was performed. Serological analyzes were performed on 949 serum samples obtained from 2017-2018, evaluating the presence of antibodies against H1N1pdm09 and H3N2 by the Hemagglutination Inhibition (HI) test. The Nested test was more sensitive than the One-step reaction. There was no nonspecific cross amplification. Seventy-one (71/92-77%) of the field samples were subtyped by the Nested RT-PCR, 14 (14/71-20%) collected in 2012-2013, 35 (35/71- 49%) in 2014-2015, and 22 (22/71-31%) in 2017-2018. In 2012-2015, most of the samples were positive for H1N1pdm09, followed by H1Delta and H3N2, with H1N1pdm09 + H3N2 and H1N1pdm09 + H1Delta co-infection. In 2017-2018, there were more positive samples for H1Delta, followed by H1N1pdm and H3N2, and co-infection was also observed. From the H1Delta positive samples, only 57% (12/21) were subtyped for the N gene, with the majority positive for N2. A total of 716 serum samples were positive for IAV, and in 2017-2018 the occurrence of H3N2 was higher than H1N1pdm09 as well as the co-infection between H1N1pdm09+H3N2. By the phylogenetic analysis, partial sequences of each analyzed subtype have grouped into similar clusters. The p-distance analysis identified dissimilarity between samples into the H1Delta cluster and samples into H1N1pdm09 group. Amino acid alignment of H1N1pdm partial sequences, from different years, showed residual variations, especially at antigenic sites. The Nested RT-PCR technique was fast, sensitive and specific, which is recommended for SIV subtyping. Four subtypes of SIV circulate in Brazil. In 2012-2015 a higher occurrence of H1N1pdm was evidenced, but H3N2 was the most observed in 2017-2018. Analysis of amino acid residues of the H1N1pdm sequences demonstrated point substitutions between samples from different years, suggesting the evolution of the virus over time. Studies related to the genetic characterization of circulating SIVs in Brazil are essential to understand the evolution of viruses and their antigenic characteristics.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ANTIGÊNICA DE Clostridium chauvoei ISOLADOS DE CASOS DE CARBÚNCULO SINTOMÁTICO EM BOVINOS

As clostridioses formam o grupo de infecções e intoxicações causadas por micro-organismos anaeróbios do gênero Clostridium. Dentre estas enfermidades, a principal doença que determina mionecrose é o carbúnculo sintomático, uma infecção endógena e aguda que acomete principalmente os bovinos, cujo agente etiológico é Clostridium chauvoei. O controle desta enfermidade se baseia em medidas adequadas de manejo e vacinações sistemáticas de todo o rebanho. As vacinas contra o carbúnculo sintomático comercializadas no Brasil são, no geral, compostas de múltiplos antígenos e seguem as normas para o controle da qualidade e eficiência definidas na legislação publicada pela Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). No entanto, são escassos os trabalhos com evidências científicas que comprovem a eficiência da vacina, assim como trabalhos que indiquem o grau de similaridade entre cepas de C. chauvoei utilizadas na produção destas vacinas, cepas de maior ocorrência no campo e a cepa padrão utilizada no teste de eficiência da vacina pelo MAPA. Da mesma forma os relatos acerca de falhas vacinais são informais e as circunstâncias destas falhas não são claramente elucidadas. Os principais fatores de virulência de C. chauvoei são a neuraminidase, citotoxina A (CctA) e a flagelina, sendo que a CctA parece ser o principal. Esta tese teve por objetivo avaliar a eficácia protetiva de vacinas comerciais frente ao desafio com C. chauvoei, bem como realizar a comparação genômica das cepas utilizadas no desafio vacinal (manuscrito 2). A diversidade molecular foi investigada, a partir do sequenciamento parcial dos genes da neuraminidase (nanA), CctA (cctA) e flagelina (fliC) de dezessete cepas de C. chauvoei isoladas de casos clínicos em bovinos (manuscrito 3). Também pretendeu à comparação genômica de seis cepas isoladas de casos de carbúnculo sintomático no Brasil com vistas a pesquisar diferenças moleculares na única cepa com apresentação clínica visceral (manuscrito 4). Dessa forma, discutir as implicações da caracterização molecular e antigênica no entendimento do carbúnculo sintomático, e subsidiar futuras pesquisas a fim de melhorar o controle da doença. Concluímos que o desempenho equivalente das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados estão correlacionados com a homologia genética das cepas, sugerindo que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica. O sequenciamento parcial dos genes nanA e cctA mostrou alta homologia entre as cepas. Por essa razão, estes antígenos solúveis são bons candidatos a antígenos vacinais. Além disso, três alelos foram detectados no gene fliC. Na comparação genômica as seis cepas brasileiras se mostraram altamente conservadas, tal como foi observado no sequenciamento parcial dos genes e na comparação das cepas utilizadas no desafio vacinal. Os resultados apresentados nesta tese podem ser um indicativo de que neste momento evolutivo C. chauvoei não está sendo desafiado a desenvolver mutações

Clostridioses are the group of infections and intoxications caused by anaerobic microorganisms of the genus Clostridium. Among these diseases, the main disease that causes myonecrosis is blackleg, an endogenous and acute infection that mainly affects cattle, whose etiological agent is Clostridium chauvoei. Control of this disease is based on adequate management measures and systematic vaccinations of herd. Vaccines against blackleg marketed in Brazil are, in general, composed of multiple antigens and follow the standards for quality and efficiency control defined in the legislation published by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA). However, there are few studies with scientific evidence to prove the effectiveness of the vaccine, as well as studies indicating the degree of similarity between strains of C. chauvoei used in the production of these vaccines, strains occurring in the field and the standard strain. Likewise reports of vaccine failures are informal and the circumstances of these failures are not clearly elucidated. The main virulence factors of C. chauvoei are neuraminidase, cytotoxin A (CctA) and flagellin, and CctA appears to be the main. This thesis aimed to evaluate the protective efficacy of commercial vaccines against the challenge with C. chauvoei, as well as to carry out the genomic comparison of the strains used in the vaccine challenge (manuscript 2). The molecular diversity, from the partial sequencing of the neuraminidase (nanA), CctA (cctA) and flagellin (fliC) genes of seventeen strains of C. chauvoei isolated from clinical cases in cattle was investigated (manuscript 3). It also aimed to the genomic comparison of six strains isolated from cases of blackleg in Brazil with a view to investigate molecular differences in the only strain with visceral clinical presentation (manuscript 4). Thus, to discuss the implications of molecular and antigenic characterization in the understanding of blackleg, and to support future research with the objective of improving disease control. We concluded that the similar performance observed between the strains in challenge in vivo and the inability to infect the vaccinated animals are correlated with the genetic homology of the strains, suggesting that vaccine failures are not related to antigenic variability. Partial sequencing of nanA and cctA genes showed high homology between strains. For this reason, these soluble antigens are good candidates for vaccine antigens. Moreover, three different fliC alleles were detected among the strains studied. In the genomic comparison, the six Brazilian strains were highly conserved, as observed in the partial sequencing of the genes and in the comparison of the strains used in the vaccine challenge. The results presented in this thesis may be indicative that at this evolutionary time C. chauvoei is not being challenged to develop mutations.

Prevalence of virulence genes among bulgarian nosocomial and cystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa

The aim of this study was to evaluate the prevalence of some virulence genes among 202 Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis (CF) patients (n=42) and non-CF in-patients (n=160) and to analyze the values according to the patient groups, infection localization and antimicrobial resistance. The following frequencies in all studied strains were established: algD (encoding GDP-mannose 6-dehydrogenase AlgD) - 91.1%, pilB (type IV fimbrial biogenesis protein PilB) - 23.8%, nan1 (neuraminidase) - 21.3%, lasB (elastase LasB) - 100%, plcH (haemolytic phospholipase C precursor) - 91.6%, exoS (exoenzyme S) - 62.4%, and exoU (exoenzyme U) - 30.2%. The prevalence of nan1 was significantly higher (P 0.01) in CF isolates (38.1%) than that in non-CF isolates (16.9%). The nan1-positive CF strains were cultured from 16 patients with recurrent lung exacerbations. This study revealed a statistically significant difference (P 0.01) between the portion of multidrug-resistant (MDR) nosocomial P. aeruginosa strains containing a large number (5) of virulence genes (38.1%) and the respective part of non-MDR isolates (17.6%). Moreover, pilB, exoU and nan1 manifested a higher spread (P 0.001) among MDR than in non-MDR strains (respectively, 39.1% vs. 13.2%; 40.2% vs. 17.7% and 26.1% vs. 4.4%). In conclusion, the dissemination of nan1 in CF isolates was moderate and correlated with the lower proportion of patients with lung exacerbations. The molecular-genetic detection of this gene may be used as an indirect measure of CF pulmonary disease evolution. Simultaneous determination of virulence factors and antimicrobial resistance is the contemporary approach for examination of the microbiological aspects of infections caused by P. aeruginosa.

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS INFLUENZA A EQUINO (H3N8) E SUÍNO (H3N2) DETECTADOS NO BRASIL.

O vírus influenza A (IAV) é capaz de infectar mamíferos e aves, constituindo-se em um risco para a produção animal e para a saúde publica. Devido a ocorrência de mutações pontuais (antigenic drift) e ressortimentos (antigenic shift), o escape imunológico de cepas emergentes é um fenômeno frequente, de modo que a imunidade previamente estabelecida em uma população pode tornar-se ineficiente contra uma nova cepa circulante. Pelo mesmo motivo, ocasionalmente o IAV pode estabelecer novas linhagens virais por meio da transmissão interespécies. O potencial epidêmico e pandêmico do IAV é um risco constante que demanda vigilância epidemiológica e caracterização molecular e antigênica das cepas circulantes. O objetivo deste estudo foi realizar análises filogenéticas e caracterização antigênica do vírus da influenza H3N8 isolado de equinos durante o surto que atingiu o Brasil e a América do Sul em 2012. Também foi realizado o isolamento e caracterização molecular de um IAV do subtipo H3N2 detectado em suínos. No primeiro estudo foi realizado o sequenciamento do genoma completo, a análise filogenética e caracterização antigênica dos vírus isolados em diferentes regiões do Brasil. A análise filogenética da hemaglutinina (HA) e da neuraminidase (NA) mostrou que o isolado pertencia à clade 1 da sublinhagem Florida, agrupando-se com isolados contemporâneos provenientes dos EUA, o que sugere uma possível origem para o vírus detectado durante o surto. As sequências de aminoácidos da HA e NA foram comparadas com a cepa vacinal recomendada pela OIE (Ohio/03 or South Africa/03 ???), com uma vacina contendo a cepa Kentucky/97, com sequências gênicas de vírus H3N8 contemporâneos da América do Sul e EUA. Mudanças consistentes de aminoácidos foram observadas na região HA1 das sequências obtidas de vírus H3N8 contemporâneos. A análise antigênica realizada por inibição da hemaglutinação utilizando antisoros de furões convalescentes contra representantes das linhagens e sublinhagens Europeia, Kentucky e Flórida (clades 1 e 2) mostrou que o isolado brasileiro foi reconhecido por soros produzido contra o vírus Florida clade 1, sem diferenças entre o isolado e a cepa recomendada pela OIE. No segundo estudo, o vírus da influenza suína H3N2 foi isolado em amostras de pulmão de leitões provenientes de um surto de doença respiratória. O isolamento foi realizado em cultura de células MDCK e a caracterização molecular do isolado mostrou um ressortimento de HA e NA semelhante a vírus H3N2 humanos de 1996-1997, e genes internos do H1N1 pandêmico. Na análise filogenética o isolado não agrupou com qualquer cluster de H3.

The influenza A virus (IAV) is able to infect mammals and birds, presenting risks for animal production and public health. Due to occurrence of punctual mutations (antigenic drift) and reassortments (antigenic shift), the immune escape of emerging strains is a frequent phenomenon, so that the previously established immunity in a population may become ineffective against novel circulating strains. For the same reasons, the IAV may establish new viral lineages by interspecies transmission. The epidemic and pandemic potential of IAV is a constant risk demanding epidemiological surveillance with molecular and antigenic characterization of circulating strains. The aim of this study was to perform phylogenetic analysis and antigenic characterization of equine influenza virus (EIV) H3N8 isolated during an outbreak which spread throughout Brazil and South America in 2012. It was also performed the isolation and molecular characterization of a swine IAV subtype H3N2.In the first study the whole genome sequence, phylogenetic analysis and antigenic characterization were performed in EIV strain that was isolated from different regions of Brazil. Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) phylogenetic analysis showed the isolate belonged to Florida clade 1 and clustered with contemporary isolates from USA, suggesting a possible origin for the virus of the outbreak. The amino acid sequences for HA and NA were compared against the OIE recommended vaccine strain, a vaccine with Kentucky/97 strain as antigen, and contemporary sequences from South America and USA. Consistent amino acid changes were observed in the HA1 region of contemporary sequences. The antigenic analysis by haemagglutination inhibition assay using ferret convalescent antisera raised against representatives of European, Kentucky and Florida (clades 1 and 2) lineage and sublineages, showed the Brazilian isolate was recognized by sera raised against Florida clade 1 viruses, without differences between the isolate and the OIE recommended strain. In the second study, a swine influenza virus (SIV) H3N2 was isolated of pulmonary samples of piglets from an outbreak of respiratory disease. The isolation was done in MDCK cell culture, and the molecular characterization of the isolate showed a reassortment with HA and NA similar to human H3N2 viruses from 1996 to 1997, and internal genes from the pandemic H1N1. The phylogenetic analysis showed the isolate not grouped with any cluster of H3.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.

Detecção do vírus da cinomose canina por RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos para os genes da fosfoproteína, hemaglutinina e neuraminidase / Detection of canine distemper virus by RT-PCR using oligonucleotides targeted to the phosphoprotein, hemagglutinin and neuraminidase genes

Empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa para detecção do vírus da cinomose canina (CC). Para a padronização da técnica foram selecionados quatro pares de oligonucleotídeos (P1, P2, N1, H1), baseados em seqüências dos genes da fosfoproteína, neuraminidase e hemaglutinina, sendo utilizadas três cepas vacinais de vírus da CC como controles positivos. Foram analisadas três amostras isoladas de cães com cinomose e quatro amostras provenientes de cães com suspeita clínica de cinomose. Não houve amplificação nas amostras com suspeita clínica da doença. Os resultados obtidos com os oligonucleotídeos P1 e N1 foram superiores aos de H1. Os oligonucleotídeos P2 foram considerados inapropriados para a detecção do vírus da CC. Os amplicons obtidos com os oligonucleotídeos P1, N1 e H1 foram clivados com endonucleases de restrição, sendo os perfis das amostras virais comparados aos da amostra vacinal Lederle, utilizada como referência. Um padrão similar de restrição foi observado em todas as amostras analisadas(AU)

The reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect canine distemper virus (CDV). Four oligonucleotide pairs were selected (P1, P2, N1, H1), based on the sequences of the phosphoprotein, hemagglutinin and nuraminidase genes for assay standardization, and three CDV vaccine strains were used as positive controls. Three viral isolates from dogs with canine distemper and four samples from animals clinically suspected of distemper were analysed. No amplification was detected in suspected samples. Results obtained by using P1 and N1 oligonucleotides were superior to those with H1 ones. P2 oligonucleotides were considered inadequate for CDV detection. Amplicons resulting from amplification of P1, N1 and H1 oligonucleotides were submitted to cleavage by restriction endonucleases and restriction patterns of viral samples were compared to that of Lederle strain used as reference. A similar restriction pattern was observed in all analysed samples(AU)

Detecção do vírus da cinomose canina por RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos para os genes da fosfoproteína, hemaglutinina e neuraminidase

The reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect canine distemper virus (CDV). Four oligonucleotide pairs were selected (P1, P2, N1, H1), based on the sequences of the phosphoprotein, hemagglutinin and nuraminidase genes for assay standardization, and three CDV vaccine strains were used as positive controls. Three viral isolates from dogs with canine distemper and four samples from animals clinically suspected of distemper were analysed. No amplification was detected in suspected samples. Results obtained by using P1 and N1 oligonucleotides were superior to those with H1 ones. P2 oligonucleotides were considered inadequate for CDV detection. Amplicons resulting from amplification of P1, N1 and H1 oligonucleotides were submitted to cleavage by restriction endonucleases and restriction patterns of viral samples were compared to that of Lederle strain used as reference. A similar restriction pattern was observed in all analysed samples.

Empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa para detecção do vírus da cinomose canina (CC). Para a padronização da técnica foram selecionados quatro pares de oligonucleotídeos (P1, P2, N1, H1), baseados em seqüências dos genes da fosfoproteína, neuraminidase e hemaglutinina, sendo utilizadas três cepas vacinais de vírus da CC como controles positivos. Foram analisadas três amostras isoladas de cães com cinomose e quatro amostras provenientes de cães com suspeita clínica de cinomose. Não houve amplificação nas amostras com suspeita clínica da doença. Os resultados obtidos com os oligonucleotídeos P1 e N1 foram superiores aos de H1. Os oligonucleotídeos P2 foram considerados inapropriados para a detecção do vírus da CC. Os amplicons obtidos com os oligonucleotídeos P1, N1 e H1 foram clivados com endonucleases de restrição, sendo os perfis das amostras virais comparados aos da amostra vacinal Lederle, utilizada como referência. Um padrão similar de restrição foi observado em todas as amostras analisadas.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.

Influenza Aviária: Uma Revisão dos Últimos Dez Anos

Avian influenza is an exotic disease in the Brazilian poultry. The National Avian Health Surveillance Program (PNSA) maintains permanent monitoring of AVES of all domestic species, including imported genetic material for the poultry industry, for example chickens (Gallus gallus formadomestica), turkeys (Meleagris gallopavo formadomestica), quail (Coturnix coturnix japonica), ducks (Anas), elite, grand grandparent and grandparent stocks for layers and broilers, as well as species more recently exploited for production, for example, the exotic ostriches (Struthio camelus) or native rheas (Rhea americana). The breeding stocks are monitored by regular sampling for serology, virology and bacteriology, principally looking for Newcastle disease, influenza, salmonellas and mycoplasmas, as established by the PNSA, in addition to monitoring vaccination responses to, for example, infectious bursal disease and infectious bronchitis. The PNSA establishes the rules for the control and eradication of Newcastle disease and avian influenza (Projeto de Vigilância..., 2001), including the need for differential diagnosis, according to the following major actions: I. Notification of outbreaks (and laboratory confirmation at the LARA-Campinas); II. Sanitary assistance to the outbreaks; III. Disinfection and sanitation measures; IV. Sanitary slaughter; V. Sanitary depopulation; VI. Vaccination of flocks and emergency strategies; VII. Control and monitoring of susceptible flocks; VIII. Other sanitary measures; The active surveillance and outbreak attention policies require the diagnosis and differential diagnosis of ND and AI, following the code described by OIE and the PNSA, as follows: 1- Zoning, interdiction and sampling for laboratory confirmation; 2- Registry of AVES, including species, category and numbers; applicable to a 10 km radius: restriction to transportation of animals and materials possible source of infection and propagation; disinfection of sites of entry and exit to affected properties; epidemiological surveillance; 3- Laboratory confirmation by isolating and characterizing AIV: hemagglutinating agent isolated in SPF eggs not inhibited by NDV specific serum, characterized as AIV by detecting antigens of the nucleoprotein and/or matrix and subtyped by assaying for hemagglutinin and neuraminidase subtypes (immunodiffusion, enzyme immunoassays or molecular methodology); 4- Slaughter and cremation of all avian individuals, residues, meats and eggs of all affected and neighboring properties (3 km radius), cleaning and disinfection of premises; sanitary depopulation for 21 days (minimum). 5- Allow transportation for slaughter or incubation within the vigilance area (10 km radius). 6- Prohibit fairs, markets, expositions etc., within the vigilance area (10 km radius). 7- Apply these measures for a minimum of 21 days after disinfection (which follows slaughter, cremation and cleaning) and prohibit transportation of animals and residues/products of properties within the protection area (3 km radius) and for 15 days within the vigilance area (10 km radius). The certification of HPAIV area is according to OIE and PNSA regulations and considers Brazil as a free country, applicable as follows: 1- HPAIV is not diagnosed by the active surveillance for the last 3 years; 2- 6 months after an outbreak of HPAIV is diagnosed, birds and residues/products are destroyed. The major species (chickens and turkeys) maintained in the Brazilian poultry industry employ the state-of-the-art production technology. Flocks are managed with the forefront knowledge in biosecurity, housing, permanent evaluation of critical points and quality and vaccination programs, which guarantee the prevention of most health problems. The geographic localization of the Brazilian poultry industry may also play a role in the absence of influenza outbreaks, in addition to the lower rate of replication of AIV in migratory birds during their subtropical season. Migratory routes may also concentrate in areas not occupied by poultry industry. Added to that, the biosecurity/housing and quality system of the industry may represent the step further to prevent health problems caused by transmissible infectious diseases such as influenza, considering that, for instance, all chicken and turkey industrial flocks are kept in houses, in contrast to open field farming, especially for ducks, geese and turkeys, kept on migratory routes of countries facing influenza problems.

A influenza aviária é doença exótica no Brasil. O sistema de vigilância implementado pelo Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) mantém monitoração permanente das aves das principais espécies domésticas, tanto do material genético importado para a indústria avícola, por exemplo, da espécie das galinhas (Gallus gallus formadomestica), perus (Meleagris gallopavo formadomestica), codornas (Coturnix coturnix japonica), patos (Anas), primários (elite), bisavós e avós para postura ou corte, como aves de espécies de exploração mais recente, exóticas, por exemplo avestruzes (Struthio camelus) ou nativas, por exemplo emas (Rhea americana). Os plantéis de reprodutores em produção são também acompanhados por amostragens periódicas, conforme previsto no PNSA, além da monitoração das respostas aos programas de vacinação, por exemplo, contra bronquite infecciosa e doença infecciosa bursal. O PNSA estabelece as normas de atuação para o controle e erradicação da doença de Newcastle (ND) e Influenza Aviária (AI) (Projeto de Vigilância, 2001), a saber: I - Notificação de focos da doença (e confirmação laboratorial no LARA-Campinas); II - Assistência a focos; III - Medidas de desinfecção; IV - Sacrifício sanitário; V - Vazio sanitário; VI - Vacinação dos plantéis ou esquemas emergenciais; VII - Controle e fiscalização dos animais susceptíveis; VIII - Outras medidas sanitárias; A vigilância e atenção ao foco exige o diagnóstico laboratorial e diferencial de AI e ND, que segue as normas do PNSA, conforme o sumário abaixo: 1- Interdição e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; 2- Registro das aves: espécie(s), categoria(s), número(s), manutenção de aves; utensílios e produtos no local; proibição de trânsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; controle de todos os animais e materiais possíveis fontes de propagação; desinfecção de vias de entradas e saídas à(s) propriedade(s); inquérito epidemiológico. 3- Confirmação laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, não inibido (inibição da hemaglutinação) ou não neutralizado (soroneutralização) por soro específico para o vírus da doença de Newcastle; caracterização do agente como vírus da influenza aviária (AIV) por detecção de antígenos da nucleoproteína e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios específicos para a caracterização da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifusão, imunoenzimáticos ou moleculares). 4- Abate e destruição imediata (cremação) de todas as aves, resíduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); limpeza e desinfecção das instalações; vazio sanitário (mínimo 21 dias); 5- Permitir o transporte para o abate ou incubação dentro da zona de vigilância (raio de 10 km). 6- Proibir feiras, exposições, mercados na zona de vigilância (10 km). 7- Aplicar estas medidas por mínimo de 21 dias após a destruição das fontes de propagação e desinfecção das instalações, proibir a retirada de aves e produtos na zona de proteção (3 km) por 21 dias e 15 dias na zona de vigilância (10 km). A certificação de área livre segue as normas da OIE e PNSA, considerando AI exótica no Brasil (país livre), e exige: 1- AI de alta patogenicidade não diagnosticada pelo sistema de vigilância pelos últimos 3 anos; 2- Um período de 6 meses após o abate, destruição das aves e resíduos e desinfecção após surto; O sistema de criação da avicultura predominante no Brasil (galinhas e perus) emprega a mais atual tecnologia e conhecimento científico na produção, no qual os plantéis são gerenciados com biossegurança, avaliação permanente dos pontos críticos, sistema de qualidade total e programas de vacinações que garantem a prevenção de inúmeros problemas sanitários. A prevenção de influenza aviária é especialmente favorecida por essas características. O sistema e tipo de construção (galpões) para o alojamento dos plantéis dessas espécies dificultam também o desafio eventualmente imposto pelas aves de vida livre. A localização geográfica da avicultura nacional, localizada fora das rotas migratórias das aves-reservatório, pode também exercer papel importante na ausência de focos de influenza no Brasil. Além disso, o baixo índice de replicação dos AIV nas aves migratórias durante a estada na região subtropical também influi para a menor ocorrência. As espécies de aves domésticas de importância comercial mais sensíveis à infecção e potencialmente envolvidas no papel de fonte de infecção, conforme citadas na literatura internacional, perus e patos, são mantidas em galpões industriais com sistema de biossegurança e de distribuição geográfica bastante restrita, em contraste com as criações dos países com relatos permanentes de surtos, em que se associam as condições de desafio naturais geográficas ditadas pelas rotas migratórias, mais alta replicação na ave na estação (países temperados) e a criação em campo aberto.

Influenza Aviária: Uma Revisão dos Últimos Dez Anos

Avian influenza is an exotic disease in the Brazilian poultry. The National Avian Health Surveillance Program (PNSA) maintains permanent monitoring of AVES of all domestic species, including imported genetic material for the poultry industry, for example chickens (Gallus gallus formadomestica), turkeys (Meleagris gallopavo formadomestica), quail (Coturnix coturnix japonica), ducks (Anas), elite, grand grandparent and grandparent stocks for layers and broilers, as well as species more recently exploited for production, for example, the exotic ostriches (Struthio camelus) or native rheas (Rhea americana). The breeding stocks are monitored by regular sampling for serology, virology and bacteriology, principally looking for Newcastle disease, influenza, salmonellas and mycoplasmas, as established by the PNSA, in addition to monitoring vaccination responses to, for example, infectious bursal disease and infectious bronchitis. The PNSA establishes the rules for the control and eradication of Newcastle disease and avian influenza (Projeto de Vigilância..., 2001), including the need for differential diagnosis, according to the following major actions: I. Notification of outbreaks (and laboratory confirmation at the LARA-Campinas); II. Sanitary assistance to the outbreaks; III. Disinfection and sanitation measures; IV. Sanitary slaughter; V. Sanitary depopulation; VI. Vaccination of flocks and emergency strategies; VII. Control and monitoring of susceptible flocks; VIII. Other sanitary measures; The active surveillance and outbreak attention policies require the diagnosis and differential diagnosis of ND and AI, following the code described by OIE and the PNSA, as follows: 1- Zoning, interdiction and sampling for laboratory confirmation; 2- Registry of AVES, including species, category and numbers; applicable to a 10 km radius: restriction to transportation of animals and materials possible source of infection and propagation; disinfection of sites of entry and exit to affected properties; epidemiological surveillance; 3- Laboratory confirmation by isolating and characterizing AIV: hemagglutinating agent isolated in SPF eggs not inhibited by NDV specific serum, characterized as AIV by detecting antigens of the nucleoprotein and/or matrix and subtyped by assaying for hemagglutinin and neuraminidase subtypes (immunodiffusion, enzyme immunoassays or molecular methodology); 4- Slaughter and cremation of all avian individuals, residues, meats and eggs of all affected and neighboring properties (3 km radius), cleaning and disinfection of premises; sanitary depopulation for 21 days (minimum). 5- Allow transportation for slaughter or incubation within the vigilance area (10 km radius). 6- Prohibit fairs, markets, expositions etc., within the vigilance area (10 km radius). 7- Apply these measures for a minimum of 21 days after disinfection (which follows slaughter, cremation and cleaning) and prohibit transportation of animals and residues/products of properties within the protection area (3 km radius) and for 15 days within the vigilance area (10 km radius). The certification of HPAIV area is according to OIE and PNSA regulations and considers Brazil as a free country, applicable as follows: 1- HPAIV is not diagnosed by the active surveillance for the last 3 years; 2- 6 months after an outbreak of HPAIV is diagnosed, birds and residues/products are destroyed. The major species (chickens and turkeys) maintained in the Brazilian poultry industry employ the state-of-the-art production technology. Flocks are managed with the forefront knowledge in biosecurity, housing, permanent evaluation of critical points and quality and vaccination programs, which guarantee the prevention of most health problems. The geographic localization of the Brazilian poultry industry may also play a role in the absence of influenza outbreaks, in addition to the lower rate of replication of AIV in migratory birds during their subtropical season. Migratory routes may also concentrate in areas not occupied by poultry industry. Added to that, the biosecurity/housing and quality system of the industry may represent the step further to prevent health problems caused by transmissible infectious diseases such as influenza, considering that, for instance, all chicken and turkey industrial flocks are kept in houses, in contrast to open field farming, especially for ducks, geese and turkeys, kept on migratory routes of countries facing influenza problems.

A influenza aviária é doença exótica no Brasil. O sistema de vigilância implementado pelo Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) mantém monitoração permanente das aves das principais espécies domésticas, tanto do material genético importado para a indústria avícola, por exemplo, da espécie das galinhas (Gallus gallus formadomestica), perus (Meleagris gallopavo formadomestica), codornas (Coturnix coturnix japonica), patos (Anas), primários (elite), bisavós e avós para postura ou corte, como aves de espécies de exploração mais recente, exóticas, por exemplo avestruzes (Struthio camelus) ou nativas, por exemplo emas (Rhea americana). Os plantéis de reprodutores em produção são também acompanhados por amostragens periódicas, conforme previsto no PNSA, além da monitoração das respostas aos programas de vacinação, por exemplo, contra bronquite infecciosa e doença infecciosa bursal. O PNSA estabelece as normas de atuação para o controle e erradicação da doença de Newcastle (ND) e Influenza Aviária (AI) (Projeto de Vigilância, 2001), a saber: I - Notificação de focos da doença (e confirmação laboratorial no LARA-Campinas); II - Assistência a focos; III - Medidas de desinfecção; IV - Sacrifício sanitário; V - Vazio sanitário; VI - Vacinação dos plantéis ou esquemas emergenciais; VII - Controle e fiscalização dos animais susceptíveis; VIII - Outras medidas sanitárias; A vigilância e atenção ao foco exige o diagnóstico laboratorial e diferencial de AI e ND, que segue as normas do PNSA, conforme o sumário abaixo: 1- Interdição e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; 2- Registro das aves: espécie(s), categoria(s), número(s), manutenção de aves; utensílios e produtos no local; proibição de trânsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; controle de todos os animais e materiais possíveis fontes de propagação; desinfecção de vias de entradas e saídas à(s) propriedade(s); inquérito epidemiológico. 3- Confirmação laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, não inibido (inibição da hemaglutinação) ou não neutralizado (soroneutralização) por soro específico para o vírus da doença de Newcastle; caracterização do agente como vírus da influenza aviária (AIV) por detecção de antígenos da nucleoproteína e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios específicos para a caracterização da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifusão, imunoenzimáticos ou moleculares). 4- Abate e destruição imediata (cremação) de todas as aves, resíduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); limpeza e desinfecção das instalações; vazio sanitário (mínimo 21 dias); 5- Permitir o transporte para o abate ou incubação dentro da zona de vigilância (raio de 10 km). 6- Proibir feiras, exposições, mercados na zona de vigilância (10 km). 7- Aplicar estas medidas por mínimo de 21 dias após a destruição das fontes de propagação e desinfecção das instalações, proibir a retirada de aves e produtos na zona de proteção (3 km) por 21 dias e 15 dias na zona de vigilância (10 km). A certificação de área livre segue as normas da OIE e PNSA, considerando AI exótica no Brasil (país livre), e exige: 1- AI de alta patogenicidade não diagnosticada pelo sistema de vigilância pelos últimos 3 anos; 2- Um período de 6 meses após o abate, destruição das aves e resíduos e desinfecção após surto; O sistema de criação da avicultura predominante no Brasil (galinhas e perus) emprega a mais atual tecnologia e conhecimento científico na produção, no qual os plantéis são gerenciados com biossegurança, avaliação permanente dos pontos críticos, sistema de qualidade total e programas de vacinações que garantem a prevenção de inúmeros problemas sanitários. A prevenção de influenza aviária é especialmente favorecida por essas características. O sistema e tipo de construção (galpões) para o alojamento dos plantéis dessas espécies dificultam também o desafio eventualmente imposto pelas aves de vida livre. A localização geográfica da avicultura nacional, localizada fora das rotas migratórias das aves-reservatório, pode também exercer papel importante na ausência de focos de influenza no Brasil. Além disso, o baixo índice de replicação dos AIV nas aves migratórias durante a estada na região subtropical também influi para a menor ocorrência. As espécies de aves domésticas de importância comercial mais sensíveis à infecção e potencialmente envolvidas no papel de fonte de infecção, conforme citadas na literatura internacional, perus e patos, são mantidas em galpões industriais com sistema de biossegurança e de distribuição geográfica bastante restrita, em contraste com as criações dos países com relatos permanentes de surtos, em que se associam as condições de desafio naturais geográficas ditadas pelas rotas migratórias, mais alta replicação na ave na estação (países temperados) e a criação em campo aberto.