Desenvolvimento e validação de kit multiplex para identificação genética e teste de parentesco por análise de microssatélites em equinos

O desenvolvimento da indústria equina tem aumentado a demanda por testes de verificação de parentesco para fins de registro na raça, os quais são realizados pela análise de regiões microssatélites de repetições curtas (STR). O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento exige, atualmente, a análise de 12 marcadores para o painel principal (sendo 9 obrigatórios e 3 a escolher entre outros 8) e 12 marcadores para um painel adicional (a escolher entre possíveis 15). No Brasil há apenas um kit comercial disponível para um painel principal, o qual possui elevado custo, e nenhum kit comercial disponível para o painel adicional. Desta forma, muitos laboratórios são levados a desenvolver seus próprios testes, os quais são realizados utilizando-se várias reações de PCR. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um sistema de reações múltiplas (multiplex) para cada um dos painéis com custo baixo e alta eficiência. Foi realizada análise in silico dos primers recomendados pela International Society for Animal Genetics (ISAG), organização responsável pela padronização desses testes, para 17 marcadores do painel principal (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX3 e VHL20) e para 15 marcadores do painel adicional (TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 e TKY394), os quais foram testados, quanto a sua eficiência, em formato monoplex e depois em formato multiplex. Foram redesenhados primers para 11 marcadores STR visando a melhor eficiência do sistema multiplex para cada painel. As concentrações de cada primer foram ajustadas para obtenção de uma amplificação equilibrada para todos os loci. As amostras foram sequenciadas no equipamento ABI 3130XL® (Applied Biosystems) e posteriormente analisadas no software Genemapper® v 5.0 (Applied Biosystems). Foi desenvolvido parcialmente um sistema multiplex com 14 marcadores para o painel principal de genotipagem de equinos (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, LEX3 e VHL20), uma vez que o marcador obrigatório HTG10 obteve resultado satisfatório apenas no formato monoplex, precisando ser testado em uma reação de PCR a parte. Os resultados das 50 amostras analisadas pelo sistema desenvolvido neste estudo, para o painel principal, foram consistentes quando comparados aos do kit comercial Equine Genotypes® (Thermo Fisher Scientific). Para o painel adicional (série TKY) foi possível o desenvolvimento composto de dois sistemas multiplex, um contemplando 8 marcadores (TKY 279, TKY297, TKY301, TKY312, TKY325, TKY337, TKY374 and TKY394) e outro contemplando 5 marcadores (TKY287, TKY321, TKY333, TKY343 and TKY344). Ambos os sistemas reproduziram os resultados das amostras referências provenientes da ISAG e testadas neste estudo. Pode ser concluído que ambos os painéis apresentaram bons resultados para análises, sendo possível desenvolver dois sistemas multiplex, atendendo o objetivo de desenvolver um método de baixo custo a alta eficiência, embora em duas etapas. Mais estudos deverão ser desenvolvidos com a finalidade de reunir em um único sistema multiplex todos os marcadores necessários.

The development of the modern horse industry has increased the demand for equine parentage tests for pedigree verification, which are based in short tandem repeats (STR) analysis. These tests use 12 STR markers (of which 9 are compulsory and 3 chosen from another 8) for a main panel and other 12 STR (chosen from possible 15) for an additional panel and are regulated by the Ministry of Agriculture, Cattle and Supply (MAPA). There is only one imported commercial kit available in Brazil for the main panel, which it is costly and there are not any commercial kits available for the secondary panel. Thus, many laboratories must customize their own tests, which are performed by several PCR reactions. This work aimed to develop a novel multiplex STR typing system for each panel with low cost and high efficiency. Seventeen primers recommended by ISAG for the main panel (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX3 and VHL20) and fifteen recommended for the additional panel (TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 and TKY394) were submitted to in silico analysis. Then primers were validated individually and then jointly to test the efficiency of the multiplex system. Eleven primers were redesigned to establish a novel multiplex PCR system for each panel. Primer concentrations were adjusted in order to achieve a well-balanced set of amplicons for all markers. Samples were loaded into ABI 3130XL® Analyzer (Applied Biosystems) and then analyzed in Genemapper® v5.0 software (Applied Biosystems). A single multiplex STR genotyping system was partially developed for the main equine panel containing 14 loci (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, LEX3 and VHL20) because HTG10 which is compulsory - only amplified well in a separately PCR reaction. Results from 50 tested samples were concordant between Equine Genotypes® kit (Thermo Fisher Scientific) and the system developed in this study for the main panel. Two multiplex PCR systems were developed for the additional panel, one containing 8 markers (TKY279, TKY297, TKY301, TKY312, TKY325, TKY337, TKY374 and TKY394) and other containing 5 markers (TKY287, TKY321, TKY333, TKY343 and TKY344). The developed multiplex systems were able to detect all alleles from ISAG reference samples tested in this work. Results indicate that multiplex systems worked well and are cost-effective while performed in 2 PCR reactions for each panel. Further studies are needed to include all markers in a single multiplex PCR reaction.

Parentage tests in service of a new mentality regarding the animal production / Testes de paternidade a serviço de uma nova mentalidade quanto à criação animal

The evolution of the animal improvement and reproduction techniques has been demanding larger cares in regard to the progenitors" certification of an animal. In this sense, the DNA analysis allows paternity/maternity tests accomplishment that, with a high degree of inclusion/exclusion probability, they guarantee the parentage of an individual. The microsatellite technique is the most recommended for this purpose, as it has a high degree of polymorphism and easiness to its interpretation.

A evolução das técnicas de melhoramento e reprodução animal tem exigido maiores cuidados no que se refere à certificação dos progenitores de um animai. Neste sentido, a análise de DNA permite a realização de testes de paternidade/maternidade que, com alto grau de probabilidade de inclusão/exclusão, garantem a filiação de um individuo. A técnica de microssatélites é a mais reco-mendada para este fim, por ter alto grau de polimorfismo e facilidade de interpre-tação.

Teste de DNA para verificação de parentesco em cães: avaliação do método não automatizado com o auxílio do primer CMR S

To evaluate the precision of the DNA tests using the non-automatized technique for individual identification and parentage tests, 105 Rottweiler dogs were studied using the primer CMR S. The sample was composed of 39 animals belonging to 11 complete families and their progenies, and 66 non related individuals until the second generation, derived from kennels located in the states of Minas Gerais and São Paulo. The CMR S primer was used for the Polimerase Chain Reaction (PCR). The results showed the inefficiency of the technique, even when analyzed through the automated gel analysis system. Also showed the impossibility of its commercial use due to the fact of does not permit the storage of data for subsequent use.

Parentage tests in service of a new mentality regarding the animal production / Testes de paternidade a serviço de uma nova mentalidade quanto à criação animal

The evolution of the animal improvement and reproduction techniques has been demanding larger cares in regard to the progenitors" certification of an animal. In this sense, the DNA analysis allows paternity/maternity tests accomplishment that, with a high degree of inclusion/exclusion probability, they guarantee the parentage of an individual. The microsatellite technique is the most recommended for this purpose, as it has a high degree of polymorphism and easiness to its interpretation.

A evolução das técnicas de melhoramento e reprodução animal tem exigido maiores cuidados no que se refere à certificação dos progenitores de um animai. Neste sentido, a análise de DNA permite a realização de testes de paternidade/maternidade que, com alto grau de probabilidade de inclusão/exclusão, garantem a filiação de um individuo. A técnica de microssatélites é a mais reco-mendada para este fim, por ter alto grau de polimorfismo e facilidade de interpre-tação.

BIOCHEMICAL POLYMORPHISMS IN SHEEP AND THEIR POTENTIAL USE FOR PATERNITY TESTS

The genetic variability of 22 protein loci was investigated in two sheep flocks: 22 females Romney Marsh and 124 animals derived from crossbreeding between Romney Marsh and Merino Booroola, reared by the Brazilian Agricultural Research Corporation (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária -EMBRAPA, Bagé, RS, Brazil). Eight loci were polymorphic; the others showed no variation. The usefulness of the eight plymorphic systems (Cat, DIA I, EP-1, EsA, HbB, ME, Tf, and X Prot.) in parentage tests was analyzed. The probability to find two random identical animals in each breed was estimated as 1:1000. The efficiency of these proteins for exclusion of one of two possible sires in parentage tests was about 77% both for Romney Marsh and Romney/ Booroola flocks. Although parentage tests in sheep have not been enforced in Brazil up to now, the establishment of this technique is important for the prevention of non-paternity on the excellent rams.

Investigou-se a variabilidade genética em 22 locos proteicos em uma amostra de 22 fêmeas Romney-Marsh e em 142 animais resultantes do cruzamento entre Romney-Marsh e Merino Booroola, criados pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMPRAPA, Bagé, RS, Brasil). Oito destes sistemas mostraram-se polimórficos, os demais não apresentando variação. Avaliou-se a eficiência destes oito sistemas proteicos polimórficos (Cat, DIA I, EP-1. EsA, HbB, ME, Tf e Prot. X ), no controle de filiação. A probabilidade de identidade entre dois animais retirados ao acaso da população foi estimada em 1:1000 em cada rebanho. A eficiência destes marcadores genéticos em excluir um entre dois possíveis pais foi de cerca de 77% tanto para os animais Romney Marsh como para os Romney/ Booroola. Testes de controle de paternidade, em ovinos, não têm sido realizados, até agora, no Brasil, mas o estabelecimento desta técnica seria importante para assegurar a paternidade da descendência de reprodutores zootecnicamente superiores.

Biochemical polymorphisms in sheep and their potential use for paternity tests

The genetic variability of 22 protein loci was investigated in two sheep flocks: 22 females Romney Marsh and 124 animals derived from crossbreeding between Romney Marsh and Merino Booroola, reared by the Brazilian Agricultural Research Corporation (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária -EMBRAPA, Bagé, RS, Brazil). Eight loci were polymorphic; the others showed no variation. The usefulness of the eight plymorphic systems (Cat, DIA I, EP-1, EsA, HbB, ME, Tf, and X Prot.) in parentage tests was analyzed. The probability to find two random identical animals in each breed was estimated as 1:1000. The efficiency of these proteins for exclusion of one of two possible sires in parentage tests was about 77% both for Romney Marsh and Romney/ Booroola flocks. Although parentage tests in sheep have not been enforced in Brazil up to now, the establishment of this technique is important for the prevention of non-paternity on the excellent rams.

Investigou-se a variabilidade genética em 22 locos proteicos em uma amostra de 22 fêmeas Romney-Marsh e em 142 animais resultantes do cruzamento entre Romney-Marsh e Merino Booroola, criados pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMPRAPA, Bagé, RS, Brasil). Oito destes sistemas mostraram-se polimórficos, os demais não apresentando variação. Avaliou-se a eficiência destes oito sistemas proteicos polimórficos (Cat, DIA I, EP-1. EsA, HbB, ME, Tf e Prot. X ), no controle de filiação. A probabilidade de identidade entre dois animais retirados ao acaso da população foi estimada em 1:1000 em cada rebanho. A eficiência destes marcadores genéticos em excluir um entre dois possíveis pais foi de cerca de 77% tanto para os animais Romney Marsh como para os Romney/ Booroola. Testes de controle de paternidade, em ovinos, não têm sido realizados, até agora, no Brasil, mas o estabelecimento desta técnica seria importante para assegurar a paternidade da descendência de reprodutores zootecnicamente superiores.

Microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 e RM88 em testes de verificação de parentesco para bovinos da raça Gir / Microsatellites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 and RM88 for parentage tests in bovines of Gir breed

Foram utilizados 46 animais da raça Gir, registrados na Associação Brasileira de Criadores de Zebu, provenientes de cinco fazendas situadas no Estado de Minas Gerais, com o objetivo de avaliar a eficiência dos microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 e RM88 em testes de verificação de parentesco. Os locos BM2113, ILSTS005, ETH131 e RM88 mostraram-se eficientes, apresentando valores de PE2 (probabilidade de exclusão quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,62 e 0,69 e PIC2 (conteúdo de informação polimórfica quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,78 e 0,83. O mesmo não ocorreu para o loco ILSTS008, o qual apresentou baixos valores de PE2 (0,24) e PIC2 (0,41).(AU)

Forty six animals of the Gir breed, registered at the Brazilian Association of Zebu Breeders, coming from five farms located in Minas Gerais State, were used to analyze the efficiency of the microsatellites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 and RM88 in parentage tests. The loci BM2113, ILSTS005, ETH131 and RM88 showed to be efficient, presenting values of PE2 (exclusion probability when both parents are genotiped) between 0.62 and 0.69 and PIC2 (polymorphic information contents when both parents are genotiped) between 0.78 and 0.83. The same was not observed for the locus ILSTS008 that showed low values of PE2 (0.24) and PIC2 (0.41).(AU)