Efficacy of fine needle aspiration in the diagnosis of spontaneous mammary tumors / Eficácia da citologia aspirativa no diagnóstico de tumores mamários espôntaneos / La eficacia de la aspiración con aguja fina en el diagnóstico de tumores mamarios espontáneos

The cytopathology exam has been utilized to diagnose mammary disorders in female dogs. The success of cytopathology results depends on, among other factors, the diagnostic accuracy of the exam. The present study aimed to compare the cytopathological and histopathological findings from mammary disorder cases in female dogs and evaluate the lesion cytopathology exam accuracy. The concordance degree was evaluated between the cytopathology and histopathology exams of 67 female dogs, carriers of palpable breast lumps, cared for at the university hospital from which the following indicators were calculated: sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, false positives, false negatives, and exam accuracy. The sensitivity was 95.23%, the specificity 75%, positive predictive value 98.36%, negative predictive value 60%, and accuracy 94.02%. There were 2 false negatives and 1 false positive. In conclusion the cytopathology exam can be amply utilized as a means of diagnosis with high accuracy and sensitivity in the first examination of female dogs with mammary tumors.(AU)

O exame citológico tem sido utilizado no diagnóstico das afecções mamárias das cadelas. O êxito no resultado da citologia dependerá, além de outros fatores, da acurácia diagnóstica deste exame. O objetivo deste estudo foi comparar os achados citológicos e histológicos das afecções mamárias de cadelas e avaliar a acurácia do exame citológico nestas lesões. Avaliou-se o grau de concordância entre os exames citológico e histológico de 67 cadelas, portadoras de nódulo mamário palpável, atendidas em um hospital universitário e foram calculados os indicadores: sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, falso positivo, falso negativo e acurácia do exame. A sensibilidade foi de 95,23%, a especificidade de 75%, o valor preditivo positivo de 98,36%, o valor preditivo negativo de 60% e a acurácia de 94,02%. Ocorreu 1 resultado falso positivo e 2 falso negativos. Conclui-se que o exame citológico pode ser amplamente utilizado como meio de diagnóstico com elevada acurácia e sensibilidade no atendimento primário das cadelas com tumor de mama.(AU)

El examen citológico se ha usado en el diagnóstico de cáncer de mama en perras. El éxito de la citología depende, entre otros factores, la precisión diagnóstica de este examen. El objetivo de este estudio fue comparar los resultados de citología y examen histológico de las enfermedades de mama en las perras y evaluar la exactitud de la citología de estas lesiones. Se evaluó el grado de acuerdo entre los exámenes citológicos e histológicos de 67 perros, que sufren de bulto palpable en la mama atendidos en un hospital universitario y se calcularon los indicadores: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, falsos positivos, falsos negativo y exactitud de la prueba. La sensibilidad fue del 95,23%, especificidad 75%, valor predictivo positivo del 98,36%, valor predictivo negativo del 60% y el 94,02% de precisión. Hubo un resultado positivo falso y dos falsos negativos. Se concluye que el examen citológico puede ser ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico de alta precisión y sensibilidad en la atención primaria de perros con cáncer de mama. (AU)

Immunohistochemical analysis of ORF2 protein and ORF3 protein of hepatitis E virus in livers of swine in Mato Grosso state, Brazil / Análise imuno-histoquímica da proteína ORF2 e proteína ORF3 do vírus da hepatite E em fígados de suínos no estado de Mato Grosso, Brasil

Hepatitis E is an emerging zoonotic disease caused by hepatitis E virus (HEV). Immunohistochemistry (IHC) can be used to verify viral presence in human and swine livers. The aim of this study was to comparatively analyze the immunolabeling of the ORF2 protein (pORF2) versus the ORF3 protein (pORF3) of HEV in swine livers from subsistence farms in the state of Mato Grosso, Brazil. This study included 25 liver samples formalin fixed paraffin embedded tissue block from a published molecular detection and immunohistochemistry (IHC) study, which used the HEV pORF3 protein, demonstrating 4% (1/25) of positive immunolabeling and 96% (24/25) negative, in contrast to the molecular exam that showed 24% (6/25) of liver samples positive and 76% (19/25) negative. In order to increase the sensitivity of the IHC technique, these samples were analyzed using the antibody for the detection of HEV pORF2, showing 24% (6/25) immunolabeling positive and 76% (19/25) negative, equivalent to the result of molecular analysis on corresponding samples. Thus, the use of antibody to pORF2 increased the number of HEV cases detectable in the IHC by 600%. The IHC added to molecular techniques can be used as a tool for monitoring viral presence in swine livers, constituting a sensitive diagnostic methodology when liver samples fixed in formalin and embedded in paraffin are available.

A hepatite E é uma enfermidade emergente de caráter zoonótico causada pelo Vírus da Hepatite E (HEV). A imuno-histoquímica (IHQ) pode ser utilizada para verificar a presença viral em fígados de humanos e suínos. O objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a imunomarcação da proteína ORF2 (pORF2) versus proteína ORF3 (pORF3) de HEV em fígados de suínos de criatórios de subsistência no estado de Mato Grosso, Brasil. Este trabalho incluiu 25 amostras de fígados de suínos fixados em formol e embebidos em parafina provenientes de um estudo publicado de detecção molecular e imuno-histoquímica (IHQ), que utilizou pORF3 de HEV, demonstrando 4% (1/25) de imunomarcação positiva e 96% (24/25) negativa, em contraste com o exame molecular que apresentou 24% (6/25) das amostras de fígado positivas e 76% (19/25) negativas. Com o objetivo de aumentar a sensibilidade da técnica de IHQ, essas amostras foram analisadas utilizando o anticorpo para detecção da pORF2 de HEV, apresentando 24% (6/25) de imunomarcação positiva e 76% (19/25) negativa, equivalente ao resultado da análise molecular em amostras correspondentes. Desta forma, o uso do anticorpo para pORF2 ampliou o número de casos de HEV detectáveis na IHQ em 600%. A IHQ somada a técnica molecular pode ser utilizada como ferramenta de monitoramento da presença viral em fígados de suínos, constituindo uma metodologia diagnóstica sensível quando há disponibilidade de amostras de fígado fixadas em formol e embebidas em parafina.

FAMACHA©: Predictive value for control of Haemonchus sp. in sheep from Brazilian Cerrado / FAMACHA©: Valor preditivo para o controle de Haemonchus sp. em ovinos do Cerrado brasileiro

This study aimed to evaluate the sensitivity and specificity of FAMACHA© method, correlating with packed cell volume (PCV) and egg count (FEC), as well as to evaluate the clinical signs of Haemonchus sp. infection in sheep from Brazilian Cerrado. Over two years (2017 to 2019), 1,435 sheep were subjected to clinical and parasitological evaluations. Sheep from six breeds (Santa Inês, Dorper, White Dorper, Ile de France, Suffolk and crossbreed) were subdivided into five production categories (pregnant, lactating, nonpregnant/lactating ewes, breeding males, and weaned lambs). Parasitological evaluations included FEC and coproculture. In the clinical evaluation, all sheep underwent determination of the FAMACHA© score and PCV. Haemonchus sp. larvae were predominant in coprocultures of the flocks (76.4%) and in each animal production category evaluated (69.4 to 84.3%). FAMACHA© method showed high sensitivity (70.6%) for evaluating sheep with scores ≥ 3, and PCV < 23%, and high specificity (97.5%) in animals with higher scores(4 and 5), and PCV < 18%. A negative correlation was observed between FAMACHA© scores and PCV (-0.46)and between PCV and FEC (-0.47), while a positive correlation was observed between FAMACHA© scores and FEC (0.22) (p < 0.01). The vast majority of the animals evaluated (54.5%) were clinically resistant to gastrointestinal parasites. Due to the high sensitivity and specificity, we concluded that the method could be a valuable diagnostic alternative and an ancillary tool in the implementation of selective treatment for helminthic infection in sheep from Brazilian Cerrado.

Este estudo objetivou avaliar a sensibilidade e especificidade do método FAMACHA©, e sua correlação com volume globular (VG) e contagem de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPG), no diagnóstico de infecção parasitária por Haemonchus sp., além de avaliar os sinais clínicos frente às infecções por tais endoparasitos, em ovinos do Cerrado brasileiro. Ao longo de dois anos (2017 a 2019), o total de 1.435 ovinos foram submetidos a avaliação clínica e parasitológica. Os ovinos de seis raças (Santa Inês, Dorper, White Dorper, Ile de France, Suffolk e mestiços) foram subdivididos em cinco categorias de produção (ovelhas gestantes, lactantes, não gestantes/lactantes, machos reprodutores e cordeiros desmamados). As avaliações parasitológicas incluíram OPG e coprocultura. Na avaliação clínica, os ovinos passaram por determinação do escore FAMACHA© e do VG. As larvas de Haemonchus sp. foram predominantes nas coproculturas dos rebanhos (76,4%) e em cada categoria de produção animal avaliada (69,4 a 84,3%). O método FAMACHA© apresentou alta sensibilidade (70,6%) para avaliar animais com escores ≥ 3 e VG <23% e alta especificidade (97,5%) em animais com escores mais elevados (4 e 5), e VG < 18%. Observou-se correlação negativa entre os escores FAMACHA© e VG (-0,46) e entre VG e OPG (-0,47), enquanto uma correlação positiva foi observada entre os escores FAMACHA© e OPG (0,22) (p < 0.01). A grande maioria dos animais avaliados (54,5%) mostrou-se clinicamente resistente às parasitoses gastrointestinais. Devido à alta sensibilidade e especificidade, concluímos que o método pode ser uma alternativa diagnóstica valiosa e ferramenta auxiliar na implementação do tratamento seletivo para infecção por helmintos em ovinos do Cerrado brasileiro.

FAMACHA©: Predictive value for control of Haemonchus sp. in sheep from Brazilian Cerrado / FAMACHA©: Valor preditivo para o controle de Haemonchus sp. em ovinos do Cerrado brasileiro

This study aimed to evaluate the sensitivity and specificity of FAMACHA© method, correlating with packed cell volume (PCV) and egg count (FEC), as well as to evaluate the clinical signs of Haemonchus sp. infection in sheep from Brazilian Cerrado. Over two years (2017 to 2019), 1,435 sheep were subjected to clinical and parasitological evaluations. Sheep from six breeds (Santa Inês, Dorper, White Dorper, Ile de France, Suffolk and crossbreed) were subdivided into five production categories (pregnant, lactating, nonpregnant/lactating ewes, breeding males, and weaned lambs). Parasitological evaluations included FEC and coproculture. In the clinical evaluation, all sheep underwent determination of the FAMACHA© score and PCV. Haemonchus sp. larvae were predominant in coprocultures of the flocks (76.4%) and in each animal production category evaluated (69.4 to 84.3%). FAMACHA© method showed high sensitivity (70.6%) for evaluating sheep with scores ≥ 3, and PCV < 23%, and high specificity (97.5%) in animals with higher scores(4 and 5), and PCV < 18%. A negative correlation was observed between FAMACHA© scores and PCV (-0.46)and between PCV and FEC (-0.47), while a positive correlation was observed between FAMACHA© scores and FEC (0.22) (p < 0.01). The vast majority of the animals evaluated (54.5%) were clinically resistant to gastrointestinal parasites. Due to the high sensitivity and specificity, we concluded that the method could be a valuable diagnostic alternative and an ancillary tool in the implementation of selective treatment for helminthic infection in sheep from Brazilian Cerrado.(AU)

Este estudo objetivou avaliar a sensibilidade e especificidade do método FAMACHA©, e sua correlação com volume globular (VG) e contagem de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPG), no diagnóstico de infecção parasitária por Haemonchus sp., além de avaliar os sinais clínicos frente às infecções por tais endoparasitos, em ovinos do Cerrado brasileiro. Ao longo de dois anos (2017 a 2019), o total de 1.435 ovinos foram submetidos a avaliação clínica e parasitológica. Os ovinos de seis raças (Santa Inês, Dorper, White Dorper, Ile de France, Suffolk e mestiços) foram subdivididos em cinco categorias de produção (ovelhas gestantes, lactantes, não gestantes/lactantes, machos reprodutores e cordeiros desmamados). As avaliações parasitológicas incluíram OPG e coprocultura. Na avaliação clínica, os ovinos passaram por determinação do escore FAMACHA© e do VG. As larvas de Haemonchus sp. foram predominantes nas coproculturas dos rebanhos (76,4%) e em cada categoria de produção animal avaliada (69,4 a 84,3%). O método FAMACHA© apresentou alta sensibilidade (70,6%) para avaliar animais com escores ≥ 3 e VG <23% e alta especificidade (97,5%) em animais com escores mais elevados (4 e 5), e VG < 18%. Observou-se correlação negativa entre os escores FAMACHA© e VG (-0,46) e entre VG e OPG (-0,47), enquanto uma correlação positiva foi observada entre os escores FAMACHA© e OPG (0,22) (p < 0.01). A grande maioria dos animais avaliados (54,5%) mostrou-se clinicamente resistente às parasitoses gastrointestinais. Devido à alta sensibilidade e especificidade, concluímos que o método pode ser uma alternativa diagnóstica valiosa e ferramenta auxiliar na implementação do tratamento seletivo para infecção por helmintos em ovinos do Cerrado brasileiro.(AU)

A real-time quantitative PCR based on molecular beacon for detecting Brucella infection / PCR quantitativo em tempo real, baseado em guia molecular para detecção de infeção por Brucella

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

A real-time quantitative PCR based on molecular beacon for detecting Brucella infection / PCR quantitativo em tempo real, baseado em guia molecular para detecção de infeção por Brucella

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

Indirect ELISA (iELISA) standardization for the diagnosis of bovine enzootic leukosis / Padronização de um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da leucose enzoótica bovina

Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease caused by bovine leukemia virus (BLV) that affects cattle worldwide. Agar gel immunodiffusion (AGID) was the reference test for EBL diagnosis for many years, but enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed higher sensitivity, was faster to perform, and resulted in an objective reading. However, the importation of ELISA kits is lengthy and expensive, and currently, no AGID kits are available in Brazil. The aim of this work was to standardize an indirect ELISA (iELISA) for EBL diagnosis using BLV antigens produced in Tadarida brasiliensis lung (Tb1Lu) cells, which are Bovine viral diarrhea virus (BVDV) free, unlike fetal lamb kidney (FLK) cells, currently used for this purpose. Following standardization, iELISA results were compared with those obtained by AGID and the commercial Chekit Leucose-Serum ELISA. Compared to AGID, iELISA had 94,44% sensitivity, 75.68% specificity, 79.10% positive predictive value (PPV) and 93.30% negative predictive value (NPV), with 84% concordance and a Kappa index of 0.699. Compared to the Chekit Leucose-Serum ELISA, iELISA showed 92.60% sensitivity, 87.09% specificity, 90.27% PPV and 90,00% NPV, with 90.27% concordance and a Kappa index of 0.801. Taking into account the high agreement with the traditional tests and the absence of non-specific reactions with BVDV, the developed assay could be used as diagnostic method to control EBL in Brazil.(AU)

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa natural dos bovinos com distribuição mundial causada pelo "bovine leukemia virus" (BLV). A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi considerada por muitos anos o teste de eleição, porém ensaios imunoenzimáticos (ELISA) apresentam sensibilidade mais elevada e leitura mais rápida e objetiva. No entanto, a importação de kits de ELISA é um processo dispendioso e demorado, e atualmente não há kits de IDGA comercialmente disponíveis no Brasil. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da LEB utilizando antígenos produzidos a partir do cultivo do BLV em linhagem celular Tadarida brasiliensis "lung" (Tb1Lu) livre de "bovine viral diarrhea virus" (BVDV), diferentemente do que acontece com as linhagens "fetal lamb kidney" (FLK) atualmente utilizadas na produção desses antígenos para uso em ensaios sorológicos. Após a padronização do iELISA, os resultados foram comparados com aqueles obtidos por IDGA e pelo ELISA comercial "Chekit Leucose-Serum". Comparado ao IDGA, o iELISA apresentou 94,44% de sensibilidade, 75,68% de especificidade, valor preditivo positivo (VPP) de 79,1% e valor preditivo negativo (VPN) de 93,3%, com concordância entre os testes de 84% e o índice Kappa 0,699. Quando comparado ao ELISA "Chekit Leucose-Serum", o iELISA apresentou sensibilidade de 92,6%, especificidade de 87,09%, VPP de 90,27% e VPN de 90%, com concordância de 90,27% e o índice Kappa 0,801. Portanto, devido à alta concordância com os testes tradicionais e ausência da ocorrência de reações inespecíficas com BVDV, o ensaio desenvolvido pode ser utilizado como ferramenta diagnóstica para o controle da LEB no Brasil.(AU)

Indirect ELISA (iELISA) standardization for the diagnosis of bovine enzootic leukosis / Padronização de um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da leucose enzoótica bovina

Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease caused by bovine leukemia virus (BLV) that affects cattle worldwide. Agar gel immunodiffusion (AGID) was the reference test for EBL diagnosis for many years, but enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed higher sensitivity, was faster to perform, and resulted in an objective reading. However, the importation of ELISA kits is lengthy and expensive, and currently, no AGID kits are available in Brazil. The aim of this work was to standardize an indirect ELISA (iELISA) for EBL diagnosis using BLV antigens produced in Tadarida brasiliensis lung (Tb1Lu) cells, which are Bovine viral diarrhea virus (BVDV) free, unlike fetal lamb kidney (FLK) cells, currently used for this purpose. Following standardization, iELISA results were compared with those obtained by AGID and the commercial Chekit Leucose-Serum ELISA. Compared to AGID, iELISA had 94,44% sensitivity, 75.68% specificity, 79.10% positive predictive value (PPV) and 93.30% negative predictive value (NPV), with 84% concordance and a Kappa index of 0.699. Compared to the Chekit Leucose-Serum ELISA, iELISA showed 92.60% sensitivity, 87.09% specificity, 90.27% PPV and 90,00% NPV, with 90.27% concordance and a Kappa index of 0.801. Taking into account the high agreement with the traditional tests and the absence of non-specific reactions with BVDV, the developed assay could be used as diagnostic method to control EBL in Brazil.(AU)

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa natural dos bovinos com distribuição mundial causada pelo "bovine leukemia virus" (BLV). A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi considerada por muitos anos o teste de eleição, porém ensaios imunoenzimáticos (ELISA) apresentam sensibilidade mais elevada e leitura mais rápida e objetiva. No entanto, a importação de kits de ELISA é um processo dispendioso e demorado, e atualmente não há kits de IDGA comercialmente disponíveis no Brasil. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da LEB utilizando antígenos produzidos a partir do cultivo do BLV em linhagem celular Tadarida brasiliensis "lung" (Tb1Lu) livre de "bovine viral diarrhea virus" (BVDV), diferentemente do que acontece com as linhagens "fetal lamb kidney" (FLK) atualmente utilizadas na produção desses antígenos para uso em ensaios sorológicos. Após a padronização do iELISA, os resultados foram comparados com aqueles obtidos por IDGA e pelo ELISA comercial "Chekit Leucose-Serum". Comparado ao IDGA, o iELISA apresentou 94,44% de sensibilidade, 75,68% de especificidade, valor preditivo positivo (VPP) de 79,1% e valor preditivo negativo (VPN) de 93,3%, com concordância entre os testes de 84% e o índice Kappa 0,699. Quando comparado ao ELISA "Chekit Leucose-Serum", o iELISA apresentou sensibilidade de 92,6%, especificidade de 87,09%, VPP de 90,27% e VPN de 90%, com concordância de 90,27% e o índice Kappa 0,801. Portanto, devido à alta concordância com os testes tradicionais e ausência da ocorrência de reações inespecíficas com BVDV, o ensaio desenvolvido pode ser utilizado como ferramenta diagnóstica para o controle da LEB no Brasil.(AU)

Synovial fluid as an auxiliary diagnostic tool for different stages of canine visceral leishmaniasis / Líquido sinovial como ferramenta diagnóstica auxiliar da leishmaniose visceral canina em diferentes estádios

Leishmaniasis represents a complex of chronic diseases with a broad geographic distribution and a high significance in public health worldwide. The varied clinical signs in conjunction with the low sensitivity and specificity of canine visceral leishmaniasis (CVL) detection methods make diagnosis of the disease complex. Among the several available laboratory tests, studies have suggested that the detection of parasites in synovial fluid (SF) is a good auxiliary tool in the diagnosis of CVL. However, no study has evaluated the influence of the clinical stage of CVL in the detection of Leishmania sp. in SF. This study aimed to evaluate the detection of Leishmania sp. amastigotes in the SF of dogs at different stages of the disease. The negative control group (G1) comprised 12 dogs that tested negative for CVL. Thirty-six other dogs, tested serologically positive for CVL, were divided into two groups: Group 2 (G2), which included animals at stage II of the disease (moderate; n=18), and Group 3 (G3) included animals at stage III of the disease (severe; n=18). The analysis of SF revealed the presence of parasites in six (33.3%) dogs from G2 and in 16 (88.9%) dogs from G3 (p=0.0437). The present research suggested that SF analysis is of high value as a supplementary tool in the diagnosis of CVL. As a new finding, the present study also indicated that this test has a higher sensitivity in animals presenting with more severe stage of the disease.(AU)

As leishmanioses representam um complexo de doenças de caráter crônico de alta importância na saúde pública mundial e com distribuição geográfica ampla. A apresentação clínica variada e a baixa sensibilidade e especificidade de alguns métodos para a detecção da doença tornam complexo o diagnóstico da leishmainiose visceral canina (LVC). Entre os diversos testes laboratóriais disponíveis, estudos tem sugerido que a pesquisa de parasitos no líquido sinovial (LS) pode ser uma ferramenta auxiliar no diagnóstico da LVC. Apesar disso, inexistem estudos avaliando a relação entre o estágio clínico da doença e a detecção de Leishmania sp. no LS. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a detecção de amastigotas de Leishmania sp. no LS de cães acometidos por diferentes estádios da doença. Foram avaliados 48 cães, sendo 12 negativos para LVC (grupo controle negativo, G1) e 36 soropositivos. O grupo 2 (doença moderada, G2) incluiu animais classificados no estádio II da doença, enquanto o grupo 3 (doença grave, G3) abrangeu animais classificados em estádio III. Na análise do líquido sinovial dos cães, o parasito foi visualizado em seis (33,3%) cães do G2 e 16 (88,9)% dos cães de G3 (p=0.0437). O presente trabalho sugere que a análise do LS apresenta alto valor como ferramenta suplementar no diagnóstico da LVC. Em adição, o presente estudo indica, pela primeira vez, que o teste apresenta uma sensibilidade maior em animais que apresentam a forma grave da doença.(AU)

Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus

ABSTRACT: Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140.

RESUMO: Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140.

Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus / Diferentes métodos de PCR em tempo real para detecção do vírus da pseudorraiva

Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140.

Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140.

False-negative reactions to the comparative intradermal tuberculin test for bovine tuberculosis / Reações falso-negativas ao teste cervical comparativo para tuberculose bovina

According to the Brazilian National Program for the Control and Eradication of Animal Brucellosis and Tuberculosis (PNCEBT), the routine tests for the diagnosis of bovine tuberculosis in the country are the simple intradermal tuberculin test (SITT) of the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA), the caudal fold test and the comparative intradermal tuberculin test (CITT). The latter is also used as a confirmatory test. A group of 53 animals from three dairy herds in a focal area for bovine tuberculosis, that were submitted to depopulation in the state of Rio Grande do Sul, were submitted to the CITT. Tissues were cultured and the resulting colonies were confirmed by PCR and DNA sequencing. Among the 53 animals analyzed using the CITT, 32 (60.4%) were negative, 14 (26.4%) were positive and seven (13.2%) results were inconclusive. The CITT detected 11 of the 39 animals with culture-confirmed M. bovis infection as positive. Among the total of 14 uninfected animals based on cultures, the CBT detected eight as negative. Thus, the CITT demonstrated sensitivity of 28.2% and specificity of 57.1% for the population sampled. A total of 24/32 (75.0%) of the animals with negative CITT results were culture positive (confirmed by PCR) and were considered false negatives based on the CITT. The maintenance of these false-negative animals in herds has serious implications for the control of the disease, since they can be a source of infection. The addition of complementary tests could help identify such animals and increase the odds of diagnostic success.(AU)

No Brasil, segundo o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os testes de rotina para o diagnóstico de tuberculose bovina são o teste cervical simples (TCC), o teste da prega caudal (TPC) e o teste cervical comparativo (TCC), sendo que o último também é utilizado como teste confirmatório. Um grupo de 53 animais oriundos de três rebanhos leiteiros de área de foco para tuberculose bovina que foram submetidos a vazio sanitário no Rio Grande do Sul foi submetido ao TCC. Os tecidos destes animais foram cultivados e as colônias resultantes confirmadas por PCR e sequenciamento de DNA. Dos 53 animais analisados no TCC, 32 (60,4%) foram negativos, 14 (26,4%) positivos e sete (13,2%) inconclusivos, com base no PNCEBT. O TCC detectou como positivos 11 dos 39 animais com infecção por M. bovis confirmada por cultivo. Do total de 14 animais não infectados, baseado na cultura, o TCC detectou oito como negativos. Assim, o TCC apresentou, para a população amostrada, sensibilidade de 28,2% e especificidade de 57,1%. Um total de 24/32 (75,0%) dos animais negativos ao TCC foi positivo no cultivo (confirmado por PCR), sendo considerados falso-negativos ao TCC. A manutenção destes animais falso-negativos nos rebanhos tem sérias implicações para o controle da enfermidade, já que os mesmos podem ser fonte de infecção. A adição de testes complementares poderia auxiliar na identificação destes animais, aumentando a cobertura diagnóstica.(AU)

Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus / Diferentes métodos de PCR em tempo real para detecção do vírus da pseudorraiva

Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140. (AU)

Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140. (AU)

False-negative reactions to the comparative intradermal tuberculin test for bovine tuberculosis / Reações falso-negativas ao teste cervical comparativo para tuberculose bovina

According to the Brazilian National Program for the Control and Eradication of Animal Brucellosis and Tuberculosis (PNCEBT), the routine tests for the diagnosis of bovine tuberculosis in the country are the simple intradermal tuberculin test (SITT) of the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA), the caudal fold test and the comparative intradermal tuberculin test (CITT). The latter is also used as a confirmatory test. A group of 53 animals from three dairy herds in a focal area for bovine tuberculosis, that were submitted to depopulation in the state of Rio Grande do Sul, were submitted to the CITT. Tissues were cultured and the resulting colonies were confirmed by PCR and DNA sequencing. Among the 53 animals analyzed using the CITT, 32 (60.4%) were negative, 14 (26.4%) were positive and seven (13.2%) results were inconclusive. The CITT detected 11 of the 39 animals with culture-confirmed M. bovis infection as positive. Among the total of 14 uninfected animals based on cultures, the CBT detected eight as negative. Thus, the CITT demonstrated sensitivity of 28.2% and specificity of 57.1% for the population sampled. A total of 24/32 (75.0%) of the animals with negative CITT results were culture positive (confirmed by PCR) and were considered false negatives based on the CITT. The maintenance of these false-negative animals in herds has serious implications for the control of the disease, since they can be a source of infection. The addition of complementary tests could help identify such animals and increase the odds of diagnostic success.(AU)

No Brasil, segundo o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os testes de rotina para o diagnóstico de tuberculose bovina são o teste cervical simples (TCC), o teste da prega caudal (TPC) e o teste cervical comparativo (TCC), sendo que o último também é utilizado como teste confirmatório. Um grupo de 53 animais oriundos de três rebanhos leiteiros de área de foco para tuberculose bovina que foram submetidos a vazio sanitário no Rio Grande do Sul foi submetido ao TCC. Os tecidos destes animais foram cultivados e as colônias resultantes confirmadas por PCR e sequenciamento de DNA. Dos 53 animais analisados no TCC, 32 (60,4%) foram negativos, 14 (26,4%) positivos e sete (13,2%) inconclusivos, com base no PNCEBT. O TCC detectou como positivos 11 dos 39 animais com infecção por M. bovis confirmada por cultivo. Do total de 14 animais não infectados, baseado na cultura, o TCC detectou oito como negativos. Assim, o TCC apresentou, para a população amostrada, sensibilidade de 28,2% e especificidade de 57,1%. Um total de 24/32 (75,0%) dos animais negativos ao TCC foi positivo no cultivo (confirmado por PCR), sendo considerados falso-negativos ao TCC. A manutenção destes animais falso-negativos nos rebanhos tem sérias implicações para o controle da enfermidade, já que os mesmos podem ser fonte de infecção. A adição de testes complementares poderia auxiliar na identificação destes animais, aumentando a cobertura diagnóstica.(AU)

Comparative analyses of thoracic radiographs and bronchoalveolar lavage of dogs and cats with chronic bronchial diseases / Análise comparativa da radiografia torácica e do lavado broncoalveolar em cães e gatos com doença bronquial crônica

There is a high incidence of bronchitis and asthma cases in veterinary medicine. Thoracic radiographs and bronchoalveolar lavage (BAL) are commonly performed for definitive diagnosis in dogs and cats with suspected bronchitis and asthma. It is believed that a combination of diagnostic tools is the best choice to achieve a diagnosis. The aim of this study was to evaluate the efficacy of thoracic radiographs and BAL in the diagnosis of chronic bronchial disease (CBD) in dogs and cats and whether there is any specific radiographic finding that could influence the indication for bronchoalveolar lavage. It was performed a cross-sectional, prospective, observational study including forty client-owned dogs and cats with lower respiratory tract signs and positive radiographic opacities that were evaluated with BAL followed by cytology and culture. The radiographic results compared with BAL culture showed a sensitivity of 38%, specificity of 95% and accuracy of 65% in detecting patients with pneumonia associated with chronic bronchial disease. Thoracic radiographs were effective in diagnosing 65% of the patients, radiographs plus BAL cytology diagnosed 75% of patients and the combination of radiographs, BAL cytology and culture diagnosed 95% of the patients with chronic bronchial disease. In conclusion, the combination of radiographic examination with BAL followed by cytological and microbiological analyses increases diagnostic success in CBD.

Existe uma alta incidência de casos de bronquite e asma em medicina veterinária. Radiografia torácica e lavado broncoalveolar (LBA) são geralmente realizados para o diagnóstico definitivo em cães e gatos com suspeita de bronquite e asma. Acredita-se que uma combinação de ferramentas diagnósticas é a melhor escolha para se obter um diagnóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de radiografias torácicas e do LBA no diagnóstico da doença brônquica crônica (DBC) em cães e gatos e tentar determinar se há algum qualquer achado radiográfico específico que possa influenciar a indicação de lavado broncoalveolar. Foi realizado um estudo prospectivo, observacional, incluindo quarenta cães e gatos com sinais clínicos de trato respiratório inferior e aumento de opacidade radiográfica torácica, os quais foram avaliados com LBA seguido de citologia e cultura bacteriana. Os resultados radiográficos em comparação com a cultura bacteriana do LBA mostraram uma sensibilidade de 38%, especificidade de 95% e acurácia de 65% na detecção de pacientes com pneumonia associada à doença brônquica crônica. As radiografias torácicas foram eficazes em diagnosticar 65% dos pacientes, radiografia mais LBA seguido de citologia diagnosticaram 75% dos pacientes e a combinação de radiografias, LBA seguido de citologia e cultura bacteriana diagnosticaram 95% dos pacientes com doença brônquica crónica. Em conclusão, a combinação de exame radiográfico torácico e LBA seguido de análise citológica e microbiológica aumenta o sucesso diagnóstico na DBC.

Comparative analyses of thoracic radiographs and bronchoalveolar lavage of dogs and cats with chronic bronchial diseases / Análise comparativa da radiografia torácica e do lavado broncoalveolar em cães e gatos com doença bronquial crônica

There is a high incidence of bronchitis and asthma cases in veterinary medicine. Thoracic radiographs and bronchoalveolar lavage (BAL) are commonly performed for definitive diagnosis in dogs and cats with suspected bronchitis and asthma. It is believed that a combination of diagnostic tools is the best choice to achieve a diagnosis. The aim of this study was to evaluate the efficacy of thoracic radiographs and BAL in the diagnosis of chronic bronchial disease (CBD) in dogs and cats and whether there is any specific radiographic finding that could influence the indication for bronchoalveolar lavage. It was performed a cross-sectional, prospective, observational study including forty client-owned dogs and cats with lower respiratory tract signs and positive radiographic opacities that were evaluated with BAL followed by cytology and culture. The radiographic results compared with BAL culture showed a sensitivity of 38%, specificity of 95% and accuracy of 65% in detecting patients with pneumonia associated with chronic bronchial disease. Thoracic radiographs were effective in diagnosing 65% of the patients, radiographs plus BAL cytology diagnosed 75% of patients and the combination of radiographs, BAL cytology and culture diagnosed 95% of the patients with chronic bronchial disease. In conclusion, the combination of radiographic examination with BAL followed by cytological and microbiological analyses increases diagnostic success in CBD.(AU)

Existe uma alta incidência de casos de bronquite e asma em medicina veterinária. Radiografia torácica e lavado broncoalveolar (LBA) são geralmente realizados para o diagnóstico definitivo em cães e gatos com suspeita de bronquite e asma. Acredita-se que uma combinação de ferramentas diagnósticas é a melhor escolha para se obter um diagnóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de radiografias torácicas e do LBA no diagnóstico da doença brônquica crônica (DBC) em cães e gatos e tentar determinar se há algum qualquer achado radiográfico específico que possa influenciar a indicação de lavado broncoalveolar. Foi realizado um estudo prospectivo, observacional, incluindo quarenta cães e gatos com sinais clínicos de trato respiratório inferior e aumento de opacidade radiográfica torácica, os quais foram avaliados com LBA seguido de citologia e cultura bacteriana. Os resultados radiográficos em comparação com a cultura bacteriana do LBA mostraram uma sensibilidade de 38%, especificidade de 95% e acurácia de 65% na detecção de pacientes com pneumonia associada à doença brônquica crônica. As radiografias torácicas foram eficazes em diagnosticar 65% dos pacientes, radiografia mais LBA seguido de citologia diagnosticaram 75% dos pacientes e a combinação de radiografias, LBA seguido de citologia e cultura bacteriana diagnosticaram 95% dos pacientes com doença brônquica crónica. Em conclusão, a combinação de exame radiográfico torácico e LBA seguido de análise citológica e microbiológica aumenta o sucesso diagnóstico na DBC.(AU)

AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOLÓGICA E TERAPÊUTICA DA OSTEOARTRITE EM GATOS

A doença articular degenerativa é uma das doenças que mais frequentemente acomete os felinos durante seu envelhecimento. Esta pode afetar somente o esqueleto apendicular, sendo reconhecida como osteoartrite ou englobar também os seguimentos espinhais, sendo classificada, portanto, como DAD. A doença se caracteriza pela inflamação e degeneração da cartilagem articular, podendo também alterar a conformação óssea. Este processo é acompanhado de dor e inflamação de forma contínua, podendo influenciar diretamente na atividade e qualidade de vida dos felinos. Além disso, o processo degenerativo não tratado pode levar à dor crônica e sensitização central. O diagnóstico da doença ainda representa um desafio, embora alta prevalência na população felina, os sinais clínicos da DAD são considerados discretos. Para isto, o uso de instrumentos de metrologia clínica tem se tornado cada vez mais relevantes no processo diagnóstico, embora ainda não exista uma ferramenta validada para tal no Brasil. A tecnologia também tem sido utilizada para auxiliar na avaliação diagnóstica e monitoração de tratamento em diversos estudos. Uma das ferramentas mais frequentemente escolhidas para os felinos é o acelerômetro. Entretanto, somente um dispositivo foi validado para a espécie. As terapias mais comumente empregadas na doença se baseiam no uso de anti-inflamatórios não esteroidais, suplementos articulares e analgésicos com possível ação central, embora nem todos os protocolos possuam evidências clínicas para seu uso. No presente trabalho foi possível realizar o processo de validação transcultural do Feline Musculoeskeletal Pain Score Chekclist (Feline MiPSC), visando sua utilização para triagem de dor musculoesquelética felina para aumentar as chances de diagnóstico dos gatos atendidos no país. O questionário apresentado neste estudo, pode ser associado ao exame ortopédico e avaliação radiográfica, aumentando a sensibilidade diagnóstica. A avaliação do acelerômetro Actigraph para uso em gatos também foi efetuada. O dispositivo foi comparado ao monitor previamente validado, fornecendo uma nova oportunidade para monitoração de atividade em gatos. Além disso, este estudo avaliou a resposta analgésica do meloxicam como único tratamento, ou associado ao tramadol e a gabapentina em gatos com DAD, comparando seus níveis de atividade e resposta clínica mediante tais protocolos.

Degenerative joint disease (DJD) is one of the most frequently diseases observed in cats during their ageing process. It is recognized as osteoarthritis (OA) when if affects exclusively the appendicular joints, or DJD if it also affects the spinal segments. The disease is characterized by inflammation and degeneration of the articular cartilage, potentially affecting bone conformation. This process is responsible for inducing pain and chronic inflammation and, possibly having directly influence in the activity and quality of life of cats. Moreover, the untreated degenerative process can lead to chronic pain and central sensitization. The diagnostic of DJD still represents a challenge, although, there is a high prevalence in the feline population once mild clinical signs are observed. For this reason, the use of clinical metrology instruments has become increasingly relevant for the diagnostic process, although there is still no validated tool for this purpose in Brazil. Technology has also been used to promote the diagnostic evaluation and treatment monitoring in several studies. One of the most recurrent tools for feline patients is the accelerometer. However, only one device has been validated for the species. The most common therapies for DJD are based on the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs, joint supplements, and analgesics with possible central action, although not all protocols have clinical evidence for their use. In the present study, it was possible to carry out a cross-cultural validation process of the Feline Musculoskeletal Pain Score Checklist (Feline MiPSC), aiming its use for feline musculoskeletal pain screening and increasing the diagnostic chances of the cats seen in the country. The questionnaire presented in this research can be associated with orthopedic examination and radiographic evaluation, increasing the diagnostic sensitivity. The implementation of Actigraph accelerometer in cats was also evaluated. The device was compared to the previously validated monitors, providing a new possibility for activity monitoring in cats. Moreover, this study has evaluated the analgesic response of meloxicam alone, or associated with tramadol and gabapentin in cats with DAD, comparing their activity levels and clinical response to these different treatments.

Estudo comparativo e validação de três técnicas de PCR em tempo real (qPCR) para diagnóstico de Peste Suína Africana / Comparative study and validation of three quantitative PCR (qPCR) techniques for the diagnosis of African Swine Fever

Este estudo verificou o desempenho de três técnicas de PCR quantitativa (Real-Time) para o diagnóstico de Peste Suína Africana, uma doença exótica no Brasil, a partir de amostras de tecidos. As três técnicas escolhidas baseiam-se na amplificação de sequências do gene da proteína viral VP72 e são preconizadas, cada uma, por laboratórios oficiais da OIE (PSA-OIE), dos Estados Unidos (PSA-USDA) e da União Europeia (PSA-EU), respectivamente. Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise marcadas com fluoróforos foram sintetizados conforme a literatura de referência consultada. Sequências-alvo do DNA viral foram inseridos em plasmídeo sintético, os quais serviram de controle positivo para a padronização das técnicas e otimização de reagentes, determinação dos limites de detecção e testes de verificação de desempenho. Para aferição de repetibilidade e reprodutibilidade das técnicas, as técnicas padronizadas foram repetidas em dias diferentes, por um segundo analista, com alteração no mix comercial de reagentes utilizado e em um equipamento diferente, e também por outro laboratório. Realizaram-se, ainda, provas de sensibilidade analítica com amostras de DNA viral de referência e especificidade analítica e diagnóstica, com amostras negativas. As técnicas de PSA-EU e PSA-USDA apresentaram-se mais vantajosas quanto ao consumo de iniciadores. Não houve diferenças significativas nos resultados quantitativos variando-se os dias dos ensaios, os analistas, os equipamentos e o mix de reagentes. As três técnicas apresentaram alta especificidade analítica e diagnóstica e sensibilidade diagnóstica. As três técnicas de qPCR mostraram-se eficazes para serem adotadas por um mesmo laboratório para emissão de diagnósticos oficiais de Peste Suína Africana.(AU)

This study evaluated the performance of three real time PCR techniques (qPCR) for the diagnosis of African Swine Fever in tissue samples. The three chosen techniques are based on amplification of viral protein VP72 gene sequences and are recommended by OIE (PSA-OIE), the United States official laboratories (PSA-USDA) and the European Union (PSA-EU). Target sequences of the viral DNA were inserted into synthetic plasmid, which served as a positive control for the standardization of techniques and optimization of reagents, determination of limits of detection and performance verification testing. To gauge repeatability and reproducibility of techniques, standard procedures were repeated on different days by two analysts and by changing mix reagents and equipment, and also by another laboratory. Analytical sensitivity tests were done with reference samples provided by an OIE reference laboratory and analytical and diagnostic specificity were tested with negative samples. The PSA-EU and PSA-USDA techniques were more advantageous to use because of lower concentration of oligos used. There were no significant differences in quantitative results varying the days of tests, analysts, equipment and the mix of reagents. The three techniques had high analytical and diagnostic specificity and sensitivity. The three qPCR techniques were considered equivalent and effective and can be adopted by any laboratory for issuing official diagnosis of African Swine Fever.(AU)

Canine distemper virus detection by different methods of One-Step RT-qPCR / Detecção do vírus da cinomose canina por diferentes métodos de One-Step RT-qPCR

Three commercial kits of One-Step RT-qPCR were evaluated for the molecular diagnosis of Canine Distemper Virus. Using the kit that showed better performance, two systems of Real-time RT-PCR (RT-qPCR) assays were tested and compared for analytical sensitivity to Canine Distemper Virus RNA detection: a One-Step RT-qPCR (system A) and a One-Step RT-qPCR combined with NESTED-qPCR (system B). Limits of detection for both systems were determined using a serial dilution of Canine Distemper Virus synthetic RNA or a positive urine sample. In addition, the same urine sample was tested using samples with prior centrifugation or ultracentrifugation. Commercial kits of One-Step RT-qPCR assays detected canine distemper virus RNA in 10 (100%) urine samples from symptomatic animals tested. The One-Step RT-qPCR kit that showed better results was used to evaluate the analytical sensitivity of the A and B systems. Limit of detection using synthetic RNA for the system A was 11 RNA copies µL-1 and 110 RNA copies µl-1 for first round System B. The second round of the NESTED-qPCR for System B had a limit of detection of 11 copies µl-1. Relationship between Ct values and RNA concentration was linear. The RNA extracted from the urine dilutions was detected in dilutions of 10-3 and10-2 by System A and B respectively. Urine centrifugation increased the analytical sensitivity of the test and proved to be useful for routine diagnostics. The One-Step RT-qPCR is a fast, sensitive and specic method for canine distemper routine diagnosis and research projects that require sensitive and quantitative methodology.(AU)

Três kits comerciais de One-Step RT-qPCR foram avaliados para o diagnóstico molecular do Vírus da Cinomose Canina.Utilizando o kit que apresentou melhor desempenho, dois sistemas de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) foram comparados quanto à sensibilidade analítica na detecção do RNA do Vírus da Cinomose Canina:One-Step RT-qPCR (Sistema A) e One-Step RT-qPCR seguido da NESTED-qPCR (Sistema B).Os limites de detecção dos dois sistemas foram determinados utilizando diluição seriada de RNA sintético do Vírus da Cinomose Canina ou de uma amostra de urina positiva. Adicionalmente, uma amostra de urina foi avaliada com centrifugação ou ultracentrifugação prévia. Os kits comerciais de One-Step RT-qPCR amplificaram o RNA do vírus da cinomose canina em 10 (100%) amostras de urinas de animais sintomáticos. O kit de One-Step RT-qPCR que apresentou melhor resultado foi utilizado para avaliar a sensibilidade analítica dos sistemas A e B. Na reação da curva padrão com RNA sintético, o limite de detecção do sistema A foi de 11 cópias de RNA µL-1. No sistema B foi de 110 cópias de RNA µL-1 na One-Step RT-qPCR e 11 cópias de RNA µL-1 na NESTED-qPCR. A relação entre os valores de Ct e concentração de RNA foi linear. O RNA extraído das diluições da urina foi detectado nas diluições de 10-3 e10-2 pelos sistemas A e B, respectivamente. A centrifugação prévia da urina aumentou a sensibilidade analítica da análise e mostrou ser importante para a rotina diagnóstica. A reação de One-Step RT-PCR é um método rápido, sensível, específico e aplicável na rotina de diagnóstico molecular da cinomose e em projeto de pesquisa que requer metodologia quantitativa e sensível.(AU)

Avaliação do microbioma cutâneo de gatos com dermatofitose pela técnica de sequenciamento de alto rendimento e caracterização de proteínas imunodominantes do Microsporum canis para o sorodiagnóstico da dermatofitose felina

A dermatofitose e uma doenca fungica comumente vista no atendimento ambulatorial de felinos. A sua importancia clinica e epidemiologica reside no fato de ser uma dermatopatia cosmopolita, infecciosa, contagiosa e zoonotica. Atualmente, o cultivo fungico e a principal ferramenta de diagnostico utilizada, porem a sua morosidade na emissao do resultado indica a necessidade do desenvolvimento de novas estrategias de diagnostico. A aplicacao de tecnologias de imunodiagnostico, bem como tecnologias de sequenciamento da microbiota, tem um grande potencial para contribuir na identificacao e desenvolvimento de novos alvos diagnosticos. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar as proteinas imunodominantes do Microsporum canis para aplicabilidade no sorodiagnostico da dermatofitose felina. Alem disso, objetivou-se avaliar a composicao e a diversidade das microbiotas fungica e bacteriana de gatos com dermatofitose, gatos assintomaticos (carreadores de M. canis) e gatos higidos. Para os ensaios de caracterizacao das proteinas de M. canis, foram colhidas amostras cutaneas e de sangue de 70 felinos: sintomaticos (n= 20), assintomaticos (n= 20), negativos (n = 20) e negativos heterologos (n= 10). As amostras cutaneas foram submetidas a cultivos fungicos para confirmacao diagnostica e subsequente extracao de M. canis e as amostras de sangue foram avaliadas por Western blot uni e bidimensional. Para a realizacao dos ensaios de sequenciamento da microbiota, foram colhidas amostras cutaneas, pelos metodos carpete e escova de dentes, de 45 felinos: sintomaticos (n= 15), assintomaticos (n= 15) e negativos (n= 15). Essas amostras foram submetidas ao sequenciamento de alto rendimento na plataforma Illumina utilizando analise dos genes 16S rRNA e ITS1. Na avaliacao bidimensional das proteinas de M. canis, foi observado que elas se encontravam majoritariamente na faixa de pH de 7 a 3. Ainda, o WB revelou um amplo perfil antigenico com proteinas variando de 150 a 20 kDa em peso molecular. As proteinas de 30 e 42 kDa demonstraram intensa imunorreatividade em felinos sintomaticos e assintomaticos e baixa imunorreatividade nos negativos. O teste de Western blot conseguiu discriminar bem os gatos positivos dos gatos negativos para M. canis demonstrando elevados indices de sensibilidade (92,5%) e especificidade (90%) diagnosticas. Quanto aos resultados da analise de sequenciamento, foi observado que gatos sintomaticos e assintomaticos apresentaram um padrao semelhante na composicao e distribuicao da microbiota. Adicionalmente, nao foi observado diferenca estatistica na distribuicao relativa do Microsporum entre esses grupos. Os resultados do imunodiagnostico sugerem que as proteinas de 30 e 42 kDa apresentam elevada acuracia diagnostica e podem ser utilizadas em teste de WB, bem como sao potenciais candidatas a purificacao e subsequente utilizacao em ensaios enzimaticos. Adicionalmente, conclui-se que a atividade proteolitica do M. canis possui maior acao em ph acido. Em relacao aos dados do sequenciamento, conclui-se que o desencadeamento da dermatofitose esta mais relacionado a fatores intrinsecos referentes a imunidade do hospedeiro do que com fatores relacionados ao dermatofito ou com a distribuicao/composicao da microbiota comensal. Adicionalmente, conclui-se que embora o M. canis seja o agente causal e fator determinante para o desencadeamento da dermatofitose, sua acao isolada nao e suficiente para desencadear a enfermidade.

Dermatophytosis is a superficial fungal disease commonly seen in dermatological practice. This mycosis is an important skin disease of cats because it is contagious, infectious and can be transmitted to people. Currently, several diagnostic techniques are available to confirm clinical suspicion, and the fungal culture remains one of the most employed diagnostic tools. However, dermatophytes are slow-growing fungi and it may take several weeks for results. Therefore, the development of new diagnostic tests as immunodiagnostic, as well as microbiota sequencing Technologies can contribute to the proper identification and development of new diagnostic targets. The aim of this study was to identify the immunodominant proteins of Microsporum canis for the serological diagnosis of feline dermatophytosis. Additionally, this study aimed to evaluate the composition and diversity of skin fungal and bacterial communities of cats with dermatophytosis, asymptomatic cats (carriers of M. canis), and healthy cats. For the M. canis protein study, skin and blood samples were collected from 70 cats: symptomatic (n=20), asymptomatic (n=20), negative (n=20) and heterologous negative (n=10 ). Skin samples were submitted to fungal cultures for diagnostic confirmation and subsequent extraction of M. canis, and blood samples were evaluated by Western blot. For the microbiota study, skin samples were collected by combing the coat using a sterile polyester carpet and toothbrush, from 45 cats: symptomatic (n=15), asymptomatic (n=15) and negative (n=15). Samples were submitted to next-generation sequencing on the Illumina platform using 16S rRNA and ITS1 gene analysis. In the two-dimensional evaluation of M. canis proteins, it was observed that they were distributed in the pH range of 7 to 3. Furthermore, the WB revealed a broad antigenic profile with proteins ranging from 150 to 20 kDa. The 30 and 42 kDa proteins showed strong immunoreactivity in symptomatic and asymptomatic samples and low immunoreactivity in negative samples. The Western blot test was able to distinguish positive and negative cats for M. canis, showing high sensitivity (92.5%) and specificity (90%). The microbiota analysis showed that symptomatic and asymptomatic cats presented a similar pattern in the composition and distribution of skin microbiota. Additionally, no statistical difference was observed in the relative distribution of Microsporum between these groups. Immunodiagnostic results suggest that proteins of 30 and 42 kDa present high diagnostic accuracy and can be applied in WB tests, as well as being potential candidates for purification and subsequent application in serological assays. Additionally, it is concluded that the proteolytic activity of M. canis occurred mainly in acidic ph. Regarding the sequencing data, it is concluded that dermatophytosis is more linked to the host's immunity than to factors associated with the dermatophyte or distribution of the commensal microbiota. Additionally, it is concluded that although M. canis is the causative agent and responsible for triggering dermatophytosis, its isolated activity is not sufficient to trigger the disease.