Kinetic vitrification: concepts and perspectives in animal sperm cryopreservation

Sperm cryopreservation is an important tool for genetic diversity management programs and the conservation of endangered breeds and species. The most widely used method of sperm conservation is slow freezing, however, during the process, sperm cells suffer from cryoinjury, which reduces their viability and fertility rates. One of the alternatives to slow freezing is vitrification, that consist on rapid freezing, in which viable cells undergo glass-like solidification. This technology requires large concentrations of permeable cryoprotectants (P- CPA's) which increase the viscosity of the medium to prevent intracellular ice formation during cooling and warming, obtaining successful results in vitrification of oocytes and embryos. Unfortunately, this technology failed when applied to vitrification of sperm due to its higher sensitivity to increasing concentrations of P-CPAs. Alternatively, a technique termed 'kinetic sperm vitrification' has been used and consists in a technique of permeant cryoprotectant-free cryopreservation by direct plunging of a sperm suspension into liquid nitrogen. Some of the advantages of kinetic vitrification are the speed of execution and no rate-controlled equipment required. This technique has been used successfully and with better results for motility in human (50-70% motility recovery), dog (42%), fish (82%) and donkey (21.7%). However, more studies are required to improve sperm viability after devitrification, especially when it comes to motility recovery. The objective of this review is to present the principles of kinetic vitrification, the main findings in the literature, and the perspectives for the utilization of this technique as a cryopreservation method.(AU)

Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.(AU)

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.

Efeitos do congelamento lento e rápido prévios à maturação na maciez da carne bovina / Effects of slow and fast freezing prior to aging on beef tenderness

Na presente pesquisa foi analisada a influência do congelamento lento (-20 °C, ar estático) e rápido (-25 °C, ar forçado) seguido da maturação (0 e 14 dias) na maciez de contrafilé de bovinos da raça Nelore. Apenas as amostras não-congeladas e maturadas por 14 dias apresentaram maiores (P < 0,05) valores de pH do que as demais. Não foi verificado efeito significativo para a PPC (média de 23,34%), enquanto que as purgas foram maiores nas amostras congeladas do que nas não-congeladas (2,52 x 11,06%), independentemente da taxa de congelamento. Amostras congeladas rapidamente apresentaram menores força de cisalhamento do que as congeladas lentamente, mas ambas não diferiram das amostras não-congeladas. Concluiu-se que o congelamento, mesmo em diferentes taxas, associado à maturação não influenciou a maciez da carne bovina.(AU)

Efeitos do congelamento lento e rápido prévios à maturação na maciez da carne bovina / Effects of slow and fast freezing prior to aging on beef tenderness

Na presente pesquisa foi analisada a influência do congelamento lento (-20 °C, ar estático) e rápido (-25 °C, ar forçado) seguido da maturação (0 e 14 dias) na maciez de contrafilé de bovinos da raça Nelore. Apenas as amostras não-congeladas e maturadas por 14 dias apresentaram maiores (P < 0,05) valores de pH do que as demais. Não foi verificado efeito significativo para a PPC (média de 23,34%), enquanto que as purgas foram maiores nas amostras congeladas do que nas não-congeladas (2,52 x 11,06%), independentemente da taxa de congelamento. Amostras congeladas rapidamente apresentaram menores força de cisalhamento do que as congeladas lentamente, mas ambas não diferiram das amostras não-congeladas. Concluiu-se que o congelamento, mesmo em diferentes taxas, associado à maturação não influenciou a maciez da carne bovina.

Efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Tris-citrato na congelação com etilenoglicol ou glicerol de espermatozoides epididimários de gato doméstico (Felis catus) / Effect of different osmolarities of Tris-citrate extender on freezing epididymal sperm from domestic cat (Felis catus)with ethyleneglycol or glycerol

Objetivou-se com o estudo investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Triscitrato em espermatozóides epididimários de gatos domésticos (Feliscatus) e a congelação com glicerol ou etilenoglicol. Foram realizados dois experimentos, com 10 gatos. No Experimento 1, avaliou-se a manutenção dos parâmetros espermáticos em diluidor tris-citrato com osmolaridades 275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm, nos tempos (T0= 0, T1= 30 e T2= 60 min). No Experimento 2 a congelação foi realizada utilizando as osmolaridades 325 e 375 do glicerol a 4% ou etilenoglicol a 3%, 6%. Dentre as osmolaridades, quanto à motilidade a 325 mOsm não diferiu estatisticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Portanto, o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos.(AU)

The aim of this study was to investigate the effect of different osmotic potentials of Tris-citrate extender in epididymal spermatozoa of domestic cats (Felis catus), frozen with glycerol or ethyleneglycol. Two experiments were carried out, with ten cats. In the first experiment, the influence of extender with the osmolarityof 275, 325, 375, 425, 475 and 525 mOsm on sperm parameters were evaluated. In the second experiment, slow freezing was performed using glycerol at 4% or ethyleneglycolat 3% and 6% added to extender with 325and 375 mOsm. Among the osmolarities, the motilityat 325 mOsm did not differ statistically with epididymal fluid (control) at all times evaluated and at 375 mOsmat T0 and T1, and both showed no statistical differences between each other and between the times in all sperm parameters. Glycerol 4% added to extender with 475 mOsm was superior, presenting motilityof 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, without statistical differences with cooling and in morphology, no statistical differences were found between the two osmolarities. Therefore, 325 and 375 mOsm Triscitrate between the osmolarities tested and after freezing with 375 mOsm and 4%, glycerol maintained the sperm parameters.(AU)

Efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Tris-citrato na congelação com etilenoglicol ou glicerol de espermatozoides epididimários de gato doméstico (Felis catus) / Effect of different osmolarities of Tris-citrate extender on freezing epididymal sperm from domestic cat (Felis catus)with ethyleneglycol or glycerol

Objetivou-se com o estudo investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Triscitrato em espermatozóides epididimários de gatos domésticos (Feliscatus) e a congelação com glicerol ou etilenoglicol. Foram realizados dois experimentos, com 10 gatos. No Experimento 1, avaliou-se a manutenção dos parâmetros espermáticos em diluidor tris-citrato com osmolaridades 275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm, nos tempos (T0= 0, T1= 30 e T2= 60 min). No Experimento 2 a congelação foi realizada utilizando as osmolaridades 325 e 375 do glicerol a 4% ou etilenoglicol a 3%, 6%. Dentre as osmolaridades, quanto à motilidade a 325 mOsm não diferiu estatisticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Portanto, o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos.

The aim of this study was to investigate the effect of different osmotic potentials of Tris-citrate extender in epididymal spermatozoa of domestic cats (Felis catus), frozen with glycerol or ethyleneglycol. Two experiments were carried out, with ten cats. In the first experiment, the influence of extender with the osmolarityof 275, 325, 375, 425, 475 and 525 mOsm on sperm parameters were evaluated. In the second experiment, slow freezing was performed using glycerol at 4% or ethyleneglycolat 3% and 6% added to extender with 325and 375 mOsm. Among the osmolarities, the motilityat 325 mOsm did not differ statistically with epididymal fluid (control) at all times evaluated and at 375 mOsmat T0 and T1, and both showed no statistical differences between each other and between the times in all sperm parameters. Glycerol 4% added to extender with 475 mOsm was superior, presenting motilityof 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, without statistical differences with cooling and in morphology, no statistical differences were found between the two osmolarities. Therefore, 325 and 375 mOsm Triscitrate between the osmolarities tested and after freezing with 375 mOsm and 4%, glycerol maintained the sperm parameters.

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

QUALIDADE ESPERMÁTICA DURANTE A CURVA DE RESFRIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO DILUÍDO EM ÁGUA DE COCO EM PÓ VISANDO SUA CRIOPRESERVAÇÃO

Abstract Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 ºC for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution - BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Resumo A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 ºC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution - BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution – BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution – BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.(AU)

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.(AU)

Influência do uso de óleo essencial de Eugenol e de Manjericão (Ocimum basilicum) na água de transporte pré-abate de tilápias cultivadas pela agricultura familiar

Procurando oferecer bem estar animal dentro dos sistemas de cultivos, os quais cada vez mais tecnificados, a tilapicultura dentro da agricultura familiar preocupa-se em produzir produtos competitivos no mercado com qualidade respeitando as leis vigentes. Este estudo teve como objetivo analisar o efeito de dois anestésicos naturais sobre a qualidade da carne da tilápia do Nilo, quando adicionados na água de transporte, in vivo, da propriedade até o frigorífico e se o modo de cultivo nesse sistema familiar apresentaria diferenças no produto final. Para tanto, um total de 100 peixes adultos, com peso médio de 816,36 ±1,42 g, foram distribuídos em cinco tratamentos: N: peixes não transportados; C: peixes transportados apenas com água (controle); A: peixes transportados com água + veículo anestésico (etanol 36L L-1); E: peixes transportados com água + eugenol (20LL-1) veículo anestésico; e M: peixes transportados com água + óleo essencial de Ocimum basilicum (20L L-1 veículo anestésico). Foi realizada a coleta dos filés de 20 peixes por tratamento para avaliação de parâmetros de qualidade de carne. Como resultado constatou-se que a qualidade da água de transporte não foi afetada (p>0,05) durante o transporte entre os tratamentos, porém o pH encontrado foi 4,59. Não houve efeito dos tratamentos quando avaliadas as colorimetrias referentes ao amarelo (b*) e à luminosidade (L*), a força de cisalhamento e a capacidade de retenção de água. Na colorimetria vermelha do lado vísceras (a*v) e vermelha do lado da pele (a*p), os maiores valores foram determinados para os filés dos tratamentos A e N, respectivamente. O pH dos filés dos peixes transportados com os anestésicos em estudo (E e M) mantiveram valores mais elevados. Os filés dos animais do tratamento N apresentaram a menor média percentual de perda por descongelamento, enquanto a maior perda por gotejamento foi observada no tratamento A, com elevados valores, possivelmente pela forma de congelamento lenta. Na composição química-bromatológica, as médias para matéria mineral (MM) apresentaram diferença significativa no tratamento M, os demais parâmetros ficaram dentro dos valores normais da espécie. Os perfis de ácidos graxos se mostraram dentro dos valores para a espécie. Os tratamentos não apresentaram entre si diferenças significativas (p<0,05) nos lipídeos. Foi possível averiguar que os anestésicos naturais exibiram capacidade sedativa e não causaram danos, mas não contiveram alterações típicas fisiológicas causadas pelo estresse de transporte nos filés de tilápias do Nilo, e a forma de cultivo da agricultura familiar ofereceu um produto com valores nutricionais favoráveis ao consumo alimentar.

Trying to offer animal welfare within the culture systems, which are more and more technified, the tilapiculture within the family agriculture is concerned in producing competitive products in the market with quality respecting the current laws. The objective of this study was to analyze the effect of two natural anesthetics on the quality of Nile tilapia meat when added to the transport water, in vivo, from the farm to the slaughterhouse and if the way of farming in this familiar system would present differences in the final product. For this purpose, a total of 100 adult fish, with a mean weight of 816.36 ±1.42 g, were distributed in five treatments: N: fish not transported; C: fish transported with water only (control); A: fish transported with water + anesthetic vehicle (ethanol 36L L-1); E: fish transported with water + eugenol (20LL-1) anesthetic vehicle; and M: fish transported with water + essential oil of Ocimum basilicum (20L L-1 anesthetic vehicle). The fillets of 20 fish per treatment were collected to evaluate meat quality parameters. As a result, the quality of the transport water was not affected (p>0.05) during transportation between treatments, but the pH value was 4.59. There was no effect of the treatments when the colorimetry referring to yellow (b*) and luminosity (L*), shear force and water retention capacity were evaluated. For the colorimetry red on the viscera side (a*v) and red on the skin side (a*p), the highest values were determined for the fillets of treatments A and N, respectively. The pH of the fillets from fish transported with the anesthetics under study (E and M) maintained higher values. The fillets from animals in treatment N presented the lowest average percentage loss by thawing, while the highest loss by dripping was observed in treatment A, with high values, possibly due to the slow freezing method. In the chemical-bromatological composition, the averages for mineral matter (MM) showed significant difference in treatment M, the other parameters were within the normal values for the species. The fatty acid profiles were within the values for the species. The treatments did not show significant differences (p<0.05) in lipids. It was possible to verify that the natural anesthetics exhibited sedative capacity and did not cause damage, but did not contain typical physiological alterations caused by transport stress in Nile tilapia fillets, and the family farm form of farming offered a product with nutritional values favorable for food consumption.

Avaliação da viabilidade de tecido ovariano canino após criopreservação

Este estudo teve por objetivo avaliar a criopreservação de tecido ovariano por vitrificação e congelamento lento e verificar se há diferença na criotolerância de acordo com o tipo folicular e com a técnica de criopreservação. Para esse fim, foram obtidos 28 ovários de 14 cadelas em anestro, de diferentes raças, entre 2 e 5 anos, em anestro submetidas à ovario-histerectomia eletiva. Os ovários foram seccionados em pequenos fragmentos e, em seguida, distribuídos aleatoriamente em três grupos: vitrificação, congelamento lento e controle (a fresco). A vitrificação foi realizada em criotubos contendo solução DAP 213 (2M DMSO, 1 M acetamida, 3M propileno glicol) em duas etapas e o congelamento lento em criotubos com solução de 1,5M DMSO inseridos em máquina programável. Os efeitos da criopreservação foram avaliados por histologia e imuno-histoquímica (caspase-3 clivada), a fim de determinar o percentual de células em apoptose. O exame histológico revelou que o grupo congelamento lento apresentou maior percentual de folículos intactos (45,75%) em comparação aos submetidos à vitrificação (38,17%; P=0,01). Folículos maduros foram mais propensos à degeneração, independentemente do grupo avaliado. Entretanto, comparando-se os grupos criopreservados, folículos maduros apresentaram maior degeneração no congelamento lento, enquanto na vitrificação, os folículos primários foram os mais afetados. A avaliação imuno-histoquímica indicou que 84,21% dos folículos avaliados no grupo congelamento lento não expressaram caspase-3, sugerindo a ausência de apoptose. Diferentemente, as amostras vitrificadas apresentaram mais células em apoptose comparadas às demais (P<0,001). Em conclusão, o congelamento lento foi o que apresentou maior número de folículos viáveis em comparação à vitrificação e mostrou-se o método de escolha para criopreservar tecido ovariano canino.

This study aimed to evaluate the cryopreservation of ovarian tissue by vitrification and slow freezing and to verify if there is a difference in cryotolerance according to the follicular type and to the cryopreservation technique. For this purpose, 28 ovaries of 14 anesthetized bitches, of different breeds, between 2 and 5 years old, in anestrus, submitted to elective ovary-hysterectomy were selected. The ovaries were divided into small fragments and then randomly distributed into three groups: vitrification, slow freezing and control (fresh). The vitrification was performed in cryotubes containing DAP 213 solution (2M DMSO, 1M acetamide, 3M propylene glycol) in two stages and the slow freezing in cryotubes with 1.5M DMSO solution and inserted in a programmable machine. The effects of cryopreservation were evaluated by histology and immunohistochemistry (cleaved caspase-3), in order to determine the percentage of cells undergoing apoptosis. Histological examination revealed that the slow freezing group had a higher percentage of intact follicles (45.75%) compared to those submitted to vitrification (38.17%; P = 0.01). Mature follicles were more prone to degeneration, regardless of the group evaluated. However, when comparing the cryopreserved groups, mature follicles showed greater degeneration in slow freezing, while in vitrification, primary follicles were the most affected. The immunohistochemical evaluation indicated that 84.21% of the follicles evaluated in the slow freezing group did not express caspase-3, suggesting the absence of apoptosis. In contrast, the vitrified samples showed significantly more cells in apoptosis compared to the others (P <0.001). In conclusion, slow freezing was the one with the highest number of viable follicles compared to vitrification and proved to be the method of choice for cryopreserving canine ovarian tissue.

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE FOLICULAR PÓS-CRIOPRESERVAÇÃO TESTANDO: UM MÉTODO ALTERNATIVO DE CONGELAMENTO LENTO E HIPOTAURINA NO MEIO DE TRANSPORTE, DE TECIDO GONADAL DE GATAS

Esta pesquisa teve por justificativa ampliar os estudos acerca da criopreservação de tecido ovariano de gatas domésticas, juntamente com o uso de antioxidante no meio de transporte, podendo servir de modelo experimental para felinos selvagens. Objetivou-se validar um método de congelamento lento sem a utilização de máquina (Capítulo 2). E comparar os efeitos da criopreservação sobre diferentes métodos vitrificação e congelamento lento, com e sem a adição de antioxidante hipotaurina no meio de transporte, em diferentes tempos de exposição, dos ovários (Capítulo 3). Foram utilizados os ovários de 320 gatas domésticas, submetidas à ovariectomia eletiva. O tecido ovariano foi dissecado e cortado em fragmentos de tamanhos pré-determinados 7 mm × 3 mm × 3 mm (63 mm3). Os fragmentos cortados foram divididos aleatoriamente sendo que metade foi direcionado para a avaliação a fresco e outra metade para criopreservação pelos métodos lento e rápido. Para o congelamento lento utilizou-se meio de cultivo MEM (earle) sem glutamina, com bicarbonato de sódio e antibiótico acrescido de dimetil sulfóxido. A vitrificação foi realizada empregando dimetil sulfóxido (DMSO) e solução de DAP 123 (acetamida 1M, DMSO 2M e propilenoglicol 3M). Fez-se análise dos fragmentos teciduais por histomorfologia, imuno-histoquímica utilizando a caspase-3 clivada. Os resultados adquiridos demonstraram a eficiência do protocolo de congelação testado, de maneira que não houve diferença entre o congelamento testado e o automatizado (p<0,05). Para hipotaurina no meio de transporte notou-se sua eficiência quando utilizada na refrigeração por 24 horas e criopreservação pelo método vitrificação (p<0,05). Assim, concluímos que o método alternativo de congelamento lento é eficiente e a hipotaurina ajuda a preservar a viabilidade folicular quando há a necessidade de refrigeração e vitrificação do fragmento ovariano.

This research had as justification to expand the studies about the cryopreservation of ovarian tissue of domestic cats, together with the use of antioxidant in the means of transport, being able to serve as an experimental model for wild cats. The objective was to validate a slow freezing method without using a machine (Chapter 2). And to compare the effects of cryopreservation on different methods of vitrification and slow freezing, with and without the addition of antioxidant hypotaurin in the transport medium, at different exposure times, of the ovaries (Chapter 3). The ovaries of 320 domestic cats, submitted to elective ovariectomy, were used. The ovarian tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes 7 mm × 3 mm × 3 mm (63 mm3). The cut fragments were divided randomly, half of which was directed to fresh evaluation and the other half to cryopreservation by slow and fast methods. For slow freezing, MEM culture medium (earle) without glutamine, sodium bicarbonate and antibiotic plus dimethyl sulfoxide was used. Vitrification was performed using dimethyl sulfoxide (DMSO) and DAP 123 solution (1M acetamide, 2M DMSO and 3M propylene glycol). Tissue fragments were analyzed by histomorphology, immunohistochemistry using cleaved caspase-3. The ovaries of 320 domestic cats, submitted to elective ovariectomy, were used. The ovarian tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes 7 mm × 3 mm × 3 mm (63 mm3). The cut fragments were divided randomly, half of which was directed to fresh evaluation and the other half to cryopreservation by slow and fast methods. For slow freezing, MEM culture medium (earle) without glutamine, sodium bicarbonate and antibiotic plus dimethyl sulfoxide was used. Vitrification was performed using dimethyl sulfoxide (DMSO) and DAP 123 solution (1M acetamide, 2M DMSO and 3M propylene glycol). Tissue fragments were analyzed by histomorphology, immunohistochemistry using cleaved caspase-3. The acquired results demonstrated the efficiency of the tested freezing protocol, so that there was no difference between the tested and the automated freezing (p <0.05). For hypotaurin in the transport medium, its efficiency was noted when used in refrigeration for 24 hours and cryopreservation by the vitrification method (p <0.05). Thus, we conclude that the alternative method of slow freezing is efficient and the hypotaurin helps to preserve follicular viability when there is a need for refrigeration and vitrification of the ovarian fragment.

PERFIL DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS À QUALIDADE E IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES OVINOS CRIOPRESERVADOS POR DIFERENTES TÉCNICAS

A transferência de embriões frescos resulta em maior taxa de gestação comparada à transferência de embriões criopreservados, sugerindo comprometimento do estabelecimento da gestação após criopreservação. Este estudo objetivou avaliar o efeito da técnica de criopreservação (vitrificação ou congelação lenta) de embriões ovinos produzidos in vivo, na taxa de sobrevivência e perfil de expressão de genes relacionados à apoptose (BAX, BCL2), proliferação e diferenciação celular (TGFB1), respiração celular (NFR1), manutenção da pluripotência (NANOG) e implantação (CDX2). Trinta e duas ovelhas foram submetidas à superovulação e posterior coleta de embriões. Os embriões obtidos foram classificados quanto ao estágio de desenvolvimento e qualidade. Os embriões GI e GII foram uniformemente distribuídos dentro dos grupos experimentais: CONT) blastocistos frescos (n=15); CONG) congelação lenta (n=42); ou VIT) vitrificação (n=43). Os embriões CONT foram congelados a seco em três pools de cinco embriões, para posterior RT-qPCR. Os embriões CONG e VIT após descongelamento/aquecimento, respectivamente, foram alocados para análise de expressão gênica ou cultivo in vitro (24 e 48 h) em meio SOF com aminoácidos suplementado com 2,5% soro fetal bovino, a 38,5 °C e 5% CO2 (CONG: n=27; VIT: n=28). As taxas de sobrevivência de CONG e VIT foram, respectivamente, 29,6% (8/27) e 14,2% (4/28) em 24 h; e 48,1% (13/27) e 32,1% (9/28) em 48 h (P > 0,05). Independentemente da técnica de criopreservação, o gene CDX2 foi super expresso (P < 0,05) quando comparado ao CONT. A expressão dos genes BAX, BCL2, TGFB1 e CDX2 foi aumentada no grupo VIT (P < 0,05) quando comparados ao CONT. Contudo, quando as duas técnicas de criopreservação foram comparadas, apenas o gene BAX foi super expresso (P < 0,05) no VIT, em comparação com o CONG. Esses dados sugerem que o decréscimo de 16% (não-significativo) na taxa de sobrevivência, observado no grupo VIT, pode estar associado ao aumento na expressão do gene pró-apoptótico (BAX). Em conclusão, a técnica de vitrificação levou a um decréscimo de 16% (não significativo) na taxa de sobrevivência do embrião e aumento do gene pró-apoptótico.

Transfer of fresh sheep embryos have a higher pregnancy rate compared to cryopreserved embryos, suggesting that cryopreservation compromises embryonic signaling during implantation and establishment of pregnancy. This mechanism needs to be more clarified. Thus, this study aimed to evaluate the effect of the cryopreservation technique (vitrification or slow freezing) of sheep embryos produced in vivo on embryo survival rate and expression of genes related to apoptosis (BAX and BCL2), cellular differentiation and proliferation (TGFB1), cellular respiration (NFR1), maintenance of pluripotency (NANOG) and implantation (CDX2). Superovulation (n=32 ewes) was performed and embryos were transcervically collected. A total of 100 GI/II embryos was randomly allocated into three groups: 1) fresh blastocysts (CONT; n=15); 2) slow freezing (SF; n=42); or 3) vitrification (VT; n=43). After thawing/warming, three pools of five embryos per group were used for RT-qPCR; and other embryos were cultured in vitro (24 and 48 h) in SOF with aminoacids and 2.5% of fetal bovine serum medium at 38.5 °C and 5% CO2 (SF: n=27; VT: n=28). Embryonic survival rate of SF and VT were, respectively, 29.6% (8/27) and 14.2% (4/28) at 24 h; and 48.1% (13/27) and 32.1% (9/28) at 48 h (P > 0.05). Only the CDX2 gene was affected (up-regulated, P < 0.05) in both groups compared to CONT. The BAX gene was up-regulated in VT, compared to SF group. The VT increased (P < 0.05) the expression of all genes associated with embryonic quality and implantation, except for NANOG and NRF1, when compared to the CONT. In conclusion, the VT technique led to a decrease of 16% (non-significant) in embryo survival rate and increased pro-apoptotic gene expression.

Congelação de sêmen e tecidos de peixes brasileiros / Semen and tissues freezing in Brazilian fish

Neste trabalho é apresentada uma revisão dos principais procedimentos adotados para a conservação da viabilidade do sêmen de diferentes espécies de peixes, com ênfase nos peixes nativos do Brasil, bem como, destaca alguns dos principais avanços obtidos na congelação de embriões e tecidos de peixes.(AU)

This paper presents a review of the main procedures adopted for the conservation of the viability of semen from different fish species, with emphasis on native fish species from Brazil, and highlights some of the major advances obtained in freezing fish embryos and tissues.(AU)