Full confluency, serum starvation, and roscovitine for inducing arrest in the G0/G1 phase of the cell cycle in puma skin-derived fibroblast lines

The puma population is constantly decreasing, and cloning by somatic cell nuclear transfer can be used to conserve the species. One of the factors determining the success of the development of cloned embryos is the cell cycle stage of the donor cells. We evaluated the effects of full confluency (~100%), serum starvation (0.5% serum), and roscovitine (15 µM) treatments on the cell cycle synchronization in G0/G1 of puma skin-derived fibroblasts by flow cytometric analysis. Also, we assessed the effects of these synchronization methods on morphology, viability, and apoptosis levels using microscopy tools. The results showed that culturing the cells to confluence for 24 h (84.0%), 48 h (84.6%), and 72 h (84.2%) and serum starvation for 96 h (85.4%) yielded a significantly higher percentage of cells arrested in the G0/G1 (P < 0.05) phase than cells not subjected to any cell cycle synchronization method (73.9%). Nevertheless, while serum starvation reduced the percentage of viable cells, no difference was observed for the full confluence and roscovitine treatments (P > 0.05). Moreover, roscovitine for 12 h (78.6%) and 24 h (82.1%) was unable to synchronize cells in G0/G1 (P > 0.05). In summary, full confluency induces puma fibroblast cell cycle synchronization at the G0/G1 stage without affecting cell viability. These outcomes may be valuable for planning donor cells for somatic cell nuclear transfer in pumas.(AU)

Meta-analysis of melatonin treatment and porcine somatic cell nuclear transfer embryo development

Abstract Porcine somatic cell nuclear transfer (SCNT) plays an important role in many areas of research. However, the low efficiency of SCNT in porcine embryos limits its applications. Porcine embryos contain high concentrations of lipid, which makes them vulnerable to oxidative stress. Some studies have used melatonin to reduce reactive oxygen species damage. At present there are many reports concerning the effect of exogenous melatonin on porcine SCNT. Some studies suggest that the addition of melatonin can increase the number of blastocyst cells, while others indicate that melatonin can reduce the number of blastocyst cells. Therefore, a meta-analysis was carried out to resolve the contradiction. In this study, a total of 63 articles from the past 30 years were analyzed, and six papers were finally selected. Through the analysis, it was found that the blastocyst rate was increased by adding exogenous melatonin. Melatonin had no effect on cleavage rate or the number of blastocyst cells, but did decrease the number of apoptotic cells. This result is crucial for future research on embryo implantation.

Transgênese e clonagem adotadas como biotécnicas reprodutivas em pequenos ruminantes / Transgenesis and cloning as reproductive biotechniques in small ruminants

Ovinos e caprinos são espécies que devido ao seu tamanho adequado, curto período gestacional e produção leiteira, tornaram-se importantes modelos na pesquisa pecuária, farmacêutica e biomédica. Assim, a engenharia genética tem sido amplamente aplicada à pesquisa com pequenos ruminantes. Caprinos e ovinos modificados geneticamente fornecem modelos valiosos para pesquisa sobre as funções dos genes, melhorando a exploração, obtendo produtos farmacêuticos no leite e aumentando a resistência às doenças. Além disso, o uso conjunto da clonagem e transgênese já foi responsável por marcos importantes na biotecnologia animal. Esta revisão destaca os avanços da clonagem e da engenharia genética nessas espécies obtidos nas últimas quatro décadas, com ênfase nas pesquisas realizadas no Brasil.

Sheep and goats are valuable species that due to their suitable size, short pregnancy period, and secretion of milk, have become important model in agricultural, pharmaceutical, and biomedical research. Thus, genome engineering has been widely applied to sheep and goat research. Gene-edited sheep and goats provide valuable models for investigations on gene functions, improving animal breeding, producing pharmaceuticals in milk and improving disease resistance. Additionally, the joint use of cloning and transgenesis has already been responsible for major milestones in animal biotechnology. This review highlights the advances of cloning and genome engineering in these species over the past four decades with particular emphasis on research in Brazil.

Meta-analysis of melatonin treatment and porcine somatic cell nuclear transfer embryo development

Porcine somatic cell nuclear transfer (SCNT) plays an important role in many areas of research. However, the low efficiency of SCNT in porcine embryos limits its applications. Porcine embryos contain high concentrations of lipid, which makes them vulnerable to oxidative stress. Some studies have used melatonin to reduce reactive oxygen species damage. At present there are many reports concerning the effect of exogenous melatonin on porcine SCNT. Some studies suggest that the addition of melatonin can increase the number of blastocyst cells, while others indicate that melatonin can reduce the number of blastocyst cells. Therefore, a meta-analysis was carried out to resolve the contradiction. In this study, a total of 63 articles from the past 30 years were analyzed, and six papers were finally selected. Through the analysis, it was found that the blastocyst rate was increased by adding exogenous melatonin. Melatonin had no effect on cleavage rate or the number of blastocyst cells, but did decrease the number of apoptotic cells. This result is crucial for future research on embryo implantation.(AU)

Bancos de recursos somáticos: Como eles contribuem para a conservação de grandes felídeos? / Somatic resource bank: How they contribute to the conservation of large felines?

Distintas estratégias de conservação têm sido adotadas visando a manutenção e recuperação da biodiversidade, especialmente de espécies que se encontram em diferentes níveis de ameaça à extinção. Neste grupo de espécies, encontram-se os grandes felídeos, os quais em virtude das ações antrópicas, como a destruição e a fragmentação de habitat, necessitam de esforços voltados para a conservação de seu material genético. Uma estratégia empregada para essa finalidade consiste nos bancos de recursos somáticos, os quais são definidos como a criopreservação de tecidos e células somáticas oriundas de diferentes populações. Essas amostras biológicas, quando adequadamente conservadas, são elementoschave para a multiplicação das espécies por meio de seu emprego na clonagem por transferência nuclear e indução de células à pluripotência. Assim, o objetivo desta revisão é abordar os aspectos relevantes envolvidos na formação de bancos de recursos somáticos em grandes felídeos, destacando os estudos desenvolvidos pelo Laboratório de Biotecnologia Animal (LBA), da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA) em onças-pintadas e onças-pardas.

Different conservation strategies have been adopted to maintain and recover biodiversity, especially for species that are at different levels of threat to extinction. In this group of species are the large felids, which, due to anthropic actions, such as habitat destruction and fragmentation, require efforts aimed at the conservation of their genetic material. A strategy employed for this purpose consists of somatic resource banks, which are defined as the cryopreservation of tissues and somatic cells from different populations. These biological samples, when properly preserved, are key elements for the multiplication of species through their use in cloning by nuclear transfer and induction of cells to pluripotency. Thus, the aim of this review is to address the relevant aspects involved in the formation of somatic resource banks in large felids, highlighting the studies carried out by the Laboratory of Animal Biotechnology (LBA) of the Federal Rural University of the Semi-Arid (UFERSA) in jaguars and pumas.

Nellore cloned calf viability during the postnatal period / Viabilidade de bezerros nelores clonados durante o período pós natal imediato

This study evaluated the viability of Nellore cloned calves derived from somatic cell nuclear transfer (SCNT) and compare their viability with animals of the same breed derived from in vitro fertilization (IVF). Thus, two groups were formed. Group I (GI) consisted of 10 calves derived from SCNT and group II (GII) consisted of 10 calves derived from IVF. The differences detected between the groups were in the physical examination of the respiratory tract in GI, which represented the most common clinical-pathological disturbances. The Apgar index score indicated that 80% of GI animals were depressed and all had pale mucous membranes. Thus, anemia was reported in GI. In GII, this started at 12 h of life and was probably caused by an iron deficiency. Moreover, total calcium and ionized calcium levels were higher in GI immediately after birth. These alterations probably resulted in a high incidence of mortality in GI, reaching 90% of the calves, whereas mortality was only 20% for the calves in GII. In conclusion, cloned calves, which were derived from SCNT, had physiological and metabolic alterations after delivery, leading to a higher mortality rate during the perinatal period.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de bezerros da raça Nelore oriundos da técnica da transferência nuclear de células somáticas (TNCS), no período pós natal imediato, comparando-a com animais desta mesma raça, oriundos de fertilização in vitro (FIV). Para tanto, os animais foram alocados em dois grupos, a saber: Grupo I (GI) - 10 animais frutos de TNCS; e, Grupo II (GII) - 10 animais oriundos de FIV. Nos respectivos bezerros, todos obtidos por cesariana, foram realizadas as avaliações físicas, escore de APGAR, bem como coleta de amostras de sangue nos momentos 0 (ao nascimento), às 2, 4, 6 e 12 horas de vida, a fim de avaliar os resultados de eritrograma, análises bioquímicas e hormonais, comparando-os entre os grupos e momentos. Nos animais que vieram a óbito foi realizada a necropsia para investigar a causa mortis. As diferenças observadas foram em relação aos achados clínico-patológicos, envolvendo, principalmente, o sistema respiratório caracterizado por bradpneia associada à dispneia, e a presença de edema e atelectasia pulmonar observadas no GI. Ademais, após a colostragem notou-se que 80% dos animais avaliados não foram capazes de manter a glicemia sendo mais evidentes nos animais do GII, possivelmente devido à hiperinsulinemia que se manifestou neste grupo ao longo de todo o período experimental. ...(AU)

Transferência Nuclear de Células Somáticas interespecífica (TNCSi) na conservação de cervídeos em risco de extinção / Interspecific Somatic Cell Nuclear Transfer (TNCSi) in the conservation of endangered species of deer

A Transferência Nuclear de Células Somáticas interespecífica (TNCSi) envolve a transferência de um núcleo ou célula de uma espécie para o citoplasma de um oócito enucleado de outra espécie. Após ativação, os complexos carioplasto-citoplasto reconstruídos podem ser cultivados in vitro até o blastocisto, o estádio final de desenvolvimento pré-implantação. Esta pode ser uma estratégia interessante na tentativa de conservação de espécies em risco de extinção. Esta revisão tem por objetivo apresentar alguns detalhes da técnica e relatar a experiência de nosso grupo usando como modelo o veado-catingueiro.(AU)

Interspecies Somatic Cell Nuclear Transfer (iSCNT) involves the transfer of a nucleus or cell from one species into the cytoplasm of an enucleated oocyte from another. Once activated, reconstructed caryoplast-cytoplast complexes can be cultured in vitro to blastocyst, the final stage of preimplantation development. This may be an interesting strategy in attempting to conserve endangered species. The objective of this review is to present some details of the technique and to report the experience of our group using as model the brown brocket deer.(AU)

Transferência Nuclear de Células Somáticas interespecífica (TNCSi) na conservação de cervídeos em risco de extinção / Interspecific Somatic Cell Nuclear Transfer (TNCSi) in the conservation of endangered species of deer

A Transferência Nuclear de Células Somáticas interespecífica (TNCSi) envolve a transferência de um núcleo ou célula de uma espécie para o citoplasma de um oócito enucleado de outra espécie. Após ativação, os complexos carioplasto-citoplasto reconstruídos podem ser cultivados in vitro até o blastocisto, o estádio final de desenvolvimento pré-implantação. Esta pode ser uma estratégia interessante na tentativa de conservação de espécies em risco de extinção. Esta revisão tem por objetivo apresentar alguns detalhes da técnica e relatar a experiência de nosso grupo usando como modelo o veado-catingueiro.

Interspecies Somatic Cell Nuclear Transfer (iSCNT) involves the transfer of a nucleus or cell from one species into the cytoplasm of an enucleated oocyte from another. Once activated, reconstructed caryoplast-cytoplast complexes can be cultured in vitro to blastocyst, the final stage of preimplantation development. This may be an interesting strategy in attempting to conserve endangered species. The objective of this review is to present some details of the technique and to report the experience of our group using as model the brown brocket deer.

Estabelecimento de linhagens celulares em felídeos silvestres Uma revisão dos efeitos das condições de cultivo e criopreservação sobre a qualidade celular / Establishment of cell lines in wild felids A review of the effects of culture and cryopreservation conditions on cell quality

Linhagens celulares, principalmente fibroblastos derivados da pele, podem ser ferramentas interessantes para a conservação e multiplicação de felídeos silvestres ameaçados de extinção. Esses animais em virtude de seu quantitativo reduzido têm nos bancos de células somáticas uma alternativa para a conservação de material biológico derivado de pequenas populações, garantindo assim o armazenamento da diversidade genética de diferentes grupos de indivíduos. Isso porque tais linhagens, quando apropriadamente estabelecidas por meio das técnicas de cultivo in vitro e criopreservação, permitem seu emprego na obtenção de embriões por clonagem por transferência nuclear de célula somática e produção de células induzidas à pluripotência. Assim, uma das etapas essenciais para o uso dessas linhagens de maneira eficiente consiste na avaliação dos efeitos das condições de cultivo in vitro e criopreservação das células, visando reconhecer os danos gerados pelas manipulações e identificar os ajustes necessários aos protocolos empregados. Portanto, o objetivo desta revisão consiste em reunir e explorar informações úteis sobre as condições de cultivo in vitro e criopreservação de células derivadas de felídeos silvestres, visando o estabelecimento de linhagens celulares na conservação e multiplicação destas espécies.(AU)

Cell lines, mainly fibroblasts derived from the skin, can be interesting tools for the conservation and multiplication of endangered wild felids. These animals, due to their reduced quantity, have somatic cell banks as an alternative for the conservation of biological material derived from small populations, thus guaranteeing the storage of the genetic diversity of different groups of individuals. This is because such lines, when properly established through in vitro culture and cryopreservation techniques, allow their use in obtaining embryos by cloning by somatic cell nuclear transfer and production of cells induced to pluripotency. Thus, one of the essential steps for the use of these lines in an efficient way consists of the evaluation of the effects of the conditions of in vitro culture and cryopreservation of the cells, aiming to recognize the damages generated by the manipulations and to identify the necessary adjustments to the employed protocols. Therefore, the aim of this review is to gather and explore useful information about in vitro culture and cryopreservation conditions of cells derived from wild felids, aiming at the establishment of cell lines in the conservation and multiplication of these species.(AU)

Estabelecimento de linhagens celulares em felídeos silvestres – Uma revisão dos efeitos das condições de cultivo e criopreservação sobre a qualidade celular / Establishment of cell lines in wild felids – A review of the effects of culture and cryopreservation conditions on cell quality

Linhagens celulares, principalmente fibroblastos derivados da pele, podem ser ferramentas interessantes para a conservação e multiplicação de felídeos silvestres ameaçados de extinção. Esses animais em virtude de seu quantitativo reduzido têm nos bancos de células somáticas uma alternativa para a conservação de material biológico derivado de pequenas populações, garantindo assim o armazenamento da diversidade genética de diferentes grupos de indivíduos. Isso porque tais linhagens, quando apropriadamente estabelecidas por meio das técnicas de cultivo in vitro e criopreservação, permitem seu emprego na obtenção de embriões por clonagem por transferência nuclear de célula somática e produção de células induzidas à pluripotência. Assim, uma das etapas essenciais para o uso dessas linhagens de maneira eficiente consiste na avaliação dos efeitos das condições de cultivo in vitro e criopreservação das células, visando reconhecer os danos gerados pelas manipulações e identificar os ajustes necessários aos protocolos empregados. Portanto, o objetivo desta revisão consiste em reunir e explorar informações úteis sobre as condições de cultivo in vitro e criopreservação de células derivadas de felídeos silvestres, visando o estabelecimento de linhagens celulares na conservação e multiplicação destas espécies.

Cell lines, mainly fibroblasts derived from the skin, can be interesting tools for the conservation and multiplication of endangered wild felids. These animals, due to their reduced quantity, have somatic cell banks as an alternative for the conservation of biological material derived from small populations, thus guaranteeing the storage of the genetic diversity of different groups of individuals. This is because such lines, when properly established through in vitro culture and cryopreservation techniques, allow their use in obtaining embryos by cloning by somatic cell nuclear transfer and production of cells induced to pluripotency. Thus, one of the essential steps for the use of these lines in an efficient way consists of the evaluation of the effects of the conditions of in vitro culture and cryopreservation of the cells, aiming to recognize the damages generated by the manipulations and to identify the necessary adjustments to the employed protocols. Therefore, the aim of this review is to gather and explore useful information about in vitro culture and cryopreservation conditions of cells derived from wild felids, aiming at the establishment of cell lines in the conservation and multiplication of these species.

Epigenetic characterization of the H19/IGF2 locus in calf clones placenta / Caracterização epigenética do locus H19/IGF2 na placenta de bezerros clones

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)

A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)

Epigenetic characterization of the H19/IGF2 locus in calf clones placenta / Caracterização epigenética do locus H19/IGF2 na placenta de bezerros clones

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)

A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)

Pathological features of cloned calves that died in the neonatal period / Aspectos patológicos de bezerros clonados com óbito no período neonatal

Somatic-cell nuclear transfer is a cloning technique that enables the creation of a viable embryo from a donor adult to produce a genetically identical individual. This technique opens numerous potential possibilities for medicine and animal reproduction. However, several reports have documented cloning-related issues. Embryo and fetal losses remain significantly higher than in other techniques, and there is a high incidence of dystocia and hydrops, which decreases efficiency and increases costs. Animals delivered at term often exhibit a syndrome known as macrosomia and experience difficulties in adapting to life outside the uterus, and death is a common outcome. In the present study, 41 cloned calves that died in the neonatal period were subjected to gross and histopathological examination. Most important gross lesions were found in the liver (enlargement, congestion, yellowish color), kidneys (brownish color at surface and cut, and cysts), lungs (atelectasis, parenchymal consolidation, and secretions in bronchi and bronchioles), and heart (concentric and eccentric hypertrophy, hematic cysts, persistence of ductus arteriosus). Primary microscopic findings were seen in the liver, kidneys, and lungs from neonatal calves. In the liver, 85% of the animals exhibited hepatic degeneration. The presence of a brownish pigment within the cortical tubules of the kidneys was found in approximately 90% of the samples; the presence of this pigment has not been previously reported in cloned calves. In the lungs, a large number of animals exhibiting lesions characteristic of pneumonia (55%). These changes were the pivotal causes of death, mainly due to problems in adapting to life outside the uterus and opportunistic infections in the neonatal period. Further investigation focusing on pathological anatomical changes is necessary to map these abnormalities in cloned animals.(AU)

A transferência nuclear de células somáticas ou clonagem é uma técnica que permite produzir um indivíduo geneticamente igual a um outro indivíduo adulto. Esta técnica abre inúmeras possibilidades para a medicina e para a reprodução animal. Porém, existem inúmeros relatos de problemas associados à clonagem. A taxa de perda nos períodos embrionário e fetal ainda é muito alta quando comparada a outras biotécnicas; além disso, há uma maior incidência de hidropsias e distocias, diminuindo a eficiência e aumentando o custo da técnica. Os animais que vem a termo frequentemente apresentam uma síndrome chamada de macrossomia, e apresentam dificuldades de adaptação à vida extrauterina e, por isso, o óbito é um desfecho comum. No presente trabalho realizou-se necropsia e coleta de fragmentos de órgãos para avaliação histopatológica de 41 bezerros com óbito neonatal. As lesões macroscópicas mais importantes foram encontradas no fígado (hepatomegalia, congestão e coloração amarelada), rins (coloração amarronzada na superfície e ao corte, e cistos), pulmões (atelectasia, parênquima consolidado, e secreções nos brônquios e bronquíolos), e coração (hipertrofia concêntrica e excêntrica, cistos hemáticos e persistência de ducto arterioso). As principais alterações microscópicas observadas foram presença de pigmento acastanhado no interior dos túbulos corticais renais (aproximadamente 90% dos animais), degeneração hepática (85% das amostras avaliadas) e lesões características de pneumonia (55% dos animais). A pigmentação acastanhada no interior dos túbulos corticais é uma alteração que ainda não havia sido relatada anteriormente em animais clonados. As alterações observadas nestes órgãos foram determinantes para o óbito, e devem ter ocorrido sobretudo devido a problemas na adaptação ao ambiente extrauterino e em decorrência de infecções adquiridas no período neonatal. Os achados encontrados no presente trabalho denotam a necessidade de investigação anatomopatológica detalhada de animais clonados inviáveis, na tentativa de mapear as anormalidades apresentadas por eles.(AU)

Pathological features of cloned calves that died in the neonatal period / Aspectos patológicos de bezerros clonados com óbito no período neonatal

Somatic-cell nuclear transfer is a cloning technique that enables the creation of a viable embryo from a donor adult to produce a genetically identical individual. This technique opens numerous potential possibilities for medicine and animal reproduction. However, several reports have documented cloning-related issues. Embryo and fetal losses remain significantly higher than in other techniques, and there is a high incidence of dystocia and hydrops, which decreases efficiency and increases costs. Animals delivered at term often exhibit a syndrome known as macrosomia and experience difficulties in adapting to life outside the uterus, and death is a common outcome. In the present study, 41 cloned calves that died in the neonatal period were subjected to gross and histopathological examination. Most important gross lesions were found in the liver (enlargement, congestion, yellowish color), kidneys (brownish color at surface and cut, and cysts), lungs (atelectasis, parenchymal consolidation, and secretions in bronchi and bronchioles), and heart (concentric and eccentric hypertrophy, hematic cysts, persistence of ductus arteriosus). Primary microscopic findings were seen in the liver, kidneys, and lungs from neonatal calves. In the liver, 85% of the animals exhibited hepatic degeneration. The presence of a brownish pigment within the cortical tubules of the kidneys was found in approximately 90% of the samples; the presence of this pigment has not been previously reported in cloned calves. In the lungs, a large number of animals exhibiting lesions characteristic of pneumonia (55%). These changes were the pivotal causes of death, mainly due to problems in adapting to life outside the uterus and opportunistic infections in the neonatal period. Further investigation focusing on pathological anatomical changes is necessary to map these abnormalities in cloned animals.(AU)

A transferência nuclear de células somáticas ou clonagem é uma técnica que permite produzir um indivíduo geneticamente igual a um outro indivíduo adulto. Esta técnica abre inúmeras possibilidades para a medicina e para a reprodução animal. Porém, existem inúmeros relatos de problemas associados à clonagem. A taxa de perda nos períodos embrionário e fetal ainda é muito alta quando comparada a outras biotécnicas; além disso, há uma maior incidência de hidropsias e distocias, diminuindo a eficiência e aumentando o custo da técnica. Os animais que vem a termo frequentemente apresentam uma síndrome chamada de macrossomia, e apresentam dificuldades de adaptação à vida extrauterina e, por isso, o óbito é um desfecho comum. No presente trabalho realizou-se necropsia e coleta de fragmentos de órgãos para avaliação histopatológica de 41 bezerros com óbito neonatal. As lesões macroscópicas mais importantes foram encontradas no fígado (hepatomegalia, congestão e coloração amarelada), rins (coloração amarronzada na superfície e ao corte, e cistos), pulmões (atelectasia, parênquima consolidado, e secreções nos brônquios e bronquíolos), e coração (hipertrofia concêntrica e excêntrica, cistos hemáticos e persistência de ducto arterioso). As principais alterações microscópicas observadas foram presença de pigmento acastanhado no interior dos túbulos corticais renais (aproximadamente 90% dos animais), degeneração hepática (85% das amostras avaliadas) e lesões características de pneumonia (55% dos animais). A pigmentação acastanhada no interior dos túbulos corticais é uma alteração que ainda não havia sido relatada anteriormente em animais clonados. As alterações observadas nestes órgãos foram determinantes para o óbito, e devem ter ocorrido sobretudo devido a problemas na adaptação ao ambiente extrauterino e em decorrência de infecções adquiridas no período neonatal. Os achados encontrados no presente trabalho denotam a necessidade de investigação anatomopatológica detalhada de animais clonados inviáveis, na tentativa de mapear as anormalidades apresentadas por eles.(AU)

Uso da clonagem por transferência nuclear na conservação e multiplicação de mamíferos silvestres / Use of cloning by nuclear transfer in the conservation and multiplication of wild mammals

A clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) desempenha um importante papel na conservação e na multiplicação de mamíferos silvestres, especialmente quando associada à TNCS interespecífica. Contudo, a clonagem ainda possui uma baixa eficiência, sendo necessária uma extensa busca por elucidações mais precisas das metodologias empregadas em suas etapas de preparo do carioplastos (células doadoras de núcleo), obtenção dos citoplastos (oócitos receptores), e reconstrução embrionária. Assim, o objetivo desta revisão é abordar os aspectos relevantes das etapas da clonagem aplicadas a mamíferos silvestres, descrevendo seus resultados promissores e avanços alcançados.(AU)

Cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) plays an important role in the conservation and multiplication of wild mammals, especially when associated with interspecific SCNT. Nevertheless, cloning still has a low efficiency, requiring an extensive search for more precise elucidations of the methodologies used in its stages of preparation of the karyoplasts (nucleus donor cells), production of cytoplasts (receptor oocytes), and embryonic reconstruction. Thus, the purpose of this review is to address the relevant aspects of the cloning steps applied to wild mammals, describing their promising results and advances.(AU)

Uso da clonagem por transferência nuclear na conservação e multiplicação de mamíferos silvestres / Use of cloning by nuclear transfer in the conservation and multiplication of wild mammals

A clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) desempenha um importante papel na conservação e na multiplicação de mamíferos silvestres, especialmente quando associada à TNCS interespecífica. Contudo, a clonagem ainda possui uma baixa eficiência, sendo necessária uma extensa busca por elucidações mais precisas das metodologias empregadas em suas etapas de preparo do carioplastos (células doadoras de núcleo), obtenção dos citoplastos (oócitos receptores), e reconstrução embrionária. Assim, o objetivo desta revisão é abordar os aspectos relevantes das etapas da clonagem aplicadas a mamíferos silvestres, descrevendo seus resultados promissores e avanços alcançados.

Cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) plays an important role in the conservation and multiplication of wild mammals, especially when associated with interspecific SCNT. Nevertheless, cloning still has a low efficiency, requiring an extensive search for more precise elucidations of the methodologies used in its stages of preparation of the karyoplasts (nucleus donor cells), production of cytoplasts (receptor oocytes), and embryonic reconstruction. Thus, the purpose of this review is to address the relevant aspects of the cloning steps applied to wild mammals, describing their promising results and advances.

New tools for cell reprogramming and conversion: Possible applications to livestock

Somatic cell nuclear transfer and iPS are both forms of radical cell reprogramming able to transform a fully differentiated cell type into a totipotent or pluripotent cell. Both processes, however, are hampered by low efficiency and, in the case of iPS, the application to livestock species is uncertain. Epigenetic manipulation has recently emerged as an efficient and robust alternative method for cell reprogramming. It is based upon the use of small molecules that are able to modify the levels of DNA methylation with 5-azacitidyne as one of the most widely used. Among a number of advantages, it includes the fact that it can be applied to domestic species including pig, dog and cat. Treated cells undergo a widespread demethylation which is followed by a renewed methylation pattern induced by specific chemical stimuli that lead to the desired phenotype. A detailed study of the mechanisms of epigenetic manipulation revealed that cell plasticity is achieved through the combined action of a reduced DNA methyl transferase activity with an active demethylation driven by the TET protein family. Surprisingly the same combination of molecular processes leads to the transformation of fibroblasts into iPS and regulate the epigenetic changes that take place during early development and, hence, during reprogramming following SCNT. Finally, it has recently emerged that mechanic stimuli in the form of a 3D cell rearrangement can significantly enhance the efficiency of epigenetic reprogramming as well as of maintenance of pluripotency. Interestingly these mechanic stimuli act on the same mechanisms both in epigenetic cell conversion with 5-Aza-CR and in iPS. We suggest that the balanced combination of epigenetic erasing, 3D cell rearrangement and chemical induction can go a long way to obtain ad hoc cell types that can fully exploit the current exiting development brought by gene editing and animal cloning in livestock production.

New tools for cell reprogramming and conversion: Possible applications to livestock

Somatic cell nuclear transfer and iPS are both forms of radical cell reprogramming able to transform a fully differentiated cell type into a totipotent or pluripotent cell. Both processes, however, are hampered by low efficiency and, in the case of iPS, the application to livestock species is uncertain. Epigenetic manipulation has recently emerged as an efficient and robust alternative method for cell reprogramming. It is based upon the use of small molecules that are able to modify the levels of DNA methylation with 5-azacitidyne as one of the most widely used. Among a number of advantages, it includes the fact that it can be applied to domestic species including pig, dog and cat. Treated cells undergo a widespread demethylation which is followed by a renewed methylation pattern induced by specific chemical stimuli that lead to the desired phenotype. A detailed study of the mechanisms of epigenetic manipulation revealed that cell plasticity is achieved through the combined action of a reduced DNA methyl transferase activity with an active demethylation driven by the TET protein family. Surprisingly the same combination of molecular processes leads to the transformation of fibroblasts into iPS and regulate the epigenetic changes that take place during early development and, hence, during reprogramming following SCNT. Finally, it has recently emerged that mechanic stimuli in the form of a 3D cell rearrangement can significantly enhance the efficiency of epigenetic reprogramming as well as of maintenance of pluripotency. Interestingly these mechanic stimuli act on the same mechanisms both in epigenetic cell conversion with 5-Aza-CR and in iPS. We suggest that the balanced combination of epigenetic erasing, 3D cell rearrangement and chemical induction can go a long way to obtain ad hoc cell types that can fully exploit the current exiting development brought by gene editing and animal cloning in livestock production.(AU)

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.(AU)

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.(AU)

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.