Utilização de células-tronco autólogas de medula óssea na regeneração do nervo tibial de coelhos mediante técnica de tubulização com prótese de silicone

This study presents an experimental model of an acute deffect in a peripheral nerve to evaluate neural regeneration using a tubulization technique associated with the inoculation of autologous stem cells from bone marrow. A total of 12 New Zealand white rabbits underwent a bilateral dissection of the tibial nerve followed by repair with silicone tubulization. On the left tibial nerve of all animals, the tube was filled with autologous bone marrow-derived stem cells collected from the humerus. For control, using the same repair technique, the tubes were filled with a NaCl solution in the right tibial nerve. After 30 days of observation, the animals were euthanized and a histological evaluation of the collected nerve segments was performed by staining with hematoxylin-eosin, luxol fast blue, and toluidine blue. From the results it is possible to conclude that the transplanted autologous stem cells associated with the tubulization technique present an advantage in the peripheral nerve regeneration process.

Neste estudo é apresentado um modelo experimental de defeito agudo em nervo periférico para avaliação da regeneração nervosa mediante técnica de tubulização associada à inoculação de células-tronco autólogas de medula óssea. Foram utilizados 12 coelhos Nova Zelândia albinos, submetidos à secção bilateral e ao afastamento de 5mm do nervo tibial e posterior reparo mediante utilização de câmara de silicone. Internamente à prótese de tubulização do nervo tibial esquerdo em todos os animais, foram inoculadas células-tronco autólogas de medula óssea, coletadas a partir do úmero. Como grupo controle (nervo tibial direito), mediante aplicação da mesma técnica de reparo, solução de NaCl 0,9% foi administrada internamente à prótese. Após 30 dias de observação, os animais foram eutanasiados e foi realizada a avaliação histológica dos segmentos nervosos por meio das colorações de hematoxilina-eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Com os resultados, foi possível concluir que o transplante de células-tronco autólogas associado à técnica de tubulização apresenta vantagens no processo de regeneração nervosa periférica.

Utilização de células-tronco autólogas de medula óssea na regeneração do nervo tibial de coelhos mediante técnica de tubulização com prótese de silicone

This study presents an experimental model of an acute deffect in a peripheral nerve to evaluate neural regeneration using a tubulization technique associated with the inoculation of autologous stem cells from bone marrow. A total of 12 New Zealand white rabbits underwent a bilateral dissection of the tibial nerve followed by repair with silicone tubulization. On the left tibial nerve of all animals, the tube was filled with autologous bone marrow-derived stem cells collected from the humerus. For control, using the same repair technique, the tubes were filled with a NaCl solution in the right tibial nerve. After 30 days of observation, the animals were euthanized and a histological evaluation of the collected nerve segments was performed by staining with hematoxylin-eosin, luxol fast blue, and toluidine blue. From the results it is possible to conclude that the transplanted autologous stem cells associated with the tubulization technique present an advantage in the peripheral nerve regeneration process.

Neste estudo é apresentado um modelo experimental de defeito agudo em nervo periférico para avaliação da regeneração nervosa mediante técnica de tubulização associada à inoculação de células-tronco autólogas de medula óssea. Foram utilizados 12 coelhos Nova Zelândia albinos, submetidos à secção bilateral e ao afastamento de 5mm do nervo tibial e posterior reparo mediante utilização de câmara de silicone. Internamente à prótese de tubulização do nervo tibial esquerdo em todos os animais, foram inoculadas células-tronco autólogas de medula óssea, coletadas a partir do úmero. Como grupo controle (nervo tibial direito), mediante aplicação da mesma técnica de reparo, solução de NaCl 0,9% foi administrada internamente à prótese. Após 30 dias de observação, os animais foram eutanasiados e foi realizada a avaliação histológica dos segmentos nervosos por meio das colorações de hematoxilina-eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Com os resultados, foi possível concluir que o transplante de células-tronco autólogas associado à técnica de tubulização apresenta vantagens no processo de regeneração nervosa periférica.

Implante de tubo de silicone com e sem colágeno na regeneração de nervos em eqüinos

Surgical nerve repair in humans, dogs and laboratory animals is widely utilized for important clinical and experimental purposes. However, in horses there is scarce information. Neuroma and excessive conjunctive proliferation are reported. The aim of the present study was to add information about the repair process utilizing implant of silicone tubes with or without collagen in nerve regeneration of horses. Eight horses were allocated in two groups: GI-13 weeks and GII-26 weeks of observation. A complete section of the ulnar nerves (UNs) and of the lateral cutaneous branch of the 17th thoracic nerves (TNs), bilaterally, was followed by repair with silicone tubes alternately filled with (STC) or without collagen (ST), with a 5mm gap between stumps. Clinical evaluation was performed weekly, by cutaneous sensitivity testing of the region innervated by the respective operated nerves and physical examination of the thoracic limbs. No alterations were found in the locomotor apparatus. The first positive reactions to the cutaneous test occurred at the 9th week post-surgery. At the end of the observation period it was verified, grossly, that the nerves were involved by conjunctive tissue and the lumen of the tube was filled by a whitish tissue, in a cylindrical shape. The ends nerves were interconnected. Microscopically, myelinated axons and Schwann cells were present in the gap between the stumps. In the GII the number of myelinated fibers was greater. The distal nerve showed remyelination process. There was no presence of neuroma and the inflammatory process was limited to the perineural areas. It was concluded that the implant of silicone tubes results in regeneration of UNs and TNs of horses without formation of neuromas and that de addition of collagen promotes an increase in the number of myelinated fibers.

A reconstituição cirúrgica de nervos em humanos, em cães e em diversos animais de laboratório é bastante utilizada e tem indicações clínicas e experimentais importantes. No entanto, em eqüinos há poucas informações sobre esta prática. Há relatos sobre a excessiva proliferação de tecido conjuntivo e a formação de neuromas à neurorrafia experimental, mesmo quando se utilizam tubos de silicone para condução do crescimento axonal. O presente estudo teve o objetivo de acrescentar informações sobre o processo de reparação de nervos periféricos em eqüinos por meio de implante de tubo de silicone preenchido ou não com colágeno. Para tanto, foram utilizados oito eqüinos, alocados em dois grupos: GI-13 semanas e GII-26 semanas de observação. Foi realizada secção dos nervos ulnares (NUs) e dos ramos cutâneos laterais dos 17° nervos torácicos (NTs), bilateralmente, seguindo tubulização, realizada em cada animal, alternando-se tubos de silicone vazios (TS), em um dos antímeros, ou preenchidos com solução de colágeno (TSC), no contralateral, deixando-se um espaço de 5mm entre os cotos. Nenhuma alteração foi encontrada ao exame do aparelho locomotor e as primeiras reações positivas ao teste de sensibilidade cutânea nos NUs e NTs com TS e TSC foram observadas a partir da 9ª semana, em ambos os grupos. Ao final do período de observação, verificou-se, macroscopicamente, que os nervos encontravam-se envolvidos por tecido conjuntivo e o interior da câmara estava preenchido por tecido de coloração esbranquiçada, de forma cilíndrica, interligando os cotos proximal e distal. Microscopicamente, constatou-se a presença de axônios mielinizados interligando os cotos, as células de Schwann e o processo de remielinização do coto distal, principalmente no TSC. Em ambos os grupos, não houve formação de neuromas e o processo inflamatório limitou-se às áreas perineurais. Concluiu-se que o implante de tubo de silicone conduz à regeneração de NUs e NTs de eqüinos sem formação de neuromas e que a adição de colágeno promove aumento do número de fibras mielinizadas.

Implante de tubo de silicone com e sem colágeno na regeneração de nervos em eqüinos

Surgical nerve repair in humans, dogs and laboratory animals is widely utilized for important clinical and experimental purposes. However, in horses there is scarce information. Neuroma and excessive conjunctive proliferation are reported. The aim of the present study was to add information about the repair process utilizing implant of silicone tubes with or without collagen in nerve regeneration of horses. Eight horses were allocated in two groups: GI-13 weeks and GII-26 weeks of observation. A complete section of the ulnar nerves (UNs) and of the lateral cutaneous branch of the 17th thoracic nerves (TNs), bilaterally, was followed by repair with silicone tubes alternately filled with (STC) or without collagen (ST), with a 5mm gap between stumps. Clinical evaluation was performed weekly, by cutaneous sensitivity testing of the region innervated by the respective operated nerves and physical examination of the thoracic limbs. No alterations were found in the locomotor apparatus. The first positive reactions to the cutaneous test occurred at the 9th week post-surgery. At the end of the observation period it was verified, grossly, that the nerves were involved by conjunctive tissue and the lumen of the tube was filled by a whitish tissue, in a cylindrical shape. The ends nerves were interconnected. Microscopically, myelinated axons and Schwann cells were present in the gap between the stumps. In the GII the number of myelinated fibers was greater. The distal nerve showed remyelination process. There was no presence of neuroma and the inflammatory process was limited to the perineural areas. It was concluded that the implant of silicone tubes results in regeneration of UNs and TNs of horses without formation of neuromas and that de addition of collagen promotes an increase in the number of myelinated fibers.

A reconstituição cirúrgica de nervos em humanos, em cães e em diversos animais de laboratório é bastante utilizada e tem indicações clínicas e experimentais importantes. No entanto, em eqüinos há poucas informações sobre esta prática. Há relatos sobre a excessiva proliferação de tecido conjuntivo e a formação de neuromas à neurorrafia experimental, mesmo quando se utilizam tubos de silicone para condução do crescimento axonal. O presente estudo teve o objetivo de acrescentar informações sobre o processo de reparação de nervos periféricos em eqüinos por meio de implante de tubo de silicone preenchido ou não com colágeno. Para tanto, foram utilizados oito eqüinos, alocados em dois grupos: GI-13 semanas e GII-26 semanas de observação. Foi realizada secção dos nervos ulnares (NUs) e dos ramos cutâneos laterais dos 17° nervos torácicos (NTs), bilateralmente, seguindo tubulização, realizada em cada animal, alternando-se tubos de silicone vazios (TS), em um dos antímeros, ou preenchidos com solução de colágeno (TSC), no contralateral, deixando-se um espaço de 5mm entre os cotos. Nenhuma alteração foi encontrada ao exame do aparelho locomotor e as primeiras reações positivas ao teste de sensibilidade cutânea nos NUs e NTs com TS e TSC foram observadas a partir da 9ª semana, em ambos os grupos. Ao final do período de observação, verificou-se, macroscopicamente, que os nervos encontravam-se envolvidos por tecido conjuntivo e o interior da câmara estava preenchido por tecido de coloração esbranquiçada, de forma cilíndrica, interligando os cotos proximal e distal. Microscopicamente, constatou-se a presença de axônios mielinizados interligando os cotos, as células de Schwann e o processo de remielinização do coto distal, principalmente no TSC. Em ambos os grupos, não houve formação de neuromas e o processo inflamatório limitou-se às áreas perineurais. Concluiu-se que o implante de tubo de silicone conduz à regeneração de NUs e NTs de eqüinos sem formação de neuromas e que a adição de colágeno promove aumento do número de fibras mielinizadas.

Autologous mononuclear bone marrow cells in the regeneration of tibial nerve of rabbits submitted to neurectomy: morphofunctional aspects / Células mononucleares autólogas de medula óssea na regeneração do nervo tibial de coelhos submetidos à neurectomia: aspectos morfofuncionais

The functional recovery after peripheral nerve injury is the main goal of therapeutic intervention. Therefore the aim of this study was to clinically evaluate functional recovery in rabbits after neurectomy and treatment with bone marrow mononuclear cells associated with the tubulization technique. For this, 24 New Zealand rabbits, were used. They were divided into two groups with 12 animals each, mononuclear cell group (MCG) and saline group (SSG). The rabbits underwent right tibial nerve section and repair by the tubulization technique using silicone hollow tube, which received 0.1 ml of autologous mononuclear bone marrow cells (2 x 106 cells ) in the MCG and of saline solution in the SSG, in order to compare the evolution of functional recovery of the operated limbs. Gait and planimetry were performed. Planimetry of the pelvic limb footprint printed on paper with water-based ink applied to the plantar area, before (M0) and after 7 (M7), 15 (M15), 30 (M30), 45 (M45) and 60 (M60) days after surgery. The results showed no functional recovery of the tibial nerve in both groups, without differences between them in different times and among times within groups, except when compared to M0.

A recuperação funcional de nervos periféricos após lesão é o principal objetivo da intervenção terapêutica. Por isso o objetivo deste estudo foi avaliar clinicamente a recuperação funcional de coelhos após neurectomia e tratamento com células mononucleares de medula óssea associada à técnica de tubulização. Foram utilizados para isto, 24 coelhos da raça Nova Zelândia, alocados em dois grupos com 12 animais cada, denominados grupo célula mononuclear (GCM) e grupo solução salina (GSS). Os coelhos foram submetidos à secção do nervo tibial direito e reparação por meio da técnica de tubulização utilizando tubo oco de silicone, para então, receberem no interior do tubo, 0,1mL de suspensão de células mononucleares autólogas de medula óssea (2 x 106 células) no GCM e solução salina no GSS, para comparação da evolução da recuperação funcional dos membros operados. Foram realizadas avaliações da marcha e planimetria da pegada do membro pélvico impressa em papel a partir de tinta à base dágua aplicada à área plantar, antes (M0) e após o 7º (M7), 15º (M15), 30º (M30), 45º (M45) e 60º (M60) dias do procedimento cirúrgico. Os resultados mostraram que não houve a recuperação funcional do nervo tibial em ambos os grupos, sem diferença entre eles nos diferentes momentos e entre os momentos dentre dos grupos, exceto quando comparado com M0.

Autologous mononuclear bone marrow cells in the regeneration of tibial nerve of rabbits submitted to neurectomy: morphofunctional aspects / Células mononucleares autólogas de medula óssea na regeneração do nervo tibial de coelhos submetidos à neurectomia: aspectos morfofuncionais

The functional recovery after peripheral nerve injury is the main goal of therapeutic intervention. Therefore the aim of this study was to clinically evaluate functional recovery in rabbits after neurectomy and treatment with bone marrow mononuclear cells associated with the tubulization technique. For this, 24 New Zealand rabbits, were used. They were divided into two groups with 12 animals each, mononuclear cell group (MCG) and saline group (SSG). The rabbits underwent right tibial nerve section and repair by the tubulization technique using silicone hollow tube, which received 0.1 ml of autologous mononuclear bone marrow cells (2 x 106 cells ) in the MCG and of saline solution in the SSG, in order to compare the evolution of functional recovery of the operated limbs. Gait and planimetry were performed. Planimetry of the pelvic limb footprint printed on paper with water-based ink applied to the plantar area, before (M0) and after 7 (M7), 15 (M15), 30 (M30), 45 (M45) and 60 (M60) days after surgery. The results showed no functional recovery of the tibial nerve in both groups, without differences between them in different times and among times within groups, except when compared to M0.

A recuperação funcional de nervos periféricos após lesão é o principal objetivo da intervenção terapêutica. Por isso o objetivo deste estudo foi avaliar clinicamente a recuperação funcional de coelhos após neurectomia e tratamento com células mononucleares de medula óssea associada à técnica de tubulização. Foram utilizados para isto, 24 coelhos da raça Nova Zelândia, alocados em dois grupos com 12 animais cada, denominados grupo célula mononuclear (GCM) e grupo solução salina (GSS). Os coelhos foram submetidos à secção do nervo tibial direito e reparação por meio da técnica de tubulização utilizando tubo oco de silicone, para então, receberem no interior do tubo, 0,1mL de suspensão de células mononucleares autólogas de medula óssea (2 x 106 células) no GCM e solução salina no GSS, para comparação da evolução da recuperação funcional dos membros operados. Foram realizadas avaliações da marcha e planimetria da pegada do membro pélvico impressa em papel a partir de tinta à base dágua aplicada à área plantar, antes (M0) e após o 7º (M7), 15º (M15), 30º (M30), 45º (M45) e 60º (M60) dias do procedimento cirúrgico. Os resultados mostraram que não houve a recuperação funcional do nervo tibial em ambos os grupos, sem diferença entre eles nos diferentes momentos e entre os momentos dentre dos grupos, exceto quando comparado com M0.

Células-tronco da medula óssea e do tecido adiposo na regeneração do nervo ulnar em equinos

submetidos à neurotomia, tubulização com tubo de silicone e terapia celular com fração de células mononucleares da medula óssea (FCM) ou células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (ADSC). Foram utilizados 15 equinos adultos alocados em três grupos, com cinco animais em cada: grupo controle (GC) com utilização de soro fisiológico; grupo com deposição de FCM; e grupo com deposição de ADSC. Foi realizado o mesmo procedimento cirúrgico em todos os grupos, utilizando-se os dois nervos de cada animal (direito e esquerdo), e estabelecido dois momentos de biopsia: na 13ª semana com biopsia no membro direiro (GC1, FCM1 e ADSC1) e na 26ª semana com biopsia no membro esquerdo (GC2, FCM2 e ADSC2). A FCM e a ADSC foram obtidas respectivamente, da medula óssea e tecido adiposo de cada aninal, ambos utilizados como implantes autólogos. Após 13 e 26 semanas, realizaram-se as biopsias de todos os grupos e imediatamente, faziam-se imprints dos fragmentos para visualização do marcador fluorescente nanocristal. Os fragmentos foram fixados em formol tamponado a 10%, para análise histológica, com as coloraçãoes de HE, luxol fast blue, tricrômio de Masson e imuno-histoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S-100, FGF-2 e GDNF. Microscopicamente avaliou-se a presença de proliferação axonal, tecido conjuntivo, infiltrado inflamatório, células de Schwann, fatores de crescimento neurais, bainha de mielina, e degeneração walleriana. Para a análise histológica estabeleceram-se escores qualitativos e para a imuno-histoquímica realizou-se análise quantitativa com o programa Image J. Foi observada diminuição da degeneração walleriana, melhor reorganização fascicular, aumento do colágeno novo, início de formação de bainha de mielina, além de maior marcação do anticorpo NF nos grupos experimentais em relação ao GC. O grupo ADSC apresentou melhores resultados em relação aos demais, enfatizando a eficiência das ADSCs em relação à FCM e ao GC para a regeneração nervosa periférica. Porém, há a necessidade de um tempo maior para ocorrer completa regeneração do tecido nervoso periférico após lesão

Ação do N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) na regeneração nervosa periférica. Estudo experimental em camundongos / N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine on peripheral nerve regeneration. Experimental study in mice

Avaliou-se o efeito do N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) na regeneração de neurônios periféricos em animais adultos. O nervo ciático esquerdo de oito camundongos machos adultos da linhagem C57BL/6J foi seccionado e o coto proximal e distal foram ancorados no interior de um tubo de polietileno (TP) com diâmetro interno de 0,76 mm, mantendo-se uma distância de quatro mm entre os mesmos. Os animais foram divididos aleatória e eqüitativamente em dois grupos e receberam 2µl de solução purificada de colágeno (Vitrogen®2,4 mg/ml) (COL) ou colágeno e MDP na proporção de 1:1 obtendo-se uma concentração de 1 mM (COL/MDP). Outros quatro animais não operados serviram como controle de normalidade (NOR). Após quatro semanas, os TP com os cabos de regeneração (CR) no seu interior, foram coletados para determinação do número de axônios mielínicos e da média do diâmetro das fibras mielínicas regeneradas. Os resultados revelaram diferença significativa no número de axônios entre os grupos NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) e COL/MDP (2430 ± 223). Houve redução significativa no diâmetro das fibras mielínicas nos grupos que receberam as próteses tubulares (COL= 3,38 µm ± 1,16 e COL/MDP= 3,54 µm ± 1,16) quando comparados ao grupo NOR (6,19 µm± 2,45). O gânglio da raiz dorsal L5 também foi removido e seccionado em série para a contagem e mensuração dos neurônios sensitivos. O número de neurônios não diferiu entre os grupos experimentais (COL = 564 ± 51 e COL/MDP = 514 ± 56), os quais apresentaram menor número de neurônios sensitivos em relação ao grupo não operado (NOR = 1097 ± 142). Os resultados indicam que a aplicação local do MDP estimula a regeneração de nervos em camundongos

N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) was evaluated for its effect on the regenerating peripheral neurons in adult animals. The left sciatic nerve of nine male adult mice C57BL/6J was cut, the proximal and distal nerve stumps were inserted into a polyethylene tube (PT) with 0,76 mm inner diameter, leaving a four mm distance gap. Animals were randomly distributed into two groups and received 2µl of purified preparation of collagen (Vitrogen® 2,4 mg/ml) (COL) or collagen and MDP made up in 1:1 volume ratio, obtaining a 1 mM (COL/MDP) concentration. Other four non-operated animals served as controls (NOR). After four weeks, PT with the regenerated nerve cables (RC), were processed for total myelinated axon counts and myelinated fiber diameter. The results revealed significant difference (p<0.05) in the axons count among the groups NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) and COL/MDP (2430 ± 223). There was a significant reduction in the diameter of myelinated fibers in the operated groups (COL = 3,38 µm ± 1,16 and COL/MDP = 3,54 µm ± 1,16) when compared to non-operated animals (6,19 µm ± 2,45). The L5 dorsal root ganglion (DRG) was also removed form the same mice and serially sectioned for sensory neurons count and measurement. No difference was found in the number of DRG neurons among the experimental groups (COL = 564 ± 51 and COL/MDP = 514 ± 56), which presented fewer sensory neurons compared to non-operated group (NOR = 1097 ± 142). The results indicate that the locally applied MDP stimulates peripheral nerve regeneration in mice