Toxinology in the proteomics era: a review on arachnid venom proteomics

Abstract The word venomics was coined to acknowledge the studies that use omics to investigate venom proteins and peptides. Venomics has evolved considerably over the last 20 years. The first works on scorpion or spider venomics were published in the early 2000s. Such studies relied on peptide mass fingerprinting (PMF) to characterize venom complexity. After the introduction of new mass spectrometers with higher resolution, sensitivity and mass accuracy, and the next-generation nucleotide sequencing, the complexity of data reported in research on scorpion and spider venomics increased exponentially, which allowed more comprehensive studies. In the present review article, we covered key publications on scorpion venomics and spider venomics, presenting historical grounds and implemented technologies over the last years. The literature presented in this review was selected after searching the PubMed database using the terms (scorpion venom) AND (proteome) for scorpion venomics, and (spider venom) AND (proteome) for publications on spider venomics. We presented the key aspects related to proteomics in the covered papers including, but not restricted to, the employed proteomic strategy (i.e., PMF, two-dimensional gel electrophoresis, shotgun/bottom-up and/or top-down/peptidome), and the type of mass spectrometer used. Some conclusions can be drawn from the present study. For example, the scorpion genus Tityus is the most studied concerning venomics, followed by Centruroides; whereas for spiders the studied genera were found more equally distributed. Another interesting conclusion is the lack of high throughput studies on post-translational modifications (PTMs) of scorpion and spider proteins. In our opinion, PTMs should be more studied as they can modulate the activity of scorpion and spider toxins.

Toxinology in the proteomics era: a review on arachnid venom proteomics

The word venomics was coined to acknowledge the studies that use omics to investigate venom proteins and peptides. Venomics has evolved considerably over the last 20 years. The first works on scorpion or spider venomics were published in the early 2000's. Such studies relied on peptide mass fingerprinting (PMF) to characterize venom complexity. After the introduction of new mass spectrometers with higher resolution, sensitivity and mass accuracy, and the next-generation nucleotide sequencing, the complexity of data reported in research on scorpion and spider venomics increased exponentially, which allowed more comprehensive studies. In the present review article, we covered key publications on scorpion venomics and spider venomics, presenting historical grounds and implemented technologies over the last years. The literature presented in this review was selected after searching the PubMed database using the terms "(scorpion venom) AND (proteome)" for scorpion venomics, and "(spider venom) AND (proteome)" for publications on spider venomics. We presented the key aspects related to proteomics in the covered papers including, but not restricted to, the employed proteomic strategy (i.e., PMF, two-dimensional gel electrophoresis, shotgun/bottom-up and/or top-down/peptidome), and the type of mass spectrometer used. Some conclusions can be drawn from the present study. For example, the scorpion genus Tityus is the most studied concerning venomics, followed by Centruroides; whereas for spiders the studied genera were found more equally distributed. Another interesting conclusion is the lack of high throughput studies on post-translational modifications (PTMs) of scorpion and spider proteins. In our opinion, PTMs should be more studied as they can modulate the activity of scorpion and spider toxins.(AU)

Neonatal diarrhea and rotavirus A infection in beef and dairy calves, Brazil, 2006-2015 / Diarreia neonatal e infecção por rotavírus A em bezerros de corte e leite, Brasil, 2006-2015

Calf diarrhea causes substantial economic losses in the cattle industry worldwide. Bovine rotavirus A (RVA) is the main viral agent that leads to enteric infection and diarrhea outbreaks in calves throughout the world. The aim of this retrospective (2006-2015) study was to determine the frequency of RVA detection in diarrheic fecal samples from beef and dairy calves from the three main cattle-producing regions of Brazil. Diarrheic fecal samples (n=1,498) of 124 beef and 56 dairy cattle herds from the Midwest, South, and Southeast geographical regions of Brazil were evaluated using the silver-stained polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE) technique. RVA double stranded-RNA was identified by the ss-PAGE technique in 410 (27.4%) fecal samples. The frequency of positive samples found in beef calves (31.9%; 328/1,027) was higher than the frequency found in diarrheic fecal samples from dairy calves (17.4%; 82/471). RVA infection was identified in calves from the three Brazilian geographical regions analyzed. However, the frequency of positive diarrheic calves in the Midwest region (39.4%), predominantly beef calves, was higher than in the South (19.4%) and Southeast (17.6%) regions. The temporal distribution of RVA-infected calves evaluated by two five-year periods (2006-2010, 24.5%; 2011-2015, 28.8%) demonstrated a very similar frequency of RVA in both periods. Considering the wide regional and temporal scope of this study, it can be concluded that RVA remains an important etiology of neonatal diarrhea in calves of Brazilian cattle herds.(AU)

A diarreia neonatal ocasiona perdas econômicas importantes na pecuária bovina em todo o mundo. Rotavírus A (RVA) é o principal agente etiológico viral de infecções entéricas e surtos de diarreia em bezerros de rebanhos de corte e leite. O objetivo deste estudo retrospectivo (2006-2015) foi determinar a frequência de detecção de RVA em amostras de fezes diarreicas de bezerros de corte e leite das três principais regiões produtoras de bovinos do Brasil. Amostras de fezes diarreicas (n=1.498) de 124 rebanhos bovinos de corte e 56 rebanhos bovinos de leite das regiões Centro-Oeste, Sul e Sudeste do Brasil foram avaliadas utilizando a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). O genoma segmentado de RVA foi identificado pela técnica de EGPA em 410 (27,4%) amostras de fezes. A frequência de amostras positivas encontrada em bezerros de rebanhos de corte (31,9%; 328/1.027) foi maior que a frequência identificada em amostras de fezes diarreicas de bezerros de rebanhos leiteiros (17,4%; 82/471). A infecção por RVA foi identificada em bezerros das três regiões geográficas brasileiras analisadas. No entanto, a frequência de bezerros com diarreia positivos para RVA na região Centro-Oeste (39,4%), predominantemente de bezerros de rebanhos de corte, foi maior que nas regiões Sul (19,4%) e Sudeste (17,6%). A distribuição temporal dos bezerros infectados com RVA avaliados por dois períodos de cinco anos (2006-2010, 24,5%; 2011-2015, 28,8%) demonstrou uma frequência muito semelhante em ambos os períodos. Considerando a amplitude regional e temporal deste estudo, pode-se concluir que RVA continua sendo uma importante etiologia de diarreia neonatal em bezerros de rebanhos bovinos brasileiros.(AU)

Neonatal diarrhea and rotavirus A infection in beef and dairy calves, Brazil, 2006-2015 / Diarreia neonatal e infecção por rotavírus A em bezerros de corte e leite, Brasil, 2006-2015

Calf diarrhea causes substantial economic losses in the cattle industry worldwide. Bovine rotavirus A (RVA) is the main viral agent that leads to enteric infection and diarrhea outbreaks in calves throughout the world. The aim of this retrospective (2006-2015) study was to determine the frequency of RVA detection in diarrheic fecal samples from beef and dairy calves from the three main cattle-producing regions of Brazil. Diarrheic fecal samples (n=1,498) of 124 beef and 56 dairy cattle herds from the Midwest, South, and Southeast geographical regions of Brazil were evaluated using the silver-stained polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE) technique. RVA double stranded-RNA was identified by the ss-PAGE technique in 410 (27.4%) fecal samples. The frequency of positive samples found in beef calves (31.9%; 328/1,027) was higher than the frequency found in diarrheic fecal samples from dairy calves (17.4%; 82/471). RVA infection was identified in calves from the three Brazilian geographical regions analyzed. However, the frequency of positive diarrheic calves in the Midwest region (39.4%), predominantly beef calves, was higher than in the South (19.4%) and Southeast (17.6%) regions. The temporal distribution of RVA-infected calves evaluated by two five-year periods (2006-2010, 24.5%; 2011-2015, 28.8%) demonstrated a very similar frequency of RVA in both periods. Considering the wide regional and temporal scope of this study, it can be concluded that RVA remains an important etiology of neonatal diarrhea in calves of Brazilian cattle herds.(AU)

A diarreia neonatal ocasiona perdas econômicas importantes na pecuária bovina em todo o mundo. Rotavírus A (RVA) é o principal agente etiológico viral de infecções entéricas e surtos de diarreia em bezerros de rebanhos de corte e leite. O objetivo deste estudo retrospectivo (2006-2015) foi determinar a frequência de detecção de RVA em amostras de fezes diarreicas de bezerros de corte e leite das três principais regiões produtoras de bovinos do Brasil. Amostras de fezes diarreicas (n=1.498) de 124 rebanhos bovinos de corte e 56 rebanhos bovinos de leite das regiões Centro-Oeste, Sul e Sudeste do Brasil foram avaliadas utilizando a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). O genoma segmentado de RVA foi identificado pela técnica de EGPA em 410 (27,4%) amostras de fezes. A frequência de amostras positivas encontrada em bezerros de rebanhos de corte (31,9%; 328/1.027) foi maior que a frequência identificada em amostras de fezes diarreicas de bezerros de rebanhos leiteiros (17,4%; 82/471). A infecção por RVA foi identificada em bezerros das três regiões geográficas brasileiras analisadas. No entanto, a frequência de bezerros com diarreia positivos para RVA na região Centro-Oeste (39,4%), predominantemente de bezerros de rebanhos de corte, foi maior que nas regiões Sul (19,4%) e Sudeste (17,6%). A distribuição temporal dos bezerros infectados com RVA avaliados por dois períodos de cinco anos (2006-2010, 24,5%; 2011-2015, 28,8%) demonstrou uma frequência muito semelhante em ambos os períodos. Considerando a amplitude regional e temporal deste estudo, pode-se concluir que RVA continua sendo uma importante etiologia de diarreia neonatal em bezerros de rebanhos bovinos brasileiros.(AU)

Uterine infusion of conceptus fragments changes the protein profile from cyclic mares

This experiment aimed to compare at day seven after ovulation, the protein profile of uterine fluid in cyclic mares with mares infused two days before with Day 13 conceptus fragments. Experimental animals were ten healthy cyclic mares, examined daily to detect ovulation (Day 0) as soon as estrus was confirmed. On day seven, after ovulation, uterine fluid was collected, constituting the Cyclic group (n = 10). The same mares were examined in the second cycle until ovulation was detected. On day five, after ovulation, fragments from a previously collected concepti were infused into each mare's uterus. Two days after infusion, uterine fluid was collected, constituting the Fragment group (n = 10). Two-dimensional electrophoresis technique processed uterine fluid samples. A total of 373 spots were detected. MALDI-TOF/TOF and NanoUHPLC-QTOF mass spectrometry identified twenty spots with differences in abundance between the Cyclic and Fragment group. Thirteen proteins were identified, with different abundance between groups. Identified proteins may be related to embryo-maternal communication, which involves adhesion, nutrition, endothelial cell proliferation, transport, and immunological tolerance. In conclusion, conceptus fragments signalized changes in the protein profile of uterine fluid seven days after ovulation in comparison to the observed at Day 7 in the same cyclic mares.

Uterine infusion of conceptus fragments changes the protein profile from cyclic mares

This experiment aimed to compare at day seven after ovulation, the protein profile of uterine fluid in cyclic mares with mares infused two days before with Day 13 conceptus fragments. Experimental animals were ten healthy cyclic mares, examined daily to detect ovulation (Day 0) as soon as estrus was confirmed. On day seven, after ovulation, uterine fluid was collected, constituting the Cyclic group (n = 10). The same mares were examined in the second cycle until ovulation was detected. On day five, after ovulation, fragments from a previously collected concepti were infused into each mare's uterus. Two days after infusion, uterine fluid was collected, constituting the Fragment group (n = 10). Two-dimensional electrophoresis technique processed uterine fluid samples. A total of 373 spots were detected. MALDI-TOF/TOF and NanoUHPLC-QTOF mass spectrometry identified twenty spots with differences in abundance between the Cyclic and Fragment group. Thirteen proteins were identified, with different abundance between groups. Identified proteins may be related to embryo-maternal communication, which involves adhesion, nutrition, endothelial cell proliferation, transport, and immunological tolerance. In conclusion, conceptus fragments signalized changes in the protein profile of uterine fluid seven days after ovulation in comparison to the observed at Day 7 in the same cyclic mares.(AU)

Proteomic profile of Piper tuberculatum (Piperaceae) / Perfil proteômico e metabólico de Piper tuberculatum (Piperaceae)

Piper tuberculatum (Piperaceae) is a species that accumulates especially amides as secondary metabolites and several biological activities was previously reported. In this article, we report a proteomic study of P. tuberculatum. Bidimensional electrophoresis (2D SDS-PAGE) and mass spectrometry (ESI-Q-TOF) were used in this study. Over a hundred spots and various peptides were identified in this species and the putative functions of these peptides related to defense mechanism as biotic and abiotic stress were assigned. The information presented extend the range of molecular information of P. tuberculatum.(AU)

Piper tuberculatum (Piperaceae) é uma espécie que acumula especialmente amidas como metabólitos secundários e diversas atividades biológicas dessa espécie foram relatadas anteriormente. No presente artigo, relatamos um estudo proteômico dessa espécie. Eletroforese bidimensional (2D SDS-PAGE) e espectrometria de massas (ESI-Q-TOF) foram utilizadas nesse estudos. Mais de cem spots e vários peptídeos foram identificados nesta espécie e as funções putativas desses peptídeos relacionadas a mecanismo de defesa como estresse biótico e abiótico foram atribuídos. As informações apresentadas ampliam a gama de informações moleculares dessa espécie.(AU)

Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.(AU)

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.(AU)

Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.

Proteínas do sêmen e sua relação com a resistência à congelação em ejaculados de diferentes varrões / Semen proteins and their relationship to freezing resistance in different boars

A identificação de proteínas presentes no sêmen possibilitará a busca por marcadores decongelabilidade. O presente trabalho teve como objetivo identificar proteínas espermáticas relacionadas com aproteção durante a criopreservação. O sêmen de quatorze reprodutores foi coletado uma vez por semana,descongelado, ressuspenso e analisado. Para o estudo da proteômica, estes foram submetidos à eletroforesebidimensional. A busca por marcadores de congelabilidade, foi feita pela divisão dos animais em dois grupos:congelabilidade boa (GFEs) e ruim (PFEs), através dos resultados de vigor e motilidade após a descongelação.Isto possibilitou comparar as proteínas presentes em cada grupo e correlacioná-las com a criopreservação dosêmen. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. A análise estatística foi processadaatravés da avaliação das médias e desvios padrões, com os testes de Mann-Witney e o teste t de Student. Paracomparação foi utilizado o teste ANOVA com pós-teste de Tukey (5%). Os animais de GFEs = 2,2 ± 0,8 e 41,8± 22,9 e os de PFEs = 1,9 ± 0,6 e 26,8 ± 17,5. Foram encontrados 263 ± 62,2 spots por gel e um total de 234,2 ±54,6 spots de forma consistente nos géis dos animais. Foram encontrados 5 spots que divergiram entre os grupos(3 mais expressos no PFES e 2 spots no GFEs). No estudo da composição proteica da membrana espermática, oscinco spots detectados podem atuar como possíveis marcadores de congelabilidade para o sêmen suíno.(AU)

The identification of proteins present in the semen wil enable the search for freezin markers. This studyaimed identify the spermatic proteins that are related to the protection during cryopreservation. The semen fromfourteen boars was collected once a week, thawed, ressuspended and analyzed. For the study of proteomic, theywere subjected to two-dimensional electrophoresis. To search for freezability markers, was made a division ofthe animals into two groups: good and bad freezability, through the results of vigour and motility after thawing.This made possible the comparison of the proteins present in each group and correlation between them andsemen cryopreservation. The experimental lineation was in randomized blocks. The statistical analysis wasmade by evaluating the means and standard deviations, in which were applied the Mann-Whitney and Student ttest. For comparison was used the ANOVA test with Tukey post-test was used (5%). The animals of GFEs = 2.2± 0.8 and 41.8 ± 22.9 and the PFEs = 1.9 ± 0.6 and 26.8 ± 17.5. Were found 263 ± 62.2 spots per gel and a totalof 234.2 ± 54.6 spots was consistently detected in the gels of the animals. The five spots that differed betweengroups were found (3 with greater intensity in PFES and 2 spots in GFEs). In the study of protein composition ofthe membrane sperm, the five spots detected can act as potential markers for boar semen freezability.(AU)

Proteínas do sêmen e sua relação com a resistência à congelação em ejaculados de diferentes varrões / Semen proteins and their relationship to freezing resistance in different boars

A identificação de proteínas presentes no sêmen possibilitará a busca por marcadores decongelabilidade. O presente trabalho teve como objetivo identificar proteínas espermáticas relacionadas com aproteção durante a criopreservação. O sêmen de quatorze reprodutores foi coletado uma vez por semana,descongelado, ressuspenso e analisado. Para o estudo da proteômica, estes foram submetidos à eletroforesebidimensional. A busca por marcadores de congelabilidade, foi feita pela divisão dos animais em dois grupos:congelabilidade boa (GFEs) e ruim (PFEs), através dos resultados de vigor e motilidade após a descongelação.Isto possibilitou comparar as proteínas presentes em cada grupo e correlacioná-las com a criopreservação dosêmen. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. A análise estatística foi processadaatravés da avaliação das médias e desvios padrões, com os testes de Mann-Witney e o teste t de Student. Paracomparação foi utilizado o teste ANOVA com pós-teste de Tukey (5%). Os animais de GFEs = 2,2 ± 0,8 e 41,8± 22,9 e os de PFEs = 1,9 ± 0,6 e 26,8 ± 17,5. Foram encontrados 263 ± 62,2 spots por gel e um total de 234,2 ±54,6 spots de forma consistente nos géis dos animais. Foram encontrados 5 spots que divergiram entre os grupos(3 mais expressos no PFES e 2 spots no GFEs). No estudo da composição proteica da membrana espermática, oscinco spots detectados podem atuar como possíveis marcadores de congelabilidade para o sêmen suíno.

The identification of proteins present in the semen wil enable the search for freezin markers. This studyaimed identify the spermatic proteins that are related to the protection during cryopreservation. The semen fromfourteen boars was collected once a week, thawed, ressuspended and analyzed. For the study of proteomic, theywere subjected to two-dimensional electrophoresis. To search for freezability markers, was made a division ofthe animals into two groups: good and bad freezability, through the results of vigour and motility after thawing.This made possible the comparison of the proteins present in each group and correlation between them andsemen cryopreservation. The experimental lineation was in randomized blocks. The statistical analysis wasmade by evaluating the means and standard deviations, in which were applied the Mann-Whitney and Student ttest. For comparison was used the ANOVA test with Tukey post-test was used (5%). The animals of GFEs = 2.2± 0.8 and 41.8 ± 22.9 and the PFEs = 1.9 ± 0.6 and 26.8 ± 17.5. Were found 263 ± 62.2 spots per gel and a totalof 234.2 ± 54.6 spots was consistently detected in the gels of the animals. The five spots that differed betweengroups were found (3 with greater intensity in PFES and 2 spots in GFEs). In the study of protein composition ofthe membrane sperm, the five spots detected can act as potential markers for boar semen freezability.

PROTEÔMICA DE TECIDO RUMINAL E CECAL DE BOVINOS NELORE CONFINADOS COM DIFERENTES ESTRATÉGIAS NUTRICIONAIS

A literatura apresenta poucos estudos que investigaram o proteoma de ceco e rúmen de bovinos submetidos a estratégias alimentares com uso de aditivos. Essa proposta é pioneira na identificação, expressão e compreensão do perfil proteico ruminal e cecal de bovinos nelore confinados. Artigo 1: Objetivou-se avaliar a expressão proteica, a fim identificar possíveis moléculas candidatas a biomarcadores e suas relações com funções metabólicas e nutricionais aplicados a animais confinados com diferentes níveis de amido (25, 35 e 45%) e aditivos (Monensina × blend de óleos essências + amilase exógena), as dosagens de monensina sódica, blend de óleos essenciais e amilase exógena foram 26, 90 e 560 mg/kg MS, respectivamente. Foram utilizados machos Nelore (n = 210) (Bos taurus indicus), não castrados (Peso Inicial = ± 380 kg). Após o abate foram coletadas amostras de ceco e acondicionadas imediatamente em nitrogênio líquido. Foi feito um pool de amostras utilizando 90 animais (15 animais/tratamento) no processo de precipitação do pellet proteico. A separação e caracterização do proteoma das amostras biológicas foram feitas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e identificadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Os géis de poliacrilamida foram analisados utilizando ImageMaster 2D Platinum 7.0 para verificar as diferenças na expressão de proteínas, para as comparações do % volume normalizado dos spots. Após a identificação das proteínas foram analisadas as vias metabólicas usando a função da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), análise de enriquecimento da via Reactome para mapear as expressões das proteínas que codificam enzimas e suas respectivas funções nas vias afetadas. O uso de Blend de Óleo essenciais associado com -Amilase como aditivo alimentar promoveu maior expressão de enzimas na via da glicólise e gliconeogênese e ausência de proteína ligada a inflamação (Leukocyte elastase inhibitor). Por outro lado, o incremento de amido nas dietas promoveu redução de enzimas ligadas a degradação de carboidrato com aumento de respostas atribuídas à injúrias inflamatórias no rúmen de bovinos Nelore confinados. Artigo 2: Objetivou-se mapear o proteoma do epitélio ruminal de bovinos nelore confinados (n=60) com diferentes níveis de amido (Baixo: 25 e Alto: 45%) e aditivos (Monensina × blend de óleos essências + amilase exógena). As separações e fracionamento das proteínas foram através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE), e posteriormente a identificação por espectrometria de massas acoplada a cromatografia líquida (LC-MS/MS). Após a identificação das proteínas foram utilizados os acessos das proteínas para a classificação em suas funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares utilizando Blast2GO, posteriormente a análise de enriquecimento via String para mapear as redes e interação entres proteínas caracterizadas suas respectivas funções no metabolismo de glicose e ácidos graxos. Dietas contendo blend de óleos essenciais associados à amilase exógena promoveram maior expressão de macromoléculas que participam da degradação de carboidratos pela via glicolítica e cetogênica. Foram identificadas 14 proteínas com maior expressão e presentes no tecido epitelial do rúmen envolvidas na oxidação da glicose, a proteína hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa parte do metabolismo metabólico intermediário, uma etapa fundamental na cetogênese. Nossos resultados sugerem que houve aumento da glicólise a partir da oxidação do gliceraldeído-3-fosfato, que participa da primeira etapa da produção de acetato e butirato e da descarboxilação oxidativa no epitélio ruminal de bovinos nelore confinados. A monensina melhora os precursores de propionato, a maior expressão de metilmalonil-CoA mutase sugere síntese de propionato via propionil-CoA que participa do ciclo do ácido cítrico através do succinil-CoA, que pode aumentar a energia metabolizável e reduzir a ingestão de alimentos.

Few studies have investigated the proteome of cecum and rumen of cattle feeding diferente estrategies with the use of additives. This proposal is a pioneer in the identification, expression. and understanding of the ruminal and cecal protein profile of feedlot Nellore cattle. Manuscript 1: The objective was to evaluate protein expression in order to identify possible candidate molecules for biomarkers and their relationships with metabolic and nutritional functions applied to animals fed with different levels of starch (25, 35 and 45%) and additives (Monensin × blend of essential oils + exogenous amylase), the dosages of sodium monensin, blend of essential oils and exogenous amylase were 26, 90 and 560 mg/kg DM, respectively. Nellore bulls (n = 210) (Bos taurus indicus) (initial weight = ) 380 kg) were used. After slaughter, cecum samples were collected and immediately placed in liquid nitrogen. Samples were pooled using 90 animals (15 animals/treatment) in the protein pellet precipitation process. The separation and characterization of the proteome of biological samples were performed by twodimensional electrophoresis (2D-PAGE) and identified by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). Polyacrylamide gels were analyzed using ImageMaster 2D Platinum 7.0 to verify differences in protein expression for the % volume normalized spot comparisons. After identifying the proteins, the metabolic pathways were analyzed using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) function, enrichment analysis of the Reactome pathway to map the expressions of proteins encoding enzymes and their respective functions in the affected pathways. The use of blend essential oil associated with -Amylase as a feedd additive promoted greater expression of enzymes in the glycolysis and gluconeogenesis pathway and absence of protein linked to inflammation (Leukocyte elastase inhibitor). On the other hand, the increase in starch in the diets reduced enzymes linked to carbohydrate degradation with increased responses attributed to inflammatory injuries in the rumen of feedlot Nellore cattle. Manuscript 2: The objective was to map the proteome of the ruminal epithelium of feedlot Nellore cattle (n=60) with different levels of starch (Low: 25 and High: 45%) and additives (Monensin × blend of essential oils + exogenous amylase) the dosages of sodium monensin, blend of essential oils and exogenous amylase were 26, 90 and 560 mg/kg DM, respectively. Protein separations were performed using two-dimensional polyacrylamide gel electrophores (2D-PAGE), followed by identification by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). After protein identification, protein accessions were used to classify their molecular functions, biological processes and cellular component using Blast2GO, then enrichment analysis pathways String to map the networks and interaction xii between proteins characterized and their respective functions in glucose and fatty acids metabolic. Diets containing blend of essential oils associated with exogenous amylase promoted greater expression of macromolecules that participate in carbohydrate degradation via glycolytic and ketogenic pathways. We identified 14 proteins with greater expression and present in the epithelial tissue of the rumen involved in glucose oxidation, the protein hydroxymethylglutaryl-CoA lyase that catalyzes part of intermediary metabolic metabolism, a fundamental step in ketogenesis. Our results suggest that there was an increase in glycolysis from the oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate, which participates in the first stage of acetate and butyrate production and oxidative decarboxylation in the ruminal epithelium of feedlot Nellore cattle. Monensin improves propionate precursors, the increased expression of methylmalonyl-CoA mutase suggests propionate synthesis via propionyl-CoA that participates in the citric acid cycle through succinyl-CoA, which can increase metabolizable energy and reduce feed intake.

EFEITOS DO ÓLEO DA SEMENTE DE MARACUJÁ NOS SISTEMAS IMUNE E ANTIOXIDANTE DE FRANGOS DE CORTE

O estresse térmico proporciona muitos prejuízos na avicultura industrial e com o objetivo de minimizá-los, estratégias nutricionais vêm sendo adotadas, com ênfase, principalmente aos alimentos naturais. O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito da suplementação de óleo da semente de maracujá (OSM) na imunidade e respostas imunes, qualidade de carne e sistema antioxidante de frangos de corte. Para isso foram utilizados 450 pintainhos de 1 dia de idade, machos, da linhagem Cobb® 500, alojados em gaiolas de arame galvanizado, em duas câmaras com 45 gaiolas cada. O delineamento foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 5, sendo duas temperaturas (termoneutra e estresse cíclico pelo calor) e cinco tratamentos (controle sem inclusão de OSM + quatro níveis de inclusão de OSM (0,30; 0,50; 0,70; 0,90%) com nove repetições de cinco aves cada. A ração foi desprovida de antibióticos como melhorador de desempenho, porém acrescida de anticoccidiano em todos os tratamentos. Os dados foram analisados utilizando-se análise de variância com auxílio do SAS 9.3 (SAS Institute, 2008) e, sendo significativas a (P<0,05) no teste de média pelo teste de Tukey. Houve efeito significativo para o peso vivo ao abate e peso de cortes comerciais, para frangos criados em ambiente termoneutro, que apresentaram maiores valores em relação ao estresse por calor, e a gordura abdominal apresentou menor valor para aves desafiadas por calor. O OSM influenciou no maior peso (em gramas) das pernas. Frangos de corte criados em estresse por calor apresentaram menores valores de a* na musculatura do peito do que os frangos criados em ambiente termoneutro. Em relação a análise proteômica eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) do plasma sanguíneo para resultados voltados a qualidade de carne, a proteína Actin alpha skeletal muscle, apresentou diferença significativa nos tratamentos com inclusão de 0,9% de OSM em ambas as temperaturas (estresse por calor e termoneutra) e, Neuropilin-1, no tratamento termoneutro com 0% de inclusão de OSM. Com 21 dias de idade foi observado uma interação significativa para titulação de anticorpos, sendo que frangos criados em ambiente de estresse que receberam o nível de 0,90% de OSM, apresentaram maior valor de titulação vacinal. Aos 28 dias de idade, novamente os animais que receberam 0,90% de inclusão de OSM e, independente do ambiente de criação, apresentaram maiores valores de títulos de anticorpos. Na análise proteômica do plasma sanguíneo (2D-PAGE) foram encontradas diversas proteínas que 11 estão relacionadas com o sistema imunológico dos frangos de corte: Complement factor B-like protease (Fragment); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; Mannose-binding protein; Zinc finger protein ubi-d4; Ig lambda chain C region; Ig lambda chain V-1 region; Apolipoprotein A-I. A análise proteômica também apresentou resultados referentes a manutenção do epitélio gastrointestinal, com a expressão diferencial de Retinol-binding protein 4 e, Homeodomain-only protein. Houve maior % de redução de DPPH com a maior inclusão do OSM, assim como maior expressão de Alcohol dehydrogenase 1, nos tratamentos com maior inclusão de OSM. Também houve diferença significativa para o efeito temperatura sobre a atividade da enzima catalase que se apresentou maior em ambiente termoneutro. Assim como, Nuclear receptor coactivator 7 que foi diferencialmente expresso no tratamento 0% de frangos de corte criados em ambiente termoneutro. Hemoglobin subunit epsilon teve sua expressão diferenciada no tratamento 0,9% de frangos de corte criados em ambiente de estresse. Além disso, vários spots proteicos relacionados as chaperonas moleculares foram diferencialmente expressas nos tratamentos 0,5% e 0,9% de inclusão de OSM em ambas as temperaturas de criação. Membrane-associated progesterone receptor component 1 foi diferencialmente expresso nos tratamentos de 0,9% de inclusão de OSM em ambos os ambientes de criação.

Heat stress causes many damages in industrial poultry farming and in order to minimize them, nutritional strategies have been adopted, with emphasis, mainly on natural foods. The objective of this work was to study the effect of passion fruit seed oil (OSM) supplementation on immunity and immune responses, meat quality and antioxidant system of broiler chickens. For this, 450 1-day-old male chicks of the Cobb® 500 strain were used, housed in galvanized wire cages, in two chambers with 45 cages each. The design was completely randomized, in a 2 x 5 factorial scheme, with two temperatures (thermoneutral and cyclic heat stress) and five treatments (control without inclusion of OSM + four levels of inclusion of OSM (0.30; 0.50; 0) .70; 0.90%) with nine replicates of five birds each.The ration was devoid of antibiotics as a performance enhancer, but added anticoccidial in all treatments. Data were analyzed using analysis of variance with the aid of SAS 9.3 (SAS Institute, 2008) and, being significant (P<0.05) in the mean test by the Tukey test. which had higher values in relation to heat stress, and abdominal fat had lower value for heat challenged birds. OSM influenced the higher weight (in grams) of the legs. Broilers reared under heat stress had lower value a* in the breast musculature than broilers raised in a thermoneutral environment. Regarding proteomic two-dimensional electrophoresis analysis in polyacrylamide gel (2D-PAGE) of blood plasma for meat quality results, the protein Actin alpha skeletal muscle showed a significant difference in treatments with inclusion of 0.9% OSM in both temperatures (heat stress and thermoneutral) and, Neuropilin-1, in thermoneutral treatment with 0% inclusion of OSM. At 21 days of age, a significant interaction for antibody titration was observed, and broilers reared in a stress environment that received the level of 0.90% of OSM had a higher value of vaccine titration. At 28 days of age, again the animals that received 0.90% inclusion of OSM and, regardless of the rearing environment, had higher antibody titers. In the proteomic analysis of blood plasma (2D-PAGE) several proteins that are related to the immune system of broiler chickens were found: Complement factor B-like protease (Fragment); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; Mannose-binding protein; Zinc finger protein ubi-d4; Ig lambda chain C region; Ig lambda chain V-1 region; Apolipoprotein A-I. Proteomic analysis also showed results regarding the maintenance of the gastrointestinal epithelium, with the differential expression of Retinol-binding protein 4 and Homeodomain-only protein. There was a greater % reduction of DPPH with the 13 greater inclusion of OSM, as well as greater expression of Alcohol dehydrogenase 1, in treatments with greater inclusion of OSM. There was also a significant difference for the temperature effect on the catalase enzyme activity, which was higher in a thermoneutral environment. As well as, Nuclear receptor coactivator 7 which was differentially expressed in the 0% treatment of broilers reared in thermoneutral environment. Hemoglobin subunit epsilon had its expression differentiated in the treatment of 0.9% of broilers reared in stress environment. Furthermore, several protein spots related to molecular chaperones were differentially expressed in the 0.5% and 0.9% OSM inclusion treatments at both rearing temperatures. Membrane-associated progesterone receptor component 1 was differentially expressed in treatments of 0.9% inclusion of OSM in both rearing environments.

TESTE DA CRISTALIZAÇÃO LACRIMAL (TCL) E AVALIAÇÃO PROTEÔMICA DA LÁGRIMA DE FELINOS DOMÉSTICOS HÍGIDOS

No presente trabalho foi realizado o teste da cristalização lacrimal (TCL) em amostras de sessenta felinos domésticos hígidos e análise proteômica do fluido lacrimal (FL) de doze felinos. O TCL é um teste oftálmico de caráter qualitativo, visando avaliar a osmolaridade indireta do FL. Ainda não havia sido realizado em amostras da espécie felina, mas, apesar de originalmente desenvolvido para a espécie humana, já foi adaptado para cães, cavalos, macacos e camelos. Como forma complementar, tem-se desenvolvido diferentes técnicas de análise proteômica para avaliação do FL, visando identificação de proteínas que possam ser utilizadas como biomarcadores para diagnóstico precoce, prognóstico, desenvolvimento de novos fármacos, bem como para elucidar a fisiologia de sistemas e fisiopatologia de alterações. Objetivou-se verificar o enquadramento de amostras de felino nas escalas propostas para classificação do TCL de humanos, e, descrever as proteínas encontradas no FL de indivíduos dessa espécie. Para tal, as amostras de FL para TCL foram coletadas através do Teste de Schirmer 1 (TLS-1), e, as tiras logo após o teste foram acondicionadas em microtubos e centrifugadas para obtenção da alíquota que era depositada em uma lâmina microscópica de vidro, analisada através do microscópio de luz polarizada, e registrada através de fotos. Enquanto as amostras para análise proteômica também foram obtidas por TLS-1, acondicionadas em microtubos que foram submetidos a centrifugação refrigerada a 4ºC, porém a alíquota era imediatamente congelada até posterior análise por espectrometria de massas (EM) com gel bidimensional de poliacrilamida (2D-SDS-PAGE) associada a cromatografia líquida de alta eficiência (ULPC). A cristalização de amostras de felinos apresentou alta densidade de cristais, poucas lacunas entre os ramos, e, grande quantidade de núcleos facilmente visíveis. Os ramos são finos e suas ramificações primárias e secundárias bem definidas. Os tipos I e II da escala de Rolando e os graus 1 e 2 da escala de Masmali foram os mais comumenteVII observados (50%, 46,6%, 56,6% e 28,4%, respectivamente) das escalas propostas. A distribuição normal não foi encontrada para as classificações obtidas (P<0,001) bem como não foi observada diferença entre classificações dos olhos direito e esquerdo (P0,102). Proteínas já descritas em estudos com amostras de FL de outras espécies foram descritas pela primeira vez em felinos, como: lactotransferrina, albumina sérica e lipocalinas alérgenas. Oito outras proteínas foram descritas nas amostras de felinos e podem ser consideradas inéditas em amostras de FL de todas as espécies, dentre elas estão: três proteínas quinase dependentes da ciclina, o receptor de apelina, proteína secretória relacionada ao C1q/TNF, aciltransferase, -1,4 glucano fosforilase e o domínio de repetição WD-1. O TCL pode ser considerado de boa aplicabilidade em felinos como uma avaliação complementar da superfície ocular, e, a técnica de proteômica escolhida superou as limitações relacionada ao pequeno volume de amostra e apresentou alta sensibilidade na identificação de proteínas. Mais estudos da aplicabilidade das escalas do TCL, bem como da expressão de proteínas do FL de felinos são necessários e podem trazer no futuro grande auxílio na prevenção, diagnóstico precoce, prognóstico, bem como tratamento de doenças oftálmicas e até mesmo sistêmicas.

In the present study Tear Ferning Test (TFT) was performed in samples of sixty healthy domestic cats, and proteomic analysis of the Tear Film (TF) in twelve cats. TFT is a qualitative ophthalmic test that evaluate the indirect osmolarity of TF. It had not yet been performed on feline specimens, and although it was originally developed for humans, it has been used on dogs, horses, capuchin monkeys and camels. As a complementary tool, different proteomic techniques have been developed for the evaluation of TF, aiming to identify proteins that can be used as biomarkers for early diagnosis, prognosis, development of new drugs, as well as to elucidate the systems physiology and pathophysiology of diseases. The aim of this study was to verify the classification of feline samples in the proposed scales for TFT of humans, and to describe the proteins found in the TF of this species. For that purpose, the TF samples for TFT were collected through Schirmer Tear Test 1 (STT-1), the strips were placed in microtubes immediately after, and centrifuged to obtain the aliquot that was deposited on a microscopic slide of glass, analyzed through the polarized light microscope and recorded through photograph. The samples for proteomic analysis were also obtained by STT-1, placed in microtubes, subjected to refrigerated centrifugation at 4ºC, and the aliquot was immediately frozen at 20 ºC until further analysis by mass spectrometry (MS) with two dimensional polyacrylamide electrophoresis (2DSDS-PAGE) associated with ultra-performance liquid chromatography (ULPC). Ferning patterns of cats TF samples showed full crystallization with high density, without gaps between the ferns and branches, forming several nuclei that were easily distinguished. The branches are thin and their primary and secondary branches well defined. Types I and II by Rolando scale and grades 1 and 2 by Masmali scale were the most observed (50%, 46.6%, 56.6% and 28.4%, respectively) of the proposed scales. Normal distribution was not found for the obtained classifications (P<0.001), as well as no difference was observedIX between classifications of the right and left eyes (P0.102). Proteins already described in studies with TF samples from other species have been described for the first time in felines, such as: lactotransferrin, serum albumin and lipocalin allergens. Eight other proteins that were found in feline samples can be considered new in TF samples of all species already reported so far, among them are: three cyclin-dependent protein kinase, the apelin receptor, secretory protein related to C1q/TNF, acyltransferase, -1,4 glucan phosphorylase and the WD-1 repeat domain. TFT can be feasible in cats as a complementary evaluation of the ocular surface, and, the chosen proteomics technique overcame the limitations related to the small sample volume and showed high sensitivity in the identification of proteins. Further studies on the use of TFT scales, as well as on the expression of feline TF proteins are needed and can bring in the future great help in prevention, early diagnosis, prognosis, as well as treatment of ophthalmic and systemic diseases.

Comparative analysis of the venom proteome of four important Malaysian snake species

Naja kaouthia, Ophiophagus hannah, Bungarus fasciatus and Calloselasma rhodostoma are four venomous snakes indigenous to Malaysia. In the present study, their proteomic profile by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) have been separated and compared.(AU)

Comparative analysis of the venom proteome of four important Malaysian snake species

Naja kaouthia, Ophiophagus hannah, Bungarus fasciatus and Calloselasma rhodostoma are four venomous snakes indigenous to Malaysia. In the present study, their proteomic profile by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) have been separated and compared.

Expressão diferencial de proteínas do fungo Conidiobolus lamprauges cultivado em diferentes temperaturas / Differential expression of protein of the fungus Conidiobolus lamprauges cultivated at different temperatures

Para sobreviverem na temperatura corpórea de seu hospedeiro, os fungos patogênicos têm desenvolvido mecanismos moleculares importantes, como a expressão de proteínas relacionadas ao crescimento em altas temperaturas. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o crescimento in vitro de Conidiobolus lamprauges em diferentes temperaturas e comparar o perfil de proteínas expressas através de eletroforese bidimensional (2D), em duas temperaturas distintas, sendo uma considerada baixa (28°C) e alta (37°C). Para análise do crescimento em diferentes temperaturas, cinco isolados de C. lamprauges, oriundos de ovinos doentes, foram incubados a 20, 25, 30, 35 e 40°C e o crescimento radial foi medido a cada 24 horas. Para análise da expressão diferencial, realizou-se a extração de proteínas do fungo cultivado a 28°C e a 37°C por 48 horas. A média de crescimento radial dos isolados foi diferente nas temperaturas analisadas, sendo 35°C a melhor temperatura para crescimento em todas as amostras. A temperatura ótima ajustada variou entre 33,3°C a 34,8°C. Os limites inferior e superior de inibição de crescimento foram 18°C e 42°C, respectivamente. Na análise da expressão diferencial, foram encontrados 16 spots diferencialmente expressos, sete (7/16) estavam com expressão diminuída e nove (9/16) com expressão aumentada a 37°C, quando comparado a 28°C. Além disso, oito spots estavam presentes apenas a 28°C e seis a 37°C. Sugere-se que C. lamprauges produza um perfil de proteínas relacionadas à termorregulação desencadeado pela alta temperatura do hospedeiro.(AU)

To survive at the body temperature of their hosts, pathogenic fungi have developed important molecular mechanisms, such as protein expression associated with growth at high temperatures. Thus, the aim of this study was to analyze the in vitro growth of Conidiobolus lamprauges at different temperatures and compare proteins expressed by two-dimensional electrophoresis (2D), for the pathogen cultivated at low (28°C) and high (37°C) temperatures. For the analysis of growth temperatures, five isolates of C. lamprauges from sick sheep were incubated at 20, 25, 30, 35 and 40°C and radial growth was measured every 24 hours. For the analysis of differential expression, protein extraction and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis were performed with C. lamprauges cultivated at 28°C and 37°C for 48 hours. The average radial growth was different at the temperatures tested, and 35°C was found to be the best growth temperature for all isolates. The optimum adjusted temperature ranged between 33.3°C and 34.8°C. The upper and lower limits of growth inhibition were 18°C and 42°C, respectively. Upon expression analysis, a total of 16 spots were differentially expressed, seven (7/16) proteins were downregulated and nine (9/16) were over-expressed at 37ºC compared to 28°C. In addition, eight spots were present only at 28ºC and six were present only at 37ºC. It is suggested that C. lamprauges produces a profile of proteins that is related to thermoregulation triggered by the high temperature of the host.(AU)

Eletroforese bidimensional e espectrometria de massa como ferramentas proteômicas aplicadas à definição de marcadores proteicos associados à eficiência reprodutiva de caprinos / Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry as proteomic tools applied to the definition of protein markers associated with reproductive efficiency goats

O crescimento e desenvolvimento do rebanho caprino no Nordeste são observados com o aumento na produção da pecuária do Brasil. Esse aumento é reflexo, a princípio, das maiores exigências do mercado consumidor por produtos de melhor qualidade obtidos a partir de rebanhos de alto padrão zootécnico. As pesquisas atuais ilustram a necessidade de dispor de biomarcadores que auxiliem a indicação do potencial reprodutivo dos animais, uma vez que isso não pode ser expresso apenas com o exame andrológico. A avaliação da expressão das proteínas, tomando-as como biomarcadores, é análise potencial uma vez que estas, dentre os constituintes do plasma seminal, são encontradas em maior quantidade na forma de complexos associados, desempenhando papel crucial em todos os processos relacionados à capacidade fecundante dos espermatozoides. Essa análise é realizada por métodos de separação e detecção simultânea de proteínas utilizando técnicas como a eletroforese bidimensional (2DE) ou cromatografias, acoplados a métodos cada vez mais eficientes e sensíveis de identificação e quantificação de níveis de expressão de proteínas por espectrometria de massas. O objetivo desta revisão é abordar sobre a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa como ferramenta na análise da expressão de proteínas dentro do campo da proteômica.

The growth and development of goat herds in the northeast are being observed due to the increase in livestock production in Brazil. This increase reflects demands of the consumer market for high quality product, which are obtained from flocks of high standard zootechnics. Current research illustrates the need for biomarkers that indicate an animal ́s reproductive potential, since this cannot be expressed solely with andrologic evaluation. For this reason, the expression of the proteins as biomarkers is a potential analysis. The proteins from the seminal plasma constituents are found in larger amounts in the form of associated complexes, playing a crucial role in all processes related to the fertilizing capacity of sperm. This analysis is performed by separation methods and simultaneous detection of proteins using techniques such as two-dimensional electrophoresis (2DE) or chromatography. These techniques are coupled with methods to identify and quantify expression levels of proteins by mass spectrometry that are increasingly efficient and sensitive. The aim of this review was to discuss the technique of two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry as a tool in the analysis of protein expression within the field of proteomics.

Eletroforese bidimensional e espectrometria de massa como ferramentas proteômicas aplicadas à definição de marcadores proteicos associados à eficiência reprodutiva de caprinos / Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry as proteomic tools applied to the definition of protein markers associated with reproductive efficiency goats

O crescimento e desenvolvimento do rebanho caprino no Nordeste são observados com o aumento na produção da pecuária do Brasil. Esse aumento é reflexo, a princípio, das maiores exigências do mercado consumidor por produtos de melhor qualidade obtidos a partir de rebanhos de alto padrão zootécnico. As pesquisas atuais ilustram a necessidade de dispor de biomarcadores que auxiliem a indicação do potencial reprodutivo dos animais, uma vez que isso não pode ser expresso apenas com o exame andrológico. A avaliação da expressão das proteínas, tomando-as como biomarcadores, é análise potencial uma vez que estas, dentre os constituintes do plasma seminal, são encontradas em maior quantidade na forma de complexos associados, desempenhando papel crucial em todos os processos relacionados à capacidade fecundante dos espermatozoides. Essa análise é realizada por métodos de separação e detecção simultânea de proteínas utilizando técnicas como a eletroforese bidimensional (2DE) ou cromatografias, acoplados a métodos cada vez mais eficientes e sensíveis de identificação e quantificação de níveis de expressão de proteínas por espectrometria de massas. O objetivo desta revisão é abordar sobre a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa como ferramenta na análise da expressão de proteínas dentro do campo da proteômica.(AU)

The growth and development of goat herds in the northeast are being observed due to the increase in livestock production in Brazil. This increase reflects demands of the consumer market for high quality product, which are obtained from flocks of high standard zootechnics. Current research illustrates the need for biomarkers that indicate an animal ́s reproductive potential, since this cannot be expressed solely with andrologic evaluation. For this reason, the expression of the proteins as biomarkers is a potential analysis. The proteins from the seminal plasma constituents are found in larger amounts in the form of associated complexes, playing a crucial role in all processes related to the fertilizing capacity of sperm. This analysis is performed by separation methods and simultaneous detection of proteins using techniques such as two-dimensional electrophoresis (2DE) or chromatography. These techniques are coupled with methods to identify and quantify expression levels of proteins by mass spectrometry that are increasingly efficient and sensitive. The aim of this review was to discuss the technique of two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry as a tool in the analysis of protein expression within the field of proteomics.(AU)

CARACTERIZAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ESTRUTURAIS E REGULATÓRIAS DO TECIDO MUSCULAR ESQUELÉTICO E SUAS RELAÇÕES COM AS CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DA CARNE EM ANIMAIS NELORE (BOS INDICUS)

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação da expressão gênica e proteômica com a maciez da carne de bovinos da raça Nelore. A partir de uma população de 90 animais foram selecionados três grupos experimentais por meio da análise de força de cisalhamento (FC) e índice de fragmentação miofibrilar (MFI), sendo: carne moderadamente macia, carne moderadamente dura e carne muito dura. A expressão dos genes foi avaliada por meio da análise de PCR em tempo real e a análise proteômica foi realizada com base na separação de proteínas por meio da eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e caracterizção por espectrometria de massas com ionização eletrospray (ESI-MS/MS). A expressão da isoforma da calpastatina (CAST2) mostrou-se up regulated (P<0,05) nos grupos de carne moderadamente dura e muito dura. Os genes HSP90AA1, DNAJA1 e HSPB1, os quais representam as proteínas de choque térmico Hsp90, Hsp40 e Hsp27, respectivamente, mostraram expressão down regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia em relação ao grupo de carne muito dura. Na análise proteômica, a expressão do spot protéico das enzimas metabólicas TPI e PGM1, proteína estrutural PFN1 e aminiopeptidase LAP3 se mostraram up regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia, enquanto que a expressão das proteínas estruturais (ACTA1, ACTB, ACTG1 e MLC1), estresse oxidativo (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), proteínas de choque térmico (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 e HSPB1), e co-chaperonas e regulação celular (CD37, STIP1 e ARHGDIA) se mostraram down regulated (P>0,05) no mesmo grupo experimental. Estes resultados fornecem uma visão importante de novos possíveis marcadores biológicos atuantes no processo de amaciamento da carne, o que pode colaborar para melhor entender e gerar novas estratégias de seleção nos programas de melhoramento genético de bovinos Nelore.

The objective of this study was to evaluate the association of gene expression and proteomics with meat tenderness in Nellore cattle. From population of 90 animals three experimental groups were selected by shear force (SF) and/or myofibrillar fragmentation index (MFI): moderately tender meat, moderately tough meat and very tough meat. Gene expression was evaluated by real-time PCR and proteomics analysis was performed based on protein separation by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and characterisation by eletrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS/MS). Expression of the calpastatin isoform (CAST2) was up-regulated (P<0.05) in the moderately tough and very tough meat groups. Expression of the HSP90AA1, DNAJA1 and HSPB1 genes, wich represent the heat shock proteins Hsp90, Hsp40 and Hsp27, respectively, were down-regulated (P<0.05) in the moderately tender meat in relation to the very tough group. In the proteomics analysis, the expression of the protein spots of metabolism TPI1 and PGM1, structural protein PFN1, and aminopeptidase LAP3 were up regulated (P<0.05) in the moderately tender meat, while the expression of structural proteins (ACTA1, ACTB, ACTG1 and MLC1), oxidative stress (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), heat shock protein (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 and HSPB1) and co-chaperones and cellular regulatory (CD37, STIP1 and ARHGDIA) were down regulated (P>0.05) in the same experimental group. The present results suggest an important view of possible new biological markers in the meat tenderization process, wich permit to unsderstand and generate new strategies for selection in Nellore cattle breeding programs.