Kinetic vitrification: concepts and perspectives in animal sperm cryopreservation

Sperm cryopreservation is an important tool for genetic diversity management programs and the conservation of endangered breeds and species. The most widely used method of sperm conservation is slow freezing, however, during the process, sperm cells suffer from cryoinjury, which reduces their viability and fertility rates. One of the alternatives to slow freezing is vitrification, that consist on rapid freezing, in which viable cells undergo glass-like solidification. This technology requires large concentrations of permeable cryoprotectants (P- CPA's) which increase the viscosity of the medium to prevent intracellular ice formation during cooling and warming, obtaining successful results in vitrification of oocytes and embryos. Unfortunately, this technology failed when applied to vitrification of sperm due to its higher sensitivity to increasing concentrations of P-CPAs. Alternatively, a technique termed 'kinetic sperm vitrification' has been used and consists in a technique of permeant cryoprotectant-free cryopreservation by direct plunging of a sperm suspension into liquid nitrogen. Some of the advantages of kinetic vitrification are the speed of execution and no rate-controlled equipment required. This technique has been used successfully and with better results for motility in human (50-70% motility recovery), dog (42%), fish (82%) and donkey (21.7%). However, more studies are required to improve sperm viability after devitrification, especially when it comes to motility recovery. The objective of this review is to present the principles of kinetic vitrification, the main findings in the literature, and the perspectives for the utilization of this technique as a cryopreservation method.(AU)

Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Canine sperm vitrification with nonpermeable cryoprotectants and coconut water extender

This study was aimed to assess the efficiency of coconut water extender with addition of soy lecithin and sucrose as nonpermeable cryoprotectants for canine semen vitrification, using a simple method that yields a high survival rate of spermatozoa for clinical use. Twelve ejaculates from 12 adult normozoospermic dogs were collected separately by digital manipulation and only the second semen fraction was used in this study. After evaluation of volume, concentration, viability, total and progressive motility, velocity parameters and morphology, semen was diluted with a coconut water extender (50% (v/v(volume per volume)) coconut water, 25% (v/v) distilled water and 25% (v/v) 5% anhydrous monosodium citrate solution) with addition of soy lecithin and fructose at 1% and 0.25M sucrose until final concentration of 100x106 spermatozoa/ml. After equilibration at 5ºC for 60 minutes, semen was vitrified by "direct dropping method" into liquid nitrogen in spheres with a volume of 30 µl. After a week of storage the spheres were devitrified as three of them were dropped into 0.5 mL of CaniPlus AI medium (Minitüb, Germany), which was previously warmed in a water bath at 42ºC for 2 minutes and evaluated about the above mentioned parameters. It was found that vitrification resulted in a lower percentage of viable sperms, normal morphology, total and progressive motilities (p0.05) compared to fresh semen samples. In conclusion, our results demonstrate that vitrification with coconut water extender with addition of 1% soy lecithin and 0.25M sucrose as cryoprotectants, has an excellent potential for routine canine sperm cryopreservation.(AU)

In vitro culture of red-rumped agouti preantral follicles enclosed in fresh and vitrified ovarian tissues using TCM199 plus different pFSH concentrations

Considering the relevance of establishing biodiversity conservation tools, the study aimed to investigate the TCM199 supplemented with different follicle-stimulating hormone (FSH) concentrations on survival and development of fresh and vitrified preantral follicles enclosed in red-rumped agouti ovarian tissues cultured in vitro. In the first experiment, six pairs of ovaries were fragmented and cultured for 6 days according to groups: 10 ng/mL pFSH (FSH10 group) and 50 ng/mL (FSH50 group). Non-cultured tissues were considered as a control. In the second experiment, vitrified/warmed fragments of four pairs of ovaries were cultured with the best concentration of FSH established (cryopreserved and cultured group). Non-cryopreserved (fresh control group) and cryopreserved but non-cultured (non-cultured group) tissues were used as controls. For both experiments, preantral follicles were evaluated for survival and development using morphological and viability analysis by trypan blue staining. After culturing fresh samples, FSH50 showed a higher percentage of morphologically normal follicles when compared to FSH10 (P < 0.05). This same response was observed for primordial follicles. Regardless of the concentrations of FSH used during in vitro culture, no difference was observed regarding the percentage of viable follicles and diameters (P > 0.05). Thus, the FSH50 group was used for second experiment, in which 76.2 ± 7.2% normal preantral follicles previously vitrified was found after 6-day culture, also presenting the highest values (P < 0.05) for morphology of primordial follicles (95.2 ± 4.7%). Nevertheless, in vitro culture did not affect the viability and diameter of preantral follicles of cryopreserved tissues (P > 0.05). In conclusion, TCM199 supplemented with 50 ng/mL FSH was efficient in maintaining the in vitro survival of fresh and vitrified red-rumped agouti preantral follicles. This was the first study related to the in vitro culture of ovarian preantral follicles in this species, aiming to contribute to its conservation.(AU)

Manual collapse of blastocoels in not effective in increasing the viability of vitrified equine embryos / Colabamento manual da blastocele não foi efetivo para aumentar a viabilidade de embriões equinos vitrificados

Embryo cryopreservation methods have been used for commercialization and formation of genetic banks. Cryopreservation of equine embryos <300 µm in diameter, collected at days 6-6.5 after ovulation, allows satisfactory pregnancy rates. However, higher embryo collection rates in mares are obtained when uterine flush is performed between days 7 and 8 after ovulation when embryos are >300 µm in diameter, needing blastocoel collapse for satisfactory resistance to cryopreservation by vitrification. To evaluate the viability of simplified blastocoel collapse by embryo puncture with low technology and low-cost equipment, 22 embryos, collected at day 8 post-ovulation (D8), were allocated to the following groups: (1) micropuncture with a 30 G needle, assisted by a mechanical micromanipulator, before vitrification (n=4); (2) manual blade microsection before vitrification (n=6); (3) no manipulation prior to vitrification (n=8); and (4) freshly inovulated embryos (n=4). Despite the high re-expansion rates observed after vitrification, embryos manipulated prior to vitrification (groups MP and MS) did not result in pregnancy 25 days after transfer. On the other hand, embryos from groups NM (non-micromanipulated) and FR (freshly inovulated) resulted in pregnancies at 25 days. Under the conditions of the present study, manual blastocoel collapse was not efficient in increasing cryotolerance to vitrification among large embryos, requiring improvements to obtain pregnancies.(AU)

Métodos de criopreservação de embriões têm sido utilizados com diversos objetivos. Maiores taxas de coleta embrio-nária em éguas com lavagem uterina realizada 7 a 8 dias pós ovulação. A criopreservação de embriões equinos com diâmetro <300 µm (6-6,5 dias após a ovulação) permite a obtenção de taxas de prenhez satisfatórias. Embriões com diâmetro >300 µm (7º dia pós-ovulação) somente são adequadamente criopreservados quando submetidos a colabamento da blastocele. Objetivando avaliar a viabilidade da punção da blastocele com equipamento de baixa sofisticação e custo, 22 embriões coletados no 8º. dia pós-ovulação (D8) foram alocados aos seguintes grupos: (1) micropunção com uma agulha 30 G assistida por micromanipula-dor antes da vitrificação (n=4); (2) microssecção manual por lâmina antes da vitrificação (n=6); (3) sem manipulação anterior à vitrificação (n=8); e (4) transferidos a fresco (n=4). Apesar de altas taxas de reexpansão após a criopreservação, os embriões manipulados previamente a vitrificação não resultaram em prenhez aos 25 dias. Tanto os embriões não micromanipulados, quanto os transferidos a fresco resultaram em prenhezes aos 25 dias. A microssecção manual não se mostrou eficiente como método para aumento da criotolerância de embriões grandes, necessitando um aprimoramento visando a obtenção de prenhezes.(AU)

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos

Abstract This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Resumo Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P 0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P 0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P 0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Relative transcript level of BMP15, BAX and CASP3 with qRT-PCR in vitrified equine immature cumulus-oocytes complexes / Relative transcript level of BMP15, BAX and CASP3 with qRT-PCR in vitrified equine immature cumulus-oocytes complexes

Research focused on female gamete vitrification has increased attention to develop a reliable cryopreservation method to preserve immature equine oocytes. Despite the intensive implementation of biotechnological procedures for horse breeding, vitrification of immature equine cumulus-oocyte complexes (COCs) remain to be clearly elucidated. We aimed to determine the relative transcript level of target genes Bone morphogenetic protein 15 (BMP15); Bcl-2-associated X protein (BAX); and Caspase 3 (CASP3) in equine COCs prior to and after vitrification. Ovarian follicles were aspirated from ovaries collected from an abattoir. A total of 240 COCs were collected and distributed into vitrified COCs (VIT, n=120) and nonvitrified (Non-VIT, n=120) groups. Then, COCs were preserved and relative transcript expressions of BMP15, BAX, CASP3 were measured and normalized against GAPDH performed by qRT-PCR. In addition, 38 COCs were evaluated to assess chromatin configuration of germinal vesicl e stage prior and after vitrification by exposure to 10 µg/ml of bisbenzimide. A difference was observed in the COCs' mRNA level of abundance for the BAX gene between the VIT (2.05 ± 0.47) and (0.85 ± 0.08) Non-VIT groups. There was no difference in mRNA relative transcript level of CASP3 and BMP15 in Non-VIT (0.63 ± 0.20 and 1.55 ± 0.73, respectively) compared to VIT (0.64 ± 0.01 and 2.84 ± 2.20, respectively) equine COCs. All COCs where considered at immature stage of development even though COCs in Non-VIT group showed higher condensed chromatin configuration compared to VIT (100% vs 60.7%, respectively). We demonstrate that BMP15 and CASP3 are detected in VIT and Non-VIT immature COCs. In conclusion, BAX is expressed highly in vitrified immature equine COCs and indicates that activation of apoptosis signaling cascades in cells exposed to vitrification.(AU)

Pesquisas sobre a vitrificação de gametas femininos estão sendo realizadas para o desenvolvimento de um método confiável de criopreservação dos complexos cumulus-oócitos (CCOs) na espécie equina. Apesar da implementação intensiva de biotecnologias reprodutivas em equinos, a vitrificação dos CCOs imaturos permanece em estágio experimental em relação à competência celular. O objetivo do estudo foi determinar o nível de transcrição relativo dos genes Proteína morfogenética óssea 15 (BMP15); Proteína X associada a Bcl-2 (BAX); e Caspase 3 (CASP3) em CCOs equinos antes e após a vitrificação. Folículos ovarianos foram aspirados de ovários coletados em matadouro. O total de 240 CCOs foi coletado e distribuído em grupos vitrificados (VIT, n=120) e não vitrificados (N-VIT, n=120). Os CCOs foram preservados e as expressões transcritas relativas de BMP15, BAX, CASP3 foram determinadas pela técnica de qRT-PCR sendo normalizadas em relação ao GAPDH. Além disso, 38 CCOs foram avaliados para determinar a configuração da cromatina no estágio de vesícula germinativa antes e após a vitrificação pela exposição a 10 µg/ml de bisbenzimida. Os resultados mostraram uma diferença no nível de abundância de mRNA dos CCOs para o gene BAX entre os grupos VIT (2,05 ± 0,47) e N-VIT (0,85 ± 0,08). Não houve diferença no nível de transcrição relativa do mRNA de CASP3 e BMP15 nos CCOs do grupo N-VIT (0,63 ± 0,20 e 1,55 ± 0,73, respectivamente) em comparação com VIT (0,64 ± 0,01 e 2,84 ± 2,20, respectivamente). Todos os CCOs foram considerados em estágio imaturo de desenvolvimento, embora os CCOs no grupo N-VIT apresentaram a configuração de cromatina condensada em maior número de células avaliadas em comparação com VIT (100% vs 60,7%, respectivamente). Demonstramos que BMP15 e CASP3 são detectados em CCOs imaturos em VIT e N-VIT. Conclui-se que o BAX é altamente expresso em CCOs equinos imaturos vitrificados sendo relacionado à sinalização de apoptose em células expostas ao processo de vitrificação.(AU)

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.(AU)

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.(AU)

Avanços na andrologia de animais selvagens / Advances in wild animal andrology

As tecnologias de reprodução assistida (TRA) são de fundamental importância para a conexão de indivíduos em diferentes localidades, facilitando assim o intercâmbio genético e favorecendo a variabilidade genética de uma espécie. Por esta razão, as TRAS podem ser ferramentas importantes para a conservação de espécies ameaçadas de extinção. Apesar dos esforços nas últimas décadas, o avanço no desenvolvimento de tais tecnologias está aquém à urgência de reverter processos de baixa variabilidade genética em algumas espécies. A necessidade de refinamento das técnicas para as particularidades fisiológicas e comportamentais de cada espécie, somada à raridade de acesso aos animais são os principais fatores relacionados as dificuldades em se avançar com as TRAS. As técnicas mais recentes desenvolvidas para a recuperação de espermatozoides em animais selvagens são a colheita farmacológica, com uso de alfa-2-agonistas e a criopreservação / vitrificação testicular com posterior cultivo. Pouco de avançou, no entanto, em relação aos métodos de criopreservação, prevalecendo associação clássica de TRIS-gema-glicerol. Discutimos, então os métodos usados para acesso ao gameta masculino em espécies selvagens e suas aplicações na conservação animal.(AU)

Assisted reproduction technologies (ART) are of fundamental importance for connecting individuals in different locations, thus facilitating genetic exchange and favoring the genetic variability of a species. For this reason, TRAS can be important tools for the conservation of endangered species. Despite efforts in recent decades, the advance in the development of such technologies is short of the urgency of reversing processes of low genetic variability in some species. The need to refine the techniques for the physiological and behavioral particularities of each species, added to the rarity of access to animals, are the main factors related to the difficulties in advancing with TRAS. The most recent techniques developed for sperm collection in wild animals are pharmacological collection, with the use of alpha-2-agonists and testicular cryopreservation / vitrification with subsequent cultivation. Little progress has been made, however, in relation to cryopreservation methods, prevailing the classic association of TRIS-yolk-glycerol. We therefore discuss the methods used to access the male gamete in wild species and their applications in animal conservation.(AU)

Uso da galactose na vitrificação de sêmen ovino em palhetas / Use of galactose to vitrify ram semen in straws

A vitrificação de espermatozoides é uma técnica que apresenta grande potencial para criopreservação de material genético, e sua eficácia tem sido superior aos métodos convencionais em algumas espécies. No entanto, existem poucos estudos sobre sua eficiência com sêmen ejaculado de carneiros e o uso da galactose como crioprotetor extracelular durante a vitrificação. Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da galactose (0,01 M), associada ou não ao glicerol (3% e 7%), em meio comercial (Steridyl® - controle), na criopreservação de espermatozoides de carneiros pelo método de palhetas, comparando o método clássico de congelação e a vitrificação. Ejaculados de seis carneiros da raça Dorper em idade reprodutiva foram coletados com vagina artificial, aliquotados, diluídos individualmente (100 × 106 espermatozoides/mL) nos meios testados, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos à congelação clássica ou vitrificação. Foram analisadas a cinemática, morfologia, morfometria, viabilidade, integridade física e funcional da membrana espermática. A congelação clássica obteve melhores resultados de motilidade total e progressiva do que a vitrificação nos quatro extensores testados, uma vez que as amostras vitrificadas não apresentaram motilidade pós-reaquecimento (p < 0,05). A adição de galactose ou glicerol ao meio comercial não trouxe efeito benéfico tanto para a vitrificação quanto congelação clássica.

Sperm vitrification is a technique with great potential for cryopreservation of genetic material, with superior effectiveness compared to conventional methods in some species. However, few studies have shown its efficiency with ejaculated sperm of rams and the use of galactose as an extracellular cryoprotectant during vitrification. This study aimed to evaluate the effect of galactose (0.01 M), with or without glycerol addition (3% and 7%) in a commercial extender (Steridyl® - control) for ram sperm cryopreservation in straws, comparing the classic freezing method and vitrification. Ejaculates from six breeding soundness Dorper rams were collected with an artificial vagina, aliquoted, individually diluted (100 × 106 sperm/mL) on extenders tested, loaded into 0.25 mL straws, and subjected to a classic freezing method or vitrification. Sperm kinematics, morphology, morphometry, viability, and physical and functional integrity of the sperm membrane were evaluated. The classic freezing method resulted in higher total and progressive motility than vitrification, as no motility was detected in vitrified samples after rewarming (p<0.05). The addition of galactose or glycerol to the commercial medium did not benefit both vitrification and the classic freezing method.

Uso da galactose na vitrificação de sêmen ovino em palhetas / Use of galactose to vitrify ram semen in straws

A vitrificação de espermatozoides é uma técnica que apresenta grande potencial para criopreservação de material genético, e sua eficácia tem sido superior aos métodos convencionais em algumas espécies. No entanto, existem poucos estudos sobre sua eficiência com sêmen ejaculado de carneiros e o uso da galactose como crioprotetor extracelular durante a vitrificação. Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da galactose (0,01 M), associada ou não ao glicerol (3% e 7%), em meio comercial (Steridyl® - controle), na criopreservação de espermatozoides de carneiros pelo método de palhetas, comparando o método clássico de congelação e a vitrificação. Ejaculados de seis carneiros da raça Dorper em idade reprodutiva foram coletados com vagina artificial, aliquotados, diluídos individualmente (100 × 106 espermatozoides/mL) nos meios testados, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos à congelação clássica ou vitrificação. Foram analisadas a cinemática, morfologia, morfometria, viabilidade, integridade física e funcional da membrana espermática. A congelação clássica obteve melhores resultados de motilidade total e progressiva do que a vitrificação nos quatro extensores testados, uma vez que as amostras vitrificadas não apresentaram motilidade pós-reaquecimento (p < 0,05). A adição de galactose ou glicerol ao meio comercial não trouxe efeito benéfico tanto para a vitrificação quanto congelação clássica.

Sperm vitrification is a technique with great potential for cryopreservation of genetic material, with superior effectiveness compared to conventional methods in some species. However, few studies have shown its efficiency with ejaculated sperm of rams and the use of galactose as an extracellular cryoprotectant during vitrification. This study aimed to evaluate the effect of galactose (0.01 M), with or without glycerol addition (3% and 7%) in a commercial extender (Steridyl® - control) for ram sperm cryopreservation in straws, comparing the classic freezing method and vitrification. Ejaculates from six breeding soundness Dorper rams were collected with an artificial vagina, aliquoted, individually diluted (100 × 106 sperm/mL) on extenders tested, loaded into 0.25 mL straws, and subjected to a classic freezing method or vitrification. Sperm kinematics, morphology, morphometry, viability, and physical and functional integrity of the sperm membrane were evaluated. The classic freezing method resulted in higher total and progressive motility than vitrification, as no motility was detected in vitrified samples after rewarming (p<0.05). The addition of galactose or glycerol to the commercial medium did not benefit both vitrification and the classic freezing method.

Efeito do resveratrol associado a sacarose em protocolo de vitrificação de tecido ovariano de vacas / Effect of resveratrol associated with sacarosis on ovarian tissue vitrification protocol in cows

The objective of this work was to evaluate the effect of the association of the antioxidant resveratrol with sucrose in a vitrification protocol of ovarian tissue in cows, on the morphology of preantral follicles. Ten ovaries of cows were used, collected in local slaughterhouses, fragmented and distributed to the following treatments: fresh control (Co); toxicity (T); (T0) zero toxicity/ only with base vitrification solution (SBV), (TS) toxicity with SBV plus sucrose, (TR) toxicity with SBV plus resveratrol, (TS+R) toxicity with SBV and sucrose plus resveratrol; and for glazing (V); (VS) vitrification with SBV and sucrose, (VR) vitrification with SBV and resveratrol, (VS+R) vitrification with SBV and sucrose plus resveratrol. Preantral follicles were quantified and classified according to morphology into normal and degenerated. The mean percentages between normal and degenerated follicles did not differ (p>0.05) in the following percentages, normal 51.4% and degenerated 48.60%. In the toxicity test there was a difference (p0.05), demonstrating that the vitrification technique is efficient, but the concentration of cryoprotectants used needs to be re-evaluated. Concluding that the natural antioxidant association resveratrol to sucrose in vitrification and rewarming protocols contributes with reservations for the morphological preservation of preantral follicles in cows.

O que já sabemos sobre a reprodução de fêmeas de grandes felídeos? / What do we already know about the reproduction of big cats' females?

Os grandes felídeos são predadores de topo de cadeia com um papel essencial nos ecossistemas globais. O conceito de Conservação Única propõe a reprodução artificial como uma das ferramentas para reduzir a vulnerabilidade dessas espécies. Este manuscrito teve como objetivo avaliar o que há de novo na reprodução de grandes felídeos na última década. O conhecimento da fisiologia e do comportamento reprodutivo é o primeiro passo para o desenvolvimento de tecnologias reprodutivas em animais selvagens. Nos grandes felídeos, o comportamento copulatório é de fundamental importância, pois necessitam de mecanismos de indução da ovulação, que podem ser mecânicos, sensoriais ou via administração de hormônio luteinizante. O sucesso no cuidado neonatal representa o sucesso da tecnologia reprodutiva em fêmeas. Na última década, o sucesso da inseminação artificial foi relatado apenas em tigres-siberianos e leopardos da Anatólia, e a inseminação de onças-pintadas é foco de pesquisa do Instituto Reprocon, trocando material genético entre ambientes in situ e ex situ por meio de inseminação artificial. Para obter oócitos viáveis de alta qualidade, a técnica de escolha é a colheita de oócitos por laparoscopia. A produção de embriões in vitro enfrenta desafios para a maturação eficiente de oócitos e sua vitrificação eficiente. As técnicas reprodutivas precisam de estudos aprofundados em grandes felídeos para atingir a repetibilidade necessária para uma aplicação eficiente na conservação.

Big cats are apex predators with an essential role in global ecosystems. The One Conservation concept proposes artificial reproduction as one of the tools to reduce the vulnerability of these species. This manuscript aimed to assess what is new in big cat reproduction in the last decade. Knowledge of reproductive physiology and behavior is the first step towards developing reproductive technologies in wild animals. In big cats, copulatory behavior is of fundamental importance because they need ovulation induction mechanisms, which can be mechanical, sensory, or via the administration of the luteinizing hormone. The success in neonatal care represents the success of reproductive technology in females. In the last decade, successful artificial insemination was only reported in Siberian tigers and Anatolian leopards. Jaguar artificial insemination focuses on research at the Reprocon Institute, exchanging genetic material between in situ and ex situ environments thru artificial insemination. The technique of choice is laparoscopic ovum pick-up to obtain high-quality viable oocytes. The production of in vitro embryos faces challenges for the efficient maturation of oocytes and their efficient vitrification. Reproductive technologies need in-depth studies in big cats to achieve the repeatability necessary for efficient application in conservation.

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.(AU)

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.(AU)

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.

Vitrificação de sêmen de peixes teleósteos / Vitrification of teleosts fish semen

A preservação de sêmen de peixes é uma técnica promissora para o desenvolvimento daaquicultura, e consiste na conservação dos gametas masculinos a longo prazo. Dentre os procedimentosde criopreservação de sêmen de peixes, a vitrificação vem sendo desenvolvida como uma alternativa àcriopreservação convencional devido à sua rapidez, praticidade e baixo custo. Apesar dos benefícios, essatécnica possui alguns entraves que limitam seu sucesso, uma vez que consiste em mergulhar a amostradiretamente em nitrogênio líquido, necessitando de grandes quantidades de crioprotetores de ação interna,que podem ser tóxicos. Dessa forma, diferentes protocolos precisam ser testados, a fim de obterresultados satisfatórios após a aplicação da técnica. A vitrificação tem sido utilizada com sucesso parasêmen, ovócitos, embriões e tecidos de mamíferos e, atualmente, alguns protocolos de vitrificação desêmen já foram elaborados para determinadas espécies de peixes com relativo sucesso, contudo maisestudos são necessários para aumentar a viabilidade espermática após o reaquecimento. Portanto, oobjetivo desta revisão é resumir os procedimentos básicos do processo de vitrificação de sêmen de peixese apresentar os principais resultados encontrados na literatura.(AU)

The preservation of fish semen is a promising technique for the development of aquaculture, andconsists in the conservation of male gametes in the long term. Among the procedures forcryopreservation of fish semen, vitrification has been developed as an alternative to conventionalcryopreservation due to its speed, practicality, and low cost. Despite the benefits, this technique has someobstacles that limit its success, since it consists of immersing the sample directly into liquid nitrogen,requiring large amounts of internal cryoprotectants, which can be toxic. Thus, different protocols need tobe tested in order to obtain satisfactory results after the application of the technique. Vitrification hasbeen successfully used for semen, oocytes, embryos and mammalian tissues, and currently some semenvitrification protocols have been developed for certain species of fish with relative success, howeverfurther studies are needed to increase sperm viability after warming. Therefore, the purpose of thisreview is to summarize the basic procedures of the fish semen vitrification process and present the mainresults found in the literature.(AU)

Cryopreservation of Brazilian green dwarf coconut plumules by droplet-vitrification / Criopreservação de coqueiro anão verde do Brasil de Jiqui por vitrificação em gotas

This study evaluated the effect of vitrification solutions and exposure time on the cryopreservation of Brazilian green dwarf coconut plumules (BGD) using the droplet vitrification technique. Explants were excised from BGD mature fruits from the Active Germplasm Bank of Embrapa Tabuleiros Costeiros, Sergipe, Brazil. Firstly, embryos were disinfected, and after excision, plumules were pre-cultivated for 72 hours in Y3 + 0.6 M sucrose + 2.2 g L-1 Gelrite® culture medium. Plumules were exposed to PVS2 and PVS3 solutions for 15 and 30 minutes and rapidly immersed in liquid nitrogen (-196 ºC). After cryopreservation, they were thawed in culture medium solution (Y3 + 1.2 M sucrose) and cultured in regeneration medium. The experimental design was completely randomized in a 2x2 factorial scheme (vitrification solutions per exposure times), with five replicates per treatment. Data were compared by the Tukeys test at 5% probability. Significant differences were observed in the callogenesis percentage for the solutions x exposure time interaction for non-cryopreserved cultures (-NL) and for exposure time after cryopreservation (+NL). PVS2 and PVS3 combined with 15 minutes of exposure promoted the highest callus formation (70 and 100%, respectively) in control cultures. The exposure time of 30 min, regardless of vitrification solution, resulted in 30% embryogenic callus formation after cryopreservation. These results contributed to the long-term conservation of coconut palm.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito das soluções de vitrificação e do tempo de exposição na criopreservação de plúmulas de coqueiro anão verde do Brasil de Jiqui (BGD), pela técnica de vitrificação em gotas. Os explantes foram excisados de frutos maduros oriundos do Banco de Germoplasma Ativo de Embrapa Tabuleiros Costeiros, Sergipe, Brasil. Os embriões foram desinfestados e as plúmulas, após a excisão, pré-cultivadas durante 72 horas em meio de cultura Y3 suplementado com sacarose 0,6 e 2,2 g L-1 Gelrite®. As plúmulas foram expostas em soluções de PVS2 e PVS3 durante 15 e 30 minutos, e rapidamente imersas em nitrogênio líquido (-196 ºC). Após a criopreservação, foram descongeladas na solução de meio de cultura Y3 com 1,2 M de sacarose, e cultivadas em meio de regeneração. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2 (soluções de vitrificação x tempos de exposição), com cinco repetições por tratamento. Os dados foram comparados pelo teste de Tukey à probabilidade de 5%. Observaram-se diferenças significativas na porcentagem de calogênese para a interação entre soluções e tempo de exposição para as culturas não criopreservadas (-NL), e para o tempo de exposição após a criopreservação (+NL). O PVS2 e o PVS3 combinados com 15 minutos promoveram a maior formação de calo (70 e 100%, respectivamente) nas culturas de controle. O tempo de exposição de 30 min, independente da solução de vitrificação, promoveu 30% da formação de calos embriogênicos após a criopreservação. Estes resultados contribuem para a conservação em longo prazo do coqueiro.(AU)

Vitrificação de sêmen de peixes teleósteos / Vitrification of teleosts fish semen

A preservação de sêmen de peixes é uma técnica promissora para o desenvolvimento daaquicultura, e consiste na conservação dos gametas masculinos a longo prazo. Dentre os procedimentosde criopreservação de sêmen de peixes, a vitrificação vem sendo desenvolvida como uma alternativa àcriopreservação convencional devido à sua rapidez, praticidade e baixo custo. Apesar dos benefícios, essatécnica possui alguns entraves que limitam seu sucesso, uma vez que consiste em mergulhar a amostradiretamente em nitrogênio líquido, necessitando de grandes quantidades de crioprotetores de ação interna,que podem ser tóxicos. Dessa forma, diferentes protocolos precisam ser testados, a fim de obterresultados satisfatórios após a aplicação da técnica. A vitrificação tem sido utilizada com sucesso parasêmen, ovócitos, embriões e tecidos de mamíferos e, atualmente, alguns protocolos de vitrificação desêmen já foram elaborados para determinadas espécies de peixes com relativo sucesso, contudo maisestudos são necessários para aumentar a viabilidade espermática após o reaquecimento. Portanto, oobjetivo desta revisão é resumir os procedimentos básicos do processo de vitrificação de sêmen de peixese apresentar os principais resultados encontrados na literatura.

The preservation of fish semen is a promising technique for the development of aquaculture, andconsists in the conservation of male gametes in the long term. Among the procedures forcryopreservation of fish semen, vitrification has been developed as an alternative to conventionalcryopreservation due to its speed, practicality, and low cost. Despite the benefits, this technique has someobstacles that limit its success, since it consists of immersing the sample directly into liquid nitrogen,requiring large amounts of internal cryoprotectants, which can be toxic. Thus, different protocols need tobe tested in order to obtain satisfactory results after the application of the technique. Vitrification hasbeen successfully used for semen, oocytes, embryos and mammalian tissues, and currently some semenvitrification protocols have been developed for certain species of fish with relative success, howeverfurther studies are needed to increase sperm viability after warming. Therefore, the purpose of thisreview is to summarize the basic procedures of the fish semen vitrification process and present the mainresults found in the literature.