Manual collapse of blastocoels in not effective in increasing the viability of vitrified equine embryos / Colabamento manual da blastocele não foi efetivo para aumentar a viabilidade de embriões equinos vitrificados

Embryo cryopreservation methods have been used for commercialization and formation of genetic banks. Cryopreservation of equine embryos <300 µm in diameter, collected at days 6-6.5 after ovulation, allows satisfactory pregnancy rates. However, higher embryo collection rates in mares are obtained when uterine flush is performed between days 7 and 8 after ovulation when embryos are >300 µm in diameter, needing blastocoel collapse for satisfactory resistance to cryopreservation by vitrification. To evaluate the viability of simplified blastocoel collapse by embryo puncture with low technology and low-cost equipment, 22 embryos, collected at day 8 post-ovulation (D8), were allocated to the following groups: (1) micropuncture with a 30 G needle, assisted by a mechanical micromanipulator, before vitrification (n=4); (2) manual blade microsection before vitrification (n=6); (3) no manipulation prior to vitrification (n=8); and (4) freshly inovulated embryos (n=4). Despite the high re-expansion rates observed after vitrification, embryos manipulated prior to vitrification (groups MP and MS) did not result in pregnancy 25 days after transfer. On the other hand, embryos from groups NM (non-micromanipulated) and FR (freshly inovulated) resulted in pregnancies at 25 days. Under the conditions of the present study, manual blastocoel collapse was not efficient in increasing cryotolerance to vitrification among large embryos, requiring improvements to obtain pregnancies.(AU)

Métodos de criopreservação de embriões têm sido utilizados com diversos objetivos. Maiores taxas de coleta embrio-nária em éguas com lavagem uterina realizada 7 a 8 dias pós ovulação. A criopreservação de embriões equinos com diâmetro <300 µm (6-6,5 dias após a ovulação) permite a obtenção de taxas de prenhez satisfatórias. Embriões com diâmetro >300 µm (7º dia pós-ovulação) somente são adequadamente criopreservados quando submetidos a colabamento da blastocele. Objetivando avaliar a viabilidade da punção da blastocele com equipamento de baixa sofisticação e custo, 22 embriões coletados no 8º. dia pós-ovulação (D8) foram alocados aos seguintes grupos: (1) micropunção com uma agulha 30 G assistida por micromanipula-dor antes da vitrificação (n=4); (2) microssecção manual por lâmina antes da vitrificação (n=6); (3) sem manipulação anterior à vitrificação (n=8); e (4) transferidos a fresco (n=4). Apesar de altas taxas de reexpansão após a criopreservação, os embriões manipulados previamente a vitrificação não resultaram em prenhez aos 25 dias. Tanto os embriões não micromanipulados, quanto os transferidos a fresco resultaram em prenhezes aos 25 dias. A microssecção manual não se mostrou eficiente como método para aumento da criotolerância de embriões grandes, necessitando um aprimoramento visando a obtenção de prenhezes.(AU)

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos

Abstract This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Resumo Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P 0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P 0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P 0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.(AU)

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.(AU)

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

O que já sabemos sobre a reprodução de fêmeas de grandes felídeos? / What do we already know about the reproduction of big cats' females?

Os grandes felídeos são predadores de topo de cadeia com um papel essencial nos ecossistemas globais. O conceito de Conservação Única propõe a reprodução artificial como uma das ferramentas para reduzir a vulnerabilidade dessas espécies. Este manuscrito teve como objetivo avaliar o que há de novo na reprodução de grandes felídeos na última década. O conhecimento da fisiologia e do comportamento reprodutivo é o primeiro passo para o desenvolvimento de tecnologias reprodutivas em animais selvagens. Nos grandes felídeos, o comportamento copulatório é de fundamental importância, pois necessitam de mecanismos de indução da ovulação, que podem ser mecânicos, sensoriais ou via administração de hormônio luteinizante. O sucesso no cuidado neonatal representa o sucesso da tecnologia reprodutiva em fêmeas. Na última década, o sucesso da inseminação artificial foi relatado apenas em tigres-siberianos e leopardos da Anatólia, e a inseminação de onças-pintadas é foco de pesquisa do Instituto Reprocon, trocando material genético entre ambientes in situ e ex situ por meio de inseminação artificial. Para obter oócitos viáveis de alta qualidade, a técnica de escolha é a colheita de oócitos por laparoscopia. A produção de embriões in vitro enfrenta desafios para a maturação eficiente de oócitos e sua vitrificação eficiente. As técnicas reprodutivas precisam de estudos aprofundados em grandes felídeos para atingir a repetibilidade necessária para uma aplicação eficiente na conservação.

Big cats are apex predators with an essential role in global ecosystems. The One Conservation concept proposes artificial reproduction as one of the tools to reduce the vulnerability of these species. This manuscript aimed to assess what is new in big cat reproduction in the last decade. Knowledge of reproductive physiology and behavior is the first step towards developing reproductive technologies in wild animals. In big cats, copulatory behavior is of fundamental importance because they need ovulation induction mechanisms, which can be mechanical, sensory, or via the administration of the luteinizing hormone. The success in neonatal care represents the success of reproductive technology in females. In the last decade, successful artificial insemination was only reported in Siberian tigers and Anatolian leopards. Jaguar artificial insemination focuses on research at the Reprocon Institute, exchanging genetic material between in situ and ex situ environments thru artificial insemination. The technique of choice is laparoscopic ovum pick-up to obtain high-quality viable oocytes. The production of in vitro embryos faces challenges for the efficient maturation of oocytes and their efficient vitrification. Reproductive technologies need in-depth studies in big cats to achieve the repeatability necessary for efficient application in conservation.

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.(AU)

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.(AU)

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.

Cryopreservation of Brazilian green dwarf coconut plumules by droplet-vitrification / Criopreservação de coqueiro anão verde do Brasil de Jiqui por vitrificação em gotas

This study evaluated the effect of vitrification solutions and exposure time on the cryopreservation of Brazilian green dwarf coconut plumules (BGD) using the droplet vitrification technique. Explants were excised from BGD mature fruits from the Active Germplasm Bank of Embrapa Tabuleiros Costeiros, Sergipe, Brazil. Firstly, embryos were disinfected, and after excision, plumules were pre-cultivated for 72 hours in Y3 + 0.6 M sucrose + 2.2 g L-1 Gelrite® culture medium. Plumules were exposed to PVS2 and PVS3 solutions for 15 and 30 minutes and rapidly immersed in liquid nitrogen (-196 ºC). After cryopreservation, they were thawed in culture medium solution (Y3 + 1.2 M sucrose) and cultured in regeneration medium. The experimental design was completely randomized in a 2x2 factorial scheme (vitrification solutions per exposure times), with five replicates per treatment. Data were compared by the Tukeys test at 5% probability. Significant differences were observed in the callogenesis percentage for the solutions x exposure time interaction for non-cryopreserved cultures (-NL) and for exposure time after cryopreservation (+NL). PVS2 and PVS3 combined with 15 minutes of exposure promoted the highest callus formation (70 and 100%, respectively) in control cultures. The exposure time of 30 min, regardless of vitrification solution, resulted in 30% embryogenic callus formation after cryopreservation. These results contributed to the long-term conservation of coconut palm.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito das soluções de vitrificação e do tempo de exposição na criopreservação de plúmulas de coqueiro anão verde do Brasil de Jiqui (BGD), pela técnica de vitrificação em gotas. Os explantes foram excisados de frutos maduros oriundos do Banco de Germoplasma Ativo de Embrapa Tabuleiros Costeiros, Sergipe, Brasil. Os embriões foram desinfestados e as plúmulas, após a excisão, pré-cultivadas durante 72 horas em meio de cultura Y3 suplementado com sacarose 0,6 e 2,2 g L-1 Gelrite®. As plúmulas foram expostas em soluções de PVS2 e PVS3 durante 15 e 30 minutos, e rapidamente imersas em nitrogênio líquido (-196 ºC). Após a criopreservação, foram descongeladas na solução de meio de cultura Y3 com 1,2 M de sacarose, e cultivadas em meio de regeneração. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2 (soluções de vitrificação x tempos de exposição), com cinco repetições por tratamento. Os dados foram comparados pelo teste de Tukey à probabilidade de 5%. Observaram-se diferenças significativas na porcentagem de calogênese para a interação entre soluções e tempo de exposição para as culturas não criopreservadas (-NL), e para o tempo de exposição após a criopreservação (+NL). O PVS2 e o PVS3 combinados com 15 minutos promoveram a maior formação de calo (70 e 100%, respectivamente) nas culturas de controle. O tempo de exposição de 30 min, independente da solução de vitrificação, promoveu 30% da formação de calos embriogênicos após a criopreservação. Estes resultados contribuem para a conservação em longo prazo do coqueiro.(AU)

Vitrificação de sêmen de peixes teleósteos / Vitrification of teleosts fish semen

A preservação de sêmen de peixes é uma técnica promissora para o desenvolvimento daaquicultura, e consiste na conservação dos gametas masculinos a longo prazo. Dentre os procedimentosde criopreservação de sêmen de peixes, a vitrificação vem sendo desenvolvida como uma alternativa àcriopreservação convencional devido à sua rapidez, praticidade e baixo custo. Apesar dos benefícios, essatécnica possui alguns entraves que limitam seu sucesso, uma vez que consiste em mergulhar a amostradiretamente em nitrogênio líquido, necessitando de grandes quantidades de crioprotetores de ação interna,que podem ser tóxicos. Dessa forma, diferentes protocolos precisam ser testados, a fim de obterresultados satisfatórios após a aplicação da técnica. A vitrificação tem sido utilizada com sucesso parasêmen, ovócitos, embriões e tecidos de mamíferos e, atualmente, alguns protocolos de vitrificação desêmen já foram elaborados para determinadas espécies de peixes com relativo sucesso, contudo maisestudos são necessários para aumentar a viabilidade espermática após o reaquecimento. Portanto, oobjetivo desta revisão é resumir os procedimentos básicos do processo de vitrificação de sêmen de peixese apresentar os principais resultados encontrados na literatura.(AU)

The preservation of fish semen is a promising technique for the development of aquaculture, andconsists in the conservation of male gametes in the long term. Among the procedures forcryopreservation of fish semen, vitrification has been developed as an alternative to conventionalcryopreservation due to its speed, practicality, and low cost. Despite the benefits, this technique has someobstacles that limit its success, since it consists of immersing the sample directly into liquid nitrogen,requiring large amounts of internal cryoprotectants, which can be toxic. Thus, different protocols need tobe tested in order to obtain satisfactory results after the application of the technique. Vitrification hasbeen successfully used for semen, oocytes, embryos and mammalian tissues, and currently some semenvitrification protocols have been developed for certain species of fish with relative success, howeverfurther studies are needed to increase sperm viability after warming. Therefore, the purpose of thisreview is to summarize the basic procedures of the fish semen vitrification process and present the mainresults found in the literature.(AU)

Vitrificação de sêmen de peixes teleósteos / Vitrification of teleosts fish semen

A preservação de sêmen de peixes é uma técnica promissora para o desenvolvimento daaquicultura, e consiste na conservação dos gametas masculinos a longo prazo. Dentre os procedimentosde criopreservação de sêmen de peixes, a vitrificação vem sendo desenvolvida como uma alternativa àcriopreservação convencional devido à sua rapidez, praticidade e baixo custo. Apesar dos benefícios, essatécnica possui alguns entraves que limitam seu sucesso, uma vez que consiste em mergulhar a amostradiretamente em nitrogênio líquido, necessitando de grandes quantidades de crioprotetores de ação interna,que podem ser tóxicos. Dessa forma, diferentes protocolos precisam ser testados, a fim de obterresultados satisfatórios após a aplicação da técnica. A vitrificação tem sido utilizada com sucesso parasêmen, ovócitos, embriões e tecidos de mamíferos e, atualmente, alguns protocolos de vitrificação desêmen já foram elaborados para determinadas espécies de peixes com relativo sucesso, contudo maisestudos são necessários para aumentar a viabilidade espermática após o reaquecimento. Portanto, oobjetivo desta revisão é resumir os procedimentos básicos do processo de vitrificação de sêmen de peixese apresentar os principais resultados encontrados na literatura.

The preservation of fish semen is a promising technique for the development of aquaculture, andconsists in the conservation of male gametes in the long term. Among the procedures forcryopreservation of fish semen, vitrification has been developed as an alternative to conventionalcryopreservation due to its speed, practicality, and low cost. Despite the benefits, this technique has someobstacles that limit its success, since it consists of immersing the sample directly into liquid nitrogen,requiring large amounts of internal cryoprotectants, which can be toxic. Thus, different protocols need tobe tested in order to obtain satisfactory results after the application of the technique. Vitrification hasbeen successfully used for semen, oocytes, embryos and mammalian tissues, and currently some semenvitrification protocols have been developed for certain species of fish with relative success, howeverfurther studies are needed to increase sperm viability after warming. Therefore, the purpose of thisreview is to summarize the basic procedures of the fish semen vitrification process and present the mainresults found in the literature.

Avaliação da técnica de vitrificação de ovários de camundongos da linhagem B6D2F1, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos - ICTB/Fiocruz-RJ / Evaluation of ovary vitrification technique from B6D2F1 strain belonging to the Institute of Biomodels Science and Technology ICTB / Fiocruz-RJ

Objetivou-se testar a vitrificação de ovários de camundongos do ICTB/Fiocruz. Inicialmente, fez-se coleta e maturação in vitro dos oócitos de ovários a fresco e vitrificados, bem como avaliação de estruturas no cultivo embrionário, pós-fertilização in vitro. Fêmeas B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e divididas em três grupos: grupo 1 (n=30 animais) - oócito de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro (120 fragmentos); grupo 2 (n=15) (controle 1) - oócitos coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro; e grupo 3 (n=15) (controle 2) - oócitos maturados in vivo e fertilizados in vitro. A técnica foi verificada no desenvolvimento embrionário in vitro, que foi avaliado pelo teste de qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperaram-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões ≥ 2 células) entre G1 (8%) e G2 (32%) (P<0,1) e G1 e G3 (49%) (P<0,05), mas não entre G2 e G3 (P>0,05). Para blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (P<0,05). A vitrificação de ovários, a maturação oocitária e a fertilização in vitro são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.(AU)

This work aimed test ovarian vitrification of hybrid mouse from ICTB/Fiocruz. Protocol collection and oocyte in vitro maturation from fresh and vitrified ovaries was established and embryos were evaluated after fertilization. B6D2F1 females were euthanized for ovarian removal (n= 60) and divided into 3 groups: G1 (n= 30) - ovaries fragmented (n= 120), vitrified, matured and fertilized; G2 (n= 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries; G3 (n= 15) - ampulla region oocytes in vitro fertilizated. Viability was verified by thawing, oocyte in vitro maturation and fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by Chi-square test (BioStat 5.0). 123, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significant differences were observed in cleavage rates at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (P< 0.1) and G1 and G3 (49%) (P< 0.05) but not between G2 and G3 (P> 0.05). Blastocysts at 96 hours presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (P< 0.05). Ovary vitrification, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization were available for the production of in vitro mouse embryos.(AU)

Avaliação da técnica de vitrificação de ovários de camundongos da linhagem B6D2F1, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos - ICTB/Fiocruz-RJ / Evaluation of ovary vitrification technique from B6D2F1 strain belonging to the Institute of Biomodels Science and Technology ICTB / Fiocruz-RJ

Objetivou-se testar a vitrificação de ovários de camundongos do ICTB/Fiocruz. Inicialmente, fez-se coleta e maturação in vitro dos oócitos de ovários a fresco e vitrificados, bem como avaliação de estruturas no cultivo embrionário, pós-fertilização in vitro. Fêmeas B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e divididas em três grupos: grupo 1 (n=30 animais) - oócito de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro (120 fragmentos); grupo 2 (n=15) (controle 1) - oócitos coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro; e grupo 3 (n=15) (controle 2) - oócitos maturados in vivo e fertilizados in vitro. A técnica foi verificada no desenvolvimento embrionário in vitro, que foi avaliado pelo teste de qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperaram-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões ≥ 2 células) entre G1 (8%) e G2 (32%) (P<0,1) e G1 e G3 (49%) (P<0,05), mas não entre G2 e G3 (P>0,05). Para blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (P<0,05). A vitrificação de ovários, a maturação oocitária e a fertilização in vitro são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.(AU)

This work aimed test ovarian vitrification of hybrid mouse from ICTB/Fiocruz. Protocol collection and oocyte in vitro maturation from fresh and vitrified ovaries was established and embryos were evaluated after fertilization. B6D2F1 females were euthanized for ovarian removal (n= 60) and divided into 3 groups: G1 (n= 30) - ovaries fragmented (n= 120), vitrified, matured and fertilized; G2 (n= 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries; G3 (n= 15) - ampulla region oocytes in vitro fertilizated. Viability was verified by thawing, oocyte in vitro maturation and fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by Chi-square test (BioStat 5.0). 123, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significant differences were observed in cleavage rates at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (P< 0.1) and G1 and G3 (49%) (P< 0.05) but not between G2 and G3 (P> 0.05). Blastocysts at 96 hours presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (P< 0.05). Ovary vitrification, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization were available for the production of in vitro mouse embryos.(AU)

Phospholipid composition and resistance to vitrification of in vivo blastocyst of a Brazilian naturalized porcine breed / Composição de fosfolipídios e resistência à vitrificação de blastocistos produzidos in vivo de uma raça de suíno naturalizada brasileira

Piau porcine blastocysts were submitted to MALDI-TOF to identify the main phospholipids (PL). After that, in vivo blastocysts (D6) were vitrified (n=52), non-vitrified were used as control (n=42). After warming, blastocysts were in vitro cultured to assess re-expansion and hatching at 24 and 48 hours. Finally, at 48 hours, hatched blastocysts were submitted to RT-qPCR searching for BCL2A1, BAK, BAX and CASP3 genes. For MALDI-TOF, the ion intensity was expressed in arbitrary units. Blastocyst development was compared by Qui-square (P< 0.05). Among the most representative PL was the phosphatidylcholine [PC (32:0) + H]+; [PC (34:1) + H]+ and [PC (36:4) + H]+. Beyond the PL, MALDI revealed some triglycerides (TG), including PPL (50:2) + Na+, PPO (50:1) + Na+, PLO (52:3) + Na+ and POO (52:2) + Na. Re-expansion did not differ (P> 0.05) between fresh or vitrified blastocysts at 24 (33.3%; 32.7%) or 48 hours (2.4%; 13.5%). Hatching rates were higher (P< 0.05) for fresh compared to vitrified at 24 (66.7%; 15.4%) and 48 hours (97.6%; 36.0%). BAX was overexpressed (P< 0.05) after vitrification. In conclusion, Piau blastocysts can be cryopreserved by Cryotop. This study also demonstrated that the apoptotic pathway may be responsible for the low efficiency of porcine embryo cryopreservation.(AU)

Blastocistos de suínos foram submetidos ao MALDI-TOF para se identificarem os principais fosfolipídios (PL). Depois, parte destes embriões (D6) foram vitrificados (n=52), ou permaneceram frescos (grupo controle, n=42). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados in vitro para se avaliar a reexpansão e a eclosão (BE) às 24 e 48 horas. Finalmente, às 48 horas, os BE foram submetidos ao RT-qPCR em busca dos genes BCL2A1, BAK, BAX e CASP3. No MALDI-TOF, a intensidade do íon foi expressa em unidades arbitrárias. O desenvolvimento embrionário foi comparado por qui-quadrado (P<0,05). Entre os PL mais representativos estavam as fosfatidilcolinas [PC (32: 0) + H] +; [PC (34: 1) + H] + e [PC (36: 4) + H] +. Além do PL, o MALDI revelou alguns triglicerídeos (TG), incluindo PPL (50: 2) + Na +, PPO (50: 1) + Na +, PLO (52: 3) + Na + e POO (52: 2) + Na. A reexpansão não diferiu (P>0,05) entre blastocistos frescos ou vitrificados às 24 (33,3%, 32,7%) e 48 horas (2,4%, 13,5%). As taxas de eclosão foram maiores (P<0,05) para o grupo fresco comparado ao vitrificado às 24 (66,7% x 15,4%) e 48 horas (97,6% x 36,0%). O BAX estava mais expresso (P<0,05) após a vitrificação. Concluindo, os blastocistos Piau podem ser criopreservados por Cryotop. Este estudo também demonstrou que a via apoptótica pode ser responsável pela baixa eficiência da criopreservação de embriões suínos.(AU)

Phospholipid composition and resistance to vitrification of in vivo blastocyst of a Brazilian naturalized porcine breed / Composição de fosfolipídios e resistência à vitrificação de blastocistos produzidos in vivo de uma raça de suíno naturalizada brasileira

Piau porcine blastocysts were submitted to MALDI-TOF to identify the main phospholipids (PL). After that, in vivo blastocysts (D6) were vitrified (n=52), non-vitrified were used as control (n=42). After warming, blastocysts were in vitro cultured to assess re-expansion and hatching at 24 and 48 hours. Finally, at 48 hours, hatched blastocysts were submitted to RT-qPCR searching for BCL2A1, BAK, BAX and CASP3 genes. For MALDI-TOF, the ion intensity was expressed in arbitrary units. Blastocyst development was compared by Qui-square (P< 0.05). Among the most representative PL was the phosphatidylcholine [PC (32:0) + H]+; [PC (34:1) + H]+ and [PC (36:4) + H]+. Beyond the PL, MALDI revealed some triglycerides (TG), including PPL (50:2) + Na+, PPO (50:1) + Na+, PLO (52:3) + Na+ and POO (52:2) + Na. Re-expansion did not differ (P> 0.05) between fresh or vitrified blastocysts at 24 (33.3%; 32.7%) or 48 hours (2.4%; 13.5%). Hatching rates were higher (P< 0.05) for fresh compared to vitrified at 24 (66.7%; 15.4%) and 48 hours (97.6%; 36.0%). BAX was overexpressed (P< 0.05) after vitrification. In conclusion, Piau blastocysts can be cryopreserved by Cryotop. This study also demonstrated that the apoptotic pathway may be responsible for the low efficiency of porcine embryo cryopreservation.(AU)

Blastocistos de suínos foram submetidos ao MALDI-TOF para se identificarem os principais fosfolipídios (PL). Depois, parte destes embriões (D6) foram vitrificados (n=52), ou permaneceram frescos (grupo controle, n=42). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados in vitro para se avaliar a reexpansão e a eclosão (BE) às 24 e 48 horas. Finalmente, às 48 horas, os BE foram submetidos ao RT-qPCR em busca dos genes BCL2A1, BAK, BAX e CASP3. No MALDI-TOF, a intensidade do íon foi expressa em unidades arbitrárias. O desenvolvimento embrionário foi comparado por qui-quadrado (P<0,05). Entre os PL mais representativos estavam as fosfatidilcolinas [PC (32: 0) + H] +; [PC (34: 1) + H] + e [PC (36: 4) + H] +. Além do PL, o MALDI revelou alguns triglicerídeos (TG), incluindo PPL (50: 2) + Na +, PPO (50: 1) + Na +, PLO (52: 3) + Na + e POO (52: 2) + Na. A reexpansão não diferiu (P>0,05) entre blastocistos frescos ou vitrificados às 24 (33,3%, 32,7%) e 48 horas (2,4%, 13,5%). As taxas de eclosão foram maiores (P<0,05) para o grupo fresco comparado ao vitrificado às 24 (66,7% x 15,4%) e 48 horas (97,6% x 36,0%). O BAX estava mais expresso (P<0,05) após a vitrificação. Concluindo, os blastocistos Piau podem ser criopreservados por Cryotop. Este estudo também demonstrou que a via apoptótica pode ser responsável pela baixa eficiência da criopreservação de embriões suínos.(AU)

Vitrification of in vitro produced porcine blastocysts: influence of cryoprotectants toxicity and embryo age

Background: Porcine embryos are sensible to all assisted reproduction manipulations, especially the ones that involvecryopreservation. Despite the high cryoprotectant concentrations routinely applied, vitrification is the most effective technique to date. These substances toxicity can also play a negative role in embryo viability. During in vitro porcine embryoproduction, the speed of development is often unevenly distributed. It is possible that their development speed, affectsembryo tolerance to cryoprotectants. This study aimed to evaluate the toxicity of porcine embryos of days 5 or 6 of cultureto cryoprotectant agents; as well as to assess embryo survival to vitrification.Materials, Methods & Results: Parthenogenetic porcine blastocysts and expanded blastocysts of days 5 and 6 of culturewere exposed to toxicity tests (experiments 1 and 2) and vitrification (experiment 3) using different protocols. In the firstexperiment, three different cryoprotectants were used (Dimethyl sulfoxide - DMSO, Ethylene glycol - EG, and Sucrose- SUC), combined in three different associations (G1: 15% EG + 15% DMSO with 0.5 M SUC; G2: 16% EG + 16%DMSO with 0.4 M SUC; G3: 18% EG + 18% DMSO with 0.5 M SUC). In the fresh Control, embryos of day 6 are moresensible than the ones of day 5, whom showed a lower hatching rate (39.7 vs. 60.8%). After the toxicity (Experiment 1)test, the G1 showed better expansion rates in day 6 (50.0 vs 31.0 and 3.6% for G2 and G3) and higher hatching of day 6compared to G2 and G3 (23.2, vs. 8.6 and 0.0% for G2 and G3). The fresh non hatched embryos at day 8, derived at day6, had a lower percentage of cells with cleaved caspase-3 (20.2%) compared with the G1 (30.5%), G2 (31.4%) and G3(30.5%). The hatched embryos of day 5 from G2 had lower total cell number (TCN) compared with the day 6 hatchedembryos, whereas in G1 the TCN was not affected. The second experiment compared EG combined to one of these threeextracellular...

Vitrification of in vitro produced porcine blastocysts: influence of cryoprotectants toxicity and embryo age

Background: Porcine embryos are sensible to all assisted reproduction manipulations, especially the ones that involvecryopreservation. Despite the high cryoprotectant concentrations routinely applied, vitrification is the most effective technique to date. These substances toxicity can also play a negative role in embryo viability. During in vitro porcine embryoproduction, the speed of development is often unevenly distributed. It is possible that their development speed, affectsembryo tolerance to cryoprotectants. This study aimed to evaluate the toxicity of porcine embryos of days 5 or 6 of cultureto cryoprotectant agents; as well as to assess embryo survival to vitrification.Materials, Methods & Results: Parthenogenetic porcine blastocysts and expanded blastocysts of days 5 and 6 of culturewere exposed to toxicity tests (experiments 1 and 2) and vitrification (experiment 3) using different protocols. In the firstexperiment, three different cryoprotectants were used (Dimethyl sulfoxide - DMSO, Ethylene glycol - EG, and Sucrose- SUC), combined in three different associations (G1: 15% EG + 15% DMSO with 0.5 M SUC; G2: 16% EG + 16%DMSO with 0.4 M SUC; G3: 18% EG + 18% DMSO with 0.5 M SUC). In the fresh Control, embryos of day 6 are moresensible than the ones of day 5, whom showed a lower hatching rate (39.7 vs. 60.8%). After the toxicity (Experiment 1)test, the G1 showed better expansion rates in day 6 (50.0 vs 31.0 and 3.6% for G2 and G3) and higher hatching of day 6compared to G2 and G3 (23.2, vs. 8.6 and 0.0% for G2 and G3). The fresh non hatched embryos at day 8, derived at day6, had a lower percentage of cells with cleaved caspase-3 (20.2%) compared with the G1 (30.5%), G2 (31.4%) and G3(30.5%). The hatched embryos of day 5 from G2 had lower total cell number (TCN) compared with the day 6 hatchedembryos, whereas in G1 the TCN was not affected. The second experiment compared EG combined to one of these threeextracellular...(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação

ABSTRACT The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P 0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P 0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.

RESUMO Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P 0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P 0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.

Lipid content and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with forskolin before vitrification

ABSTRACT: The aim of the present study was to evaluate the intracytoplasmic lipid content, development and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with different concentrations of forskolin before vitrification. Embryos were produced from abattoir-derived ovaries and allocated into four groups. In the treatment groups, forskolin was added to the in vitro culture medium on Day 6 and incubated for 24 hours in one of the following concentrations: 2.5M (Forsk 2.5 group), 5.0M (Forsk 5.0 group) or 10.0M (Forsk 10.0 group). Embryos from the control group were cultured without forskolin. On Day 7 of culture, the expanded blastocysts were stained with the lipophilic dye Sudan Black B for determination of the intracytoplasmic lipid content or were cryopreserved via the Vitri-Ingá® procedure. Although there were no significant differences (P>0.05) in the blastocyst rates between the Control group (44.9%) and the other treatments, the embryo production was lower (P 0.05) in Forsk 10.0 group (38.8%) compared to Forsk 2.5 (50.5%) and Forsk 5.0 (54.7%) groups. The intracytoplasmic lipid content (expressed in arbitrary units of pixels) in blastocysts from the Control group (1.00±0.03) was similar (P>0.05) to that found in Forsk 2.5 (0.92±0.03) and Forsk 10.0 groups (1.06±0.03) groups; however the lipid accumulation in blastocysts from Forsk 5.0 group (0.82±0.04) was lower than in the Control group (P 0.05). Based on these results, Forsk 5.0 treatment was tested for cryotolerance and it was observed that the blastocoel re-expansion rate evaluated 24 hours after warming was greater (P 0.05) in Forsk 5.0 group (72.2%) compared to the Control group (46.2%). In conclusion, pre-treatment with forskolin at a concentration of 5.0 M for 24 hours before vitrification is effective in reducing the intracytoplasmic lipid content and, consequently, improves cryotolerance of IVP bovine embryos.

RESUMO: Os embriões foram produzidos a partir de ovários obtidos em abatedouro e foram alocados em quatro grupos experimentais. Nos grupos tratados, o forskolin foi adicionado ao meio de cultivo in vitro no dia 6 do cultivo e os embriões foram incubados durante 24 horas com uma das seguintes concentrações: 2,5M (grupo Forsk 2,5), 5,0M (grupo Forsk 5,0) ou 10,0M (grupo Forsk 10,0). Os embriões do grupo controle foram cultivados na ausência de forskolin. No dia 7 do cultivo, os blastocistos expandidos foram corados com o corante lipofílico Sudan Black B para a determinação do teor de lípidos intracitoplasmáticos ou foram criopreservados através do protocolo Vitri-Ingá®. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) na taxa de produção de blastocistos entre o grupo Controle (44,9%) e os demais tratamentos, todavia observou-se menor produção de embriões (P 0,05) no grupo Forsk 10,0 (38,8%) em comparação com os grupos Forsk 2,5 (50,5%) e Forsk 5,0 (54,7%). A quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos do grupo Controle (1,00±0,03) foi semelhante (P>0,05) a dos grupos Forsk 2,5 (0,92±0,03) e Forsk 10,0 (1,06±0,03); no entanto, o acúmulo de lípidos nos blastocistos do grupo Forsk 5.0 (0,82 ± 0,04) foi menor do que no grupo controle (P 0,05). A partir destes resultados, o grupo Forsk 5,0 foi testado quanto à criotolerância e foi observado que a taxa de re-expansão da blastocele 24 horas após o aquecimento foi maior (P 0,05) no grupo Forsk 5,0 (72,2%) quando comparado ao grupo Controle (46,2%). Em conclusão, o pré-tratamento com forskolin na concentração de 5,0 M durante 24 horas antes da vitrificação foi eficiente para promover a redução da quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos e, consequentemente, melhorou a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro.

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)