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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-207484

Resumo

Células-tronco presentes nos compartimentos da pele são indispensáveis para a manutenção da homeostase, regeneração, reparação tecidual e reconstrução da integridade e funcionalidade após lesões. Em 2001 um protocolo de isolamento de precursores neurais foi adaptado para o isolamento de células-tronco da pele, referidas como precursores derivados da pele (SKPs), as quais foram diferenciadas, posteriormente, em células da linhagem germinativa, abrindo, assim, uma via de exploração para aplicações em biotecnologias da reprodução. Outro relevante aspecto sobre a pele, são as metodologias desenvolvidas para sua conservação e manutenção por longos períodos, o que permite a estocagem de suprimento biológico para inúmeras pesquisas, inclusive em biologia da conservação e criobiologia. Nesse contexto, considerando-se a necessidade de novas técnicas que contribuam para a preservação de espécies de primatas neotropicais e ungulados silvestres, este trabalho teve como objetivo o isolamento de células derivadas da pele de macacos Sapajus apella e de bovinos, buscando-se, em acréscimo, o estabelecimento de um protocolo de criopreservação das amostras, para posterior utilização em biotécnicas da reprodução. Inicialmente, implementou-se um protocolo otimizado de isolamento enzimático de precursores derivados da pele, com o qual foi possível obter SKPs de fetos bovinos, as quais foram positivas para a atividade da enzima fosfatase alcalina, marcadora de pluripotência. Em Sapajus apella foi possível isolar e cultivar células por essa metodologia até a formação de aglomerados. Em seguida, células resistentes a estresse conhecidas como células Muse, foram isoladas de fibroblastos de macaco Sapajus apella e de bovino adulto e em idade fetal. As células resistentes a estresse formaram aglomerados semelhantes a SKPs em amostras dos três animais, indicando a técnica como um método com potencial para a obtenção de esferas multipotentes. Por fim, estabeleceu-se um protocolo para vitrificação de biópsias de pele de macacos Sapajus apella, o qual foi efetivo para manter a integridade de até 88% das células epidermais, preservar boa densidade de fibroblastos e viabilizar a obtenção de células através do cultivo primário por explante. O protocolo de vitrificação proposto nesse estudo, associado às técnicas de isolamento de células derivadas da pele executadas, constituem em valiosa metodologia para a formação de bancos de germoplasma que viabilizem a realização de biotécnicas da reprodução como a clonagem e a geração de gametas in vitro e contribuam para a preservação de espécies silvestres em risco de extinção.

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Stem cells present in the skin compartments are indispensable for the maintenance of homeostasis, regeneration, tissue integrity repair and functionality recovering after injury. In 2001 a protocol for the isolation of neural precursors was adapted for the isolation of skin stem cells, referred as "skin derived precursors" (SKPs), which were able to differentiate into germline cells, thus opening up a line of research in the field of reproduction biotechnology.Another relevant aspect about the skin are the methodologies developed for its conservation and maintenance for long periods, which allows the storage of biological supplies for numerous researches, including conservation biology and cryobiology. In this context, considering the need for new techniques that contribute to the preservation of neotropical primates and wild ungulates species, this work aimed to isolate skin derived cells of Sapajus apella monkeys and bovines. In addition, it was stablished a cryopreservation protocol for the skin samples. Initially, an optimized protocol of enzymatic isolation of skin derived precursors was implemented. It was possible to obtain alkaline phosphatase positive SKPs from bovine fetuses and to isolate and cultures cells from Sapajus apella until cluster formation. Next, stress-tolerant cells also known as Muse cells, were isolated from fibroblastsof Sapajus apella, adult bovine and bovine fetus. The stress-tolerant cells isolated from all three animals generated SKP-like spheres, indicating the technique as a potential method for multipotent spheres obtention. Finally, a protocol for Sapajus apella skin biopsies vitrification was established, which was effective to maintain the integrity of up to 88% of epidermal cells, preserve good fibroblast density and to be established a primary culture of skin explants.The vitrification protocol proposed in this study, associated with the techniques of skin derived cells isolation, constitute a valuable methodology for the formation of germplasm banks that enable the performance of reproductive biotechniques such as cloning and in vitro gametes generation and contribute to the preservation of endangered or threatened wild species.

Biblioteca responsável: BR68.1