Potencial das membranas de células-tronco mesenquimais na regeneração periodontal: uma revisão sistemática de estudos pré-clínicos em modelo animal / Potential of mesenchymal stem cell sheets on periodontal regeneration: a systematic review of pre-clinical animal studies

A periodontite é uma doença inflamatória crônica multifactorial caracterizada pela destruição progressiva do aparelho de suporte periodontal. Atualmente, as técnicas convencionais para regeneração desses tecidos periodontais perdidos tiveram sucesso limitado. A tecnologia de membranas de células usando células-tronco mesenquimais apareceu como uma estratégia promissora na medicina regenerativa periodontal. Embora estudos recentes tenham mostrado o papel das membranas de células-tronco mesenquimais (MSCSs) no aumento dos tecidos de suporte dentário e ósseo, não há uma revisão sistemática focada especificamente na avaliação da regeneração periodontal em modelos animais ortotópicos. Esta revisão tem como objetivo avaliar o potencial das MSCSs na regeneração periodontal em comparação ao controle, em modelos animais experimentais. Estudos pré-clínicos em defeitos periodontais de modelos animais foram considerados elegíveis. A busca eletrônica incluiu as bases de dados MEDLINE, Web of Science, EMBASE e LILACS. Além disso, uma busca manual avaliou as revistas científicas na área de periodontia/regeneração. A revisão sistemática foi conduzida de acordo com as diretrizes de Preferred Reporting Item for Systematic Reviews and Meta-Analyses statement guidelines. A ferramenta do Centro de Revisão Sistemática para Experimentação com Animais de Laboratório (SYRCLE) foi usada para avaliar o risco de viés. Dos 3989 estudos obtidos a partir da busca no banco de dados eletrônicos foram incluídos 17 artigos. Foram empregados MSCSs autólogos, alógenos e xenógenos para melhorar a regeneração periodontal. Estes incluíram MSCSs do folículo dentário (DF), MSCSs do ligamento periodontal (PDL), MSCSs da polpa dentária (DP), MSCSs da medula óssea (BM), MSCSs periosteais alveolares (AP) e MSCSs gengivais (G). Em relação ao protocolo de indução de células, a maioria dos estudos utilizou ácido ascórbico (52,94%), outros utilizaram placas de cultura com polímero termo responsivo (47,06%). Os efeitos adversos, em relação à utilização das MSCSs no sítio doador, não foram identificados na maioria dos estudos, mesmo com o uso adjunto de scaffolds, membranas ou ambos. Meta-análise não foi considerada devido a heterogeneidades metodológicas. PDL-MSCSs demonstrou ser superior para aumento da regeneração periodontal em comparação ao controle, mas em um microambiente inflamatório induzido, DF-MSCSs foram melhores. Os DF-MSCSs parecem estar relacionados à espessura do cemento e dimensão periodontal. Além disso, DP-MSCSs e BM-MSCSs mostraram resultados melhores em comparação com o controle. Em contraste, AP-MSCSs não foram associados a melhorias na regeneração periodontal. A avaliação do risco de viés com a ferramenta da SYRCLE revelou que 44,12% dos estudos apresentavam baixo risco de viés, 55,29% foram incertos e 0,59%, alto risco. A presente revisão sistemática mostrou que as MSCSs podem aumentar a regeneração periodontal em modelos animais de defeito periodontal, fornecendo uma estratégia promissora para aumentar a regeneração periodontal.

Cobalt Chloride as a Hypoxia Mimicking Agent Induced HIF-1α and mTOR Expressions of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

ABSTRACT Objective: To assess the effects of cobalt chloride (CoCl2) as a hypoxia mimicking agent on human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) expression of HIF-1α and mTOR for use in regenerative dentistry. Material and Methods: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated and then cultured. The characteristics of stemness were screened and confirmed by flow cytometry. The experiment was conducted on hypoxia (H) and normoxia (N) groups. Each group was divided and incubated into 24-, 48-, and 72-hours observations. Hypoxic treatment was performed using 100 µM CoCl2 on 5th passage cells in a conventional incubator (37°C; 5CO2). Then, immunofluorescence of HIF-1α and mTOR was done. Data was analyzed statistically using One-way ANOVA and Tukey's HSD. Results: Significant differences were found between normoxic and hypoxic groups on HIF-1α (p=0.015) and mTOR (p=0.000) expressions. The highest HIF-1α expression was found at 48 hours in the hypoxia group, while for mTOR at 24 hours in the hypoxia group. Conclusion: Hypoxia using cobalt chloride was able to increase human umbilical cord mesenchymal stem cells expression of HIF-1α and mTOR.

Avaliação in vitro da fotobiomodulação das SHEDs semeadas em um scaffold de osso bovino mineral desproteinizado e colagenado / In vitro evaluation of photobiomodulation of Stem cells from human exfoliated deciduous teeth seeded in a deproteinized bovine bone mineral with 10% collagen scaffold

A regeneração óssea é um processo importante para oferecer tratamentos reconstrutivos mais rápidos e eficientes, no entanto, limitações técnicas continuam sendo um desafio, assim como a velocidade de formação e maturação óssea. Portanto, as pesquisas têm se voltado para técnicas alternativas na regeneração óssea e atualmente, a engenharia tecidual tem estudado o uso de células tronco para tratamento de perdas ósseas. A eficácia e a taxa de sucesso das diferentes técnicas e scaffolds foram avaliadas. Porém, há pouca informação sobre a eficácia combinada de carreadores xenógenos, células tronco de dentes decíduos esfoliados humano (SHEDs) e a terapia de fotobiomodulação (PBMT) na regeneração de defeitos ósseos. Baseado em estudos prévios, a proposta deste estudo foi avaliar, in vitro, a ação da PBMT, uma técnica com propriedades imunomodulatórias, angiogênicas e com capacidade de aumentar a adesão, proliferação e migração celular ao biomaterial tridimensional de osso bovino mineralizado desproteinizado com colágeno suíno a 10% (OBMDC), semeado com SHEDs, para acelerar e aumentar a taxa de formação óssea. Foi utilizado o laser de diodo, com comprimento de onda de 660nm; 40mW de potência; 3J/cm2 de densidade de energia e 2 segundos de tempo de aplicação após 24h e 72h do plaqueamento. Para avaliar a proliferação, as SHEDs foram descongeladas cultivadas, plaqueadas, semeadas no scaffold de OBMDC e divididas em 8 grupos: 1) Controle 15%; 2) Controle 5%; 3) OBMDC 15%; 4) OBMDC 5%; 5) Laser 15%; 6) Laser 5%; 7) OBMDC-L 15%; 8) OBMDC-L 5% e a análise de proliferação foi realizada por MTT. Para avaliar diferenciação celular, as amostras foram divididas em quatro grupos: 1) Grupo Controle clonogênico: SHEDs cultivadas em meio clonogênico; 2) Grupo Controle mineralizante: SHEDs cultivadas em meio mineralizante; 3) Grupo laser clonogênico: SHEDs cultivadas em meio clonogênico com aplicação de laser; 4) Grupo laser mineralizante: SHEDs cultivada em meio mineralizante com aplicação de laser. Para o grupo laser, as células foram irradiadas no período de 24h e 72h após o plaqueamento e todas as amostras fixadas para análise da formação dos depósitos de cálcio, através do ensaio de vermelho de alizarina após 23 dias de cultivo celular e os dados foram tratados estatisticamente (p0,05). Para avaliar a morfologia celular das SHEDs em todos os grupos, utilizou-se o microscópio invertido de fase em 24h e 72h após o plaqueamento. O grupo OBMDC-L 5% SFB em 72h, demonstrou maior proliferação celular que o grupo Controle (p=0.0286). O grupo laser no meio mineralizante apresentou maior formação de depósito de matriz mineralizada em comparação ao grupo controle em meio clonogênico, controle em meio mineralizante e laser em meio clonogênico (p<0,0001). Considerando as condições experimentais deste estudo, concluiu-se que, in vitro, as SHEDs, semeadas em scaffold OBMDC, proliferaram mais após 2 aplicações de PBMT e houve diferenciação osteogênica das células após 23 dias em meio mineralizante.

Accelerating Wound Healing of Traumatic Ulcer with Topical Application of Dental Pulp Mesenchymal Stem Cell Secretome and Robusta Green Coffee Bean Extract Combination in vivo

ABSTRACT Objective: To investigate the ability of a combination dental pulp mesenchymal stem cell secretome (DPMSCS), robusta green coffee bean extract (RGCBE), and Carboxymethylcellulose-Natrium (CMC-Na) in a Wistar rats model of traumatic ulcers. Material and Methods: Twenty-eight young, male, healthy Wistar rats (Rattus norvegicus) were divided into seven groups randomly: Group K0, group K1-3 (traumatic ulcer rats that received CMC-Na gel for three days), group K1-7 (traumatic ulcer rats that received CMC-Na gel for seven days), group K2-3 (traumatic ulcer rats that received RGCBE for three days), group K2-7 (traumatic ulcer rats that received RGCBE for seven days), group K3-3 (traumatic ulcer rats that received DPMSCS for three days), and group K3-7 (traumatic ulcer rats that received DPMSCS for seven days). An ulcer was made with an amalgam stopper on the right buccal mucosa of the rats. DPMSCS 50% gel was applied to the ulcer on the left buccal mucosa. The ulcer diameter was measured on day 3 and day 7. Results: There was a significant difference in the diameter of the ulcer, the number of neutrophils, and fibroblasts in the treatment group compared to the control group on day 7. Conclusion: A combination of DPMSCS and RGCBE 50% accelerates traumatic ulcer wound healing by lowering ulcer diameter, decreasing neutrophil counts, and increasing fibroblast proliferation in vivo.

Caracterização das subpopulações de células mononucleares dos granulomas centrais de células gigantes dos maxilares / Characterization of mononuclear cell subpopulations of central giant cell granulomas of the jaws

O granuloma central de células gigantes (GCCG) dos maxilares é uma lesão intraóssea benigna, que pode apresentar um curso localmente agressivo. Setenta por cento dessas lesões apresentam mutações em TRPV4, KRAS ou FGFR1. Alguns estudos apontam que a população de células mononucleares parece ser o componente proliferativo da lesão. Essa população de células mononucleares é uma população mista, composta tanto por células mononucleares de origem monocítica quanto por células mesenquimais indiferenciadas. Assim, este estudo avaliou se, quando colocadas em cultura, o componente proliferativo da lesão é composto por células de origem mesenquimais ou de natureza monocítica. Foi estabelecida a cultura de células primárias de GCCG, a partir de uma amostra de conveniência composta por uma linhagem oriunda de uma lesão em mandíbula em paciente do sexo masculino, 20 anos. E, as amostras foram incubadas com os anticorpos CD14 e CD51/CD61, e triplicadas amostrais foram submetidas a citometria de fluxo para identificação das subpopulações de células presentes. Foi observado que somente as células mononucleares permaneciam ao longo das passagens. Pela citometria de fluxo, observou-se predominância de células CD14-CD51-CD61- triplamente negativas, compatível com o perfil esperado para células estromais/mesenquimais. Com base nos resultados, reforça-se a ideia de que as células mononucleares CD14- CD51-CD61- são centrais na patogênese dos GCCG, enquanto as células mononucleares de origem monocítica (CD14+) e as células gigantes semelhantes a osteoclastos (CD51+CD61 +) são reativas.

Central giant cell granuloma (CGCG) of the jaws is a benign intraosseous lesion, which may present an aggressive course. Seventy per cent of these lesions present mutations in TRPV4, KRAS or FGFR1. The population of mononuclear cells seems to be the proliferative component of the lesion. This mononuclear cell population is a mixed population, composed of both mononuclear cells of monocytic origin and undifferentiated mesenchymal cells. Thus, this study evaluated whether, when placed in culture, the proliferative component of (CGCG) is composed of mesenchymal cells or monocytic cells. The culture of primary CGCG cells was established from a convenience sample composed of a lineage originated from a mandibular lesion in 20 y.o. male patient. The samples were incubated with CD14 and CD51/CD61 antibodies, and triplicate samples were submitted to flow cytometry to identify the subpopulations of cells. It was observed that only mononuclear cells remained along the passages. By flow cytometry, a predominance of triple negative CD14-CD51-CD61- cells was observed, compatible with the expected profile for stromal/mesenchymal cells. Our results reinforce the idea that the mesenchymal cells (CD14-CD51-CD61-) have central importance in the CGCG pathogenesis, while the mononuclear cells of monocytic origin (CD14+) and the osteoclast-like giant cells (CD51+CD61+) are reactive.

Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Over Platelet Rich Fibrin Scaffold for Mandibular Cartilage Defects Regenerative Medicine

ABSTRACT Objective: To evaluate the regeneration of mandibular cartilage defect after implantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSC) over platelet rich fibrin (PRF) as scaffold. Material and Methods: 20 male Wistar rats were randomly divided into four experimental groups consisting of: a control group featuring untreated mandibular defects (C), experimental groups whose mandibular defects were implanted with hUCMSC (E1), mandibular defects implanted with PRF (E2), mandibular defects implanted with hUCMSC and PRF scaffold (E3). The subjects were sacrificed after six weeks of observation for immunohistochemical examination in order to evaluate the expression of Ki67, Sox9, FGF 18, type 2 collagen, and aggrecan, in addition to histology examination to evaluate chondrocyte number and cartilage thickness. Data was analyzed with univariate analysis (ANOVA). Results: The implantation of hUCMSC and PRF scaffold proved capable of regenerating mandibular cartilage defect through the expression of FGF 18, Sox9, Ki67, chondrosis counts, type 2 collagen, aggrecan, and cartilage thickness. The regeneration were significantly higher in group E3. Conclusion: Human umbilical cord mesenchymal stem cells in platelet rich fibrin scaffold proved capable of regenerating mandibular cartilage defect.

Influência de scaffolds à base de cimento de aluminato de cálcio incorporados com células mesenquimais na regeneração óssea: estudo in vivo / Influence of scaffolds based on calcium aluminate cement, incorporated with mesenchymal cells, in bone regeneration: an in vivo study

O cimento de aluminato de cálcio (CAC) tem se tornado um biomaterial de destaque para a neoformação óssea devido às suas propriedades físicas, mecânicas e biocompatibilidade, além de possuir coeficiente de expansão térmica similar ao osso humano. O objetivo neste trabalho foi avaliar o potencial de regeneração óssea de scaffolds à base de CAC, incorporados ou não com células mesenquimais (MSC) em defeitos ósseos realizados em fêmures de ratos. Foram produzidos 48 scaffolds de CAC e suas blendas fosfato tricálcico (FOSF), óxido de zinco (ZNO) e zircônia (ZIRC), sendo que metade destes foram incorporados com MSC. Vinte e três ratos Wistar foram utilizados, sendo 03 para isolamento das MSC e 20 para confecção de defeitos ósseos em ambos os fêmures. Estes, receberam scaffolds do mesmo material incorporados com MSC do lado esquerdo e não incorporados do lado direito (n=5); e foram eutanasiados 21 dias após o procedimento cirúrgico.Na análise dos scaffolds por microscopia eletrônica de varredura foram verificadas estruturas com poros abertos e interconectados, além de adesão celular em todos os grupos.Na análise histológica, foi observado que todos os grupos apresentaram trabéculas ósseas neoformadas, entremeadas por células da medula óssea e tecido conjuntivo. Na histomorfometria, para os scaffolds não incorporados com MSC, observou-se que o grupo ZIRC apresentou maior neoformação óssea e nos scaffolds incorporados com MSC, o grupo FOSF demonstrou melhores resultados, ambos exibindo diferença estatística para os demais grupos (p<0,05). Na análise intragrupos, todos os grupos exibiram maior neoformação óssea quando incorporados com MSC, exceto o grupo ZIRC, único que apresentou melhores resultados quando não incorporado com MSC. Concluiu-se que scaffolds da blenda ZIRC promovem maior neoformação óssea, porém, quando estes são incorporados com MSC, a blenda FOSF exibe os melhores resultados. A incorporação de MSC influenciou positivamente a neoformação óssea, exceto na blenda ZIRC. Concluiu-se ainda que, dentre todos os grupos, o ZIRC sem células e o FOSF com células mostraram-se mais promissores na neoformação óssea, sem diferença estatística entre eles (p<0,05)(AU)

Calcium aluminate cement (CAC) has become a prominent biomaterial for bone neoformation due to its physical, mechanical and biocompatibility properties, in addition to having a coefficient of thermal expansion similar to human bone. The objective of this work was to evaluate the bone regeneration potential of scaffolds based on CAC, incorporated or not with mesenchymal cells (MSC) in bone defects performed in rat femurs. 48 CAC scaffolds and their tricalcium phosphate (FOSF), zinc oxide (ZNO) and zirconia (ZIRC) blends were produced, half of which were incorporated with MSC.Twenty three Wistar rats were used, being 03 for isolation of MSC and 20 for making bone defects in both femurs. These received scaffolds of the same material incorporated with MSC on the left side and not incorporated on the right side (n = 5); and were euthanized 21 days after the surgical procedure. In the analysis of the scaffolds by scanning electron microscopy, structures with open and interconnected pores were verified, in addition to cell adhesion in all groups. In the histological analysis, it was observed that all groups presented bone trabeculae. neoformed, interspersed with bone marrow cells and connective tissue. In histomorphometry, for the scaffolds not incorporated with MSC, it was observed that the ZIRC group showed greater bone neoformation and in the scaffolds incorporated with MSC, the FOSF group demonstrated better results, both showing statistical difference for the other groups (p <0.05). In the intragroup analysis, all groups exhibited greater bone neoformation when incorporated with MSC, except for the ZIRC group, the only one that showed better results when not incorporated with MSC. It was concluded that scaffolds from the ZIRC blend promote greater bone neoformation, however, when these are incorporated with MSC, the FOSF blend exhibits the best results. The incorporation of MSC positively influenced bone neoformation, except in the ZIRC blend. It was also concluded that, among all groups, ZIRC without cells and FOSF with cells were more promising in bone neoformation, with no statistical difference between them (p <0.05)(AU)

Systemic versus local injection of bone marrow mesenchymal stem cells on 5-fluorouracil treated parotid glands of albino rats / Injeção sistêmica e local de células tronco da medula óssea em glandula parotida de ratos albinos tratados com 5-Fluorouracil

Objective: Head and neck cancer is the sixth leading cancer by incidence worldwide and eighth by death. Recent reports revealed that, not only radiotherapy but also chemotherapy may induce xerostomia. The aim of this study was to compare the possible regenerative effect of BMSCs through systemic and local injections. Material and Methods: 52 male Albino rats were randomly divided into 4 groups: Group 1: 10 rats received 0.5 ml of PBS by injection. Group 2: 14 rats received an intraperitoneal injection of 5-FU drug. Group 3: 14 rats were injected the same dose of 5-FU then received an intraglandular transplantation of BMSCs suspended in 0.5 ml of PBS at day 1 after 5-FU administration. Group 4: 14 rats were injected the same dose of 5-FU then received an intravenous injection of BMSCs suspended in 0.5 ml of PBS via the tail vein at day 1 after 5-FU administration. Results: Histological examination showed that group 2 showed features of severe degenerative changes which increased over time. Group 3 showed increasing amelioration in the ductal structure overtime. Group 4 also showed regenerated ductal elements however concerning apoptotic changes, immunohistochemistry results revealed improvement in both group 3 and 4 over group 2 with no statistical difference between groups 3 and 4. Conclusion: Histological and immunohistochemical features in group 3 and group 4 revealed similar amelioration in regenerative potentials. On the other hand, regenerative features of both experimental groups were statistically significant as compared independently to group 1 (AU)

Objetivo: O carcinoma de cabeça e pescoço é o sexto câncer de maior incidência no mundo sendo a oitava causa de morte por cancer. Relatos recentes revelaram que não apenas a radioterapia, mas também a quimioterapia podem induzir xerostomia. O objetivo desse estudo foi comparar a possivel ação regenerative de BMSCs através de injeção local e sistêmica. Material e Métodos: 52 ratos Albino foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: Grupo 1: 10 ratos que receberam 0.5 ml de injeção de PBS. Grupo 2: 14 ratos que receberam injeção intraperitoneal da droga 5-FU. Grupo 3: 14 ratos que foram injetados com a mesma dose de 5-FU e receberam transplante intraglandular de BMSCs ressuspendidas em 0.5mL de PBS no dia 1 após a administração do 5-FU. Grupo 4: 14 ratos que foram injetados com a mesma dose de 5-FU e receberam injeção intravenosa de BMSCs ressuspendidas em 0.5mL de PBS via veia caudal 1 dia após a administração de 5-FU. Resultados: O exame histológico demonstrou que o grupo 2 apresentou alterações degenerativas severas que se agravaram com o tempo. O Grupo 3 mostrou melhora da estrutura ductal ao longo do experimento. Group 4 também mostrou elementos ductais regenerados. Referente a alterações apoptóticas,análise imunohistoquimica mostrou melhora nos grupos 3 e 4 comparados ao grupo 2, sendo que os grupos 3 e 4 foram estatisticamente semelhantes. Conclusão: Análises histológicas e imunohistoquímicas mostram que os grupos 3 e 4 apresentam melhora no potencial regenerativo Por outro lado, os resultados observados para os dois grupos foi estatisticamente semlhante quando comparados independentemente ao grupo 1 (AU)

Citotoxicidade, genotoxicidade e expressão gênica em células-tronco mesenquimais expostas a materiais endodônticos / Cytotoxicity, genotoxicity and gene expression in mesenchymal stem cells exposed to endodontic cements

No mercado encontramos uma grande variedade de materiais endodônticos disponibilizados para uso clínico, mas diversos estudos mostram divergências de opiniões com relação ao comportamento biológico dos diferentes materiais. Este trabalho teve como objetivos investigar a viabilidade celular, a expressão de genes envolvidos na plasticidade celular e a diferenciação celular em culturas de células- tronco recuperadas de polpa dentária humana (hDPSCs) quando em contato com quatro materiais endodônticos (Endofill, Pulp Canal Sealer, Sealer 26, MTA) rotineiramente utilizados na clínica odontológica. Objetivou também, por meio de uma revisão sistemática, analisar a biocompatibilidade de cimentos de uso endodôntico sobre células tronco de origem dental. Para isto, o metabolismo celular das hDPSCs, quando em contato com os capilares contendo ou não os cimentos, foi avaliado pelo ensaio de MTT (24 e 48 horas) e a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de exclusão do azul de tripan (48 horas). A plasticidade celular, na presença dos capilares contendo ou não os cimentos, foi avaliada pela expressão gênica dos marcadores CD34, CD45, Nestin, CD105, Nanog e OCT-4 por PCR. Finalmente, a diferenciação celular frente aos cimentos endodônticos foi verificada pela expressão dos genes RUNX2, ALP, OC/BGLAP e DMP1 por RT-PCR. Os dados foram analisados pelo teste ANOVA com correção de Bonferroni (p<0.05). Observou-se que os cimentos Pulp Canal Sealer e o Endofill reduziram significativamente a viabilidade e o metabolismo celular quando comparados ao controle após 48 horas (p<0.001). O MTA e o Sealer 26 não interferiram na viabilidade celular em ambos os períodos de avaliação (p>0.05). As hDPSCs, quando cultivadas na presença do MTA e Sealer 26, expressaram os marcadores Nestin, CD105, NANOG e OCT-4, e não expressaram CD34 e CD45. Por sua vez, o MTA e o Sealer 26 interferiram positivamente ou negativamente na expressão gênica de DMP1, OC/BGLAP e RUNX2 em relação ao grupo controle (p<0.05), mas não houve diferença significativa em relação à expressão gênica de ALP (p>0.05). Portanto, MTA e Sealer 26 demonstram boa compatibilidade biológica quando na presença das hDPSCs. A revisão sistemática demonstrou que a maioria dos materiais, apresentam boa compatibilidade quando em contato com as células tronco, estando aptos a serem utilizados na prática clínica.

On the market, we found a wide variety of endodontics cements available for clinical use, but several studies show divergences of opinion regarding the biological behavior of these different materials. This work aimed to investigate cell viability and metabolism, an expression of genes involved in cell plasticity and cell differentiation in stem cell cultures recovered from human dental pulp (hDPSCs) when in contact with four endodontic cements (Endofill, MTA, Pulp Canal Sealer, Sealer 26) routinely used in endodontic clinic. It also aimed, through a systematic review, to analyze the biocompatibility of endodontic materials on dental stem cells. For this, the viability and metabolism of hDPSCs, when it comes into contact with capillaries that included or not cements, was assessed by MTT assay (24 and 48 hours) and exclusion of trypan blue assay (48 hours). Cellular plasticity, with the presence of capillaries containing or not sealers, was evaluated by the genetic expression of the markers CD34, CD45, Nestin, CD105, Nanog and OCT-4 by PCR. Finally, cell differentiation from endodontics sealers was verified by the expression of the RUNX2, ALP, OC/BGLAP and DMP1 genes by RT-PCR. The data were analyzed using the ANOVA test with Bonferroni correction (p<0.05). We note that Pulp Canal Sealer and Endofill sealers decrease cell viability and cellular metabolism when compared to control after 48 hours (p<0.001). MTA and Sealer 26 did not interfere with cell viability in the two evaluation periods (p>0.05). hDPSCs, when grown in the presence of MTA and Sealer 26, express the Nestin, CD105, NANOG and OCT-4 markers, and do not express CD34 and CD45. In turn, MTA and Sealer 26 interfered in the gene expression of DMP1, OC/BGLAP and RUNX2 in relation to the control group (p<0.05), but did not find a significant difference in relation to the ALP gene expression (p>0.05). Therefore, MTA and Sealer 26 demonstrate good biological compatibility when in the presence of hDPSCs. The systematic review showed that almost all materials have good compatibility when in contact with stem cells, being able to be used in clinical practice.

Adult mesenchymal stem cells and their possibilities for Dentistry: what to expect?

ABSTRACT Introduction: Stem cells obtained from the pulp of human deciduous teeth are highly proliferative and plastic multipotent cells, which makes them a relevant model of stem cells, applied in several biomedical areas, with different purposes. Objective: Based on a brief review of the literature, the present work intends to present from conceptual aspects about stem cells, classifications, potential (in vitro and in vivo) applications in dental practice, cell culture, cryopreservation and its importance, ethical and regulatory aspects, as well as the role of the dental surgeon as the endorser responsible for the entire clinical stage that involves the process of collecting stem cells obtained from dental pulps for cryopreservation, with a view to using them under appropriate conditions, in accordance with scientifically proven and justified good laboratory and clinical practices.

RESUMO Introdução: As células-tronco obtidas a partir da polpa de dentes decíduos humanos são células multipotentes altamente proliferativas e plásticas, o que as torna um modelo relevante de células-tronco, aplicado em diversas áreas biomédicas, com diferentes propósitos. Objetivo: A partir de uma breve revisão da literatura, o presente trabalho pretende apresentar desde aspectos conceituais acerca das células-tronco, classificações, potenciais aplicações (in vitro e in vivo) na prática odontológica, cultivo celular, criopreservação e sua importância, aspectos éticos e regulatórios, bem como o papel do cirurgião-dentista como homologador responsável por toda a etapa clínica que envolve o processo de coleta das células-tronco obtidas a partir de polpas dentais para criopreservação, com vistas ao uso em condições adequadas, em acordo com as boas práticas laboratoriais e clínicas cientificamente comprovadas e justificadas.

Lipopolysaccharides' Cytotoxicity on Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Abstract Objective: To show the cytotoxicity of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (LPS) on human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs) to better understand the characteristics for its application in regenerative procedures under periodontopathogen LPS influence. Material and Methods: Ultrapure Porphyromonas gingivalis LPS was used in this study. This research used a frozen stock HUCMSCs, previously confirmed by flow cytometry. The biological characteristics, such as cell morphology, proliferation, and protein expression, were screened. To check the cytotoxicity, HUCMSCs were cultured and divided into two groups, the control group and LPS group with various concentrations from 25 to 0.39 µg/mL. MTT assay was done and the cells were observed and counted. The significance level was set at 5%. Results: The percentage of living HUCMSCs on LPS group were not significantly different among concentrations (p>0.05) from 25 to 0.39 µg/mL, even though there were slight mean decrease between groups, but they were not significant. The duration of 24 hours of exposure of LPS does not significantly lower HUCMSCs viability. Conclusion: LPS does not affect the viability of HUCMSCs. The lower the concentration of LPS, the higher the viability of HUCMSCs.

Cytotoxicity of Calcium Hydroxide on Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Abstract Objective: To examine the cytotoxicity of calcium hydroxide on human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSC) to understand the characteristics for use in regenerative dentistry procedures especially regenerative endodontics. Material and Methods: HUCMSC was isolated, cultured, and confirmed by flow cytometry. The biological characteristics, such as cell morphology, proliferation, and protein expression, were screened. To check the cytotoxicity, HUCMSC was cultured and divided into two groups, the control group (cultured in minimum essential medium (MEM) alpha) and calcium hydroxide group (cultured in MEM alpha and calcium hydroxide). Methyl-thiazole-tetrazolium (MTT) assay was done on different concentrations of calcium hydroxide (0.39 to 25 µg/mL) and the cells were observed and counted. One-way ANOVA test was used with a significance level set at 5%. Results: Flow cytometric analysis confirmed positive of CD73, CD90, CD105, negative of CD45 and CD34. A significant difference was found between the concentration of 6.25 and 3.125 µg/mL (p=0.004). There was no significant difference among 6.25, 12.5 and 25 µg/mL concentrations. There was also no significant difference among 0.39, 0.78, 1.56, and 3.125 µg/mL concentrations. Conclusion: Even though calcium hydroxide is a medicament of choice in clinical endodontics, it decreases the viability of HUCMSC. The lower the concentration of calcium hydroxide, the higher the viability of HUCMSC.

Fotoativação mobiliza pericitos e células de origem neural no reparo da polpa dentária / Photoactivation mobilizes pericytes and cells of neural origin in the repair of dental pulp

Introdução: O laser tem se mostrado capaz de fotoativar células-tronco endógenas induzindo sua diferenciação em múltiplos tecidos, além de modular processos inflamatórios e imunes em microambientes injuriados. Essa terapia é hoje chamada de terapia por fotobiomodulação (PBM) ou simplesmente fotoativação. Células da glia e pericitos - células perivasculares -, por sua vez, têm sido sugeridas como as principais células de reparo da polpa dentária. No entanto, os efeitos da PBM sobre essas células nunca foram explorados utilizando técnicas elegantes (state-of-art) de rastreamento, as quais poderiam prover informações relevantes sobre as interações do laser com os componentes celulares marcados. Objetivos: Este estudo visou verificar a capacidade estimuladora da PBM na mobilização de pericitos e células de origem neural no reparo da polpa dentária após injúria tecidual in vivo. Para isso, foi utilizado um modelo murino(NG2-DsRed/Nestin-GFP) com transgene para pericitos (NG2) e células neurais indiferenciadas (Nestina). Métodos: As polpas dentárias dos primeiros molares superiores dos camundongos (n =12) foram expostas utilizando broca #1190F e lima K #20. O grupo PBM (n = 6) foi tratado imediatamente, 24h, 48h e 72h após a injúria com laser de diodo (InGaAlP; 660nm; 20mW; 5J/cm2; 0,71 W/cm2; 7s; modo contínuo e em contato) e o outro grupo foi mantido como controle(n = 6) sem qualquer tratamento. No 4º dia, os animais foram eutanasiados e os efeitos da aplicação da PBM sobre a mobilização dos pericitos e no reparo da polpa dentária foram verificados por microscopia confocal e por análises histológicas (H&E e azul de toluidina). Polpas dentárias saudáveis foram utilizadas como parâmetro de normalidade (n = 6). Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA seguido pelo post-hoc de Tukey (¿ = 0,05). Resultados: A terapia promoveu a mobilização significativa de pericitos e células indiferenciadas nos cornos pulpares coronários contíguos à região injuriada em relação ao controle (p<0,05). Além disso a PBM mostrou intensa proliferação de capilares terminais nos dentes fotoativados (p<0,05), enquanto manteve sinais de vitalidade pulpar nos terços coronários adjacentes à injúria. Embora não identificados na polpa dentária em nenhum grupo estudado, mastócitos puderam ser observados intactos ou degranulados nos tecidos orais moles adjacentes ao dente fotoativado (p<0,05). Conclusão: A PBM estimulou a a neoformação da microvasculatura tecidual local e contribuiu para o influxo de células potentes para a região injuriada. A PBM pode ser considerada uma terapia adjuvante promissora em tratamentos endodônticos regenerativos da polpa dentária.

Introduction: Laser light has proven to be capable of photoactivate endogenous stem cells inducing their differentiation into multiple tissues, in addition to modulating inflammatoryand immune processes in injured microenvironments. This therapy is now called photobiomodulation therapy (PBM). Glial cells and pericytes ­ the perivascular cells ­ have been identified as the true stem cells of our body. However, the effects of PBM on these cells have never been explored using elegant (state-of-art) tracking techniques, which could providerelevant information about the laser's interactions with these labeled cellular components. Objectives: The goal of this study is to verify the stimulating capacity of PBM in the mobilization of pericytes and other endogenous cells in the repair of the dental pulp upon tissueinjury in vivo using a murine model (NG2-DsRed/Nestin-GFP) with transgenes for pericytes (NG2) and undifferentiated cells (Nestin). Methods: The dental pulps of the animals' first upper molars (n = 12) were exposed using drill 3195 and K#20 file. The PBM group (n = 6) was treated for 3 consecutive days with a diode laser (InGalP; 660nm; 20mW; 5J/cm2 ; 0.71 W/cm2 ;7s; continuous and in contact) and the other group was maintained as control (n = 6) without any treatment. On the 4 th day, the animals were euthanized and the effects of the application ofPBM on the mobilization of pericytes and on the dental pulp repair were verified by confocal microscopy and histological analysis (H&E and toluidine blue), respectively. Healthy dental pulps were used as a normality parameter (n = 6). The data were analyzed by the ANOVA testfollowed by the Tukey's poshoc (α = 0.05). Results: PBM showed an intense proliferation of terminal capillaries in the photoactivated teeth (p<0.05), while signs of pup vitality were observed in the coronal thirds adjacent to the injury site. In addition, the therapy promoted significant mobilization of pericytes and undifferentiated cells in the coronary pulp horns contiguous to the injury concerning the control group (p<0.05). Mast cells could not be identified in the dental pulp of any of the studied groups but could be seen mostly degranulated in the smooth tissues adjacent to the mesial root of the teeth of the photoactivated group (p<0.05). Conclusion: PBM stimulates the pulp tissue microvasculature neoformation and contributes to the influx of potent cells into the injured site. PBM may be a promise adjunct tool in regenerative endodontic procedures of the pulp tissue

Reparo de defeitos ósseos críticos usando hidroxiapatita sintética ou bovina com ou sem fração mononuclear da medula óssea: análise histomorfométrica e imuno-histoquímica / Repair of critical size bone defects using synthetic or bovine hydroxyapatite with or without bone marrow mononuclear fraction: histomorphometric and immunohistochemical analysis

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a regeneração óssea de defeitos ósseos críticos na calvária de ratos com a utilização de enxerto xenógeno Bio-Oss Small ( Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Suíça) e hidroxiapatita sintética, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda., Rio de Janeiro/RJ, Brasil ) puros e enriquecidos com a fração mononuclear medular de célula tronco. Material e métodos: quarenta ratos adultos jovens machos, Sprague Dawley, com doze semanas distribuídos em cinco grupos com oito animais, sendo assim denominados: grupo controle, grupo 1, grupo 2, grupo 3, e grupo 4. Além dos quarenta ratos adultos jovens, mais oito ratos adultos jovens machos, Sprague Dawley, com doze semanas foram utilizados como doadores de medula óssea. Os cinco grupos foram submetidos a defeitos ósseos críticos com trefina de 8 (oito) milímetros de diâmetro, na região temporoparietal. No grupo controle não teve a colocação de biomaterial, no grupo 1 os defeitos críticos foram preenchidos por hidroxiapatita sintética ,0.10 gramas, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda., Rio de Janeiro/RJ, Brasil), no grupo 2 foram preenchidos com hidroxiapatita bovina,0,10 gramas, Bio-Oss Small (Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Suíça), no grupo 3 os defeitos críticos foram preenchidos por hidroxiapatita sintética,0,10 gramas, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda, Rio de Janeiro/RJ, Brasil) enriquecida com 300 µl da fração mononuclear medular de células tronco na concentração de 1 x 10 6, obtida dos animais doadores de medula, e no grupo 4 os defeitos críticos foram preenchidos por hidroxiapatita bovina, 0,10 gramas, Bio-Oss Small (Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Suíça) também enriquecida com 300 µl da fração mononuclear medular de células tronco na concentração de 1 x 10 6, obtida dos animais doadores de medula Após oito semanas, os cinco grupos tiveram todos os animais eutanasiados, por intermédio de overdose anestésica de Pentobarbital (180 mg/ kg intraperitoneal). Os grupos, foram submetidos a análises histomorfométrica, preparados corados com tricrômico de Masson, e técnicas imuno-histoquímica de VEGF e Osteopontina. Não existiu diferença estatisticamente significativa entre os grupos 1, 2, 3 e 4, porém existiu entre o grupo controle e os demais grupos que receberam tratamento para regeneração dos defeitos ósseos críticos.

The present study aimed to evaluate the bone regeneration of critical bone defects in the calvaria of rats using xenogenous grafts, Bio-Oss Small (Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland) and synthetic hypooxypatite, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda., Rio de Janeiro / RJ, Brazil) pure or enriched with the medullary mononuclear fraction of stem cells, in the material and methods: forty young adult male rats, Sprague Dawley, were used, with twelve weeks distributed in five groups with eight animals, being thus named: control group, group 1, group 2, group 3, and group 4. In addition to the forty young adult rats, eight more animals were used as bone marrow donors. The Five groups were submitted to critical size bone defects with 8 (eight) millimeter diameter trephine, in the temporoparietal region. In the control group there was no biomaterial placement, in group 1 the critical size bone defects were filled with synthetic hydroxyapatite, 0,10 grams, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda., Rio de Janeiro / RJ, Brazil), in group 2 they were filled with bovine hydroxyapatite,0,10gramas, Bio-Oss Small (Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland), in group 3 the critical size bone defects were filled with synthetic hydroxyapatite,0,10 grams, (Alobone poros Osseocon Biomateriais Ltda., Rio de Janeiro / RJ, Brazil) enriched with 300 µl of BMMF containing 1x106 cells, obtained from bone marrow donors animals, and in group 4 the critical size bone defects were filled with bovine hydroxyapatite, 0,10 grams Bio-Oss Small (Bio-Oss® Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland) enriched with 300 µl of BMMF containing 1x106 cells, obtained from bone marrow donors animals. After eight weeks, all five of animals were euthanized by Pentobarbital anesthetic overdose (180 mg / kg intraperitoneal). The groups were submitted to histomorphometric analysis, using Masson's trichrome Stain, and immunohistochemical techniques of VEGF and Osteopontin. There was no statistically significant difference among groups 1, 2, 3 and 4, but it did exist with the control group and the other groups that received treatment for the regeneration of critical bone defects.

Efeito da ativação do receptor ativado por protease do tipo 2 (PAR-2) sobre a atividade osteogênica de células mesenquimais do ligamento periodontal / Effect of type 2 protease activated receptor (PAR-2) activation in the osteogenic activity of the periodontal ligament stem cells

O receptor ativado por protease do tipo 2 (PAR-2) está associado à patogênese de doenças inflamatórias crônicas, incluindo periodontite, e a ativação do PAR-2 desempenha papel relevante no processo inflamatório. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da ativação do PAR-2 na atividade osteogênica de células-tronco do ligamento periodontal humano (PDLSCs). PDLSCs obtidos de 3 sujeitos foram cultivados em meio controle ou em meio osteogênico por 2, 7, 14 e 21 dias. Proliferação celular, atividade da fosfatase alcalina (ALP), expressão gênica (qPCR) e expressão proteica (ensaio ELISA) de fatores osteogênicos e depósitos de cálcio, concentração de cálcio (sobrenadante) foram avaliados na presença de tripsina (0,1 U/ml), peptídeo agonista de PAR-2 (100nM), peptídeo antagonista de PAR-2 (100 nM) e peptídeo controle de PAR-2. A ativação do PAR-2 levou à alteração na proliferação celular, diminuição na formação de depósitos de cálcio (p <0,05), na concentração de cálcio (p<0,05) e atividade da ALP (p <0,05). Além disso, os ensaios de qPCR e ELISA mostraram que a ativação de PAR-2 pode aumentar a expressão gênica e protéica de RANKL (p<0,05) e diminuir a expressão gênica e proteica de OPG (p<0,05). Os resultados do presente estudo demonstram que a ativação do PAR-2 aumenta a proliferação e diminuem a atividade osteogênica dos PDLSCs, indicando que o PAR-2 pode ser um alvo importante a ser considerado no uso de células mesenquimais do ligamento periodontal em procedimentos regenerativos em periodontia.

Behavior of Mesenchymal Stem Cells Obtained From Dental Tissues: A Review of the Literature / Comportamiento de células mesenquimales obtenidas de tejidos dentales: Revisión de literatura

Abstract 20. The success of tissue engineering in combination with tissue regeneration depends on the behavior and cellular activity in the biological processes developed within a structure that functions as a support, better known as scaffolds, or directly at the site of the injury. The cell-cell and cell-biomaterial interaction are key factors for the induction of a specific cell behavior, together with the bioactive factors that allow the formation of the desired tissue. Mesenchymal Stem Cells (MSC) can be isolated from the umbilical cord and bone marrow; however, the behavior of Dental Pulp Stem Cells (DPSC) has been shown to have a high potential for the formation of bone tissue, and these cells have even been able to induce the process of angiogenesis. Advances in periodontal regeneration, dentin-pulp complex, and craniofacial bone defects through the induction of MSC obtained from tooth structures in in vitro-in vivo studies have permitted the obtaining of clinical evidence of the achievements obtained to date.

Resumen 24. El éxito de la ingeniería de tejidos en combinación con la regeneración de tejidos depende del comportamiento y la actividad celular en los procesos biológicos desarrollados dentro de una estructura que funciona como soporte mejor conocida como andamio o directamente en el sitio de la lesión. La interación célula-célula y célula-biomaterial son factores claves para la inducción a un comportamiento célular específico junto con factores bioactivos que permitan la formación del tejido deseado. Las células troncales mesenquimales (MSCs) pueden ser aisladas del cordón umbilical y de la medula ósea, sin embargo, el comportamiento de las células troncales de pulpa dental (DPSCs) han demostrado tener un alto potencial para la formación de tejido óseo e incluso han logrado inducir el proceso de angiogénesis. Avances en la regeneración periodontal, complejo dentino-pulpar y defectos óseos craneofaciales a travez de la inducción de MSCs obtenidas de estructuras de dientes en estudios in vitro-in vivo han permitido obtener evidencia clínica de los logros obtenidos hasta el momento.

Papel dos receptores ß1 e ß2 adrenérgicos sobre a diferenciação osteoblástica de células mesenquimais estromais da medula óssea de ratos espontaneamente hipertensos / Role of ß1 and ß2 adrenergic receptor on bone marrow mesenquimal stem cells osteoblastic differentiation from hypertensive rats

Introdução: O remodelamento ósseo é um processo complexo que depende do balanço entre formação e reabsorção óssea, mecanismo regulado pelas células ósseas e fatores sistêmicos, como o Sistema Nervoso Simpático (SNS). Os mediadores deste sistema são capazes de regular o metabolismo ósseo através dos receptores adrenérgicos expressos na superfície dos osteoblastos. Entretanto, o papel dos receptores ß-adrenérgicos ainda não está totalmente elucidado no processo de diferenciação osteogênica. Objetivos: avaliar o papel dos receptores ß-adrenérgicos na diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) foram utilizados para a coleta da medula óssea a partir do fêmur, as quais foram plaqueadas em garrafas de cultivo celular e depois em placas de 24 poços, onde receberam o meio osteogênico (MO: MEM, mais 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de ß-glicerofosfato e 10-8 M de dexametasona), e o tratamento com Isoprenalina (0,01 µM), Carvedilol (1 µM), antagonista adrenérgico não seletivo, ou Nebivolol (0,1 µM), antagonista ß1-adrenérgico. O ensaio de proliferação celular (MTT) e a atividade de fosfatase alcalina (Fal) foram realizados nos dias 7, 10 e 14. A mineralização foi avaliada no dia 14 através do vermelho de Alizarina. A expressão gênica dos marcadores osteogênicos e dos receptores ß1 e ß2 adrenérgicos foi avaliada no dia 7 por RT-PCR em tempo real. A atividade proteolítica da metaloproteinase de matriz (MMP-2) foi avaliada no mesmo período utilizando zimografia. As vias da MAPK também foram avaliadas ao final de 7 dias. Resultados: A Isoprenalina reduz a fosfatase alcalina na linhagem de células Wistar nos dois primeiros períodos, e ao final de 14 dias apresenta um aumento significativo. A adição dos -bloqueadores reverte tal resposta. Em SHR a Isoprenalina proporciona aumento da atividade de fosfatase alcalina no período intermediário. O Nebivolol inibe essa resposta no mesmo período e, em 7 dias, é capaz de reverter a redução causada pelo agonista. A Isoprenalina aumentou a expressão de todos os fatores de transcrição e o bloqueio dos receptores reverteu essa condição A Isoprenalina aumenta a expressão de Opn, Ocn e BSP nas células de animais Wistar, e em SHR aumenta apenas Ocn e o tratamento com Carvedilol corrige. A atividade de MMP-2 também foi reduzida pelo Nebivolol apenas no grupo Wistar. Além disso, o Nebivolol reduziu a expressão gênica do receptor ß1-adrenérgico. O ensaio de mineralização mostrou menor deposição mineral em Wistar. O Nebivolol também mediou a redução da fosforilação das vias da MAPK neste mesmo grupo de células. Conclusão: Nossos dados sugerem que o receptor ß1-adrenérgico pode estar envolvido na diferenciação osteogênica de células de ratos Wistar mas não em células de ratos SHR(AU)

Introduction: Bone remodeling is a complex process that depends on the balance between formation and resorption bone, a process which is regulated by bone cells and systemic factors, like the Sympathetic Nervous system (SNS). The mediators of these system are able to regulate bone metabolism through adrenergic receptors on the surface os the osteoblastos. However, the role of ß-adrenergic receptors is not clear in he osteogenic differentiation process. Thus, in this study we aimed to evaluate the role of B-adrenergic receptor on osteoblastic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from normotensive and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR). Methods: 70-days-old male Wistar and SHR rats were used for bone marrow collection from femurs, which was placed in cell culture flasks and after in to 24-well plates, where they received osteogenic medium (OM: MEN, plus 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM ß glycerophosphate, and 10-8 M dexamethasone) and the treatment with Isoprenaline (0.01 µM), Carvedilol (1µM), non-selective adrenergic receptor antagonist, or Nebivolol (0,1 µM), ß1-adrenergic receptor antagonist. Cell proliferation (MTT assay) and alkaline phosphatase specific activity (Alp) were analyzed at day 7, 10 and 14. Mineralization was evaluated at day 14, by Alizarin Red S. Gene expression of osteogenic markers and B1 and B2-adrenergic receptor were evaluated at day 7, by real time-RT-PCR. The proteolytic activity of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) were evaluated at day 7 using gelatin zymography. The MAPK pathway was evaluated at the same period. Results: Isoprenaline provides increased alkaline phosphatase activity in the intermediate period. The addition of Nebivolol includes this response over this same period and, within 7 days, was able to reverse the reduced agonist reduction. Isoprenaline increased expression of all transcription factors and receptor blockade reversed this condition Isoprenaline increases expression of Opn, Ocn and BSP in Wistar animal cells, and in SHR only increases Ocn and Carvedilol-corrected treatment. MMP-2 was reduced by Nebivolol treatment just at Wistar cells. Besides that, Nebivolol reduced Adrb1 gene expression at day 7 in Wistar group. Mineralization showed that Nebivolol reduced mineral deposition in Wistar. Nebivolol reduced MAPK proteins phosphorylation. Conclusion: Our results suggest that ß1 adrenergic receptor seems to be involved in the osteogenic differentiation of cells from Wistar rats but not in SHR cells(AU)

Retinoic acid increases the effect of bone morphogenetic protein type 2 on osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells

Abstract Bone morphogenetic protein type 2 (BMP-2) and retinoic acid (RA) are osteoinductive factors that stimulate endogenous mechanisms of bone repair which can be applied on management of osseous defects in oral and maxillofacial fields. Objective Considering the different results of RA on osteogenesis and its possible use to substitute/potency BMP-2 effects, this study evaluated the outcomes of BMP-2, RA, and BMP-2+RA treatments on in vitro osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (ASCs) and the signaling pathway(s) involved. Material and Methods ASCs were treated every other day with basic osteogenic medium (OM) alone or supplemented with BMP-2, RA, or BMP-2+RA. Alkaline phosphatase (ALP) activity was determined using the r-nitrophenol method. Extracellular matrix mineralization was evaluated using von Kossa staining and calcium quantification. Expression of osteonectin and osteocalcin mRNA were determined using qPCR. Smad1, Smad4, phosphorylated Smad1/5/8, BMP-4, and BMP-7 proteins expressions were analyzed using western blotting. Signaling pathway was evaluated using the IPA® software. Results RA promoted the highest ALP activity at days 7, 14, 21, and 28, in comparison to BMP-2 and BMP-2+RA. BMP-2+RA best stimulated phosphorylated Smad1/5/8 protein expression at day 7 and Smad4 expression at days 7, 14, 21, and 28. Osteocalcin and osteonectin mRNA expressions were best stimulated by BMP-2+RA at day 7. Matrix mineralization was most improved by BMP-2+RA at days 12 and 32. Additionally, BMP-2+RA promoted the highest BMP signaling pathway activation at days 7 and 14, and demonstrated more activation of differentiation of bone-forming cells than OM alone. Conclusions In summary, RA increased the effect of BMP-2 on osteogenic differentiation of human ASCs.

Cultura de células osteogênicas primárias a partir de osso de baixa densidade e análise do reparo ósseo periimplantar em ratas osteoporóticas em função da texturização de superfície por meio da oxidação por plasma eletrolítico / Primary cell culture from low-density bone and analysis periimplantar bone repair in osteoporotic rats as a function of surface texturing by electrolytic plasma oxidation

O objetivo deste estudo foi avaliar um novo método de texturização por PEO com incorporação de Ca e P na superfície do Ti-6Al-4V em ossos de baixa densidade, por meio de avaliação in vitro, ex-in vivo e in vivo, em função de parâmetros topográficos e reparacionais. 57 ratas Wistar (Rattus novergicus), sendo 38 ratas com 6 meses de idade (Grupos OXV - submetidas à ovariectomia e SHAM - cirurgia fictícia) e 19 ratas senis (18 meses de idade: Grupo SENIL), foram divididas para realização do estudo ex-in vivo (n=9) e in vivo (n=48). Os grupos para análise ex-in vivo foram submetidos à eutanásia e os fêmures foram removidos e transportados em meio de cultura contendo meio essencial mínimo modificação alfa (α- MEM) suplementado com 500 µg/mL de gentamicina e 3 µg/mL de fungisona. As células-tronco mesenquimais de medula óssea (CTMsMO) dos fêmures, foram isoladas e cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas em 3 superfícies de discos de Ti-6Al-4V, grupo CONTROLE (superfície usinada) grupo AC (superfície tratada por Ataque Ácido e Jateamento) e grupo PEO (superfície tratada por Oxidação de Plasma Eletrolítico com associação de Cálcio e Fosforo). Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteina óssea (BSP) e osteopontina (OPN), atividade da fosfatase alcalina (ALP) e formação de matriz mineralizada. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA 1 fator ou Kruskal-Wallis (p < 0,05). Nos experimentos in vivo, após 90 dias, foi instalado um implante em cada tíbia, sendo um implante pertencente ao grupo PEO e o outro implante do grupo AC. Após 42 dias da instalação dos implantes, 8 animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia e suas tíbias passaram pela descalcificação, para a análise histológica e imunoistoquímica (OPG, RANKL, OC e TRAP). As demais ratas, após a eutanásia, tiveram suas tíbias coletadas e analisadas em microtomografia computadorizada (BV.TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp e Po(tot)) e, em seguida os implantes submetidos ao torque reverso em torquímetro digital (N.cm). A outra metade das tíbias foram processadas com inclusão em resina fotopolimerizadas para cortes calcificados e assim, a análise por microscopia confocal (calceina e alizarina) e em seguida, análise histométrica. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA 1 fator ou Kruskal-Wallis, seguido de pós teste Tukey; p < 0,05). A análise da viabilidade celular mostrou que em todos os grupos testes de CTMs-MO para SHAM, OVX e SENIL apresentaram um crescimento progressivo nos diferentes tempos de 3, 7 e 10 dias. Avaliação da expressão gênica através dos genes Runx2, SP7/Osterix, ALP, BSP, OC e OPN e analise pela imunofluorecência apresentaram uma leve tendência de melhores respostas nas CTMs-MO SHAM para o grupo AC, CTMs-MO OVX para o grupo PEO e CTMsMO SENIS características semelhantes nos grupos AC e PEO. A atividade da fosfatase alcalina ocorreu maior expressão na superfície PEO no grupo SHAM, maior expressão na superfície CONTROLE no grupo OVX e no grupo SENIL houve um equilíbrio em todas as superfícies. A superfície PEO apresentou maior formação de nódulos de mineralização (21º dia) em todos os grupos. Nos experimentos in vivo, as análises histológicas mostrou maior neoformação óssea no grupo PEO quando comparado ao grupo AC nos grupos SHAM e OVX, e no grupo SENIL foram similares os resultados. A avaliação imunoistoquímica demonstrou um equilíbrio em todos os grupos na comparação de superfícies na proteína TRAP, para o processo de remodelação (OPG e RANKL) e mineralização (OC) nos grupos SHAM e SENIL (p>0,05), ocorrendo uma diminuição no grupo OVX, no qual os resultados do PEO foram mais favoráveis que AC nessa conformação. Na análise microtomográfica, BV.TV os resultados foram semelhantes em ambos os grupos, porém em OVX AC mostrou menor porcentagem de volume ósseo e uma maior porosidade (Po(tot)). A análise biomecânica por torque-reverso (N.cm) mostrou que os maiores valores pertenciam ao grupo PEO. A dinâmica do tecido ósseo representada pelo turnover ósseo, observado através dos fluorocromos (Calceína e Alizarina) mostrou-se similares nos grupos experimentais. As superficies PEO E AC nesse estudo demonstram que possuem uma grande capacidade de promoção da formação óssea independente dos tipos ósseos experimentais (SHAM, OVX e SENIL), tanto na área de contato osso e implante (ELCOI), quanto para a área de osso neoformado (AON). Diante daslimitações do estudo in vitro e in vivo, os resultados foram esclarecedores para acreditar que o método de texturização aqui testado, por meio da Oxidação por Plasma Eletrolítico (PEO), favoreceu à formação óssea, principalmente nos ossos mais críticos (OVX), inclusive evidenciando maior maturação óssea nos períodos mais tardios aqui analisados(AU)

The objective of this study was to evaluate a new PEO texturing method with Ca and P incorporation on the Ti-6Al-4V surface in low bone density, by means of in vitro, ex vivo and in vivo evaluation through topographic and repairment parameters. 57 Wistar rats (Rattus novergicus), being 38 at 6 months of age (OXV Groups - submitted to ovariectomy and SHAM surgery) and 19 senile rats (18 months of age: SENIL Group) were divided into three subgroups: ex-in vivo (n = 9) and in vivo (n = 48). The Groups for ex-in vivo analysis were euthanized and femurs were removed and transported in culture medium containing minimal alpha modification (α- MEM) medium supplemented with 500 µg / ml gentamicin and 3 µg / ml fungizone. The mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC-M) of the femur were isolated and cultured in growth medium to remain as MSCs. After reaching the subconfluence, the cells were grown on 3 surfaces of Ti-6Al-4V discs, CONTROL group (machined surface) group AC (surface treated by etched-acid) and PEO group (surface treated by Electrolytic Plasma Oxidation with the association of Calcium and Phosphorus). Cell viability assays, gene expression of osteoblastic markers, bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), alkaline phosphatase (ALP) activity, and mineralized matrix formation were performed to evaluate cellular responses. Data were submitted to ANOVA 1 factor test or Kruskal-Wallis test (P <0.05). In the groups for the in vivo study, after 90 days, an implant was installed on each tibia, one implant to the PEO group and another implant of the AC group. After 42 days of implant implantation, eight animals from each group underwent euthanasia and their tibiae underwent decalcification for histological and immunohistochemical analysis (OPG, RANKL, OC, and TRAP). The other rats, after euthanasia, had their tibiae collected and analyzed in computerized microtomography (BV.TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp and Po (tot)), and then implants submitted to reverse torque in Digital torque wrench (N.cm). Another half of the tibiae were processed with inclusion in photopolymerized resin for calcified cuts and thus the analysis by confocal microscopy (calcein and alizarin) and then histometric analysis. Data were submitted to 1-factor ANOVA or Kruskal-Wallis test, followed by Tukey test; p <0.05). The cell viability analysis showed that in all groups, MOH tests for SHAM, OVX, and SENIL showed a progressive growth in the different times of 3, 7 and 10 days. Evaluation of gene expression through the Runx2, SP7 / Osterix, ALP, BSP, OC and OPN genes and immunofluorescence analysis showed a slight tendency for better responses in the CTMs- MO SHAM for the AC group, CTMs-MO OVX for the PEO group and CTMs-MO SENIS features similar in AC and PEO groups. The alkaline phosphatase activity was higher on the PEO surface in the SHAM group, the greater expression on the CONTROL surface in the OVX group and the SENIL group showed a balance on all surfaces. The PEO surface presented a higher formation of mineralization nodules in all groups (21st day). For the in vivo analyzes, the histological analysis showed greater bone neoformation in the PEO group when compared to the AC group in the SHAM and OVX groups, and in the SENIL group, the results were similar. The immunohistochemical evaluation showed a balance in all groups in the comparison of surfaces in the TRAP protein, for the remodeling process (OPG and RANKL) and mineralization (OC) in the SHAM and SENIL groups (p> 0.05). OVX group, in which PEO results were more favorable than AC in this confirmation. In the microtomographic analysis, BV.TV the results were similar in both groups, but in OVX AC showed a lower percentage of bone volume and a higher porosity (Po (tot)). Biomechanical analysis by torque-reverse (N.cm) showed that the highest values belonged to the PEO group. The dynamics of the bone tissue represented by the bone turnover observed through the fluorochromes (Calcein and Alizarin) were similar in the experimental groups. The PEO and AC surfaces in this study demonstrate that they have a great ability to promote bone formation independent of experimental bone types (SHAM, OVX, and SENIL), both in the area of bone and implant contact (ELCOI) and in the area of newly formed bone (AON). Considering the limitations of the in vitro and in vivo study, the results were enlightening to believe that the texturing method tested here, through Electrolytic Plasma Oxidation (PEO), favored bone formation, mainly in the most critical bones (OVX), including evidence of increased bone maturation in the later periods analyzed here(AU)

Efeito de diferentes doses de laser de baixa intensidade em células-tronco dentais cultivadas sobre arcabouços de ácido polilático / Effect of different doses of low intensity laser on dental stem cells cultured on polylactic acid scaffolds

As células-tronco mesenquimais dentais (dMSC) têm sido amplamente utilizadas na engenharia tecidual por sua capacidade de auto-renovação e potencial multilinhagem. Dentre as dMSCs, as células-tronco da polpa do dente decíduo esfoliado (SHEDs) destacam-se pela facilidade de coleta, capacidade proliferativa e tempo sobrevivência. O objetivo do estudo foi avaliar, através de experimentos in vitro, o efeito de diferentes doses do laser de baixa intensidade (LBI) na atividade biológica de SHEDs cultivadas sobre arcabouços de ácido polilático (PLA). Células previamente isoladas e caracterizadas foram cultivadas sobre filmes de PLA e foram irradiadas ou não (controle) com um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação contínuo) em um screening de doses (1, 4, 7.5, 15, 22.5 e 30 J/cm²). A proliferação e viabilidade celular foram analisadas nos intervalos de 24, 48 e 72 h, através dos ensaios do Alamar Blue e Live/Dead. A morfologia celular foi avaliada por MEV no intervalo de 72h. A avaliação do estresse oxidativo foi realizada através das dosagens de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH). Densidades de energia de 1 J/cm² e 4 J/cm² promoveram um efeito estimulador da proliferação celular nos três intervalos de tempo quando comparados ao grupo controle e aos demais grupos irradiados. Por outro lado, doses elevadas de irradiação (22.5 e 30 J/cm²) promoveram redução significativa das células. Verificou-se que a viabilidade celular foi afetada ao longo do experimento nos grupos L22.5 e L30, que apresentaram maior quantidade de células mortas no intervalo de 72h. Na análise por MEV evidenciou-se uma maior densidade celular nos grupos L1 e L4, contrapondo-se às SHEDs arranjadas mais dispersamente nos grupos L22.5 e L30. Em relação ao estresse oxidativo, nos grupos L1 e L4 houve elevação dos níveis de GSH e redução do MDA, de modo contrário, nos grupos L22.5 e L30 houve redução dos níveis de GSH e elevação do MDA. Conclui-se que doses baixas de LBI (1 e 4 J/cm²) promovem proliferação e tem efeito citoprotetor em SHEDs cultivadas sobre arcabouços de PLA, enquanto doses elevadas (22.5 e 30J/cm²) tem ação citotóxica e reduzindo a viabilidade e proliferação destas células (AU).

Dental mesenchymal stem cells (dMSCs) have been widely used in tissue engineering for their capacity for self-renewal and multi-lineage potential. Among the dMSCs, the stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs) are highlighted for their ease of collection, proliferative capacity and survival time. The aim of the study was to evaluate, through in vitro experiments, the effect of different doses of low intensity laser (LLLI) on the biological activity of SHEDs cultured on polylactic acid (PLA) scaffolds. Pre-isolated and characterized cells were cultured on PLA films and irradiated or not (control) with an InGaAlP diode laser (660 nm, 30 mW, continuous action mode) in a dose screening (1, 4, 7.5, 15, 22.5 and 30 J/cm²). Cell proliferation and viability were analyzed at 24, 48 and 72 hr using the Alamar Blue and Live/Dead assays. Cell morphology was evaluated by SEM at 72 h. The evaluation of oxidative stress was performed through the dosages of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH). Energy densities of 1 J/cm² and 4 J/cm² promoted cell proliferation in all intervals when compared to the control group and the other irradiated groups. Contrarily, high doses of irradiation (22.5 and 30 J/cm²) promoted significant negative effect on cell proliferation. It was verified that cell viability was affected throughout the experiment in groups L22.5 and L30, which presented a higher number of dead cells in the interval of 72h. The SEM analysis showed a greater cell density in L1 and L4 groups, opposing the SHEDs arranged more sparsely in L22.5 and L30 groups. Regarding to oxidative stress, in L1 and L4 groups there was elevation of GSH levels and reduction of MDA, showing a cytoprotective effect of these doses. Conversely, in groups L22.5 and L30 there was a reduction of GSH levels and elevation of MDA, corroborating with the results of the aforementioned assays. It is concluded that low doses of LLLI (1 and 4 J/cm²) promote proliferation of SHEDs on PLA scaffolds, while high doses (22.5 and 30 J/cm²) promote cytotoxic and anti-proliferative action in these cells (AU).