Efeitos à distância de feridas cirúrgicas em mucosa oral sobre populações granulocíticas na medula óssea em modelo murino / Remote effects of surgical oral mucosa wounds on populations granulocytes in the bone marrow in a murine model

Neste trabalho procuramos determinar os efeitos à distância de um ferimento cirúrgico único na cavidade bucal (localizado no palato duro, de extensão 3 mm) sobre a medula óssea em camundongos C57BL/6. Para isto, quantificamos células totais, eosinófilos, neutrófilos e fagócitos mononucleares, tanto na medula óssea recém-coletada, como na medula óssea cultivada em presença de diferentes citocinas. As citocinas foram utilizadas para revelar defeitos sutis que não são detectáveis no exame da medula óssea recém-coletada. Na medula óssea recém-coletada, foi encontrado um aumento modesto, mas significativo, nos números de neutrófilos. Em culturas incubadas com Interleucina (IL)-3, foi observada uma redução significativa dos números de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em culturas incubadas com Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos (G-CSF), foram observados efeitos negativos semelhantes aos encontrados com IL-3, com supressão de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em culturas incubadas com Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF), foi observada redução significativa somente sobre o número de neutrófilos. O mesmo ocorreu na presença de Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos (M-CSF). Utilizamos também rhG-CSF (Filgrastim®), que tem atividade em cultura de células murinas, sendo observado efeito negativo apenas sobre neutrófilos, em contraste com o observado na presença de G-CSF murino. O efeito positivo sobre o número de neutrófilos na medula óssea recém-coletada poderia ser explicado pela exposição a microrganismos da microbiota bucal no local da lesão, causando bacteremia. Para testar esta hipótese, adotamos uma estratégia de desinfecção local (Clorhexidina a 0,2% e 0,04%) antes da realização do corte, e avaliamos a repercussão deste tratamento sobre as diferentes respostas anteriormente caracterizadas. O tratamento com Clorhexidina a 0,2% eliminou os efeitos observados anteriormente sobre os números de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em contrapartida, após o tratamento com Clorhexidina a 0,04% alguns dos efeitos anteriormente encontrados, quanto aos números de neutrófilos e de fagócitos mononucleares, persistiram. Procuramos também avaliar se o bloqueio da resposta de glicocorticóides endógenos ao trauma cirúrgico, pelo uso de Mifepristone (RU486), antagonista do receptor de glicocorticóides, poderia modificar os efeitos da ferida na cavidade bucal sobre a medula óssea. Não houve evidência de bloqueio específico dos efeitos do trauma com o uso de RU486, comparativamente aos controles que receberam veículo. Em experimentos-piloto, avaliamos os efeitos do trauma cirúrgico, induzido em camundongos BP-2 segundo os protocolos utilizados anteriormente em camundongos C57BL/6, obtendo evidência de respostas importantes entre cepas no padrão de resposta da medula óssea. Dentro das limitações do presente estudo, podemos concluir que o trauma cirúrgico bucal atinge a medula óssea à distância, demonstrando efeitos positivos 24h após o trauma e negativos quando utilizamos citocinas. Além disso, a presença de bactérias bucais é responsável pela depressão da resposta da medula. (AU)

In this study, we aimed to identify, using C57BL/6 mice, long-distance effects of a single, surgical oral wound of 3 mm extension in the hard palate, on the bone marrow. To do so, we enumerated total cells as well as eosinophil, neutrophil and mononuclear phagocytes, from recently harvested bone marrow, and from cultured bone marrow following different cytokine stimuli. Cytokines were used to reveal subtle effects on the recently harvest bone marrow. In recently harvested bone marrow, a small but significant increase was found in neutrophil numbers. In cultures exposed to interleukin (IL)-3 there were decreased total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers. In cultures exposed to granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), reduced total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers were observed resembling those in IL-3-exposed cultures. In cultures exposed to granulocytemacrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), significant reduction was fund only in neutrophil numbers. The occurred when macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) was used. We also used recombinant human G-CSF (rhG-CSF, Filgrastim®), which acts on murine cells, observing reduction in neutrophil numbers, unlike observations of murine G-CSF. The increase in neutrophil numbers in the fresh bone marrow might be induced by exposure of wounded surfaces to oral microorganisms and possibly by bacteremia. To test this hypothesis, the hard palate was disinfected with clorhexidine (CHX) 0.2% or 0.04%, prior to wounding. The treatment with CHX 0.2% abolished the cytokine effects in the total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers. By contrast, after treatment with CHX 0.04%, cytokine effects on the neutrophil and mononuclear phagocyte numbers persisted. We also sought to evaluate whether the effect of oral wounding on bone marrow was dependent on endogenous glucocorticoids. Blockade of the glucocorticoid antagonist receptor with mefipristone (RU486) provided results comparable to those of control group given vehicle only, thus ruling out this hypothesis. In pilot experiments, we also evaluated the effects of surgical trauma in BP-2 mice, using the protocol previously used for C57BL/6 mice, and found significant differences in the bone marrow responses between these two strains. Briefly, our limited experimental evidence shows that oral surgical trauma can influence the bone marrow at distance over a 24h postoperative period, and inducing positive or negative effects on various leukocyte lineages, before and after culture with cytokines. Available evidence points to oral bacteria as involved in these long-distance effects on bone-marrow. (AU)

Evaluation of Qualea grandiflora Mart effect on HIF-1alpha and MMP-14 modulation in cell lines of pre-osteoblasts and fibroblasts / Avaliação do efeito da Qualea grandiflora Mart na modulação de HIF-1alpha e MMP-14 em linhagens celulares de fibroblastos e pré-osteoblastos

A espécie vegetal Qualea grandiflora (QG), popularmente conhecida como "pauferro", "pau-terra-da-folha-grande", "pau-terra" ou "pau-de-tucano", muito comum no Cerrado brasileiro, é bem conhecida devido às suas variadas propriedades terapêuticas. Suas indicações incluem ações preventivas no aparecimento de lesões de mucosa gástrica, efeitos analgésicos, antibacterianos, anti-inflamatórios e antifúngicos. Assim, os componentes da QG poderiam ter alguma ação sobre moléculas amplamente envolvidas em processos angiogênicos e de desenvolvimento/reparo, como a Metaloproteinase de matriz 14 (MMP-14) e o Fator Induzido por hipóxia 1α (HIF-1alfa). Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do extrato hidroalcoólico das folhas de QG na viabilidade celular e expressão de MMP-14 e HIF-1alpha em culturas de fibroblastos da linhagem NIH/3T3 e pré-osteoblastos da linhagem MC3T3-E1. Para o teste de viabilidade celular e expressão das moléculas, concentrações de 0.1; 1.0 e 10 µg/mL do extrato hidroalcoólico das folhas de QG foram administrados por períodos de 24, 48, 72 e 96h. Após cada período, a viabilidade celular foi avaliada pelo método de redução de MTT e a análise da expressão das moléculas foi feita por meio da técnica de imunofluorescência. Os resultados mostram que o extrato de QG não promove redução da viabilidade celular de fibroblastos e pré-osteoblastos em concentrações até 10 µg/mL, nos períodos iniciais (24 e 48h). Porém, uma redução significativa da viabilidade pode ser verificada nos períodos de 72h e 96h para os fibroblastos e 96h para os pré-osteoblastos, expostos a mais alta concentração do extrato (10 µg/mL). O ensaio de imunofluorescência indica que o extrato, nas concentrações de 0.1; 1.0 e 10 µg/mL foi capaz de aumentar a expressão de MMP-14 e HIF-1alpha, em ambos os tipos celulares. Em conclusão, nossos resultados indicam que o extrato de QG exerce um efeito capaz de aumentar a expressão das duas moléculas em estudo (MMP-14 e HIF-1alpha), tanto para os fibroblastos da linhagem NIH/3T3 como para os pré- osteoblastos da linhagem MC3T3-E1. Assim, os compostos de QG podem apresentar potencial para serem utilizados como agentes terapêuticos moduladores da angiogênese, por meio do aumento da expressão de MMP-14 e HIF-1alpha.(AU)

The vegetable specie Qualea grandiflora (QG), popularly known as "pau-ferro", "pauterra-da-folha-grande", "pau-terra" or "pau-de-tucano", very common in the Brazilian Cerrado, is well known due to its varied therapeutic properties. Its indications include preventive actions in the appearance of lesions of gastric mucosa, analgesic, antibacterial, anti-inflammatory and antifungal effects. Thus, QG components could have some action on molecules widely involved in angiogenic and developmental / repair processes, such as Matrix metalloproteinase 14 (MMP-14) and HypoxiaInducible Factor-1α (HIF-1alpha). Thus, the objective of our study was to investigate the effects of QG hydroalcoholic extract on cell viability and expression of MMP-14 and HIF-1alpha in NIH/3T3 fibroblasts and MC3T3-E1 pre-osteoblasts cell lines. For the cell viability assay and expression of the molecules, concentrations of 0.1; 1.0 and 10 µg / mL of the hydroalcoholic extract of leaves of QG, were administered for periods of 24, 48, 72 and 96h. After each period, the cell viability was evaluated by MTT assay and the expression of the molecules was analyzed using the immunofluorescence technique. The results show that the QG extract does not promote reduction of the cellular viability of fibroblasts and pre-osteoblasts in concentrations up to 10 µg/mL in the initial periods (24 and 48h). However, a significant reduction in viability can be observed in 72h and 96h for fibroblasts and 96h for pre-osteoblasts exposed to the highest extract concentration (10 µg/mL). The immunofluorescence assay indicates that the extract, at concentrations of 0.1; 1.0 and 10 µg/mL was able to increase the expression of MMP-14 and HIF-1alpha in both cell types. In conclusion, our results indicate that the QG extract exerts an effect capable of increasing the expression of the two molecules under study (MMP-14 and HIF-1alpha) both for the NIH/3T3 fibroblasts as well as for the MC3T3-E1 pre-osteoblasts cells. Thus, the QG compounds could have potential to be used as angiogenesis modulating therapeutic agents, by increasing the expression of MMP-14 and HIF-1alpha.(AU)

Resposta in vitro de células pré-osteoblásticas em cerâmica de hidroxiapatita / In vitro evaluation of pre-osteoblastic cells in hydroxyapatite ceramic

Com a evolução do Biomateriais houve melhorias nas opções de tratamentos e atualmente são utilizados em substituição de partes do corpo que foram perdidas e promovem a recuperação de funções biológicas. Dentre eles existem as chamadas Biocerâmicas, que incluem alumina, zircônia e derivadas de fosfato de cálcio. A hidroxiapatita possui composição e estrutura minerais semelhantes à fase mineral óssea e apresenta como propriedades a biocompatibilidade, osteocondutividade e bioatividade. O trabalho avaliou a viabilidade celular em cerâmica de hidroxiapatita experimental de origem bovina em comparação com dois tipos de zircônia comerciais e liga de titânio comercialmente puro, para que futuramente possa ser utilizada como material base para implantes dentários. A avaliação in vitro foi realizada por meio de testes nos quais células pré-osteoblásticas cultivadas de linhagem murina MC3T3-E1 foram colocadas em contato indireto e direto com estes materiais. Para viabilidade celular (n=8) foram feitos testes de ensaio MTT e Cristal Violeta em duplicata e após 24, 48 e 72 horas os níveis de absorbâncias foram analisados por meio de espectrofotometria no leitor de Elisa. Para as analises por microscopia eletrônica de varredura (n=6) as células foram plaqueadas diretamente sobre as superfícies dos discos, fixadas em vapor de tetróxido de ósmio 2% após 24 e 48 horas, seguido da metalização após 48 horas da fixação das células para análise em Microscópio Eletrônico de Varredura. Os resultados para viabilidade indireta foram submetidos ao teste paramétrico ANOVA, seguido de teste de Tukey (p<0,05). Tanto no teste de MTT quanto no Cristal Violeta, de acordo com o grupo controle positivo, todos os grupos apresentaram resultados satisfatórios. A cerâmica de hidroxiapatita não apresentou diferença estatística significante, demonstrando não ser um material citotóxico. Pelas imagens geradas no MEV do teste de viabilidade direta, verificou-se que houve adesão...

With the evolution biomaterials there were improvements in treatment options, and are currently used in replacement body parts that were lost and promote the recovery of biological functions. Among them are the bioceramic which include alumina, zirconia and calcium phosphate derivative. Hydroxyapatite has mineral composition and structure similar to bone mineral phase and can be used as a biomaterial having biocompatibility, osteoconductivity and bioactivity. The study evaluated the cell viability in experimental hydroxyapatite ceramic bovine compared the two types of commercial zirconia and titanium alloy commercially pure, so that in future it can be used as base material for dental implants. In vitro evaluation was carried by means of tests in which the pre-osteoblastic cells MC3T3-E1 murine lineage cultured were placed in indirect and direct contact with these materials. For cell viability (n=8) were carried MTT assay and Crystal Violet tests in duplicate and after 24, 48 and 72 hours the absorbance levels were analyzed by spectrophotometry Elisa reader. For analysis by Scanning Electron Microscope variable pressure (n = 6) cells were plated directly on the discs surfaces, fixed in osmium tetroxide steam 2% after 24 and 48 hours, followed by metallization after 48 of cells fixation. The results for the cell viability were submitted to parametric test ANOVA, followed by Tukey test (p<0.05). Both in the MTT assay as Crystal Violet all groups exhibited satisfactory results absent cytotoxicity. By means of the SEM images produced, it was found that there was adhesion and proliferation of cells on the materials surfaces in the two periods. Therefore, it can be stated that the hydroxyapatite ceramic was presented as a biocompatible material.

Avaliação da capacidade fagocítica de mastócitos frente ao periodontopatógeno Aggregatibacter actinomycetemcomitans / Evaluation of the phagocytic ability of mast cells against the periodontopathogens Aggregatibacter actinomycetemcomitans

As doenças periodontais afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por microrganismos que possuem a capacidade de invadir os tecidos periodontais. A evolução desta doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares. Atualmente, existem evidências de que os mastócitos, além de outras funções, possuem a capacidade de eliminar bactérias, através da fagocitose. Assim sendo, este estudo teve por objetivo avaliar a capacidade fagocítica dos mastócitos frente ao periodontopatógeno A. actinomycetemcomitans, além de comparar sua capacidade fagocítica com a dos macrófagos, considerados fagócitos profissionais. Para este fim, foram realizados ensaios fagocíticos in vitro utilizando mastócitos e macrófagos murinos, desafiados ora com A. actinomycetemcomitans ora com Escherichia coli, opsonizados ou não, sob diferentes proporções célula: bactérias. Após 1 hora de desafio, as células foram coradas com laranja de acridina e avaliadas qualitativamente utilizando-se microscópio de varredura confocal a laser e quantitativamente através do microscópio de fluorescência convencional. Nossos resultados demonstraram que os mastócitos murinos se mostraram eficientes quanto a sua capacidade fagocítica frente a A. actinomycetemcomitans. Os valores percentuais de mastócitos com A. actinomycetemcomitans internalizados, na ausência de opsonização com complemento, foram maiores que aqueles na presença da opsonização, sugerindo a participação de receptores opsoninas-independentes no reconhecimento deste patógeno pelos mastócitos, além do receptor de complemento tipo 3 (CR3). Comparando os dois tipos celulares, verificou-se que ambas as células apresentaram importante atividade fagocítica contra A. actinomycetemcomitans, porém os valores percentuais de mastócitos com bactérias internalizadas sem complemento foram maiores que aqueles de macrófagos com bactérias internalizadas com complemento, em...

Periodontal diseases affect the supporting tissues of the teeth and are triggered by microorganisms which are capable of invading periodontal tissues. The evolution of this disease is influenced by inflammatory and immune response of the host and involves the participation of different cell types. Currently, there is evidence that mast cells, among other functions, have the ability to eliminate bacteria by phagocytosis. Thus, this study aimed to evaluate the phagocytic ability of mast cells against the periodontopathogens A. actinomycetemcomitans, and compare with the phagocytic capacity of macrophages, which are considered professional phagocytes. Therefore, in vitro phagocytic assays were conducted using murine mast cells and macrophages, challenged with A. actinomycetemcomitans or Escherichia coli, at the same time, opsonized or not, under different proportions cell: bacteria. After 1 hour of challenge, cells were stained with acridine orange and qualitatively assessed by using a confocal laser scanning electron microscope and quantitatively by the conventional scanning fluorescence microscope. The results demonstrated that phagocytic ability of murine mast cells was effective against A. actinomycetemcomitans. The percentages of mast cells with A. actinomycetemcomitans internalized in the absence of opsonization with complement, were higher than those in the presence of opsonization, suggesting the involvement of opsonin-independent receptors in recognition of this pathogen by mast cells, as well as complement receptor type 3 (CR3). Comparing the two cell types, it was observed that both cells showed significant phagocytic activity against A. actinomycetemcomitans, however, the percentages of mast cells with internalized bacteria without complement were higher than those of macrophages with internalized bacteria with complement, in one of the proportions (1:10). The results suggest the role of mast cells as professional phagocytes in the pathogenesis of...