Biomarcadores da transição epitélio-mesenquimal em desordens potencialmente malignas e carcinoma de células escamosas de língua oral / Biomarkers of epithelial-mesenchymal transition in potentially malignant disorders and squamous cell carcinoma of the oral tongue

Durante a carcinogênese oral, as células malignas adquirem um fenótipo agressivo que resulta em aumento da motilidade individual e na capacidade para invadir tecidos circunvizinhos. Para tanto, as células epiteliais malignas desenvolvem um processo regulatório e programado denominado transição epitélio-mesenquimal (TEM), que é crucial para aquisição deste fenótipo maligno agressivo. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da expressão imunoistoquímica de proteínas sinalizadoras da TEM em displasias epiteliais orais e em carcinomas de células escamosas de língua oral (CCELO), avaliando suas respectivas associações com parâmetros clínico-patológicos e de prognóstico. Inicialmente, objetivando obter uma compreensão aprofundada sobre o tema proposto, foram desenvolvidas duas revisões sistemáticas de literatura avaliando o papel da TEM como possível marcador de prognóstico em casos diagnosticados como displasia epitelial oral e o papel dos fatores de transcrição nuclear associados ao processo de TEM na regulação da plasticidade celular e no compartamento biológico em linhagens celulares de carcinoma de células escamosas em região de cabeça e pescoço. Para o estudo imunoistoquímico, foram selecionados 47 casos de displasias epiteliais orais e 41 casos diagnosticados como CCELO, nos quais foram analisados a imunoexpressão das proteínas Twist1, Snail1, E-caderina e N-caderina. Foram investigadas possíveis associações entre o padrão de expressão destas proteínas com a gradação histopatológica das displasias epiteliais e com os aspectos clínico-patológicos, recidiva e sobrevida em CCELO. Foram observados diferentes padrões de marcação entre os grupos analisados, observando-se uma perda significativa da expressão da E-caderina membranar em casos de CCELO em comparação aos casos de displasias epiteliais orais (p = <0.0001). Foi observado uma pior sobrevida global em casos com baixa expressão da E-caderina membranar (HR = 0.27; p = 0.033) e alta expressão do Twist1 citoplasmático (HR = 3.19; p = 0.010). Ao analisar isoladamente o parâmetro intensidade de expressão, foi observada associação entre a alta intensidade da N-caderina citoplasmática com a sobrevida global (HR = 4.93; p = 0.006). Nossos achados sugerem que a perda da expressão da E-caderina e o aumento da expressão da N-caderina e dos fatores de transcrição nuclear Twist1 e Snail1 estão associados ao desenvolvimento e progressão da carcinogênese oral. Isoladamente, a perda da expressão membranar da E-caderina e o aumento da expressão citoplasmática do Twist1 e da N-caderina foram associados a uma pior sobrevida (AU).

During oral carcinogenesis, malignant cells acquire an aggressive phenotype that results in increased individual motility and the ability to invade surrounding tissues. Therefore, malignant epithelial cells develop a regulatory and programmed process called epithelial-mesenchymal transition (EMT), which is crucial for the acquisition of this aggressive malignant phenotype. The aim of the present study was to investigate the role of immunohistochemical expression of EMT signaling proteins in oral epithelial dysplasias and oral squamous cell carcinomas of the tongue (OTSCC), evaluating their respective associations with clinicopathological and prognostic parameters. Initially, aiming to obtain a deeper understanding of the proposed topic, two systematic literature reviews were developed evaluating the role of EMT as a possible prognostic marker in cases diagnosed as oral epithelial dysplasia and the role of nuclear transcription factors associated with the MET process in regulation of cellular plasticity and biological behavior in head and neck squamous cell carcinoma cell lines. For the immunohistochemical study, 47 cases of oral epithelial dysplasias and 41 cases diagnosed with OTSCC were selected, in which the immunoexpression of Twist1, Snail1, E-cadherin and Ncadherin proteins were analyzed. Possible associations between the expression pattern of these proteins and the histopathological grading of epithelial dysplasias and with the clinicopathological aspects, recurrence and survival in OTSCC were investigated. Different staining patterns were observed between the analyzed groups, with a significant loss of membrane E-cadherin expression in cases of OTSCC compared to cases of oral epithelial dysplasias (p = <0.0001). Worse overall survival was observed in cases with low membrane E-cadherin expression (HR = 0.27; p = 0.033) and high cytoplasmic Twist1 expression (HR = 3.19; p = 0.010). When analyzing the expression intensity parameter alone, an association was observed between high cytoplasmic N-cadherin intensity and overall survival (HR = 4.93; p = 0.006). Our findings suggest that loss of E-cadherin expression and increased expression of N-cadherin and nuclear transcription factors Twist1 and Snail1 are associated with the development and progression of oral carcinogenesis. Alone, loss of membrane expression of E-cadherin and increased cytoplasmic expression of Twist1 and N-cadherin were associated with worse survival (AU).

Associação da imunoexpressão das proteínas Ecaderina, SHH e GLI-1 com parâmetros clinicopatológicos em Carcinoma Epidermóide de Língua Oral / Association of immunoexpression of Ecadherin, SHH and GLI-1 proteins with clinicopathological parameters in Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma

O potencial de invasão do carcinoma epidermoide requer modifcações fenotípicas nas células parenquimatosas de forma que essas adquiram capacidade de sobreviver e invadir o microambiente tumoral. Esse processo de modificação fenotípica é denominado de transição epitélio-mesenquimal (TEM), cujo as células epiteliais perdem parte de suas características e adquirem outras inerentes às células mesenquimais, de forma controlada por diversos fatores de transcrição indutores destas alterações, conferindo além das habilidades citadas, características de célula tronco, de resistência ao tratamento antineoplásico e angiogênese. O objetivo do presente estudo foi investigar associações da expressão imunoistoquímica das proteínas E-caderina, Shh e Gli-1, sinalizadoras da TEM, com caraterísticas clinicopatológicas de carcinomas epidermoides de língua oral (CELO). A imunoexpressão dessas proteínas foi analisada em 42 casos de CELO, de forma semiquantitativa, nas células neoplásicas do front de invasão tumoral e nos brotamentos tumorais. Os CELOs foram classificados como de baixa e alta expressão proteíca. As gradações de Almangush et al. (2015) e de Boxberg et al. (2017) mostraram categorização semelhante para os casos de CELOs, todavia, a gradação de Almangush et al. (2015) apresentou melhor associação com os parâmetros clínicos, destacando o tamanho do tumor (p=0,013) e o desfecho de óbito (p<0,01). A análise imunoistoquímica revelou predomínio de baixa expressão membranar da E-caderina, apresentando associação significativa com o comprometimento linfonodal (p=0,042). A expressão do Shh foi bem variável e não mostrou associações significativas. A expressão do Gli-1 foi predominantemente alta, mostrando relações significativas com parâmetros clinicopatológicos, como comprometimento linfonodal (p=0,024), estágio clínico do tumor (p=0,016), profundidade de invasão (p=0,015), atividade de brotamentos tumorais (p=0,033), menor tamanho do ninho tumoral (p=0,020) e o grau de diferenciação (p=0,033), sendo estes quatro últimos associados com os brotamentos tumorais. A análise estatística evidenciou ausência de associações significativas entre as variáveis imunoistoquímicas e indicadores de prognóstico do CELO. Os resultados deste estudo indicam que os sistemas de gradação morfológica analisados mostraram-se eficazes na identificação de casos de CELOs mais agressivos, com maior destaque para o proposto por Almangush et al (2015) e, em relação aos achados imunoistoquímicos, os resultados sugerem que a menor expressão membranar da E-caderina e a alta expressão nuclear/citoplasmática de Gli-1 associaram-se ao parâmetro clínico de pior prognóstico, referente ao comprometimento nodal. Diante do modelo do estudo, não se observou associação da imunoexpressão das proteínas estudadas com a sobrevida dos pacientes (AU).

The potential for squamous cell carcinoma invasion requires phenotypic modifications in the parenchymal cells so that they acquire the ability to survive and invade the tumor microenvironment. This process of phenotypic modification is called epithelialmesenchymal transition (EMT), which is crucial for the acquisition of this aggressive malignant phenotype. In this process, the epithelial cells lose part of their characteristics and acquire others inherent to the mesenchymal cells, in a controlled manner, inducing by various transcription factors, conferring, in addition to the aforementioned abilities, stem cell characteristics, resistance to anti-neoplastic treatment and angiogenesis. The aim of the present study was to investigate associations between the immunohistochemical expression of E-cadherin, Shh e, Gli-1 proteins, signaling TEM, with clinicopathological characteristics of oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC). The immunoexpression of these proteins was analyzed in 42 cases of OTSCC, in a semiquantitative way, in the neoplastic cells of the tumor invasion front and in the cells that make up the tumor budding. OTSCCs were classified as low and high protein expression. Aiming at the association of immunohistochemical findings with clinicopathological variables and survival rates, cases were classified into low expression and high expression categories. Initially, statistical differences between the histopathological gradations of malignancy by Almangush et al. (2015) and that of Boxberg et al. (2017) regarding clinical parameters. Both, the gradations showed similar categorization for OTSCC cases, were able to categorize the tumors, however, the gradation by Almangush et al. (2015) showed a better association with clinical parameters, highlighting tumor size (p=0.013) and the outcome of death (p<0.01). The immunohistochemical analysis revealed a predominance of low membrane expression of E-cadherin, with a statistically significant association with lymph node involvement (p=0.042). The expression of Shh was quite variable and had no statistically significant associations. Gli-1 had a prevalence of high expression, showing significant relationships with clinicopathological parameters, such as the occurrence of lymph node involvement (p=0.024), clinical stage of the tumor (p=0.016), depth of invasion (p=0.015), activity of tumor budding (p=0.033), smaller size of the tumor nest (p=0.020) and degree of differentiation (p=0.033), the last four being associated with tumor budding. Some correlations between markers were found, such as the positive correlation between the cytoplasmic expression of E-cadherin with Shh (p=0.030) and the immunoexpression of Gli-1 in the cytoplasm/nucleus with Shh (p=0.041). Statistical analysis evidenced the absence of significant associations between immunohistochemical variables and OTSCC prognostic indicators. The findings of this study suggest the expression pattern of E-cadherin, Shh and Gli-1 in OTSCC, in addition to indicating a better clinicopathological association with the malignancy gradation of Almangush et al. (2015). However, the expression of these biomarkers may not be related to patient survival. In addition, no significant differences were observed between the expression of the proteins studied in tumor budding when other cells in the invasion front were evaluated, suggesting a similar cell phenotype for both. The results of this study indicate that the analyzed morphological grading systems proved to be effective in identifying cases of more aggressive OTSCC, with greater emphasis on the one proposed by Almangush et al (2015) and, in relation to the immunohistochemical findings, the results suggest that the lower membrane expression of E-cadherin and the high nuclear/cytoplasmic expression of Gli-1 were associated with the clinical parameter of worse prognosis (AU).

Alveolar bone healing in rats: micro-CT, immunohistochemical and molecular analysis

Abstract Alveolar bone healing after upper incisor extraction in rats is a classical model of preclinical studies. The underlying morphometric, cellular and molecular mechanism, however, remains imprecise in a unique study. Objectives The aim of this study was therefore to characterize the alveolar bone healing after upper incisor extraction in rats by micro computed tomographic (Micro-CT), immunohistochemical and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. Material and Methods Thirty animals (Rattus norvegicus, Albinus Wistar) were divided into three groups after upper incisors extraction at 7, 14, and 28 days. Micro-CT was evaluated based on the morphometric parameters. Subsequently, the histological analyses and immunostaining of osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear kappa B ligand (RANKL) and tartrate resistant acid phosphate (TRAP) was performed. In addition, RT-PCR analyses of OPG, RANKL, the runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcin (OC), osteopontin (OPN), osterix (OST) and receptor activator of nuclear kappa B (RANK) were performed to determine the expression of these proteins in the alveolar bone healing. Results Micro-CT: The morphometric parameters of bone volume and trabecular thickness progressively increased over time. Consequently, a gradual decrease in trabecular separation, trabecular space and total bone porosity was observed. Immunohistochemical: There were no differences statistically significant between the positive labeling for OPG, RANKL and TRAP in the different periods. RT-PCR: At 28 days, there was a significant increase in OPG expression, while RANKL expression and the RANKL/OPG ratio both decreased over time. Conclusion Micro-CT showed the newly formed bone had favorable morphometric characteristics of quality and quantity. Beyond the RUNX2, OC, OPN, OST, and RANK proteins expressed in the alveolar bone healing, OPG and RANKL activity showed to be essential for activation of basic multicellular units during the alveolar bone healing.

Análise imuno-histoquímica de proteínas relacionadas às respostas Th1, Th2 e Th17 na doença periodontal / Immunohistochemical analysis of proteins related to the Th1, Th2 and Th17 cells in periodontal disease

A doença periodontal é uma condição inflamatória de caráter infeccioso, caracterizada pela destruição dos tecidos de proteção e sustentação dentários, face à resposta produzida pelo hospedeiro frente às agressões sofridas pelos microrganismos. Vários fatores estão envolvidos nesse processo, sendo as citocinas as principais moléculas reguladoras dessa resposta imune, desempenhando um papel protetor e/ou destrutivo na progressão da lesão. Diante disso, este experimento investigou a expressão iimmo-histoquímica de IFN-y, GATA-3, IL-17, IL-23, IL-6 e TGF-p em tecidos gengivais de humanos, na tentativa de se obter um maior entendimento da participação das respostas imunes Thl, Th2 e Thl7 no desenvolvimento destes processos patológicos. Para tanto, oitenta e duas amostras de tecidos gengivais foram subdivididas em três grupos: Grupo 1=15 (amostras de tecido gengival saudável-controle), Grupo 2=36 (amostras com gengivite crónica) e Grupo 3=31 (amostras com periodontite crónica). Todos os casos foram submetidos à análise morfológica a partir de cortes corados em hematoxilina e eosina e, posteriormente, submetidas à técnica de coloração pela imuno-histoquímica através do método da Estreptoavidina-Biotina. Os resultados mostraram positividade de marcação para todas as proteínas, sendo observada uma maior tendência de marcação para as citocinas das respostas Thl e Thl7 no grupo 3. Diferença estatisticamente significativa foi verificada entre a expressão de TGF-p e a condição clínica das amostras (p=0,02). Assim, podemos concluir que as respostas Thl e Thl7 podem atuar sinergicamente no processo destrutivo dos tecidos periodontais, sobrepondo-se à resposta Th2 que também se encontrou presente nestes tecidos.

Expressão de MMP-13 e ativação de vias de sinalização intracelular em dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente em ratos / MMP-13 expression and signaling pathways activated in two models of experimentally-induced periodontal disease in rats

A progressão da doença periodontal é marcada pela excessiva produção de citocinas que, por sua vez, promove o aumento de outros mediadores inflamatórios, entre os quais, de metaloproteinases de matriz (MMPs). MMP-13 é uma colagenase de regulação complexa que tem sido relacionada à degradação da matriz extracelular (ECM) e à reabsorção óssea em diversas condições inflamatórias, incluindo doença periodontal e artrite reumatóide. A regulação da expressão gênica requer a ativação de várias vias de sinalização através da interação de receptores celulares específicos a estímulos externos, como antígenos bacterianos e citocinas derivadas do hospedeiro. A complexidade da rede de citocinas estabelecida durante a progressão da doença periodontal depende das vias de sinalização ativadas, as quais são influenciadas pela natureza do estímulo extracelular. Considerando o papel fundamental das vias de sinalização no controle da expressão gênica de citocinas e a relevante atividade de MMP-13 na doença periodontal, este estudo avaliou a expressão de MMP-13 e as vias de sinalização ativadas durante o curso de dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente. A expressão de MMP-13 nos níveis de RNA mensageiro (mRNA) e proteína foram avaliados por RT-PCR e Western Blot, respectivamente. A cinética de ativação das vias de sinalização intracelular relacionadas à expressão de mediadores inflamatórios também foi verificada por Western Blot. Estes achados foram relacionados à severidade da reação inflamatória determinada por estereometria. Dois modelos experimentais foram usados: injeção de LPS e colocação de ligadura. Injeções de LPS de Eschericia coli foram realizadas na região palatina de molares superiores 2 vezes por semana (30 µg por aplicação). Ligaduras foram colocadas na região cervical dos primeiros molares inferiores. O grupo controle recebeu injeções de PBS (veículo) na gengiva palatina dos primeiros molares superiores, enquanto ligaduras não foram colocadas nos molares inferiores. Amostras foram coletadas 5, 15 e 30 dias após a indução da doença periodontal e processadas para extração de RNA total e proteína, assim como rotineiramente processadas para análise histológica/estereométrica. Um aumento significante da severidade da inflamação foi observado em ambos os modelos já no período de 5 dias. Entretanto, o modelo de ligadura mostrou uma diminuição da intensidade da inflamação aos 30 dias, que não foi observada no modelo de injeção de LPS. O perfil de expressão dos níveis de mRNA de MMP-13, assim como a cinética das vias de sinalização ativadas durante o curso da doença periodontal foram distintos segundo o modelo experimental mas, em geral, acompanharam a severidade do processo inflamatório. De forma interessante, não houve correlação entre os níveis protéicos e de mRNA de MMP-13 em ambos os modelos, sugerindo uma regulação pós­transcricional da expressão de MMP-13 in vivo. Além disso, p38 e ERK MAPkinases, assim como NF- B foram ativadas nos dois modelos de doença periodontal, embora com cinética distinta; enquanto ativação de STAT3 e STAT5 foi verificada apenas no modelo de ligadura. Estes achados sugerem uma ativação diferencial de receptores celulares em cada forma de indução da doença periodontal, o que determina diferenças temporais e qualitativas nas redes de sinalização intracelular ativadas e influencia a regulação da expressão gênica de MMP-13 em cada modelo experimental

The hallmark of destructive periodontal disease progression is the overproduction of cytokines which promotes the increased expression of other inflammatory mediators such as, MMPs. MMP-13 is a collagenase of complex gene regulation that has been implicated on ECM degradation and bone resorption in several inflammatory conditions, including periodontal disease and rheumatoid arthritis. Regulation of gene expression requires the activation of several signaling pathways through receptor-ligand binding of external stimuli represented by bacterial antigens and/or host-derived cytokines. The complexity of the cytokine network established during periodontal disease progression results from the signaling pathways activated, which are determined by the nature of external stimuli. Thus, considering the fundamental role of signaling pathways on regulation of cytokine gene expression and the relevant role of MMP-13 in periodontal disease, this study evaluated the expression of MMP-13 and the signaling pathways activated during the course of two experimentallyinduced periodontal disease models. Expression of MMP-13 at mRNA and protein levels was evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot, respectively. The activation kinetics of some signaling pathways that are related to the expression of inflammatory mediators was also verified by Western Blot. The two experimental models used were: LPS injections and placement of ligatures. Bi-weekly injections of Eschericia coli LPS were done into the palatal aspect of upper molars (30 µg per injection). Ligatures were placed at the cervical portion of both lower first molars. The control animals received injections of PBS vehicle on the palatal gingiva of upper molars, whereas no ligatures were placed on the lower molars. Samples were collected 5, 15 and 30 days after beginning of periodontal disease induction and processed for extraction of total RNA and protein, as well as routinely processed for histology/estereometry. A significant increase on the severity of inflammation was observed in both experimental models already at the 5-day period. However, the ligature model presented a significant decrease on the intensity of inflammation at the 30-day period, which was not observed with the LPS injection model. MMP-13 expression profile, as well as the kinetic of signaling pathways activated during periodontal disease were somewhat different according to each experimental model, however paralleled the severity of inflammation. Interestingly, there was no transcription-translation coupling for MMP-13 in both models, suggesting a post­transcriptional regulation of MMP13 expression in vivo. Moreover, p38 and ERK MAPkinases, as well as NF-kB were activated in both periodontal disease models, however with different kinetics, whereas activation of STAT3 and STAT5 was verified only on the ligature model. These findings suggest a differential activation of cellular receptors in each model of experimentally-induced periodontal disease, which results in temporal and qualitative differences on the signaling network and influences MMP-13 gene regulation in each experimental model

Expressão de MMP-13 e ativação de vias de sinalização intracelular em dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente em ratos / MMP-13 expression and signaling pathways activated in two models of experimentally-induced periodontal disease in rats

A progressão da doença periodontal é marcada pela excessiva produção de citocinas que, por sua vez, promove o aumento de outros mediadores inflamatórios, entre os quais, de metaloproteinases de matriz (MMPs). MMP-13 é uma colagenase de regulação complexa que tem sido relacionada à degradação da matriz extracelular (ECM) e à reabsorção óssea em diversas condições inflamatórias, incluindo doença periodontal e artrite reumatóide. A regulação da expressão gênica requer a ativação de várias vias de sinalização através da interação de receptores celulares específicos a estímulos externos, como antígenos bacterianos e citocinas derivadas do hospedeiro. A complexidade da rede de citocinas estabelecida durante a progressão da doença periodontal depende das vias de sinalização ativadas, as quais são influenciadas pela natureza do estímulo extracelular. Considerando o papel fundamental das vias de sinalização no controle da expressão gênica de citocinas e a relevante atividade de MMP-13 na doença periodontal, este estudo avaliou a expressão de MMP-13 e as vias de sinalização ativadas durante o curso de dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente. A expressão de MMP-13 nos níveis de RNA mensageiro (mRNA) e proteína foram avaliados por RT-PCR e Western Blot, respectivamente. A cinética de ativação das vias de sinalização intracelular relacionadas à expressão de mediadores inflamatórios também foi verificada por Western Blot. Estes achados foram relacionados à severidade da reação inflamatória determinada por estereometria. Dois modelos experimentais foram usados: injeção de LPS e colocação de ligadura. Injeções de LPS de Eschericia coli foram realizadas na região palatina de molares superiores 2 vezes por semana (30 μg por aplicação). Ligaduras foram colocadas na região cervical dos primeiros molares inferiores.

The hallmark of destructive periodontal disease progression is the overproduction of cytokines which promotes the increased expression of other inflammatory mediators such as, MMPs. MMP-13 is a collagenase of complex gene regulation that has been implicated on ECM degradation and bone resorption in several inflammatory conditions, including periodontal disease and rheumatoid arthritis. Regulation of gene expression requires the activation of several signaling pathways through receptor-ligand binding of external stimuli represented by bacterial antigens and/or host-derived cytokines. The complexity of the cytokine network established during periodontal disease progression results from the signaling pathways activated, which are determined by the nature of external stimuli. Thus, considering the fundamental role of signaling pathways on regulation of cytokine gene expression and the relevant role of MMP-13 in periodontal disease, this study evaluated the expression of MMP-13 and the signaling pathways activated during the course of two experimentallyinduced periodontal disease models. Expression of MMP-13 at mRNA and protein levels was evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot, respectively. The activation kinetics of some signaling pathways that are related to the expression of inflammatory mediators was also verified by Western Blot. The two experimental models used were: LPS injections and placement of ligatures. Bi-weekly injections of Eschericia coli LPS were done into the palatal aspect of upper molars (30 μg per injection). Ligatures were placed at the cervical portion of both lower first molars. The control animals received injections of PBS vehicle on the palatal gingiva of upper molars, whereas no ligatures were placed on the lower molars.

Estudo da relação de genes e agenesia dentária em uma população brasileira / The relationship between dental agenesis and genes in Brazilian population

O principal fator etiológico da agenesia dentária é a hereditariedade. Os genes MSX1 e PAX9 estão comprovadamente associados com o ligodontia. O objetivo deste trabalho foi averiguar a existência de associação desses genes com hipodontia em uma população brasileira. Esta pesquisa foi desenvolvida na Faculdade de Odontologia de uma instituição pública de ensino superior, em duas etapas. Na primeira parte, foram avaliadas 1034 radiografias panorâmicas, de crianças de 6 a 12 anos de ambos os gêneros, com a finalidade de se identificar a ocorrência de anodontias. Das radiografias analisadas, 519 eram de crianças do gênero masculino e 515 crianças do gênero feminino, sendo encontrados 39 casos de agenesia dentária, perfazendo uma prevalência de 3,77%. A esses 39 casos de agenesia dentária, para a segunda parte deste estudo, foram acrescentados mais 116 probandos provenientes de clínicas odontológicas privadas das cidades do Rio de Janeiro totalizando 155 pacientes com ausência congênita de, pelo menos, 1 dente permanente, a exceção dos terceiros molarares. A coleta do material biológico foi realizada de acordo com protocolo padrão e amplificado por reações em cadeia de polimerase (PCR). Através de seqüenciamento direto das regiões codificantes, não foram encontradas mutações potencialmente patogênicas nos genes MSX1 e PAX9. Esses resultados sugerem que outros genes candidatos devem desempenhar um papel na hipodontia em seres humanos.